專利名稱：Gap啟動(dòng)子文庫在調(diào)節(jié)s-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及GAP啟動(dòng)子在調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在過去的幾十年里，為了提高微生物發(fā)酵產(chǎn)量，越來越多的基因工程手段被應(yīng)用到代謝工程中。但是大多數(shù)情況下，這些嘗試都無法達(dá)到預(yù)期的效果，有的甚至與預(yù)期的結(jié)果截然相反。在改造代謝途徑的研究中，為了增加特定目的代謝產(chǎn)物或構(gòu)建具有過量生產(chǎn)能力且能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的工程菌，常采用過表達(dá)限速反應(yīng)步驟中相關(guān)酶和阻斷目的產(chǎn)物分支代謝途徑這兩個(gè)傳統(tǒng)的策略。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)作為所有生物體內(nèi)的重要甲基供體，無論是在抑郁癥，肝臟疾病還是關(guān)節(jié)炎治療領(lǐng)域都具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。正因?yàn)镾AM具備如此廣泛的應(yīng)用價(jià)值，越來越多的研究人員利用代謝工程改變細(xì)胞的代謝途徑以獲得高產(chǎn)SAM的菌株。過表達(dá)和基因敲除這兩個(gè)基因操作手段成功地應(yīng)用到了 SAM高產(chǎn)菌的代謝工程改造中強(qiáng)化S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(saml和san^)的表達(dá)量，提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)的活性，從而增加SAM的產(chǎn)量；敲除β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻斷SAM和L-Met在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑，增加胞內(nèi)SAM的積累。野生菌中，MAT酶活是SAM產(chǎn)量提高的限速步驟，提高細(xì)胞內(nèi)部的SAM合成酶的酶活有利于胞內(nèi)SAM的累積。有兩條途徑可以提高重組菌胞內(nèi)的SAM合成酶的酶活，即提高胞內(nèi)SAM合成酶的量或者提高所表達(dá)的外源SAM合成酶的比酶活。對(duì)于前者，將外源SAM合成酶基因在適合的宿主菌中進(jìn)行強(qiáng)化表達(dá)，通過體外添加L-Met來實(shí)現(xiàn)SAM的高產(chǎn)。已有研究者將克隆得到的S. cerevisiae來源的sam2基因置于醇氧化酶_1 (AOXl)啟動(dòng)子調(diào)控下，整合至畢赤酵母Pichia pastoris，獲得了 SAM累積量比野生株高30多倍的重組菌。而對(duì)于后者，可利用DNA Shuffling來增強(qiáng)SAM合成酶的酶活。Hu (H. Hu. J. C. Qian. J. Chu.Y. Wang. Y. P. Zhuang. S. L. Zhang. DNA shuffling of methionine adenosyltransferasegene leads to improved S-adenosyl-L-methionine production in Pichia pastoris.Journal of Biotechnology. 2009,141 :97-103)等為了提高外源SAM合成酶在重組畢赤酵母胞內(nèi)的活力，以來源不同的三種SAM合成酶基因?yàn)槌霭l(fā)材料，利用DNA Shuffling技術(shù)對(duì)SAM合成酶進(jìn)行體外進(jìn)化。經(jīng)過篩選獲得了一株整合了編碼高酶活SAM合成酶基因的重組畢赤酵母菌株GS115/DS56，在搖瓶中，GS115/DS56的胞內(nèi)SAM累積量為1. 64g/L，SAM合成酶的酶活達(dá)到463U/gDCW，比含來源于母本的SAM合成酶的重組菌分別提高了 102%和201%，有效改善了胞內(nèi)SAM合成酶的酶活對(duì)SAM合成的限制。然而，Hu等還發(fā)現(xiàn)，GS115/DS56胞內(nèi)的SAM合成酶的酶與出發(fā)菌株相比提高了 2. 8倍，但是SAM的單位菌體產(chǎn)量只提高了 13%，胞內(nèi)SAM合成酶的酶活達(dá)到一定水平后，對(duì)合成SAM的促進(jìn)作用十分有限。實(shí)驗(yàn)表明單獨(dú)增加限速酶量有時(shí)并不有效。在過表達(dá)該酶的過程中還可能造成一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需物質(zhì)的減少，菌體代謝負(fù)擔(dān)加大，或者是代謝過程所需輔因子的平衡被打破，最終相對(duì)于整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)而言該途徑的通量是減少的，這也是該方法的缺陷所在。很多研究表明，基因的適度表達(dá)比過量表達(dá)能達(dá)到更好的效果。將SAM分解代謝途徑進(jìn)行阻斷是增加細(xì)胞內(nèi)SAM積累的另一有效策略。敲除β -胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻斷SAM和L-Met在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑，可以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)SAM積累的增加。