專利名稱：普洱茶微生物菌群中的優(yōu)勢(shì)真菌及其譜圖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌菌群的鑒定方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
普洱熟茶是以云南特有大葉茶[Camellia sinensis (Linn) var. assamica(Masters)Kitamura]的曬青毛茶為原料，在微生物的作用下，經(jīng)快速的人工渥堆后發(fā)酵而成的后發(fā)酵茶類。微生物在普洱茶的渥堆發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中起著重要的作用，離開(kāi)了微生物，普洱茶的品質(zhì)和風(fēng)味將得不到保證，本發(fā)明研究了渥堆發(fā)酵普洱茶中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群，并提供了鑒定方法，如果將這些優(yōu)勢(shì)菌群用于普洱茶的渥堆發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，將有利于普洱茶的生產(chǎn)和提高質(zhì)量。目前渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物的研究，主要是應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分離、純化、鑒定等方法。傳統(tǒng)的研究方法是首先從特定樣品中取樣，采用模擬自然環(huán)境的各種培養(yǎng)基和條件進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過(guò)純培養(yǎng)獲得菌株后，再對(duì)其表型特征、細(xì)胞的性質(zhì)(形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)的觀察)進(jìn)行觀察收集，同時(shí)進(jìn)行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)，才能對(duì)其特性進(jìn)行描述，這種方法又被稱作經(jīng)典方法。應(yīng)用傳統(tǒng)方法可以分離培養(yǎng)的微生物不一定是優(yōu)勢(shì)菌群，只是它們適合并能夠在人工培養(yǎng)條件下被分離純化，不能動(dòng)態(tài)反映大曲微生物菌群的生長(zhǎng)狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上，普洱茶微生物研究仍停留在細(xì)胞水平，主要研究細(xì)菌、霉菌、酵母和放線菌單一的菌落形態(tài)和純種的生長(zhǎng)特性。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上，不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不能獲得微生物多樣性的真正概貌。因此傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)的方法制約了人們對(duì)微生物生態(tài)的客觀認(rèn)識(shí)，對(duì)于人們正確認(rèn)識(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，正確認(rèn)識(shí)微生物資源，正確開(kāi)發(fā)并利用這些資源造成了嚴(yán)重的障礙。變性梯度凝膠電泳(DGGE)最初被用于基因的突變檢測(cè)，任意位點(diǎn)的單堿基突變的DNA片段和原始的DNA片段能被分開(kāi)，經(jīng)過(guò)序列測(cè)定和比較就可以找出突變的位點(diǎn)。變性梯度凝膠電泳對(duì)不同DNA片段的分離原理是變性梯度凝膠電泳(DGGE)中同樣長(zhǎng)度但具有不同序列的DNA片段能夠被分離，因?yàn)樵诤谐示€形增加梯度變性劑(尿素和甲酞胺) 的混合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解鏈行為，將在凝膠的不同位置停止遷移。變性梯度凝膠電泳 (DGGE)自1993年以來(lái)被用于環(huán)境微生物領(lǐng)域來(lái)研究環(huán)境樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，它是建立在PCR反應(yīng)對(duì)環(huán)境樣品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因區(qū)間的DNA片斷的擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，這些被擴(kuò)增出的DNA片斷可以代表所有不同微生物的信息，這些使用同一引物對(duì)擴(kuò)增出的不同微生物的DNA片斷具有相同的堿基數(shù)，因此一般的電泳無(wú)法將它們分離開(kāi)，這就為后續(xù)的進(jìn)一步研究提出了新的問(wèn)題。由于變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以將不同堿基順序的相同大小的DNA片段予以分離，所以 PCR-DGGE可以對(duì)環(huán)境樣品中的微生物群落進(jìn)行研究。然而渥堆發(fā)酵普洱茶與城市污水廠污泥和農(nóng)田土壤的化學(xué)、物理性質(zhì)高度異質(zhì)，微生物數(shù)量和種群分布也明顯不同，這就決定了不同環(huán)境下的樣品在進(jìn)行微生物群落構(gòu)成分析時(shí)存在差異。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行渥堆發(fā)酵普洱茶微生物群落構(gòu)成研究的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為提高普洱茶質(zhì)量和提高普洱茶產(chǎn)量，本發(fā)明研究了普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌菌群的鑒定方法，本發(fā)明通過(guò)提取全部真菌菌群中的DNA并從中分離出優(yōu)勢(shì)真菌菌群的DNA，測(cè)定優(yōu)勢(shì)真菌菌群的DNA結(jié)構(gòu)，和標(biāo)準(zhǔn)真菌菌群比較，得到詳細(xì)的優(yōu)勢(shì)真菌菌群的種類和名稱。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌菌群的鑒定方法。所述鑒定方法，包括以下步驟1)取渥堆發(fā)酵過(guò)程中不同翻堆次數(shù)和位置的普洱茶作為待測(cè)樣品；2)提取待測(cè)樣品的總DNA，并對(duì)其進(jìn)行純化；3)以待測(cè)樣品的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后， 對(duì)目的片段進(jìn)行回收及純化；4)對(duì)純化的目的片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，染色后得到DGGE指紋圖譜；5)從凝膠中回收優(yōu)勢(shì)條帶，并以此為模板，在上游引物 GeoA2 5 ‘ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘ 禾口；下游引物 Geoll 5' -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘，引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收、純化及測(cè)序；6)步驟5的測(cè)序結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)菌群的序列進(jìn)行比對(duì)，確定渥堆發(fā)酵普洱茶的優(yōu)勢(shì)真菌菌群。其中，所述步驟2)的DNA提取采用試劑盒法，具體的操作步驟為取5g茶葉樣品， 使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入200mg玻璃珠。使用Omega soil DNA提取試劑盒對(duì)處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻， 70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin， 棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴 20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA柱子中，IOOOOg離心lmin， 棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個(gè)新的收集管中，加入700ul經(jīng)無(wú)水乙醇稀釋過(guò)的SPW wash溶液，IOOOOg 離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一個(gè)新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴lOmin, 13000g離心lmin。 