專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高溫酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl 及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β -甘露 聚糖 酶(β -mannanase endo-1，4_β -D-mannanmannohydroase EC3. 2. 1. 78)是一類(lèi)能水解甘露聚糖的半纖維素酶，廣泛存在于微生物、動(dòng)物和植物中。
甘露聚糖是植物半纖維素的主要成份，是以l，4-i3_D-吡喃甘露糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性多糖。在甘露聚糖外切酶和甘露糖苷內(nèi)切酶的作用下，甘露聚糖可被分解為甘露糖。甘露聚糖的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，如主鏈上某些殘基被葡萄糖取代或半乳糖通過(guò)α-1，6_糖苷鍵與甘露糖殘基相連形成分枝則稱(chēng)為異甘露聚糖。主要有半乳甘露聚糖(galactomarman)，葡萄甘露聚糖(glucomarman)，半乳葡萄甘露聚糖 (galactoglucomannan) 0因此消化甘露聚糖主要是依靠β _甘露聚糖酶，此外還需要幾種酶的協(xié)同作用，包括β-甘露糖苷酶(0-11^11110&叔％)，外-0-0-甘露聚糖酶 (Εχο-β-mannanase)，甘露糖苷酶(galactosidase)，葡萄糖苷酶(glucosidase)和脫乙酰酉旨化酶(deacytle esterase)等支鏈酶。
蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，β-甘露聚糖酶多屬于糖基水解酶家族(glycoside hydrolasefamilies GHs) 5和沈。糖基水解家族5中包含多種不同來(lái)源的糖基水解酶。主要包含細(xì)菌、真菌、植物中的β-甘露聚糖酶和內(nèi)源性的葡聚糖酶。對(duì)糖基水解家族5中甘露聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行比較表明，序列同源性很低(< 20% )，因此在糖基水解家族5 中又劃分出8個(gè)亞家族Α1-Α8。其中Α7為真核生物β-甘露聚糖酶，Α8為細(xì)菌β -甘露聚糖酶，該亞家族氨基酸序列同源性多超過(guò)43% (Hilge et al. , 1998 ；Beguinet al，1990)。
隨著對(duì)β -甘露聚糖酶的深入研究，該酶在飼料、造紙、保健食品及生物技術(shù)研究等方面均得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)，綠色飼料的興起以及人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)甘露聚糖酶的研究和利用已進(jìn)入了一個(gè)新的階段。甘露聚糖酶已被廣泛應(yīng)用于食品、洗滌、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開(kāi)采、精細(xì)化工及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值，在工業(yè)中有著廣闊的應(yīng)用前景。目前，對(duì)于酸性甘露聚糖酶的報(bào)道較少。而在飼料中應(yīng)用的甘露聚糖酶，需要在酸性條件下具有高活性。酸性甘露聚糖酶主要來(lái)源于真菌。它們作用的最適PH值在2. 4 5.0，但天然菌株所產(chǎn)的甘露聚糖酶產(chǎn)量低，不能滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的高溫酸性甘露聚糖酶。
本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述高溫酸性甘露聚糖酶的基因。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述高溫酸性甘露聚糖酶的基因工程方法。
本發(fā)明的另一目的提供上述高溫酸性甘露聚糖酶的應(yīng)用。
本發(fā)明從青霉Cl(Penicillium. Cl CGMCC 4432) (2010年12月7日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCC 4432)中分離得到一種新的高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl。
本發(fā)明提供了一種高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所不。
SEQ ID NO. 1
MRTTILLASTLLGHSVSAQTTSGLRSTGTATTTTSSTLTTTTSKTTSSTSKTTSSSTTT
SAPTSTGFSKVNGLNFTIDGETNYFVRTNTYWLAFLNNNSDVDLVLSDIAASGMKI
LRVWGFNDVNTVPSAGTVYFQLLANGTATINTGADGLEKLDYVVS SAEAHGIKLII
PFVNNWSDYGGMAAYVTAFGGSQTTWYTNTAAQAAYQAYIKAVVSRYSSSPAIFA
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YTYGEGTNFTALLSIPDIDFGTIHLYPDSWGEVLSWGSSWVLTHGAACASIGKPCIL
EEFGTSTNQCANEAPWQATSLDTKGMAADMFWQY⑶TLSTGQSPNDGNTIYYG
TDTFTCIVTDHIAAI*
其中，該酶基因編碼407個(gè)氨基酸，N端18個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列 "mrttillastllghsvsa" (SEQ ID NO. 3)。
因此，成熟的高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl的理論分子量為41. 2kDa,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示
QTTSGLRSTGTATTTTSSTLTTTTSKTTSSTSKTTSSSTTTSAPTSTGFSKVNGLNFTI
DGETNYFVRTNTYWLAFLNNNSDVDLVLSDIAASGMKILRVWGFNDVNTVPSAG