L-Met和ATP經(jīng)SAM合成酶催化反應(yīng)生成SAM，SAM通過轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)很容易生成SAH，后者可以通過水解生成同型高半胱氨酸和腺苷，同型高半胱氨酸有三個(gè)流向一是再次甲基化形成L-Met，二為在胱硫醚合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)的作用下和絲氨酸化合生成胱硫醚，三為通過SAH水解酶作用逆反應(yīng)生成SAH。其中第一、三流向均為L(zhǎng)-Met和SAM閉循環(huán)，而第二個(gè)流向由于通過CBS將巰基從同型高半胱氨酸源源不斷移出來，影響了 SAM的積累濃度。細(xì)胞內(nèi)若存在過量的L-Met，SAM的產(chǎn)量將會(huì)提高 80 倍(F. Schlenk. C. R. Zydek. D. J. Ehninger. J. L. Dainko. The production ofS-adenosyl-L-methionine and S-adenosyl-L-ethionine by yeast. Enzymologia. 1965,29 :283-298)。胱硫醚β -合成酶(CBQ是細(xì)胞轉(zhuǎn)硫途徑的第1個(gè)酶，催化絲氨酸和高半朧氨酸合成胱硫醚和生成水。理論上，敲除胱硫醚β-合成酶基因(cys4)，阻斷SAM和L-Met在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑，可增加L-Met合成SAM的代謝途徑通量，從而提高SAM 的胞內(nèi)累積量。鑒于此，He 等(J. He. J.Deng· Y. Zheng. J. Gu. A synergistic effecton the production of S-adenosyl-L-methionine in Pichia pastoris by knockingin of S-adenosyl-L-methionine synthase and knocking out of cystathionine-betasynthase. J Biotechnol. 2006，126 :519-527)通過基因敲除的方法將過量表達(dá)SAM合成酶的畢赤酵母菌株的CBS合成基因缺失掉，結(jié)果SAM積累量提高了兩倍多，效果相當(dāng)明顯；但是，將SAM分解代謝途徑β-胱硫醚(CBS)完全阻斷，重組菌成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，培養(yǎng)基中需外源添加谷胱甘肽(GSH)。因此也導(dǎo)致發(fā)酵成本大大提高。雖然相對(duì)要提高的目的代謝物而言，一些支路代謝途徑對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)并不是必需的，即便完全阻斷該途徑也不會(huì)影響細(xì)胞的存活，但是這些代謝途徑中的一些代謝物可能用于維持細(xì)胞內(nèi)的輔因子平衡，或可能調(diào)控其他代謝途徑中的代謝物。因此，去除這些旁路可能造成細(xì)胞整個(gè)代謝能力的減弱，最終也影響到目的產(chǎn)物的產(chǎn)量提高，這也是完全阻斷代謝途徑的缺陷所在?？偠灾?，在代謝途徑中限速步驟往往是由多個(gè)基因控制的，因此成功的代謝工程操作需要對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行平衡操作才能實(shí)現(xiàn)目的?；诩?xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，過表達(dá)限速步驟關(guān)鍵酶或敲除代謝支路支點(diǎn)的酶這兩種傳統(tǒng)方式已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足代謝工程的要求，科研工作者越來越傾向于對(duì)細(xì)胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行精確地控制和調(diào)節(jié)。取而代之，在一寬廣的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)基因的連續(xù)微調(diào)并找到最佳表達(dá)水平(最大化該代謝途徑通量或目的產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)基因表達(dá)水平)已成為代謝優(yōu)化必不可少的手段。隨后，以同樣的方式優(yōu)化第二、三……個(gè)代謝物的表達(dá)水平。因此，只有對(duì)代謝途徑中多個(gè)酶同時(shí)進(jìn)行調(diào)控(強(qiáng)化或弱化相關(guān)酶的表達(dá))，才能實(shí)現(xiàn)某個(gè)代謝途徑的通量的增加。這就要求在代謝工程操作中對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行連續(xù)精細(xì)的調(diào)控。為了實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的連續(xù)微調(diào)，也有研究人員利用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)來調(diào)控目的基因。無論是通過改變誘導(dǎo)劑的濃度來實(shí)現(xiàn)基因的連續(xù)微調(diào)，還是利用溫度、溶氧或PH誘導(dǎo)系統(tǒng)通過改變發(fā)酵控制參數(shù)來實(shí)現(xiàn)基因的微調(diào)，這些誘導(dǎo)系統(tǒng)存在許多缺陷。利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以通過不同濃度的誘導(dǎo)劑在一定程度上實(shí)現(xiàn)對(duì)基因不同表達(dá)強(qiáng)度的控制，但是誘導(dǎo)劑通常比較昂貴，對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，而且細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)劑感應(yīng)存在非均一性。