將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測(cè)。所述步驟3)中的專用引物，第一步擴(kuò)增采用的引物為GeoA2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘和 Geoll :5' -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘；第二步擴(kuò)增采用的引物為NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGC AAGTCTGGTGCC-3’ 和 Glol :5’ -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3，。所述步驟3)中的PCR擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增先加入擴(kuò)增18S rDNA全長(zhǎng)的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s， 50°C _55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4min,然后在94°C變性45s，50_55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)30-35次，72°C 終延伸lOmin。所述步驟4)中可先通過(guò)預(yù)試得到DGGE適宜的丙烯酰胺濃度梯度范圍及所用時(shí)間。所述步驟幻中在紫外燈下將優(yōu)勢(shì)條帶用無(wú)菌手術(shù)刀小心割下，并在銀染圖譜中標(biāo)記相應(yīng)位置，經(jīng)無(wú)菌水沖洗3遍后放入1. 5mLEP管中，用滅菌槍頭搗碎，加入30ul ddH20浸泡5小時(shí)。將EP管12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的針對(duì) 18S rDNA 片段設(shè)計(jì)的特異引物 NS31 :5，-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3，Glol 5，-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3，的引導(dǎo)下，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，50ul PCR 反應(yīng)體系為10ng 的 DNA 模板(一般用 1 μ 1)、50pmol 每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1 的 10XPCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2、3U的Taq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補(bǔ)足50 μ 1。采用巢式PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性4min,然后在94°C變性45s, 50°C引物復(fù)性45s, 72°C引物延伸1. 5min,循環(huán)30次，72°C 終延伸IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后取3pl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用CyC Ie-Pure DNA試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收及純化，并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行。所述步驟6)中可采用 Blast 程序在線(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/) 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定渥堆發(fā)酵普洱茶優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)。本發(fā)明步驟3和步驟5中所述的引物為現(xiàn)有技術(shù)，可以買到，也可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)合成。本發(fā)明還提供了普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌菌群及其DGGE譜圖。本發(fā)明所述的鑒定方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、免培養(yǎng)高效提取微生物總DNA ；2、結(jié)合Bio-ID++軟件對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行半定量分析，以及通過(guò)測(cè)序比對(duì)完成的菌群定性分析，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，逐步克服了常規(guī)的人工培養(yǎng)法對(duì)普洱茶菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的不足。3、從DGGE譜圖上可以直觀地看到優(yōu)勢(shì)真菌菌群條帶，具體代表性?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明將在普洱茶優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的分析中發(fā)揮巨大作用


圖1、普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中真菌的PCR-DGGE譜圖
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1、本發(fā)明的鑒定方法一、準(zhǔn)備樣品對(duì)發(fā)酵普洱茶進(jìn)行取樣，按照不同翻堆次數(shù)以及在堆中的不同位置點(diǎn)取樣，本實(shí)驗(yàn)用的是在取樣。二、總DNA的提取及純化取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入200mg玻璃珠。 使用Omega soil DNA提取試劑盒對(duì)處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置aiiin， 13000g離心aiiin，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入 HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA 柱子中，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個(gè)新的收集管中，加入700ul經(jīng)無(wú)水乙醇稀釋過(guò)的SPW wash溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash 溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一個(gè)新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴lOmin，13000g離心lmin。將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心 2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測(cè)三、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收、純化對(duì)純化后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第一步擴(kuò)增采用的引物為GeoA2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘和Geol 1:5' -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘。第二步擴(kuò)增采用的引物為NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGC AAGTCTGGTGCC-3，和Glol :5，-GCCTGCTTTAAACACTCTA_3，。，以上引物全部由上海英駿生物技術(shù)公司合成。