專利名稱：一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸是一種重要的有機(jī)酸，學(xué)名α -羥基丙酸，在分子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)不對稱碳原子，因此乳酸存在兩種異構(gòu)體，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。作為一種重要的生物化工原料， L-乳酸被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、日用化工、有機(jī)化工等領(lǐng)域，覆蓋大量產(chǎn)品。乳酸可以通過化學(xué)合成或碳水化合物發(fā)酵得到，但是基于發(fā)酵法能夠?qū)Ｒ恍缘氐玫絃-乳酸或D-乳酸，因此發(fā)酵法被廣泛用于L-乳酸的生產(chǎn)。乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸具有光學(xué)純度高、發(fā)酵強(qiáng)度顯著提高等特點(diǎn)，因此，利用乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸成為大規(guī)模生產(chǎn) L-乳酸的趨勢。目前用于L-乳酸生產(chǎn)的原料主要有淀粉、糖蜜、乳清水等。為了降低L-乳酸的制備成本，提高乳酸生產(chǎn)質(zhì)量，國內(nèi)外對乳酸生產(chǎn)的研究，主要集中在低價(jià)原料的開發(fā)利用、 提高發(fā)酵強(qiáng)度、優(yōu)化乳酸分離提取工藝這三個(gè)方面。農(nóng)作物廢棄物如作物秸稈、玉米芯等可作為低價(jià)原料的開發(fā)對象。我國是玉米生產(chǎn)大國，也是玉米纖維資源浪費(fèi)大國，僅玉米芯每年就浪費(fèi)掉1000萬噸，同時(shí)也引發(fā)了許多環(huán)境問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，用以解決現(xiàn)有乳酸生產(chǎn)發(fā)酵成本高的問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以農(nóng)作物廢棄物的糖化液為碳源，利用乳酸菌 (Lactobacillus)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。具體地，該方法包括如下步驟1)將農(nóng)作物廢棄物粉碎后，采用稀堿液、稀酸液、纖維素酶依次處理，制得含糖質(zhì)量百分比為10% 20%的糖化液；2)將乳酸菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5 10%，發(fā)酵溫度為30 50°C， 200rpm進(jìn)行厭氧攪拌發(fā)酵；當(dāng)乳酸含量不再增加時(shí)發(fā)酵結(jié)束，停止攪拌，放出80% 85% 體積的發(fā)酵液，補(bǔ)入新發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，連續(xù)循環(huán)發(fā)酵5 10批次作為一代；其中，以步驟1)制得的糖化液為碳源，第一代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置如下總糖10%、 酵母膏0. 2% 0. 4%、牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀 0. 03% 0. 05%、氯化鈉0. 02% 0. 03%、硫酸鎂0. 04% 0. 06%、碳酸鈣3% 5% ；3)以上一代的發(fā)酵液按5 10%的接種量接種到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按步驟 2)的方法連續(xù)發(fā)酵5 10批次；連續(xù)發(fā)酵馴化3 4代；其中，以步驟1)制得的糖化液為碳源，第二代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置如下總糖15%、酵母膏0.2% 0.4%、牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀0. 03% 0. 05%、氯化鈉 0. 02 % 0. 03 %、硫酸鎂0. 04 % 0. 06 %、碳酸鈣3 % 5 % ；以步驟1)制得的糖化液為碳源，第三或四代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置如下總糖20%、酵母膏0.2% 0.4%、 牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀0. 03% 0. 05%、氯化鈉 0. 02 % 0. 03 %、硫酸鎂0. 04 % 0. 06 %、碳酸鈣3 % 5 %。如無特別說明，本發(fā)明培養(yǎng)基中未注明的其它成分為水。所述農(nóng)作物廢棄物包括但不限于作物秸稈、玉米芯等。所述步驟1)制備糖化液的方法為，于反應(yīng)器中按固液比1 4 6(w/w)向粉碎的農(nóng)作物廢棄物中加入2% (w/v)的稀堿液，封口后在125°C條件下加熱處理50分鐘，所得漿液在2000rpm離心機(jī)內(nèi)離心；所得固相經(jīng)水洗后加入容器中，按固液比1 5 8 (w/w)加入2% (ν/ν)的稀酸液，調(diào)節(jié)溫度到50°C處理lh，再按照20單位/g纖維素加入纖維素酶， 攪拌轉(zhuǎn)速lOOrpm，酶解時(shí)間控制在60 70小時(shí)。