發(fā)酵參數(shù)的控制(如溫度、溶氧或PH的控制)難以實(shí)現(xiàn)在小范圍內(nèi)的改變，也難以在大規(guī)模的發(fā)酵體系中快速達(dá)到設(shè)定值。而且，誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)均無法達(dá)到基因的穩(wěn)定表達(dá)。因此現(xiàn)有的一些誘導(dǎo)系統(tǒng)，無論是基于化學(xué)試劑還是基于發(fā)酵控制參數(shù)，都不能實(shí)現(xiàn)在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中基因的精確調(diào)控，也無法實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因連續(xù)調(diào)控。因此，本領(lǐng)域目前還需要對(duì)SAM生產(chǎn)菌株的基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行深入研究，找到改變細(xì)胞的代謝途徑以獲得高產(chǎn)的新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供GAP啟動(dòng)子文庫在調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種突變型GAP啟動(dòng)子文庫的用途，用于調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑，從而調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量；其中，所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫包括選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑為調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶(CBQ的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫包括選自SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子，用于提高S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量。在另一優(yōu)選例中，所述的GAP啟動(dòng)子通過下調(diào)(非阻斷)β-胱硫醚合成酶的表達(dá)提高S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量。在本發(fā)明的另一方面，提供一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物包括以下操作性相連的元件(5’ 一 3’) β -胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側(cè)翼序列；抗性選擇標(biāo)記；選自SEQ IDNO=USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子；β -胱硫醚合成酶的編碼基因。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物用于整合到S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的基因組中，從而調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑。在另一優(yōu)選例中，所述的β-胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側(cè)翼序列具有SEQ IDNO :5所述的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的β-胱硫醚合成酶的編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO 6所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量的方法，包括以選自突變型GAP啟動(dòng)子文庫的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量；其中，所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫包括選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(1)提供一種表達(dá)載體，其中包含所述的構(gòu)建物；(2)將(1)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，使得所述的構(gòu)建物整合到S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的基因組中，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌；(3)培養(yǎng)( 所述的重組S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，從而該菌的S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量相對(duì)于基因組中未整合所述構(gòu)建物的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌發(fā)生改變。在另一優(yōu)選例中，(1)中，還包括以下元件ori，fl origin,以及多克隆位點(diǎn)(酶切位點(diǎn))，終止子；這些元件在表達(dá)載體上操作性相連。