先加入擴(kuò)增18S rDNA全長(zhǎng)的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，50μ1的PCR 反應(yīng)體系組成如下=IOng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1 的10XPCR buffer、2. 5mmol/L的MgCl2、5U的Taq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補(bǔ)足50 μ 1。 PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸 1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA 為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，55°C引物復(fù)性 45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)35次，72°C終延伸lOmin，目的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。四、變性梯度凝膠電泳(DGGE)及凝膠成像掃描與分析采用DC0DE 系統(tǒng)(BIO-RAD)構(gòu)建DGGE指紋圖譜，具體方法為，將各樣品18S rDNA擴(kuò)增純化產(chǎn)物在10%聚丙烯變性膠中分離(丙烯酞胺濃度35% -60%,電泳緩沖液 0. 5-lx TAE)，100V, 12h，樣品點(diǎn)樣量 IOOOng DNA。五、優(yōu)勢(shì)條帶的回收、測(cè)序與序列比對(duì)分析在紫外燈下將優(yōu)勢(shì)條帶用無(wú)菌手術(shù)刀小心割下，并在銀染圖譜中標(biāo)記相應(yīng)位置，經(jīng)無(wú)菌水沖洗3遍后放入1. 5mLEP管中，用滅菌槍頭搗碎，加入30ul dd H2O浸泡5小時(shí)。 將EP管12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的針對(duì)18S rDNA片段設(shè)計(jì)的特異引物 NS31 5' -TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3' Glol 5，-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3，的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50ul PCR反應(yīng)體系為IOng的DNA模板(一般用1μ1)、50ρπιΟ1每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1 的 10XPCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2、3U 的 iTaq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補(bǔ)足50 μ 1。采用巢式PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s， 50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后取3pl 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用CyC Ie-Pure DNA試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收及純化，并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行。采用Blast 程序在線(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)進(jìn)行序列比對(duì)分析，分析結(jié)果見(jiàn)表1表1普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中DGGE指紋圖譜對(duì)應(yīng)單個(gè)條帶的序列比對(duì)分析
權(quán)利要求
1.一種普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌菌群的分子鑒定方法，包括以下步驟1)取渥堆發(fā)酵過(guò)程中不同翻堆次數(shù)和位置的普洱茶作為待測(cè)樣品；2)提取待測(cè)樣品的總DNA，并對(duì)其進(jìn)行純化；3)以待測(cè)樣品的總DNA為模板，在專用引物——第一步擴(kuò)增采用的引物為GeoA2: 5 ‘ CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geo 11 5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 ‘；第二步擴(kuò)增采用的引物為NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGC AAGTCTGGTGCC-3，和 Glol :5，GCCTGCTTTAAACACTCTA-3，的引導(dǎo)下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收及純化；4)對(duì)純化的目的片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，染色后得到DGGE指紋圖譜；5)從凝膠中回收優(yōu)勢(shì)條帶，并以此為模板，用上游引物 GeoA2 5 ‘ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘ 禾口；下游引物 Geoll: 5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 ‘，組成的專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收、純化及測(cè)序；6)步驟5的測(cè)序結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)菌群的序列進(jìn)行比對(duì)，確定渥堆發(fā)酵普洱茶的優(yōu)勢(shì)真菌菌群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟幻的DNA提取采用試劑盒法，具體的操作步驟為取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入 200mg玻璃珠，使用Omega soil DNA提取試劑盒對(duì)處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2 溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入HTR溶液處理，加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到 HiBind DNA柱子中，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液， IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個(gè)新的收集管中，加入700ul經(jīng)無(wú)水乙醇稀釋過(guò)的SPW wash溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一個(gè)新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g離心lmin，將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin， 13000g離心2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟幻中的PCR擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增先加入擴(kuò)增18S rDNA全長(zhǎng)的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s, 50°C _55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸 1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸lOmin，取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA 為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，50_55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)30-35次，72°C終延伸IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟4)中的染色液為 sybrgreen,濃度為1 10000稀釋原液，IXTAE緩沖液，染色時(shí)間為20_40min，得DGGE圖■i並曰O