所述稀堿液可以是氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液或氨水中的一種或幾種。所述稀酸液可以是鹽酸、硫酸、醋酸中的一種或幾種。上述優(yōu)選的發(fā)酵條件是按8%的接種量接入乳酸菌種子液，在35 45°C、200rpm 厭氧條件下發(fā)酵，發(fā)酵至乳酸含量不再增加，結(jié)束發(fā)酵。其中，乳酸菌種子液可按照如下方法制備平板培養(yǎng)將乳酸菌種接種到活化培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)將平板培養(yǎng)的乳酸菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中，38°C厭氧培養(yǎng) 20小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，檢測OD600為4. 0。其中，以上述步驟1)制得的糖化液為碳源，平板培養(yǎng)使用的活化培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配制為總糖1%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.5%、瓊脂2% ；其中，以上述步驟1)制得的糖化液為碳源，搖瓶種子培養(yǎng)使用的液體培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配制為總糖3 %、酵母膏0.5%、蛋白胨0.5%、玉米漿0.5%、磷酸二氫鉀 0. 05%、硫酸鎂 0. 06%、硫酸猛 0. 003% ο本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)以大量的農(nóng)作物廢棄物為主要原料制備L-乳酸，顯著降低L-乳酸的生產(chǎn)成本，其產(chǎn)業(yè)前景非常廣闊。(2)采用乳酸菌(Lactobacillus 1. 2131) 一次接種增殖，菌體多次重復(fù)利用生產(chǎn) L-乳酸，減少菌種制備，簡化發(fā)酵工藝，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。(3)菌種經(jīng)過連續(xù)發(fā)酵馴化，L-乳酸發(fā)酵周期由50 55小時(shí)縮短至24 26小時(shí)，L-乳酸的發(fā)酵強(qiáng)度顯著提高，生產(chǎn)效率提高了 50%以上。(4)本發(fā)明不僅實(shí)現(xiàn)了秸稈糖化液連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的目的，而且在發(fā)酵過程中達(dá)到了馴化菌種的目的，過程簡單，連續(xù)性強(qiáng)，易于工業(yè)放大應(yīng)用于生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1農(nóng)作物廢棄物糖化液的制備將玉米芯粉碎，加入到反應(yīng)釜中，然后按固液比1 5(w/w)的比例加入2% (w/ν)的NaOH，封好口后，在125°C條件下加熱處理50分鐘，得到的漿液在2000rpm離心機(jī)內(nèi)離心，離心后的黑液經(jīng)膜處理以回收其中的堿；所得固相經(jīng)水洗后加入容器中，按固液比 1 6(w/w)加入2% (ν/ν)的稀HC1，調(diào)節(jié)溫度到50°C處理lh，再按照20單位/g纖維素加入纖維素酶，攪拌轉(zhuǎn)速IOOrpm，酶解時(shí)間控制在65小時(shí)，酶解終點(diǎn)后，將料液離心過濾，液相為酶解糖液，利用DNS法測酶解液的總糖濃度，利用高效液相色譜法測酶解液中的葡萄糖及木糖濃度。結(jié)果總糖濃度達(dá)10 20% (w/v) 0實(shí)施例2第一代L-乳酸連續(xù)發(fā)酵以乳酸菌(Lactobacillus 1. 2131)(購自中科院微生物所)為例，來說明本發(fā)明的發(fā)酵過程。對于保藏的乳酸菌，首先經(jīng)過如下過程制備種子液平板培養(yǎng)將乳酸菌種接種活化培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)；搖瓶種子培養(yǎng)將平板培養(yǎng)的乳酸菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中，38°C厭氧培養(yǎng) 20小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，檢測OD600為4. 0。其中，以實(shí)施例1制得的糖化液為碳源，平板培養(yǎng)使用的活化培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配制為總糖1%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.5%、瓊脂2% ；其中，以實(shí)施例1制得的糖化液為碳源，搖瓶種子培養(yǎng)使用的液體培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配制為總糖3%、酵母膏0. 