在另一優(yōu)選例中，所述的抗性選擇標(biāo)記選自(但不限于)=Zeocin或Kan。在另一優(yōu)選例中，選自所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫的啟動(dòng)子包括選自SEQ IDNO 2或SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子，其下調(diào)(非阻斷)β -胱硫醚合成酶的表達(dá)，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量。在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，其基因組中整合有所述的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌是酵母。在另一優(yōu)選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌是重組畢赤酵母。在本發(fā)明的另一方面，提供一種突變型GAP啟動(dòng)子，所述的啟動(dòng)子的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的突變型GAP啟動(dòng)子(如SEQ ID NO 3所示)的用途，用于下調(diào)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶(CBQ的表達(dá)，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、畢赤酵母SAM代謝途徑。圖2、啟動(dòng)子G0，G6和G12相對(duì)強(qiáng)度。圖3、CBS啟動(dòng)子替換載體pGAP-CBS的構(gòu)建示意圖。圖4、重組質(zhì)粒驗(yàn)證圖。其中，(A)質(zhì)粒pGAP-Z-TT的酶切驗(yàn)證。Lanel 質(zhì)粒經(jīng)Mil線性化驗(yàn)證；Lane2 質(zhì)粒經(jīng)NotI 和 SalI 雙酶切驗(yàn)證；Lane3 :DNA Marker。(B)質(zhì)粒pET-Z-TT的酶切驗(yàn)證。Lanel 質(zhì)粒經(jīng)BamHI線性化驗(yàn)證；Lane2 質(zhì)粒經(jīng)NotI 和 BamHI 雙酶切驗(yàn)證；Lane3、4 :DNA Marker。(C)質(zhì)粒pET-Z-TT-GAP的酶切驗(yàn)證。Lane2 質(zhì)粒經(jīng)NotI和1雙酶切驗(yàn)證；Lane3 質(zhì)粒經(jīng) XbaI 線性化驗(yàn)證；Lanel、4 =DNA Marker。(D)質(zhì)粒pGAP-CBS的酶切驗(yàn)證。Lanel 質(zhì)粒經(jīng)XhoI和NotI雙酶切驗(yàn)證；Lane2 質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切驗(yàn)證；Lane3 質(zhì)粒經(jīng)EcoRI線性化驗(yàn)證；Lane4、5 =DNA Marker。(E)質(zhì)粒 pGO-CBS，pG6_CBS 和 pG12_CBS 的酶切驗(yàn)證；Lanel_3 質(zhì)粒經(jīng) XbaI 線性化驗(yàn)證；Lane4-6 質(zhì)粒經(jīng) XbaI 和 BamHI 雙酶切驗(yàn)證；Lane7、8 =DNAMarker0圖5、重組菌GO-CBS，G6-CBS和G12-CBS陽性克隆菌落PCR驗(yàn)證(A)重組菌 GO-CBS 和 G6-CBS 用引物 GAP F5/CBS R2 進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。Lanel-6 重組菌 GO-CBS 的 PCR 驗(yàn)證；Lane7-12 重組菌 G6-CBS 的 PCR 驗(yàn)證；Lanel3 :DNA Marker。
(B)重組菌G12-CBS用引物GAP F5/CBS R2進(jìn)行PCR驗(yàn)證。Lane 1-6 重組菌G12-CBS 的 PCR 驗(yàn)證；Lane7 :DNA Marker。(C)重組菌 GO-CBS 和 G6-CBS 用引物 PCBS F/TZ R 進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。Lane 1-6 重組菌 GO-CBS 的 PCR 驗(yàn)證；Lane8-13 重組菌 G6-CBS 的 PCR 驗(yàn)證；Lane7 =DNAMarker0(D)重組菌G12-CBS用引物PCBS F/TZ R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。Lane 1-6 重組菌G12-CBS的 PCR 驗(yàn)證；Lane7 :DNA Marker。圖6、重組菌GO-CBS、G6-CBS、G12-CBS和對(duì)照菌DS16生長(zhǎng)比較。圖7、比較重組菌GO-CBS、G6-CBS和G12-CBS與對(duì)照菌DS16的SAM產(chǎn)量。A 重組菌GO-CBS、G6-CBS和G12-CBS與對(duì)照菌DS16的SAM單位菌體產(chǎn)量比較；B 與對(duì)照菌DS16相比重組菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS的SAM產(chǎn)量增加百分比。圖 8、重組菌 G0-CBS、G6-CBS、G12-CBS 和對(duì)照菌 DS16 的 cys4 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平、CBS酶活和SAM產(chǎn)量比較。A 各重組菌CBS轉(zhuǎn)錄水平和CBS酶比酶活比較；B 各重組菌SAM單位菌體產(chǎn)量和CBS酶比酶活比較。圖9、誘導(dǎo)前重組菌G0-CBS、DS16、G6-CBS和G12-CBS胞內(nèi)L-Met水平比較。圖10、15L發(fā)酵罐中G12-CBS和DS16的SAM產(chǎn)量比較。