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟4)中的DGGE電泳分離，電泳條件為使用Bio-Rad公司的Dcode基因突變檢測(cè)系統(tǒng)在80-120V，60°C下電泳8_14h，變性膠為聚丙烯酰胺凝膠，含有尿素和甲酰胺等變性劑，變性劑濃度范圍為從35%到60%， 膠濃度為8-10%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟6)中采用Blast程序在線對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定渥堆發(fā)酵普洱茶優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟1)對(duì)的發(fā)酵普洱茶進(jìn)行取樣，按照不同翻堆次數(shù)以及在堆中的不同位置點(diǎn)取樣；2)取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入200mg玻璃珠， 使用Omega soil DNA提取試劑盒對(duì)處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70度水浴lOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入0. 7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心lOmin，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置aiiin， 13000g離心aiiin，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入 HTR溶液處理，加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA 柱子中，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個(gè)新的收集管中，加入700ul經(jīng)無(wú)水乙醇稀釋過(guò)的SPW wash溶液，IOOOOg離心lmin，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash 溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一個(gè)新的離心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴lOmin，13000g離心lmin，將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴lOmin，13000g離心 2min，所得洗脫液取5ul電泳檢測(cè)；3)對(duì)純化后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第一步擴(kuò)增采用的引物為GeoA2 5，-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3，和 Geoll :5，-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3，，第二步擴(kuò)增采用的引物為NS31-GC :5，-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGT CTGGTGCC-3’和Glol :5’ -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’，以上引物全部由上海英駿生物技術(shù)公司合成，先加入擴(kuò)增18S rDNA全長(zhǎng)的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，50 μ 1的PCR反應(yīng)體系組成如下:10ng的DNA模板、50pmol每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1的10XPCR buffer、 2. 5mmol/L的MgCl2、5U的Taq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補(bǔ)足50 μ 1，PCR反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次， 72°C終延伸lOmin，取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增， PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸 lmin，循環(huán)35次，72°C終延伸lOmin，目的產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳緩沖液為 IX TAE緩沖液；4)采用DC0DE 系統(tǒng)構(gòu)建DGGE指紋圖譜，具體方法為，將各樣品ISSrDNA擴(kuò)增純化產(chǎn)物在10%聚丙烯變性膠中分離，100V, 12h，樣品點(diǎn)樣量IOOOng DNA ；5)在紫外燈下將優(yōu)勢(shì)條帶用無(wú)菌手術(shù)刀小心割下，并在銀染圖譜中標(biāo)記相應(yīng)位置，經(jīng)無(wú)菌水沖洗3遍后放入1. 5mLEP管中，用滅菌槍頭搗碎，加入30uldd H2O浸泡5小時(shí)，將EP 管12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的針對(duì)18S rDNA片段設(shè)計(jì)的特異引物 NS31 :5，-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3，Glol :5，-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3，的弓丨導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50ul PCR反應(yīng)體系為IOng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每種引物、Ιμ dNTPs、5y 1 的 IOXPCR buffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2、3U 的 iTaq DNA 聚合酶，適量的雙蒸水補(bǔ)足50 μ 1，采用巢式PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s， 50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1.5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后取3pl 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用CyC Ie-Pure DNA試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收及純化，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行；6)步驟5的測(cè)序結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)菌群的序列進(jìn)行比對(duì)，確定渥堆發(fā)酵普洱茶的優(yōu)勢(shì)真菌菌群，采用Blast程序在線進(jìn)行序列比對(duì)分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌菌群的鑒定方法及其專用引物。其中，所述鑒定方法包括以下步驟1)取不同發(fā)酵過(guò)程中的普洱茶待測(cè)樣品；2)提取待測(cè)樣品的總DNA；3)以待測(cè)樣品的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4)對(duì)目的片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，sybrgreen染色后得到DGGE指紋圖譜；5)回收優(yōu)勢(shì)條帶，并以此為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序；6)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定普洱茶渥堆發(fā)酵優(yōu)勢(shì)真菌菌群結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559862SQ201010622769
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉冰, 張長(zhǎng)霞, 李季, 李巍, 李長(zhǎng)文, 梁慧珍, 閆希軍 申請(qǐng)人:云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司