專利名稱：一種啟動(dòng)子BgIosP522及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因調(diào)控領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，具體是水稻的啟動(dòng) 子BgIosP522，以及所述啟動(dòng)子的制備方法。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物或 雙子葉植物中目的基因表達(dá)的用途。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、 結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效 率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng) 子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子。另一種高效的組成型啟動(dòng)子CsVMV是從木薯 葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV 35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也 取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。單子葉植物基因中常見的啟動(dòng)子有山bi啟動(dòng)子(Plant ubiquitin promoter)、 Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 啟動(dòng)子(Maize alcohol dehydrogenase lpromoter)。Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目 前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的WDi-I啟動(dòng)子、水稻 泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素WdBI啟動(dòng)子、煙草泛素Ubi. U4啟動(dòng)子、 馬鈴薯泛素證丨7啟動(dòng)子、番茄泛素W^il-I啟動(dòng)子，大麥泛素Mubl啟動(dòng)子。玉米泛素W^i-I 啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻 和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強(qiáng)組成 型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉 植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。Adh-I啟動(dòng)子調(diào)控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對(duì)植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-I啟動(dòng)子對(duì)單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥 和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子 提高10-50倍。Adh-I啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對(duì)絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào) 控效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá) 具有特殊性狀的外源基因，對(duì)優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強(qiáng)效啟動(dòng)子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了許多單子葉植物的啟動(dòng)子。此外，雙子 葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng) 子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作用。盡管已經(jīng)有上述已知的單子葉植物的啟動(dòng)子，本發(fā)明人通過對(duì)水稻基因組的深入 研究，提供了一種新的單子葉植物啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物和雙子葉 植物中目的基因表達(dá)，同時(shí)為研究單子葉植物和雙子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新 的工具和選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面中，本發(fā)明提供了一個(gè)具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子基因BgIosP522。所述 啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。TAGGTGCCATCTACCAACTTGGATCTCTGATATCAATGTTTTTGGTGGGTAGTAGAATAATATGTCAT TTATGTTTGTTTTTTGGCCTTCAATTTTCTCAATCATCTTTCACTCTGATTATGTGCATGATTTCTCCCATCCTTG TATTACATTCAGTAGCTTCAGACATATTAGTGGAGCTAGGGAAAGGCATATCTATCCTAATTGTGATTATCATAT CAAGTGCTACCACAGATGATCTGCAAGACTACTACATGGCTGGAATTGTTTGAAGGCACTCTTGGCATAGACTTG TCAAATTAGTGGTGAATATGTCTTCTGCAGCCATCTGTCTCCTGATCTACTAGAACAATGTGTGCCACAGAAGGG ACCCAGCATACAACAAACAACTCACTGCTGGAGTTGTTATCACCCAAACACCAACAGGAAATTCTTGTGAATTTC AATGGTCAGGACAGGTTCATGGATGTCATATATCAGGACATCTCCACCGTCGAAACTCGAAAGACGCCTATGGGC AACAGTTCCTGGTGAAATGCACCCACAGAAAGCCAGAATTCTTCATCATCCAGCCAGGGATGATCCTTATTTATG GACCGCGTATCGCGAAGAAGAAAAAACTCTGTTTTTACATGGTACACAAAAAAAAGGGAAAGGAAAATCATGGGG AGGAAATCATGTTGCCAGGGTCAGGACAAAGGAGGTGGTGGCAAGAGGATTGGAGCAACCAAAGCAGAGCCATTC ATATCCAGGAGGCCAACCTCCACCTCACAACTCATATCCCTTTTGCCCTTAAATCTGAGAAGTTGCTGCACTTCT CACCCCCCCTCTAAGGAAAGACTGCAAAGAAAAGGCCTGTGTCAAGGAGAGGGTAGTAGCACCTTGCTCTCCTTT GCCTTCAGAGAAACCGGAAGCACC(SEQ ID NO :1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷 酸序列的啟動(dòng)子a、SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ ID NO 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；以及e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
在第二方面中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟 動(dòng)子以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來源相同或者 不同。在第三方面中，本發(fā)明提供了一種載體，所述載體包含本發(fā)明的啟動(dòng)子或核酸構(gòu) 建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒是PMD18-T質(zhì)?；騪8質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體序列位于KpnI酶切位點(diǎn)和SbfI酶切位點(diǎn)之間。在第四方面中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體或載體的重 組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述菌株是根癌農(nóng)桿菌EHA105-P522。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物愈傷組織是水稻愈傷組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物 是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或 煙草NC89。