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，采用組成型啟動(dòng)子文庫(突變型GAP啟動(dòng)子文庫)實(shí)現(xiàn)了 S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中基因表達(dá)的精確調(diào)控，找到了提高S-腺苷甲硫氨酸產(chǎn)量的切實(shí)可行的方法。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。如本文所用，所述的“GAP啟動(dòng)子文庫”(也稱為“突變型GAP啟動(dòng)子文庫”)是指含有本發(fā)明的一系列突變型GAP啟動(dòng)子的核酸集合體。較佳地，所述的“GAP啟動(dòng)子文庫”包括選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。 如本文所用，所述的“GAP啟動(dòng)子”簡(jiǎn)稱為pGAP、Pgap或Pe。如本文所用，所述的“可操作地連接”或“操作性相連”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述的“弱化型GAP啟動(dòng)子”是指相對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子(其序列如SEQ ID N0:4所示)其調(diào)控目的基因表達(dá)的強(qiáng)度顯著弱化，例如弱化10%以上，較佳的弱化20%以上，更佳的弱化30%以上，如弱化50%以上、弱化80%以上或弱化100%以上。較佳地，除非另外說明，所述的“弱化型GAP啟動(dòng)子”是指SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。如本文所用，所述的“增強(qiáng)型GAP啟動(dòng)子”是指相對(duì)于野生型GAP啟動(dòng)子其調(diào)控目的基因表達(dá)的強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，例如增強(qiáng)10 %以上，較佳的增強(qiáng)20 %以上，更佳的增強(qiáng)30%以上，如增強(qiáng)50%以上、增強(qiáng)80%以上或增強(qiáng)100%以上。其調(diào)控目的基因表達(dá)的強(qiáng)度可通過檢測(cè)目的的基因表達(dá)量而得知，表達(dá)量的檢測(cè)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。較佳地，除非另外說明，所述的“增強(qiáng)型GAP啟動(dòng)子”是指SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。如本文所用，“目的基因”是指可由本發(fā)明的啟動(dòng)子指導(dǎo)表達(dá)的基因。較佳地，除非另外說明，所述的“目的基因”是指胱硫醚合成酶(CBS)。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于該目的基因來說是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。GAP啟動(dòng)子文庫為了實(shí)現(xiàn)對(duì)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中基因表達(dá)的連續(xù)微調(diào)，本發(fā)明人選擇了一組突變型GAP啟動(dòng)子，包括SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子，構(gòu)成啟動(dòng)子文庫，各啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的強(qiáng)度呈現(xiàn)梯度分布，用于在不同強(qiáng)度下指導(dǎo)目的基因表達(dá)。啟動(dòng)子文庫的獲得可保證對(duì)所調(diào)控的目的基因表達(dá)進(jìn)行梯度調(diào)節(jié)，實(shí)施可控基因擾動(dòng)和系統(tǒng)分析。本發(fā)明還包括具有與上述的任一種啟動(dòng)子序列具有80%以上，更優(yōu)地選90%以上，最優(yōu)選地95%以上(如98%、99%)相同性的啟動(dòng)子，它們保留有與上述啟動(dòng)子相同的功能以及啟動(dòng)目的基因表達(dá)的強(qiáng)度。“相同性”是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以被可操作地連接到目的基因前，該目的基因相對(duì)于啟動(dòng)子而言可以是外源(異源)的。所述的目的基因是S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶(CBQ。通過調(diào)節(jié)β-胱硫醚合成酶的表達(dá)強(qiáng)度，可以調(diào)節(jié)SAM和L-Met在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑，調(diào)節(jié)L-Met合成SAM的代謝途徑通量，從而改變SAM的胞內(nèi)累積量。例如通過弱化β-胱硫醚合成酶的表達(dá)強(qiáng)度，可以弱化SAM和L-Met在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑，增加L-Met合成SAM的代謝途徑通量，從而提高SAM的胞內(nèi)累積量。表達(dá)載體和宿主細(xì)胞來自于本發(fā)明的啟動(dòng)子文庫的任何一種啟動(dòng)子和/或目的基因序列可被包含在構(gòu)建物或重組表達(dá)載體中。