專利名稱：普洱茶微生物菌群中的優(yōu)勢細菌及其譜圖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定普洱茶渥堆發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌菌群結(jié)構(gòu)的鑒定方法及其專用引物和DGGE指紋譜圖。
背景技術(shù)：
普洱熟茶是以云南特有大葉茶[Camellia sinensis (Linn) var. assamica(Masters)Kitamura]的曬青毛茶為原料，在微生物的作用下，經(jīng)快速的人工渥堆后發(fā)酵而成的后發(fā)酵茶類。微生物在普洱茶的渥堆發(fā)酵生產(chǎn)過程中起著重要的作用，離開了微生物，普洱茶的品質(zhì)和風(fēng)味將得不到保證，本發(fā)明研究了渥堆發(fā)酵普洱茶中的優(yōu)勢微生物菌群，并提供了鑒定方法，如果將這些優(yōu)勢菌群用于普洱茶的渥堆發(fā)酵生產(chǎn)過程，將有利于普洱茶的生產(chǎn)和提高質(zhì)量。目前，渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物的研究，主要是應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分離、純化、鑒定等方法。傳統(tǒng)的研究方法是首先從特定樣品中取樣，采用模擬自然環(huán)境的各種培養(yǎng)基和條件進行分離培養(yǎng)，通過純培養(yǎng)獲得菌株后，再對其表型特征、細胞的性質(zhì)(形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)和細胞組成成分結(jié)構(gòu)的觀察)進行觀察收集，同時進行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化實驗，才能對其特性進行描述，這種方法又被稱作經(jīng)典方法。應(yīng)用傳統(tǒng)方法可以分離培養(yǎng)的微生物不一定是優(yōu)勢菌群，只是它們適合并能夠在人工培養(yǎng)條件下被分離純化，不能動態(tài)反映大曲微生物菌群的生長狀態(tài)。在實驗技術(shù)上，普洱茶微生物研究仍停留在細胞水平，主要研究細菌、霉菌、酵母和放線菌單一的菌落形態(tài)和純種的生長特性。在實驗結(jié)果上，不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不能獲得微生物多樣性的真正概貌。因此傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)的方法制約了人們對微生物生態(tài)的客觀認識，對于人們正確認識微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，正確認識微生物資源，正確開發(fā)并利用這些資源造成了嚴重的障礙。變性梯度凝膠電泳(DGGE)最初被用于基因的突變檢測，任意位點的單堿基突變的DNA片段和原始的DNA片段能被分開，經(jīng)過序列測定和比較就可以找出突變的位點。變性梯度凝膠電泳對不同DNA片段的分離原理是變性梯度凝膠電泳(DGGE)中同樣長度但具有不同序列的DNA片段能夠被分離，因為在含有呈線形增加梯度變性劑(尿素和甲酞胺) 的混合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解鏈行為，將在凝膠的不同位置停止遷移。變性梯度凝膠電泳 (DGGE)自1993年以來被用于環(huán)境微生物領(lǐng)域來研究環(huán)境樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，它是建立在PCR反應(yīng)對環(huán)境樣品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因區(qū)間的DNA片斷的擴增的基礎(chǔ)上，這些被擴增出的DNA片斷可以代表所有不同微生物的信息，這些使用同一引物對擴增出的不同微生物的DNA片斷具有相同的堿基數(shù)，因此一般的電泳無法將它們分離開，這就為后續(xù)的進一步研究提出了新的問題。由于變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以將不同堿基順序的相同大小的DNA片段予以分離，所以 PCR-DGGE可以對環(huán)境樣品中的微生物群落進行研究。
然而，渥堆發(fā)酵普洱茶與城市污水廠污泥和農(nóng)田土壤的化學(xué)、物理性質(zhì)高度異質(zhì)， 微生物數(shù)量和種群分布也明顯不同，這就決定了不同環(huán)境下的樣品在進行微生物群落構(gòu)成分析時存在差異。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于運用PCR-DGGE技術(shù)進行渥堆發(fā)酵普洱茶微生物群落構(gòu)成研究的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
為提高普洱茶質(zhì)量和提高普洱茶產(chǎn)量，本發(fā)明研究了普洱茶渥堆發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌菌群的鑒定方法，本發(fā)明通過提取全部細菌菌群中的DNA并從中分離出優(yōu)勢細菌菌群的DNA，測定優(yōu)勢細菌菌群的DNA結(jié)構(gòu)，和標準細菌菌群比較，得到詳細的優(yōu)勢細菌菌群的種類和名稱。本發(fā)明提供一種普洱茶渥堆發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌菌群的鑒定方法。本發(fā)明的鑒定方法，包括以下步驟1)取渥堆發(fā)酵過程中不同翻堆次數(shù)和位置的普洱茶作為待測樣品；2)提取待測樣品的總DNA，并對其進行純化；3)以待測樣品的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后， 對目的片段進行回收及純化；4)對純化的目的片段進行變性梯度凝膠電泳，染色后得到DGGE指紋圖譜；5)從凝膠中回收優(yōu)勢條帶，并以此為模板，在上游引物338F 5 ‘ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，；下游引物 R518 5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，，引導(dǎo)下進行 PCR擴增，擴增結(jié)束后，對目的片段進行回收，純化及測序；6)步驟5的測序結(jié)果和標準菌群的序列進行比對，確定渥堆發(fā)酵普洱茶的優(yōu)勢細菌菌群。其中，步驟2)的DNA提取采用試劑盒法，具體的操作步驟為取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入200mg玻璃珠。使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻， 70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin， 棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴 20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA柱子中，IOOOOg離心lmin， 棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，IOOOOg 離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一個新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴lOmin, 13000g離心lmin。 