在第五方面中，本發(fā)明提供了一種制備SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列的方法，包 括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物是SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 擴(kuò)增引物5’端還連接一段限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基。例如，所述擴(kuò)增引物是SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，其中SEQ ID NO 4和SEQID NO 5的5，端分別含有KpnI酶切位點(diǎn) 和SbfI酶切位點(diǎn)。在第六方面中，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO 1所示的序列用作啟動(dòng)子的用途。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述用途是調(diào)控植物中目的基因表達(dá)的用途，所述目的基因優(yōu)選是GUS。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻 或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第七方面中，本發(fā)明提供了一種調(diào)控基因表達(dá)方法，所述方法包括步驟將本發(fā) 明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化至植物，優(yōu)選轉(zhuǎn)化至植物愈傷組織，使所述 啟動(dòng)子位于所述基因的5’端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述的啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多拷 貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。在第八方面中，本發(fā)明提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物 的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細(xì)胞、植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物是單子葉植 物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第九方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、植 物愈傷組織、植物外植體或植物用于調(diào)控植物目的基因表達(dá)和育種的用途，所述植物是單 子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草 NC89。保藏信息培養(yǎng)物名稱煙草NC89種子。
保藏日期2010年11月12日。保藏單位湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)。保藏編號(hào)CCTCCNO :P201017。


圖1示出質(zhì)粒pCAMBIA-1301的圖譜。圖2示出含有需要構(gòu)建的多克隆位點(diǎn)及GUS序列的p8質(zhì)粒的圖譜。圖3示出水稻愈傷組織gus染色的照片。以含有啟動(dòng)子的P8+P522重組載體的重 組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。作為對(duì)照，經(jīng)不含啟動(dòng)子 的P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化(左)。圖4示出水稻轉(zhuǎn)基因苗的根gus染色的照片。以含有啟動(dòng)子的P8+P522重組載體 的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。作為對(duì)照，經(jīng)不含啟動(dòng) 子的P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化(左)。圖5示出水稻轉(zhuǎn)基因苗葉gus染色照片。以含有啟動(dòng)子的P8+P522重組載體的重 組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。作為對(duì)照，經(jīng)不含啟動(dòng)子的 P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化(左)。圖6示出轉(zhuǎn)基因煙草的葉gus染色的顯微照片(光學(xué)顯微鏡，X 3)。以重組根癌 農(nóng)桿菌EHA105-P522轉(zhuǎn)化的煙草的葉經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。對(duì)照煙草的葉經(jīng)⑶S染色 后顏色未發(fā)生變化(左)。圖7示出轉(zhuǎn)基因煙草根gus染色的顯微照片(光學(xué)顯微鏡，Χ； )。以重組根癌農(nóng) 桿菌EHA105-P522介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的煙草的根經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。對(duì)照煙草的根經(jīng)⑶S染 色后顏色未發(fā)生變化(左)。
具體實(shí)施例方式在第一方面中，本發(fā)明提供了一個(gè)具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子基因BgIosP522。在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列的啟動(dòng) 子a、SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ ID NO 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明中，所述的啟動(dòng)子來源于單子葉植物。具體而言，所述單子葉植物為水 稻，例如所述水稻為日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)。本發(fā)明的啟 動(dòng)子可以調(diào)控基因在植物、特別是單子葉植物中的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述 單子葉植物為稻屬。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述稻屬是水稻。在本發(fā)明的又一實(shí)施 方案中，所述為水稻日本晴。
本發(fā)明的啟動(dòng)子還可以控制基因在雙子葉植物，所述雙子葉植物有例如煙草，大 豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花生等。煙草是典型的基因工程模式植物。在實(shí)施例中選擇煙草進(jìn) 行轉(zhuǎn)基因研究，以驗(yàn)證本發(fā)明的啟動(dòng)子在雙子葉植物中的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子能 在轉(zhuǎn)基因煙草中起作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知獲得一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)序列的方法。而且，為了實(shí)現(xiàn)啟 動(dòng)子對(duì)基因的調(diào)控，可以將所述基因的互補(bǔ)序列連接至所述啟動(dòng)子的互補(bǔ)序列的5’形成核 酸構(gòu)建體，然后獲得所述核酸構(gòu)建體的互補(bǔ)序列，從而可以利用所述核酸構(gòu)建體的互補(bǔ)序 列實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子對(duì)一個(gè)基因的調(diào)控。利用核苷酸雜交進(jìn)行核苷酸的鑒定和篩查是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。典型地，“雜 交條件”根據(jù)測量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié) 合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低 于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以 下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件 可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極 低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性；0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從 功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列； 而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊 性在內(nèi)的雜交條件。