專利名稱：渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總DNA的提取和檢測方法，屬于微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普洱熟茶是以云南特有大葉茶[Camellia sinensis (Linn) var. assamica(Masters)Kitamura]的曬青毛茶為原料，在微生物的作用下，經(jīng)快速的人工渥堆后發(fā)酵而成的后發(fā)酵茶類。微生物在普洱茶的渥堆發(fā)酵生產(chǎn)過程中起著重要的作用，離開了微生物，普洱茶的品質(zhì)和風(fēng)味將得不到保證，本發(fā)明研究了渥堆發(fā)酵普洱茶中的優(yōu)勢微生物菌群。目前渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物的研究，主要是應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分離、純化、鑒定等方法。傳統(tǒng)的研究方法是首先從特定樣品中取樣，采用模擬自然環(huán)境的各種培養(yǎng)基和條件進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過純培養(yǎng)獲得菌株后，再對其表型特征、細(xì)胞的性質(zhì)(形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)的觀察)進(jìn)行觀察收集，同時(shí)進(jìn)行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)，才能對其特性進(jìn)行描述，這種方法又被稱作經(jīng)典方法。應(yīng)用傳統(tǒng)方法可以分離培養(yǎng)的微生物不一定是優(yōu)勢菌群，只是它們適合并能夠在人工培養(yǎng)條件下被分離純化，不能動(dòng)態(tài)反映大曲微生物菌群的生長狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上，普洱茶微生物研究仍停留在細(xì)胞水平，主要研究細(xì)菌、霉菌、酵母和放線菌單一的菌落形態(tài)和純種的生長特性。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上，不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不能獲得微生物多樣性的真正概貌。因此傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)的方法制約了人們對微生物生態(tài)的客觀認(rèn)識(shí)，對于人們正確認(rèn)識(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，正確認(rèn)識(shí)微生物資源，正確開發(fā)并利用這些資源造成了嚴(yán)重的障礙。變性梯度凝膠電泳(DGGE)最初被用于基因的突變檢測，任意位點(diǎn)的單堿基突變的DNA片段和原始的DNA片段能被分開，經(jīng)過序列測定和比較就可以找出突變的位點(diǎn)。變性梯度凝膠電泳對不同DNA片段的分離原理是變性梯度凝膠電泳(DGGE)中同樣長度但具有不同序列的DNA片段能夠被分離，因?yàn)樵诤谐示€形增加梯度變性劑(尿素和甲酞胺) 的混合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解鏈行為，將在凝膠的不同位置停止遷移。變性梯度凝膠電泳 (DGGE)自1993年以來被用于環(huán)境微生物領(lǐng)域來研究環(huán)境樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，它是建立在PCR反應(yīng)對環(huán)境樣品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因區(qū)間的DNA片斷的擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，這些被擴(kuò)增出的DNA片斷可以代表所有不同微生物的信息，這些使用同一引物對擴(kuò)增出的不同微生物的DNA片斷具有相同的堿基數(shù)，因此一般的電泳無法將它們分離開，這就為后續(xù)的進(jìn)一步研究提出了新的問題。由于變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以將不同堿基順序的相同大小的DNA片段予以分離，所以 PCR-DGGE可以對環(huán)境樣品中的微生物群落進(jìn)行研究。然而渥堆發(fā)酵普洱茶與城市污水廠污泥和農(nóng)田土壤的化學(xué)、物理性質(zhì)高度異質(zhì)，微生物數(shù)量和種群分布也明顯不同，這就決定了不同環(huán)境下的樣品在進(jìn)行微生物群落構(gòu)成分析時(shí)存在差異。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行渥堆發(fā)酵普洱茶微生物群落構(gòu)成研究的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種提取渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總DNA的方法。本發(fā)明根據(jù)普洱茶渥堆發(fā)酵的特性，結(jié)合土壤、污泥樣品微生物DNA提取方法，摸索出一種適用于提取渥堆發(fā)酵普洱茶微生物總DNA的方法。得到的微生物總DNA能全面的包括在普洱茶發(fā)酵過程中的微生物種類，能克服傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)不能得到不可培養(yǎng)微生物的缺陷。本發(fā)明提供一種從渥堆發(fā)酵普洱茶中提取分離微生物總DNA的方法，該方法包括以下步驟1)取不同發(fā)酵過程中的普洱茶樣品；2)對提取的普洱茶樣品進(jìn)行預(yù)處理；3)提取預(yù)處理后樣品中微生物的總DNA ；4)將提取的微生物總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；5)以提取的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增后的總 DNA ；其中，步驟1中所述不同發(fā)酵過程為在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中以每次翻堆為時(shí)間點(diǎn)取堆中不同空間位置的茶葉樣品。步驟2中所述預(yù)處理包括取茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨得到粉末。步驟3中所述的提取方法如下預(yù)處理的樣品，使用Omega soil DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，操作步驟根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行。步驟5中所述的專用引物為第一步擴(kuò)增采用的引物為16sl 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘和 16s2 :5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‘。