專利名稱：番茄潰瘍病菌快速ims-pcr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種在番茄潰瘍病菌基因水平上快速檢測的試劑盒，屬于植物檢疫和植物保護(hù)領(lǐng)域，專一針對番茄潰瘍病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的檢測。本試劑盒適用于番茄潰瘍病的田間預(yù)防和出入境植物檢疫及植物保護(hù)中番茄潰瘍病菌的快速檢測。
背景技術(shù)：
番茄潰瘍病(Bacterial canker of tomato)是影響番茄生產(chǎn)最重要的細(xì)菌性病害。該病分布廣泛，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)廣泛流行并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在我國的東北、 華北、西北及東部沿海等地均有發(fā)生，部分地區(qū)產(chǎn)量減少在80%以上，導(dǎo)致我國番茄產(chǎn)量銳減并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)嚴(yán)重威脅著我國外繁種子基地的健康發(fā)展。番茄植株從幼苗到坐果期都可發(fā)病，發(fā)病的植株常表現(xiàn)為病苗矮化枯死、莖桿增粗潰瘍、葉片壞死萎蔫、果實(shí)皺縮畸形等癥狀，嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，給各國番茄主要生產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在苗期染病，癥狀初始于下部葉緣，隨后向上蔓延引起整株葉片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表現(xiàn)為植株葉片萎蔫、下垂、卷縮，植株莖桿產(chǎn)生狹長稍凹陷的開裂狀條斑，莖桿增粗。病菌侵染種子時(shí)，通常表現(xiàn)為萎蔫， 此時(shí)維管束受到嚴(yán)重破壞；病菌通過植株表面的毛孔、水孔等自然孔口侵染后，則會出現(xiàn)葉片邊緣壞死、萎蔫等局部癥狀；病菌侵染維管束時(shí)，則造成果實(shí)皺縮、畸形；病菌侵染果實(shí)時(shí)則出現(xiàn)白色圓形小點(diǎn)，后變黃褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色暈圈，呈“鳥眼狀”。 在葉片，最初的癥狀是葉片出現(xiàn)可逆性的萎蔫，在葉片的葉脈之間產(chǎn)生白色隨后轉(zhuǎn)為褐色的壞死條斑，最后表現(xiàn)出永久性萎蔫，使整個(gè)植株干枯死亡。在田間，最初的癥狀主要是低位葉片的小葉邊緣出現(xiàn)卷縮、下垂、凋萎、似缺水狀，最后造成大片的缺株斷壟，危害十分嚴(yán)重。番茄潰瘍病遠(yuǎn)距離廣泛傳播最主要的途徑是種子中攜帶的番茄潰瘍病菌，有研究表明0.01%的種子傳病率就能引起該病的大面積流行。更有研究表明，導(dǎo)致病害在田間流行并造成較大經(jīng)濟(jì)損失的最主要原因是初侵染，而初侵染最重要的來源是種子帶菌。至今， 尚無成功防治該病害的抗病品種和有效的藥物。因此，嚴(yán)格控制帶菌種子流入市場是防止該病暴發(fā)的最重要的措施之一。但是，番茄種子的帶菌率普遍較低，一般為1%，常規(guī)的檢測方法常常導(dǎo)致漏檢。目前國內(nèi)外對番茄潰瘍病菌檢測采用的方法主要有育苗檢測、分離培養(yǎng)檢測、免疫血清學(xué)和PCR檢測等方法。育苗檢測、分離檢測所需檢測時(shí)間較長，無法滿足多批次種子進(jìn)出口檢測要求；免疫血清學(xué)如ELI SA檢測靈敏度相對較低，且常有交叉反應(yīng)，種子樣品中的雜質(zhì)和其他抑制劑等因素也使得PCR的檢測靈敏度較低。因此，發(fā)展一種將病原富集技術(shù)和PCR高靈敏檢測有效結(jié)合的方法，是出入境商用番茄種子快速檢測急需解決的實(shí)際問題。發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足提提供一種番茄潰瘍病菌快速免疫磁珠分離PCR(Immunomagnetic separation-PCR, IMS-PCR)檢測試劑盒，以克服現(xiàn)有植物病原菌檢測方法靈敏性低、特異性差、檢測周期長的缺點(diǎn)。本實(shí)用新型是將免疫磁珠分離技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)結(jié)合起來，首先利用免疫磁珠對番茄潰瘍病菌進(jìn)行富集，然后再利用分子生物學(xué)的高檢測靈敏度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而建立了一種將免疫磁珠分離技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來的檢測方法。該方法檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷、能直接對帶菌種子進(jìn)行檢測，同時(shí)省去了核酸提取的過程，降低了操作過程中病原的損失，極大地提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，縮短了檢測周期，是一種特別適用于番茄種子等植物材料中微量病原的檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案為一種番茄潰瘍病菌快速 IMS-PCR檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊O)，在襯墊( 上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其特征是包括有在容器孔中分別放置IOXPCR Buffer 1管(3)，2. 5mM dNTPs 1管(4)，5U Taq DNA聚合酶 1 管(5)，5 μ M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 1 管(6)，5 μ M 下游引物 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 1 管(7)，去離子水 1 管，PBST 洗液 1 管(8)，番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠1管(9)，體積為2 5mmX 2 5mmX 2 5mm的普通磁體1塊(10)， 陽性對照1管(11)。上述各種液體分別裝在容器內(nèi)，插入容器孔內(nèi)。