為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預(yù)洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 雜交過夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個(gè)，或者不超過2-30個(gè)，或者不超過3-20個(gè)，或者不超 過4-15個(gè)，或者不超過5-10個(gè)，或者不超過6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的置 換、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基 的置換、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的 啟動(dòng)子活性。通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO=I的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO :1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核 苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些 核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核 苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參 考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5或3末端位置，或在這些末端位置之間的 任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考 序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可 以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本 文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。在第二方面中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟 動(dòng)子以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來源相同或者 不同。在本文中，所述核酸構(gòu)建體可以包含SEQ ID NO 1所示的啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序 列的核苷酸序列。所述核酸構(gòu)建體可以通過將SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序 列與所需的其他序列可操作地連接進(jìn)行制備?；蛘?，所述核酸構(gòu)建體可以通過直接合成制備。在第三方面中，本發(fā)明提供了一種載體，所述載體包含本發(fā)明的啟動(dòng)子或核酸構(gòu) 建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒是PMD18-T質(zhì)粒或p8質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體序列位于KpnI酶切位點(diǎn)和SbfI酶切位點(diǎn)之間。構(gòu)建質(zhì)粒的方法是本 領(lǐng)域中已知。例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中構(gòu)建了 PMD18-T質(zhì)粒和p8質(zhì)粒。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19-T SimpleVecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在第四方面中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體或載體的重 組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。將質(zhì) 粒導(dǎo)入細(xì)菌的方法是本領(lǐng)域中已知的。例如，所述重組細(xì)胞可以通過將含有本發(fā)明啟動(dòng)子 的所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到。在本發(fā)明的實(shí)施例中，質(zhì)粒被導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)，具體是根癌農(nóng)桿菌 EHA105-P522。
適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等在第五方面中，本發(fā)明提供了一種制備SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列的方法，包 括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增?？梢允褂帽景l(fā)明中公知的方法制備SEQ ID NO 1所示的啟動(dòng)子，例如化學(xué)合成法 直接從頭合成或者從基因組中擴(kuò)增所述啟動(dòng)子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物根 據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)。例如，本 發(fā)明的引物可以是 TAGGTGCCATCTACCAACT(SEQ ID NO 2)和 GGTGCTTCCGGTTTCTCTGAA(SEQ ID NO :3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物5’端還連接一段限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù) 堿基。例如，在實(shí)施例中使用的擴(kuò)增引物是SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，其中SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO 5的5，端分別含有KpnI酶切位點(diǎn)和SbfI酶切位點(diǎn)。在擴(kuò)增引物5，端連 接一段限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基是基因擴(kuò)增中常用的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通 過常規(guī)的方法實(shí)現(xiàn)。在第六方面中，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO 1所示的序列用作啟動(dòng)子的用途。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述用途是調(diào)控植物中目的基因表達(dá)的用途，所述目的基因優(yōu)選是GUS。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻 或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第七方面中，本發(fā)明提供了一種調(diào)控基因表達(dá)方法，所述方法包括步驟將本發(fā) 明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化至植物，優(yōu)選轉(zhuǎn)化至植物愈傷組織，使所述 啟動(dòng)子位于所述基因的5’端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。將核苷酸序列、構(gòu)建核酸構(gòu)建體、質(zhì)?；蚣?xì)菌導(dǎo)入植物可以使用本領(lǐng)域中常用的 方法。例如，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn) 化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本 發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另一種方法是粒 子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外，還可以采用的 轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩選和再生整合 有表達(dá)單元的植株。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多 拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。在第八方面中，本發(fā)明提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物 的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細(xì)胞、植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物是單子葉植 物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第九方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、植物 愈傷組織或植物用于調(diào)控植物目的基因表達(dá)和育種的用途。