為了改變S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的代謝途徑，使其在本發(fā)明的啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)CBS，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了構(gòu)建物。所述的構(gòu)建物包括胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側(cè)翼序列；抗性選擇標(biāo)記；選自SEQ ID NO =USEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子；β-胱硫醚合成酶的編碼基因。所述的構(gòu)建物用于整合到S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的基因組中，從而調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑。當(dāng)用于轉(zhuǎn)化S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌時(shí)，所述的構(gòu)建物被包含在表達(dá)載體中。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。術(shù)語“表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體是酵母細(xì)胞適用的表達(dá)載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)等。重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動(dòng)子和編碼基因，還可含有一種或多種其它啟動(dòng)子或編碼基因。所述的其它啟動(dòng)子例如是組織特異性的、組成型的或誘導(dǎo)型的。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的重組表達(dá)載體包括(從5’到3’方向)β_胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側(cè)翼序列，pTEF，抗性選擇標(biāo)記(如koCin、Kan)，A0Xl TT，選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子，β -胱硫醚合成酶的編碼基因，ori，抗性選擇標(biāo)記(如k0Cin、Kan)，fl origin，以及多克隆位點(diǎn)(酶切位點(diǎn))，終止子；這些元件在表達(dá)載體上操作性相連。所述的重組表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌是酵母；更佳地，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌是重組畢赤酵母。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸產(chǎn)量的方法本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量的方法，包括以選自所述突變型GAP啟動(dòng)子文庫的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量；其中，所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫包括選自SEQID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述方法包括(1)提供一種表達(dá)載體，其中包含所述的構(gòu)建物；(2)將(1)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，使得所述的構(gòu)建物整合到S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的基因組中，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌；(3)培養(yǎng)( 所述的重組S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，從而該菌的S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量相對(duì)于基因組中未整合所述構(gòu)建物的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌發(fā)生改變。組成型啟動(dòng)子文庫應(yīng)用于基因的連續(xù)微調(diào)組成型啟動(dòng)子文庫作為基因精確調(diào)控的新工具克服了誘導(dǎo)啟動(dòng)子的缺點(diǎn)，對(duì)組成型啟動(dòng)子進(jìn)行人工進(jìn)化可以得到不同活性范圍的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)基因同時(shí)的精細(xì)、穩(wěn)定調(diào)控。代謝控制理論告訴人們只有對(duì)代謝途徑中多個(gè)酶同時(shí)進(jìn)行調(diào)控，才能實(shí)現(xiàn)某個(gè)代謝途徑的通量的增加。因此，對(duì)于SAM代謝的調(diào)控，不僅要調(diào)控MAT酶活水平，還要嘗試在適度表達(dá)MAT的同時(shí)減少SAM分解代謝途徑的通量，以實(shí)現(xiàn)SAM合成的最大化。弱化SAM分解代謝途徑是增加細(xì)胞內(nèi)SAM積累的另一有效策略。通過基因敲除的方法將過量表達(dá)SAM合成酶的畢赤酵母菌株的CBS合成基因缺失掉，結(jié)果SAM積累量提高了兩倍多，效果相當(dāng)顯著；但是，將SAM分解代謝途徑β-胱硫醚(CBQ完全阻斷，重組菌成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，培養(yǎng)基中需外源添加GSH。