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本發(fā)明的甘露聚糖酶Man5Cl同時(shí)具有好的熱穩(wěn)定性而在常溫下在酸性和中性的范圍內(nèi)均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本發(fā)明篩選到Penicillium sp. C1CGMCC 4432 所產(chǎn)生的甘露聚糖酶，其最適PH值為4. 0，在pH3. 0 7. 0的范圍內(nèi)維持60%以上的酶活性；最適溫度為70°C，在40°C仍具有38%左右的酶活力；用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別處理 60分鐘，酶活性分別維持85%與95%。
本發(fā)明提供了編碼上述高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl。具體地，該基因的基因組序列如SEQ ID NO. 4所示
atgaggacgacgatccttcttgccagtacccttctgggtcactccgtttcggctcagaccgtaggtgcc tggggtcaatgcggagg
tataaactattcgggttctacaacatgtgtctcgggatatgtatgcacatatgagaatccgtactacag tcaatgtgttccaggtgggc
tcccttcttgaacgttagacttccggtctaagaagtacaggtaccgccacaactacgacctcttctacg ttgacaacgacaacctcca
agacaacatcatccacatcaaaaacgacttctagttcgaccactacatcagctccgacttcaaccggct tttctaaagtcaatggcct
caactttacgatcgatggagaaacaaactactttgtgagaaccaacacctactggcttgcattcttgaa caataacagtgatgtcgac
ctagtcctcagcgatattgcagcatctggtatgaagattctccgagtctggggtttcaacgacgtcaac actgttccctctgccggaa
ctgtttacttccaactccttgcaaatggcacagcaacaatcaatacaggtgctgatggtcttgagaagt tggactacgttgtaagctc
agctgaagcccatggaatcaaattgatcattccttttgtcaacaattgggatgattatgggggaatggc tgcatatgtcactgcttttg
gaggttcacagaccacttggtacaccaacaccgcggctcaagcagcataccaagcatacatcaaggccg tggtcagtcggtata
gctcatcgccagcgatttttgcatgggaactaggcaacgaaccacgctgtaatggatgcaatacatcgg ttcttaccaactgggca
gaaactaccagtgcttacatcaaatctctcgattcgaaccacatggtcaccactggtattggtaagtgt caactcgataaattaagca
agacttgactaacacgtggtcagagggttttggtcttgatgccggatcagacggttcatatccatacac atatggcgagggaacaa
actttacagcactcctatccattcctgacatcgacttcggtactattcacttgtatccggatagctgta agtagtctcctgaagaaactta
cgtactacatgctagggggatctactactaatcaacaacagggggcgaagttttaagctggggcagcag ctgggtcttgacccac
ggagcagcctgtgcatctatcggcaaaccatgcattctcgaagaattcggaacatcaaccaaccaatgc gcgaatgaggccccat
ggcaagccacatctcttgacacaaagggcatggcagctgatatgttctggcaatacggagacactttga gtacgggacaatcgcc
gaatgatgggaacacaatttattacggtacggatacatttacttgtattgtgacggaccatattgcggc aatttgatga
本發(fā)明通過(guò)PCR的方法分離克隆了甘露聚糖酶基因Man5Cl，DNA全序列分析結(jié)果表明，甘露聚糖酶Man5Cl基因man5Cl全長(zhǎng)1473bp。其中，信號(hào)肽的堿基序列為
ATGAGGACGACGATCCTTCTTGCCAGTACCCTTCTGGGTCACTCCGTTTCGGCT(SEQ ID NO. 6)。
成熟的甘露聚糖酶Man5Cl的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
SEQ ID NO. 5
Cagaccacttccggtctaagaagtacaggtaccgccacaactacgacctcttctacgttgacaacgaca acctccaagacaacat
catccacatcaaaaacgacttctagttcgaccactacatcagctccgacttcaaccggcttttctaaag tcaatggcctcaactttacg
atcgatggagaaacaaactactttgtgagaaccaacacctactggcttgcattcttgaacaataacagt gatgtcgacctagtcctca
gcgatattgcagcatctggtatgaagattctccgagtctggggtttcaacgacgtcaacactgttccct ctgccggaactgtttacttc
caactccttgcaaatggcacagcaacaatcaatacaggtgctgatggtcttgagaagttggactacgtt gtaagctcagctgaagc
ccatggaatcaaattgatcattccttttgtcaataactggagtgactatggaggaatggctgcatatgt cactgcttttggaggttcaca
gaccacttggtacaccaacaccgcggctcaagcagcataccaagcatacatcaaggccgtggtcagtcg gtatagcteatcgcc
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gtgcttacatcaaatctctcgattcgaaccacatggtcaccactggtattgagggttttggtcttgatg ccggatcagacggttcatat