5%、蛋白胨0. 5%、玉米漿0. 5%、磷酸二氫鉀0. 05%、 硫酸鎂0. 06 %、硫酸錳0. 003 %。通過上述培養(yǎng)得到發(fā)酵種子液，檢測種子液0D_為4. 0即可。以實(shí)施例1制得的糖化液為碳源，第一代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置為 總糖10%、酵母膏0. 3%、牛肉膏0. 4%、磷酸二氫鉀0. 04%、磷酸氫二鉀0. 04%、氯化鈉 0. 02 %、硫酸鎂0.05%、碳酸鈣4 %。L-乳酸連續(xù)發(fā)酵將發(fā)酵種子液中的乳酸菌(Lactobacillusl. 2131)接種至上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量8%，在40°C、200rpm進(jìn)行厭氧攪拌發(fā)酵；發(fā)酵至乳酸含量不再增加， 結(jié)束發(fā)酵，停止攪拌，放出5/6體積的發(fā)酵液，補(bǔ)入上述配方新發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵；連續(xù)循環(huán)發(fā)酵10批次，發(fā)酵周期為50 55小時(shí)，平均53小時(shí)。實(shí)施例3第二代L-乳酸連續(xù)發(fā)酵使用實(shí)施例2中發(fā)酵10批次后的乳酸菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中，以實(shí)施例 1制得的糖化液為碳源，第二代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置為總糖15%、酵母膏 0. 2% 0. 4%、牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀0. 03% 0. 05%、氯化鈉0. 02% 0. 03%、硫酸鎂0. 04% 0. 06 %、碳酸鈣3 % 5 %，在40°C、 200rpm進(jìn)行厭氧攪拌，連續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵至乳酸含量不再增加，結(jié)束發(fā)酵，停止攪拌，放出5/6 體積的發(fā)酵液，補(bǔ)入新發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵；連續(xù)循環(huán)發(fā)酵10批次，發(fā)酵周期為40 45小時(shí)，發(fā)酵周期縮短為平均42小時(shí)。實(shí)施例4第三代L-乳酸連續(xù)發(fā)酵使用實(shí)施例3中發(fā)酵10批次后的乳酸菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中，以實(shí)施例 1制得的糖化液為碳源，第三代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置為總糖20%、酵母膏 0. 2% 0. 4%、牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀0. 03% 0. 05%、氯化鈉0. 02% 0. 03%、硫酸鎂0. 04% 0. 06 %、碳酸鈣3 % 5 %，在40°C、200rpm進(jìn)行厭氧攪拌，連續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵至乳酸含量不再增加，結(jié)束發(fā)酵，停止攪拌，放出5/6 體積的發(fā)酵液，補(bǔ)入新發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵；再連續(xù)循環(huán)發(fā)酵10批次，發(fā)酵周期為26 32 小時(shí)，發(fā)酵周期縮短為平均28小時(shí)。實(shí)施例5第四代L-乳酸連續(xù)發(fā)酵使用實(shí)施例4中發(fā)酵10批次后的乳酸菌接種至實(shí)施例4所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 40°C、200rpm進(jìn)行厭氧攪拌，連續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵至乳酸含量不再增加，結(jié)束發(fā)酵，停止攪拌，放出5/6體積的發(fā)酵液，補(bǔ)入新發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)循環(huán)發(fā)酵20批次，發(fā)酵周期為24 30小時(shí)； 發(fā)酵周期縮短為平均25小時(shí)。上述四代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果表明，在經(jīng)過三代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)馴化后，菌種就能基本保持其發(fā)酵特性，菌種性能比較穩(wěn)定，可作為進(jìn)一步連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的菌種。