第二步擴(kuò)增采用的引物為338fGC:5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，禾口 R518 5 ’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’以上引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系為37uLddH20，5uL 10*反應(yīng)緩沖液，2uL PCR引物Pl,2uLPCR引物P2，2uLdNTP, IuLTaq酶，IuL模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸90s，30個(gè)循環(huán) 72°C終延伸lOmin。得到大曲微生物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，電泳緩沖液為IxTAE緩沖液。步驟4中所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的在于確定總DNA的譜圖，所用方法采用常規(guī)技術(shù)，包括制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度為30% 60%。使用的電泳緩沖液為ΙχΤΑΕ，電壓150V，60°C，電泳8h，sybrgreen染色20min。得瓊脂糖凝膠電泳圖譜，通過該圖可分析比較渥堆發(fā)酵普洱茶微生物種群多樣性程度。本發(fā)明具體的操作步驟見實(shí)施例。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
1、本發(fā)明可以用于得到普洱茶渥堆發(fā)酵過程中的所有微生物種類的總DNA2、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短，得到的微生物總DNA可排除茶葉中眾多的復(fù)雜化合物的干擾，無需純化可直接用于后續(xù)的生產(chǎn)和研究。


圖1提取的總DNA的瓊脂糖凝膠電泳2PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3DGGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1對的渥堆發(fā)酵普洱茶進(jìn)行取樣，取不同翻堆次數(shù)和不同堆放位置的渥堆發(fā)酵普洱茶，對細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)分析和優(yōu)勢菌群的確定步驟如下1)取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入200mg玻璃珠。使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul SLX溶液， 高速振蕩IOmin混合均勻，70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置aiiin， 13000g離心aiiin，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入 HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA 柱子中，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個(gè)新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash 溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一個(gè)新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g離心lmin。將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心 2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測2)PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測，第一步擴(kuò)增采用的引物為16sl 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘和 16s2:5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3 ‘。第二步擴(kuò)增采用的引物為338fGC 5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，禾口 R518 5 ’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’由上海英駿生物技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系為37uLddH20，5uL 10*反應(yīng)緩沖液， 2uLPCR 引物 Pl，2uLPCR 引物 P2，2uLdNTP, IuLTaq 酶，IuL 模板。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?94°C 預(yù)變性5min ；94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸90s，30個(gè)循環(huán)72°C終延伸 IOmin0得到大曲微生物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，電泳緩沖液為 IxTAE緩沖液。3) DGGE電泳分離制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度提高為30% 60%。使用的電泳緩沖液為IxTAE,電壓150V, 60 ，電泳8h，sybrgreen染色20min。得DGGE圖譜，見圖3DGGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。通過該圖可分析比較渥堆發(fā)酵普洱茶微生物種群多樣性程度。
權(quán)利要求