ccatacacatatggcgagggaacaaactttacagcactcctatccattcctgacatcgacttcggtact attcacttgtatccggatag
ctggggcgaagttttaagctggggcagcagctgggtcttgacccacggagcagcctgtgcatctatcgg caaaccatgcattctc
gaagaattcggaacatcaaccaaccaatgcgcgaatgaggccccatggcaagccacatctcttgacaca aagggcatggcagc
tgatatgttctggcaatacggagacactttgagtacgggacaatcgccgaatgatgggaacacaattta ttacggtacggatacattt
acttgtattgtgacggaccatattgcggcaatttga
成熟蛋白理論分子量為41. 2kDa，將甘露聚糖酶基因man5Cl序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，該基因與來(lái)源于A(yíng)spergillus aculeatus的甘露聚糖酶氨基酸序列一致性為57. 8%。說(shuō)明Man5Cl是一種新的甘露聚糖酶。
本發(fā)明還提供了包含上述高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl的重組載體，優(yōu)選為 pPIC-Man5Cl。將本發(fā)明的甘露聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案， 優(yōu)選為將本發(fā)明的甘露聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的5naB I和Not I限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于A(yíng)OXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9_man5Cl。
本發(fā)明還提供了包含上述高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株GS115/man5Cl。
本發(fā)明還提供了一種制備高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl的方法，包括以下步驟
1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組甘露聚糖酶表達(dá)；
3)回收并純化所表達(dá)的甘露聚糖酶Man5Cl。
其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichia past0ris)GS115，得到重組菌株GS115/ man5Cl。
本發(fā)明還提供了上述高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl的應(yīng)用。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在飼料、食品工業(yè)中應(yīng)用新的甘露聚糖酶。本發(fā)明的甘露聚糖酶最適PH為4.0，在 PH3. 0 7. 0都有較高的酶活性；pH穩(wěn)定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力。本甘露聚糖酶在人工瘤胃模擬試驗(yàn)中穩(wěn)定，可應(yīng)用到飼料添加劑當(dāng)中，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展有著重要的意義。 此外，Man5Cl可有效降解半乳甘露聚糖與葡萄甘露聚糖，而不降解木聚糖與微晶纖維素鈉， 可以有效降解漂白紙漿中的甘露聚糖部分而不影響纖維素。因此，本甘露聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用也顯示出其巨大的潛力。


圖1重組甘露聚糖酶的最適pH。
圖2重組甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性。
圖3重組甘露聚糖酶的最適溫度。
圖4重組甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
青霉Cl (Penicillium sp. Cl)于2010年12月7日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所， 100101)，其保藏號(hào)為CGMCCNo. 4432。
具體實(shí)施方式
試驗(yàn)材料和試劑
1、菌株及載體本發(fā)明從青霉(Penicillium sp. Cl CGMCC 4432)。畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及菌株GSl 15購(gòu)自于hvitrogen公司。
2、酶類(lèi)及其它生化試劑內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自hvitrogen公司。 角豆膠購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到)。
3、培養(yǎng)基
(I)Penicillium sp. Cl CGMCC 4432培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基IOOOmL馬鈴薯汁， IOg葡萄糖，25g瓊脂，pH3. 0。
(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)。
(3) BMGY 培養(yǎng)基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。
(4)BMMY培養(yǎng)基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4. 0。
說(shuō)明以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
實(shí)施例1 青霉 Penicillium sp. CICGMCC 4432 產(chǎn)酶特性