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步驟1)將農(nóng)作物廢棄物粉碎后，采用稀堿液、稀酸液、纖維素酶依次處理，制得含糖質(zhì)量百分比為10% 20%的糖化液；2)將乳酸菌(Lactobacillus)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5 10%，發(fā)酵溫度為 30 50°C，200rpm進(jìn)行厭氧攪拌發(fā)酵，當(dāng)乳酸含量不再增加時(shí)發(fā)酵結(jié)束，停止攪拌，放出 80% 85%體積的發(fā)酵液，補(bǔ)入新發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，按上述步驟連續(xù)發(fā)酵5 10批次作為第一代；其中，以步驟1)制得的糖化液為碳源，第一代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置如下總糖10%、酵母膏0. 2% 0. 4%、牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀 0. 03% 0. 05%、氯化鈉 0. 02% 0. 03%、硫酸鎂 0. 04% 0. 06%, 碳酸鈣3% 5% ；3)以上一代的發(fā)酵液按5 10%的接種量接種到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按步驟2)的方法連續(xù)發(fā)酵5 10批次；連續(xù)發(fā)酵馴化3 4代；其中，以步驟1)制得的糖化液為碳源，第二代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置如下總糖15%、酵母膏0. 2% 0. 4%、牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀0. 03% 0. 05%、氯化鈉 0. 02 % 0. 03 %、硫酸鎂0. 04 % 0. 06 %、碳酸鈣3 % 5 % ；以步驟1)制得的糖化液為碳源，第三或四代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配置如下總糖20%、酵母膏0.2% 0.4%、 牛肉膏0. 3% 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 03% 0. 05%、磷酸氫二鉀0. 03% 0. 05%、氯化鈉0.02% 0. 03%、硫酸鎂0. 04% 0. 06%、碳酸鈣3% 5%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述農(nóng)作物廢棄物為秸稈或玉米芯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟1)糖化液的制備方法為，按固液比1 4 6(w/w)向粉碎的農(nóng)作物廢棄物加入2% (w/v)的稀堿液并置于反應(yīng)器中，封口后在125°C條件下加熱處理50分鐘，所得漿液于2000rpm離心；所得固相經(jīng)水洗后加入容器中，按固液比1 5 8(w/w)加入2% (ν/ν)的稀酸液，調(diào)節(jié)溫度到50°C處理1小時(shí)，再按照20單位/g纖維素加入纖維素酶，攪拌轉(zhuǎn)速IOOrpm，酶解時(shí)間控制在60 70小時(shí)，將料液離心過濾，液相為酶解糖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述稀堿液為氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液或氨水中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述稀酸液為鹽酸、硫酸、醋酸中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌為Lactobacillus1.2131。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵溫度為35 45°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。該方法以農(nóng)作物廢棄物糖化液為碳源通過乳酸菌(Lactobacillus)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，一次接種增殖，菌體多次重復(fù)利用，減少了菌種制備的工作量，簡化了發(fā)酵工藝，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度；另外，菌種經(jīng)過連續(xù)發(fā)酵馴化，L-乳酸發(fā)酵周期由50～55小時(shí)縮短至24～30小時(shí)，L-乳酸的發(fā)酵強(qiáng)度顯著提高，生產(chǎn)效率提高了50％以上。本發(fā)明過程簡單，連續(xù)性強(qiáng)，易應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，可顯著降低L-乳酸的生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/225GK102174600SQ20101062405
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者崔剛, 李榮杰, 楊麗 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司