將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測。所述步驟幻進行兩步擴增，其中的專用引物為——第一步擴增采用的引物為16sl 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘和 16s2:5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‘，第二步擴增采用的引物為338fGC 5' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3，和 R518 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3，，所述步驟幻中的PCR擴增條件為巢式PCR擴增先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進行第一步擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s， 50°C _55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標進行擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50_55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)30-35 次，72°C終延伸IOmin0所述步驟4)中的染色液為sybrgreen，濃度為1 10000稀釋原液，1 X TAE緩沖液，染色時間為20-40min，得DGGE圖譜。所述步驟4)中的DGGE電泳分離，合適的電泳條件為使用Bio-Rad公司的Dcode 基因突變檢測系統(tǒng)在80-120V，60°C下電泳8-14h，變性膠為聚丙烯酰胺凝膠，含有尿素和甲酰胺等變性劑，變性劑濃度范圍為從35%到60%，膠濃度為8-10%。所述步驟幻在紫外燈下將優(yōu)勢條帶用無菌手術(shù)刀小心割下，并在銀染圖譜中標記相應(yīng)位置，經(jīng)無菌水沖洗3遍后放入1. 5mLEP管中，用滅菌槍頭搗碎，加入30ul ddH20 浸泡5小時。將EP管12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的針對 16S rDNA v3 區(qū)片段設(shè)計的特異引物 338f :5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，R518 5‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3‘的引導(dǎo)下，進行PCR擴增，50ul PCR反應(yīng)體系為10ng的DNA模板(一般用 1 μ 1)、50pmol 每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1 的 10XPCR buffer,2. 5mmol/L 的 MgCl2、3U的Taq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補足50 μ 1。采用巢式PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性4min,然后在94°C變性45s, 50°C引物復(fù)性45s, 72°C引物延伸1. 5min,循環(huán)30次，72°C 終延伸IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后取3pl反應(yīng)產(chǎn)物進行2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，用CyC Ie-Pure DNA試劑盒對目的片段進行回收及純化，并進行測序。測序由上海英駿生物技術(shù)公司進行。步驟6)中可采用 Blast 程序在線(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)對測序結(jié)果進行序列比對分析，確定渥堆發(fā)酵普洱茶優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)。本發(fā)明步驟3和步驟5中所述的引物為現(xiàn)有技術(shù)，可以買到，也可以通過現(xiàn)有技術(shù)合成。本發(fā)明所述的鑒定方法具有以下優(yōu)點1、免培養(yǎng)高效提取微生物總DNA ；2、結(jié)合Bio-ID++軟件對優(yōu)勢菌群進行半定量分析，以及通過測序比對完成的菌群定性分析，結(jié)果準確，可靠，逐步克服了常規(guī)的人工培養(yǎng)法對普洱茶菌群結(jié)構(gòu)進行分析的不足；3、從DGGE譜圖上可以直觀地看到優(yōu)勢細菌菌群條帶，具體代表性?；谏鲜鰞?yōu)點，本發(fā)明將在普洱茶優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)的分析中發(fā)揮巨大作用


圖1、普洱茶渥堆發(fā)酵過程中細菌的PCR-DGGE譜圖
具體實施例方式通過以下具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1、鑒定方法一、準備樣品對的發(fā)酵普洱茶進行取樣，按照不同翻堆次數(shù)以及在堆中的不同位置點取樣，本實驗用的是在取樣。二、總DNA的提取及純化取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入200mg玻璃珠。 使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min， 13000g離心aiiin，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入 HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA 柱子中，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash 溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一個新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴lOmin，13000g離心lmin。將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心 2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測三、PCR擴增及產(chǎn)物回收、純化對純化后的DNA進行PCR擴增，第一步擴增采用的引物為16sl 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘和 16s2:5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‘。第二步擴增采用的引物為338fGC :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3，和R518 5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，，以上引物全部由上海英駿生物技術(shù)公司合成。先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進行第一步擴增，50 μ 1的PCR反應(yīng)體系組成如下:10ng的DNA模板(一般用1μ l)、50pmol每種引物、1μ 1 dNTPs、5y 1的10XPCR buffer,2. 5mmol/L的MgCl2,5U的TaqDNA聚合酶，適量的雙蒸水補足50 μ 1。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標進行擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，55°C引物復(fù)性 45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)35次，72°C終延伸lOmin，目的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。四、變性梯度凝膠電泳(DGGE)及凝膠成像掃描與分析采用DC0DE 系統(tǒng)(BIO-RAD)構(gòu)建DGGE指紋圖譜，具體方法為，將各樣品16S rDNAv3區(qū)擴增純化產(chǎn)物在10%聚丙烯變性膠中分離(丙烯酞胺濃度35% -60%，電泳緩沖液 0. 5-lx TAE)，100V, 12h，樣品點樣量 IOOOng DNA。