因此本發(fā)明人在此采用更合理的方案，將CBS酶活降低，以實(shí)現(xiàn)CBS合成途徑通量的減少，以維持細(xì)胞自身生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)，而不是完全將CBS酶失活以阻斷轉(zhuǎn)硫途徑。綜上所述，用傳統(tǒng)的基因缺失的方式阻斷CBS代謝途徑，并不明智，而將其進(jìn)行弱化，減少SAM的代謝通量更值得研究。因此本發(fā)明主要研究了不同強(qiáng)度啟動(dòng)子調(diào)控CBS表達(dá)，實(shí)現(xiàn)CBS合成途徑流量不同程度弱化，以考查其對(duì)細(xì)胞內(nèi)SAM積累的影響。本實(shí)驗(yàn)以整合了編碼高酶活SAM合成酶基因dsl6(MAT酶活為1. 14U/mg蛋白)的重組畢赤酵母菌株GS115/DS16[1]為出發(fā)菌株，用GAP啟動(dòng)子文庫中弱啟動(dòng)子對(duì)GS115/DS16的CBS基因進(jìn)行調(diào)控，以弱化CBS途徑，GAP突變啟動(dòng)子包括PTO，PG6, Pei2，啟動(dòng)子強(qiáng)度依次降低，構(gòu)建的對(duì)應(yīng)重組菌分別為 GO-CBS、G6-CBS 和 G12-CBS。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pGO-CBS，pG6_CBS和pG12_CBS的構(gòu)建CBS啟動(dòng)子替換載體pGAP-CBS的構(gòu)建過程如圖3。首先以質(zhì)粒pPICZ A(購自Invitrogen)為模板，用引物TZ F/TZ R(表1)擴(kuò)增帶kocin抗性片段TEF-kocin，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Not I和MlI雙酶切并與同樣方法酶切質(zhì)粒pGAPZA連接獲得重組質(zhì)粒PGAP-Z-TT0重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證如圖4A，pGAP-Z-TT經(jīng)Mil單酶切后得到3. 7kb的線性化片段；經(jīng)NotI和MlI雙酶切，得到961bp插入的目的條帶與2. 7kb的載體片段。重組質(zhì)粒pGAP-Z-TT經(jīng)Not I和BamHI雙酶切后約1. 2kb片段與經(jīng)同樣方式酶切的質(zhì)粒PET 28a連接獲得重組質(zhì)粒pET-Z-TT。重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證如圖4B。pET-Z-TT經(jīng)BamHI線性化后為6. 56kb ；經(jīng)NotI和BamHI雙酶切驗(yàn)證，切下目的條帶為1. 2kp，余下載體片段為5. 3kb0以質(zhì)粒pGAPZA(Invitrogen)作為模板，利用引物GAP F B/GAP R X(表1)，擴(kuò)增得到的GAP啟動(dòng)子片段經(jīng)BamH I和)(baI酶切，連接經(jīng)同樣方法酶切的載體pET-Z-TT，獲得重組質(zhì)粒pET-Z-TT-GAP。重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證如圖4C。pET-Z-TT-GAP經(jīng)XbaI線性化后為6. 9kb ；經(jīng)BamH I和XbaI雙酶切驗(yàn)證，切下目的條帶為480bp，余下載體片段為6. 4kb。以畢赤酵母基因組DNA為模板，利用引物PCBS F/PCBS R和引物CBSORF F/CBSORF R分別擴(kuò)增CBS編碼序列的上游的304bp片段CBS 5，和CBS編碼序列的469bp片段CBS 0RF。先將CBS ORF的469bp片段經(jīng)BglII和^CbaI雙酶切后與同樣方式酶切的質(zhì)粒pET-Z-TT-GAP連接，再將經(jīng)XhoI和NotI雙酶切后片段CBS 5’插入，最終構(gòu)建成CBS啟動(dòng)子替換載體pGAP-CBS。重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證如圖4D。pGAP-CBS經(jīng)EcoRI線性化后為7. 6kb ；經(jīng)XhoI和NotI雙酶切驗(yàn)證，切下目的條帶為300bp，余下載體片段為7. 3kb ；經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切切驗(yàn)證，切下目的條帶為470bp，余下載體片段為7. 21Λ。
將篩選獲得的突變啟動(dòng)子PmPa^nPei2作為模板，利用引物GAP F B/GAPR X，擴(kuò)增得到的Pe。，Pg6和Pei2突變啟動(dòng)子序列經(jīng)BamH I和)(baI酶切，連接經(jīng)同樣方法酶切的載體pGAP-CBS,分別獲得重組質(zhì)粒pGO-CBS，pG6_CBS和pG12_CBS。重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證如圖4E。pGO-CBS, pG6-CBS 和 pG12_CBS 經(jīng) XbaI 線性化后為 7. 6kb ；經(jīng) BamH I 和 XbaI 雙酶切驗(yàn)證，切下目的條帶為480bp，余下載體片段為7. 11Λ。表1、基因克隆及PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用引物
SEQ ID
引物名稱引物序列NO:
TZ FCCGCGGCGGCCGCCCCACACACCATAGCTTC7
TZRACAGTCGACTCAGTCCTGCTCCTCGGCC8
GAP F BCGCGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGT9
GAPRXTGCTCTAGAATAGTTGTTCAATTGATTGAAA10
PCBS FCCGCTCGAGGGGGGTGGAACACTACAGGTATAG11PCBS R AATGCGGCCGCAGTATGTATTTCTGAAAAGAAAAGAAAAGAA 12