本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新 的啟動(dòng)子作為單子葉植物、尤其是水稻轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子，為開展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩 選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而極大的縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā)明的啟動(dòng)子可廣泛用于培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物。例如， 可使用本領(lǐng)域中常用的基因重組方法，將本發(fā)明的啟動(dòng)子導(dǎo)入植物基因組中希望表達(dá)量增 加的目標(biāo)基因5’端，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的表達(dá)增加。在本發(fā)明中，術(shù)語“單子葉植物”，具體地，可以為禾本科植物，更具體地，可以為稻 屬植物例如水稻，包括但不限于，例如包括但不限于水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。在本發(fā)明中，術(shù)語“水稻”包括但不限于，日本晴，中花9、中花10、中花11、臺(tái)北 309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu) 128,11優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農(nóng)家福有限公 司)等。在本發(fā)明中，術(shù)語“雙子葉植物”，具體地，可以為茄科植物，更具體地，可以為煙 草屬植物(煙草)，包括但不限于 K326、K346, K394、NC82、NC89、G140、G28, G80、中煙 90、 Coker 176, CV87 等等實(shí)施例下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明 具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。 所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 :P522啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+P522重組載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號(hào)DP320-(^)提取水稻日本晴(已在申請(qǐng)?zhí)枮?00910238992.0、發(fā)明名稱為“一種啟動(dòng)子 BgIosP587、其制備方法及用途”的發(fā)明申請(qǐng)中保藏，并于2010年9月22日公開，保藏編號(hào) 為CCTCC P200910)的基因組DNA，根據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾 設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)KpnI和保護(hù)堿基，下游引 物R1，加限制性酶切位點(diǎn)SbfI和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使 用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。
表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
權(quán)利要求
1.一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列a、SEQID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQID NO 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核苷酸 序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
2.—種核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因 序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來源相同或者不同。
3.一種載體，含有權(quán)利要求1的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體，例如含有權(quán)利要求 1的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體的pMDIS-T質(zhì)粒或p8質(zhì)粒。
4.一種重組細(xì)胞，含有權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3的 載體，所述重組細(xì)胞例如為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
5.一種含有權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3的載體或權(quán)利 要求4的重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物可以為單子葉植物或雙 子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
6.一組引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述 引物對(duì)的兩條引物分別含有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的序列，優(yōu)選地，所述引物對(duì) 的兩條引物在5’端還分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，更優(yōu)選地，所述引物對(duì) 的兩條引物分別具有SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示的序列。
7.制備SEQID NO :1所示的啟動(dòng)子的方法，包括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使 用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID N0:1在水稻日本晴gDNA中的序列分 別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選是權(quán)利要求6所述的引物對(duì)。
8.一種調(diào)控基因表達(dá)方法，所述方法包括步驟將權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3的載體或權(quán)利要求4的 重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化至植物(優(yōu)選植物愈傷組織或植物外植體)，使所述核苷酸序列位于所述基 因的5’端，所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙 草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4的重組 細(xì)胞或權(quán)利要求5的植物愈傷組織、植物外植體或植物。所述植物可以為單子葉植物或雙 子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
10.權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3的載體、權(quán)利要求4的 重組細(xì)胞或者權(quán)利要求5的植物愈傷組織、植物外植體或植物者用于調(diào)控植物目的基因表 達(dá)和植物育種的用途，所述植物可以為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu) 選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子BgIosP522及其制備方法和用途，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列a、SED ID NO1所示的核苷酸序列；b、與SED ID NO1互補(bǔ)的核苷酸序列；c、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物或雙子葉植物中目的基因表達(dá)以及育種的用途。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102146409SQ20101062318
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者張衛(wèi), 張厚寶, 張耕耘, 費(fèi)小紅 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司