五、優(yōu)勢條帶的回收、測序與序列比對分析在紫外燈下將優(yōu)勢條帶用無菌手術(shù)刀小心割下，并在銀染圖譜中標記相應(yīng)位置， 經(jīng)無菌水沖洗3遍后放入1.5mLEP管中，用滅菌槍頭搗碎，加入30ul dd H2O浸泡5小時。將 EP管12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的針對16S rDNA v3區(qū)片段設(shè)計的特異引物 338f :5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，R518 :5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3， 的引導(dǎo)下，進行PCR擴增，50ul PCR反應(yīng)體系為10ng的DNA模板(一般用1μ1)、50ρπιΟ1 每種引物、Ιμ dNTPs、5y 1 的 10XPCR buffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2、3U 的 iTaq DNA 聚合酶，適量的雙蒸水補足50 μ 1。采用巢式PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性 45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1.5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后取3pl反應(yīng)產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用CyC Ie-Pure DNA試劑盒對目的片段進行回收及純化，并進行測序。測序由上海英駿生物技術(shù)公司進行。采用Blast 程序在線(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)進行序列比對分析，分析結(jié)果見表1表1普洱茶渥堆發(fā)酵過程中DGGE指紋圖譜對應(yīng)單個條帶的序列比對分析
權(quán)利要求
1.一種普洱茶渥堆發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌菌群結(jié)構(gòu)的分子鑒定方法，包括以下步驟1)取渥堆發(fā)酵過程中不同翻堆次數(shù)和位置的普洱茶作為待測樣品；2)提取待測樣品的總DNA，并對其進行純化；3)以待測樣品的總DNA為模板，在專用引物——第一步擴增采用的引物為16sl 5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘和 16s2:5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3 ‘，第二步擴增采用的引物為338fGC :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAG GCAGCAGHP R518 5 ‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘,的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，對目的片段進行回收及純化；4)對純化的目的片段進行變性梯度凝膠電泳，染色后得到DGGE指紋圖譜；5)從凝膠中回收優(yōu)勢條帶，并以此為模板，在上游引物338F 5 ‘-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，；下游引物 R518 :5，ATTACCGCGGCTGCTGG_3，，引導(dǎo)下進行 PCR 擴增，擴增結(jié)束后，對目的片段進行回收，純化及測序；6)步驟5的測序結(jié)果和標準菌群的序列進行比對，確定渥堆發(fā)酵普洱茶的優(yōu)勢細菌菌群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟幻的DNA提取采用試劑盒法，具體的操作步驟為取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入 200mg玻璃珠，使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2 溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入HTR溶液處理，加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到 HiBind DNA柱子中，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液， IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一個新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g離心lmin，將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴IOmin, 13000g離心2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟幻中的PCR擴增條件巢式 PCR擴增先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進行第一步擴增，PCR反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30 次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標進行擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，55°C引物復(fù)性45s， 72°C引物延伸lmin，循環(huán)35次，72°C終延伸IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟4)中的染色液為 sybrgreen,濃度為1 10000稀釋原液，IXTAE緩沖液，染色時間為20_40min，得DGGE圖譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟4)中的DGGE電泳分離，合適的電泳條件為使用Bio-Rad公司的Dcode基因突變檢測系統(tǒng)在80-120V，60°C下電泳 8-14h，變性膠為聚丙烯酰胺凝膠，含有尿素和甲酰胺等變性劑，變性劑濃度范圍為從35 % 到60%，膠濃度為8-10%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟6)中采用Blast程序在線對測序結(jié)果進行序列比對分析，確定渥堆發(fā)酵普洱茶優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，包括以下步驟1)發(fā)酵普洱茶進行取樣，按照不同翻堆次數(shù)以及在堆中的不同位置點取樣；2)取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入200mg玻璃珠， 