將來(lái)源于云南某礦的鈾礦廢水樣品經(jīng)富集培養(yǎng)后(富集培養(yǎng)基(NH4)2S045g/L, KH2PO4lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. Olg/L, CaCl2O. 2g/L，玉米芯粉 0. 5%，麩皮0. 5%, ρΗ2· 5)，按常規(guī)稀釋后涂布于產(chǎn)酶培養(yǎng)基((NH4)2S045g/L, KH2PO4lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 01g/L，CaCl2O. 2g/L，角豆膠 0. 5%，1. 5%瓊脂糖，pH 2. 5)平板上， 30°C培養(yǎng)5 6d，挑取產(chǎn)生透明圈菌落在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板劃線(xiàn)分離，重復(fù)劃線(xiàn)分離過(guò)程3 輪，使菌株純化。通過(guò)此方法篩選到該分泌木聚糖酶的菌株。產(chǎn)透明圈最大的菌株經(jīng)劃線(xiàn)分離純化后定名為Cl，經(jīng)18SrDNA鑒定該菌株為瓶霉，命名為Penicillium sp.Cl。
實(shí)施例2青霉Penicillium sp. C1CGMCC4432甘露聚糖酶編碼基因man5Cl的克隆
提取青霉Penicillium sp. CICGMCC 4432 基因組 DNA
將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無(wú)菌濾紙過(guò)濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。
根據(jù)第五家族甘露聚糖酶基因的保守(NNWSDYGG和AWELGNEP)序列設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物Pl，P2
Pl 5' -AAYAAYTGGGAYGAYTWYGGNGG-3‘；
P2 5' -GGYTCRYYNSCNARYTCCCANGC-3‘。
以Penicillum sp. Cl CGMCC 4432總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為 94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，50°C降落45°C (每個(gè)循環(huán)降落0. 5°C )退火30sec， 72°C延伸30s，10個(gè)循環(huán)后接著94°C變性30s，45°C退火30s，72°C延伸30s，一共30個(gè)循環(huán)， 72°C保溫lOmin。得到一約176bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
根據(jù)測(cè)序得到的核苷酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離沒(méi)有嚴(yán)格規(guī)定，引物長(zhǎng)度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl，卿2，usp3(上游特異性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特異性引物)見(jiàn)表1。
表1.甘露聚糖酶Man5ClTAIL_PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl，其特征在于，序列SEQIDNO. 1在 N端包含信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.—種高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl。
4.如權(quán)利要求3所述的高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl，其特征在于，其堿基序列如 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
5.如權(quán)利要求3所述的高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl，其特征在于，所述高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl包括信號(hào)肽序列，所述序列如SEQ ID NO. 6所示。
6.包含權(quán)利要求3所述高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl的重組載體。
7.包含權(quán)利要求3所述高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl的重組載體pPIC-man5Cl。
8.包含權(quán)利要求3所述高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl的重組菌株。
9.一種制備高溫酸性甘露聚糖酶基因man5Cl的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求6的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組甘露聚糖酶表達(dá)；3)回收并純化所表達(dá)的甘露聚糖酶Man5Cl。
10.權(quán)利要求1所述高溫酸性甘露聚糖酶Man5Cl的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高溫酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來(lái)源于青霉屬Penicillium sp.C1 CGMCC 4432的甘露聚糖酶Man5C1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述甘露聚糖酶的編碼基因man5C1。本發(fā)明的木聚糖酶的具有以下性質(zhì)最適pH4.0，最適溫度70℃，比活為1035U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解角豆膠半乳甘露聚糖以及易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于飼料，食品等。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102533698SQ20101062190
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國(guó), 王亞茹, 石鵬君, 羅會(huì)穎, 蔡紅英, 袁鐵錚, 趙珩, 黃火清 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所