CBS ORF FTGCTCTAGAATGTCAGACAACAACCAACCTTTG13
CBS ORF RCGCGGATCCGGAATTCGGTCTAAGATTACAGCAT14
PCBSFAATTGATCTTCGATACGAATCCC15
GAP F5CCCTATTTCAATCAATTGAACAAC16
CBS R2GGGCATCTGGATTGTTAACATTAC17表2
.各啟動(dòng)子及基因序列
權(quán)利要求
1.一種突變型GAP啟動(dòng)子文庫的用途，用于調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑，從而調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量；其中，所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫包括選自SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑為調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶的表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫包括選自SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子，用于提高S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量。
4.一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物包括以下操作性相連的元件(5’ 一 3’ ) 胱硫醚合成酶的編碼基因的5，側(cè)翼序列；抗性選擇標(biāo)記；選自SEQ ID NO =USEQID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子；β -胱硫醚合成酶的編碼基因。
5.一種調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量的方法，包括以選自突變型GAP啟動(dòng)子文庫的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量；其中，所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫包括選自SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一種表達(dá)載體，其中包含權(quán)利要求4所述的構(gòu)建物；(2)將(1)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，使得所述的構(gòu)建物整合到S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌的基因組中，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌；(3)培養(yǎng)( 所述的重組S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，從而該菌的S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量相對(duì)于基因組中未整合所述構(gòu)建物的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌發(fā)生改變。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的選自權(quán)利要求1所述的突變型GAP啟動(dòng)子文庫的啟動(dòng)子包括選自SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動(dòng)子，其下調(diào)β -胱硫醚合成酶的表達(dá)，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量。
8.—種重組的S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)菌，其基因組中整合有權(quán)利要求4所述的構(gòu)建物。
9.一種突變型GAP啟動(dòng)子，所述的啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
10.權(quán)利要求9所述的突變型GAP啟動(dòng)子的用途，用于下調(diào)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達(dá)，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及GAP啟動(dòng)子文庫在調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑的表達(dá)載體，以及含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明采用組成型啟動(dòng)子文庫實(shí)現(xiàn)了S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中基因表達(dá)的精確調(diào)控，找到了提高S-腺苷甲硫氨酸產(chǎn)量的切實(shí)可行的方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102559726SQ201010621230
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者于曉光, 儲(chǔ)炬, 莊英萍, 張嗣良, 武曉樂, 秦秀林, 錢江潮 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)