使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min， 13000g離心aiiin，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入 HTR溶液處理，加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA 柱子中，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash 溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一個新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴lOmin，13000g離心lmin，將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心 2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測；3)對純化后的DNA進行PCR擴增，第一步擴增采用的引物為16sl 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘和 16s2 :5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‘，第二步擴增采用的引物為338fGC :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3，和R518 5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，，以上引物全部由上海英駿生物技術(shù)公司合成，先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進行第一步擴增，50 μ 1的PCR反應(yīng)體系組成如下=IOng 的 DNA 模板(一般用 1μ l)、50pmol 每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1 的 10XPCR buffer、2. 5mmol/L的MgCl2、5U的Taq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補足50 μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標進行擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，55°C引物復(fù)性 45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)35次，72°C終延伸lOmin，目的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為IXTAE緩沖液；4)采用DC0DE 系統(tǒng)(BIO-RAD)構(gòu)建DGGE指紋圖譜，具體方法為，將各樣品16S rDNAv3區(qū)擴增純化產(chǎn)物在10%聚丙烯變性膠中分離(丙烯酞胺濃度35% -60%，電泳緩沖液 0. 5-lx TAE)，100V, 12h，樣品點樣量 IOOOng DNA ；5)在紫外燈下將優(yōu)勢條帶用無菌手術(shù)刀割下，并在銀染圖譜中標記相應(yīng)位置，經(jīng)無菌水沖洗3遍后放入1. 5mLEP管中，用滅菌槍頭搗碎，加入30ul ddH20浸泡5小時，將EP管 12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的針對16S rDNAv3區(qū)片段設(shè)計的特異引物 338f 5‘ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3‘, R518 5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，的引導(dǎo)下，進行PCR擴增，50ul PCR反應(yīng)體系為:10ng的DNA模板、50pmol每種引物、1μ 1 dNTPs、 5μ1的10XPCR buffer、2. 5匪ol/L的MgCl2、3U的iTaq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補足 50 μ 1，采用巢式PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s， 72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后取3pl反應(yīng)產(chǎn)物進行2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用CyC Ie-Pure DNA試劑盒對目的片段進行回收及純化，并進行測序，測序由上海英駿生物技術(shù)公司進行；6)步驟5的測序結(jié)果和標準菌群的序列進行比對，確定渥堆發(fā)酵普洱茶的優(yōu)勢細菌菌群，采用Blast程序在線進行序列比對分析。
8.權(quán)利要求1中步驟3采用的專用引物，其特征在于，第一步擴增采用的引物為16sl 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘和 16s2 :5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‘，第二步擴增采用的引物為338fGC :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3，和 R518 :5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。
9.權(quán)利要求1中步驟3采用的專用引物，其特征在于，上游引物338F:序列為 5 '-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，。
10.權(quán)利要求1中步驟5采用的專用引物，其特征在于，下游引物R518:序列為 5， -ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種普洱茶渥堆發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌菌群結(jié)構(gòu)的分子鑒定方法，包括以下步驟1)取渥堆發(fā)酵過程中不同翻堆次數(shù)和位置的普洱茶作為待測樣品；2)提取待測樣品的總DNA，并對其進行純化；3)以待測樣品的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，對目的片段進行回收及純化；4)對純化的目的片段進行變性梯度凝膠電泳，染色后得到DGGE指紋圖譜；5)從凝膠中回收優(yōu)勢條帶，并以此為模板，在上游引物338F和下游引物R518引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，對目的片段進行回收，純化及測序；6)步驟5的測序結(jié)果和標準菌群的序列進行比對，確定渥堆發(fā)酵普洱茶的優(yōu)勢細菌菌群。
文檔編號C12Q1/68GK102533964SQ20101062276
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉冰, 張長霞, 李季, 李巍, 李長文, 梁慧珍, 閆希軍 申請人:云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司