1.一種從渥堆發(fā)酵普洱茶中提取分離微生物總DNA的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)取不同發(fā)酵過程中的普洱茶樣品；2)對提取的普洱茶樣品進(jìn)行預(yù)處理；3)提取預(yù)處理后樣品中微生物的總DNA；4)將提取的微生物總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；5)以提取的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增后的總DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟1中所述不同發(fā)酵過程為在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中以每次翻堆為時(shí)間點(diǎn)取堆中不同空間位置的茶葉樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟2中所述預(yù)處理包括取茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨得到粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟3中所述的提取方法如下預(yù)處理的樣品，使用Omega soil DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，操作步驟根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟5中所述的專用引物為第一步擴(kuò)增采用的引物為16sl :5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘ 和16s2 5 ‘ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‘，第二步擴(kuò)增采用的引物為338fGC 5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，和 R518 5， -ATTACCGCGGCTGCTGG-3‘
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中PCR反應(yīng)體系為37uLddH20，5uL10* 反應(yīng)緩沖液，2uL PCR引物Pl，2uLPCR引物P2，2uLdNTP, IuLTaq酶，IuL模板，PCR擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸90s，30個(gè)循環(huán) 72°C終延伸lOmin，得到大曲微生物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，電泳緩沖液為IxTAE緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟4中所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的在于確定總DNA的譜圖，所用方法采用常規(guī)技術(shù)，包括制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度為30% 60%，使用的電泳緩沖液為ΙχΤΑΕ，電壓150V，60°C，電泳8h， sybrgreen染色20min，得瓊脂糖凝膠電泳圖譜，通過該圖可分析比較渥堆發(fā)酵普洱茶微生物種群多樣性程度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，包括以下步驟1)取不同發(fā)酵過程中的普洱茶樣品在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中以每次翻堆為時(shí)間點(diǎn)取堆中不同空間位置的茶葉樣品來測動(dòng)態(tài)的微生物的群落構(gòu)成；2)對提取的普洱茶樣品進(jìn)行預(yù)處理取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到 2ml離心管中；3)提取預(yù)處理后樣品中微生物的總DNA加入200mg玻璃珠，使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻， 70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin， 棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入HTR溶液處理，加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA柱子中，IOOOOg離心lmin， 棄去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個(gè)新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，IOOOOg 離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一個(gè)新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴IOmin, 13000g離心IminJf 離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心aiiin，所得洗脫液即為提取好的微生物總DNA ；4)將提取的微生物總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測以每個(gè)樣品5ul的上樣量在 0. 8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測樣品總DNA，電泳條件為120v，30min ；5)以提取的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用16s引物序列為 338f :ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, r518 :ATTACCGCGGCTGCTGG ；所用 18s 引物序列為 GLOL GCCTGCTTTAAACACTCTA, NS31 TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC, PCR 反應(yīng)體系為 37uLddH20，5uL 10* 反應(yīng)緩沖液，2uL PCR 引物 Pl,2uLPCR 引物 P2, 2uLdNTP, IuLTaq 酶，IuL 模板，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸90s，30個(gè)循環(huán)72°C終延伸IOmin ；6)將PCR擴(kuò)增好的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測以每個(gè)樣品5ul的上樣量在的瓊脂糖凝膠上電泳檢測PCR擴(kuò)增片段，電泳條件為120v，25min。
全文摘要
本發(fā)明涉及了渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總DNA的提取方法，該方法包括以下步驟1)取不同發(fā)酵過程中的普洱茶樣品；2)對提取的普洱茶樣品進(jìn)行預(yù)處理；3)提取預(yù)處理后樣品中微生物的總DNA；4)將提取的微生物總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；5)以提取的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；6)將PCR擴(kuò)增好的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102559655SQ20101062276
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉冰, 張長霞, 李季, 李巍, 李長文, 梁慧珍, 閆希軍 申請人:云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司