番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，屬于植物檢疫和植物保護(hù)范疇， 本實(shí)用新型是屬于基因水平檢測，檢測的基因位于16S-23S rRNA間隔區(qū)，上游引物序列為，Cmm Fl 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘，下游引物序列為，Cmm Rl 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘，引物具有亞種特異性，專一針對番茄潰瘍病的病原密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安棒形亞種。使用本實(shí)用新型試劑盒對參試的番茄潰瘍病菌菌株進(jìn)行檢測，可以擴(kuò)增得到270bp大小的特異性目標(biāo)片段，而參試的其余非番茄潰瘍病菌菌株均未擴(kuò)增出特異性目標(biāo)片段。同時(shí)用本試劑盒對ELISA檢測為陽性的樣品進(jìn)行回顧性檢驗(yàn)驗(yàn)證，陽性樣品符合率為100%，說明本試劑盒具有較好的檢測靈敏度。番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，是將免疫磁珠分離技術(shù)和PCR特異性擴(kuò)增結(jié)合起來的一種新技術(shù)，該技術(shù)集病原分離富集、特異性抗體捕捉和PCR擴(kuò)增于一體，是一種檢測靈敏度高、檢測周期短、結(jié)果準(zhǔn)確、使用方便的植物病原檢測試劑盒，尤其適用于植物保護(hù)和植物檢疫部門對可能含有微量番茄潰瘍病菌的樣品進(jìn)行快速檢測。本實(shí)用新型試劑盒的有益效果番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，涉及到檢測危險(xiǎn)性植物病原菌的一種新技術(shù)，試劑盒提供了一種依賴免疫磁珠分離技術(shù)富集病原和PCR擴(kuò)增的檢測技術(shù)，克服了現(xiàn)有植物病原菌檢測方法靈敏性低、特異性差、檢測周期長的缺點(diǎn)，具有檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測周期短，操作簡便快捷的優(yōu)點(diǎn)，可以在紐內(nèi)就完成整個(gè)檢測過程。本試劑盒可以直接從番茄種子等植物組織中檢測番茄潰瘍病菌，大大簡化了檢測程序，提高了我國口岸的檢疫水平，同時(shí)為病害防治策略的制定提供了依據(jù)。試劑盒特異性驗(yàn)證試驗(yàn)通過使用番茄潰瘍病菌亞種特異性引物Cmm Fl和Cmm Rl對番茄潰瘍病菌菌株和非番茄潰瘍病菌菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果表明引物Cmm Fl和Cmm Rl 在優(yōu)化的PCR擴(kuò)增條件下在番茄潰瘍病菌株中擴(kuò)增出了大小約270bp的特異性目標(biāo)片段，而在其他7個(gè)參試的非番茄潰瘍病菌菌株中均未擴(kuò)增出特異性目標(biāo)片段，說明本實(shí)用新型中使用的引物對番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。試劑盒靈敏度驗(yàn)證試驗(yàn)在梯度稀釋的純菌懸液中，本試劑盒的檢測靈敏度可以達(dá)到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL ；在梯度稀釋的模擬帶菌種子提取液中，本試劑盒的檢測靈敏度同樣可以達(dá)到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL。而使用直接PCR在梯度稀釋的純菌懸液和模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度僅為IO4CfuAiL和106cfu/mL。也即是說，本試劑盒在模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度比普通PCR高IO4倍，比常規(guī)的ELISA 方法檢測靈敏度也高IO4倍。試劑盒實(shí)用性驗(yàn)證使用本試劑盒對可能自然感染番茄潰瘍病菌的5批番茄種子進(jìn)行檢測，結(jié)果在5批種子中均擴(kuò)增出大小為270bp的目標(biāo)片段，而采用ELISA方法在同樣的5批番茄種子中只有2批檢測為陽性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本試劑盒的檢測靈敏度比ELI SA試劑盒高，更適用于實(shí)際的種子病原檢測。

圖1是本實(shí)用新型的立體示意圖。圖2試劑盒使用流程圖；圖3試劑盒特異性驗(yàn)證結(jié)果；圖中1-7 號泳道分別為 Cmm、I3SS Jst、^^、Xcc Jcp、I^sl，細(xì)菌濃度均為 107cfu/ mL，M 為 IOObp DNA ladder。圖4梯度稀釋純菌液直接PCR結(jié)果；圖中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 4X107-2. 4X101cfu/mL, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNA ladder。圖5梯度稀釋純菌液IMS-PCR結(jié)果；圖中1-6號泳道細(xì)菌濃度為4. 3X 106-4.3Χ10、 \ι/ιΛ，N為陰性對照，M為IOObp DNA ladder。圖6梯度稀釋模擬帶菌種子提取液直接PCR結(jié)果；[0023]圖中1-7號泳道細(xì)菌分別為2. 4X107-2.4X IO1CfuAiLiN為陰性對照，M為IOObp DNA ladder。圖7梯度稀釋模擬帶菌種子提取液IMS-PCR結(jié)果；圖中1-6號泳道細(xì)菌濃度為4. 3X 106-4.3Χ10、 \ι/ιΛ，N為陰性對照，M為IOObp DNA ladder。圖8自然感染種子IMS-PCR結(jié)果。圖中1-5號泳道分別為5批自然感染的番茄種子，P為陽性對照，M為IOObp DNA Iadder0
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對本實(shí)用新型的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本實(shí)用新型，并非用于限定本實(shí)用新型的范圍。實(shí)施例1 一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，見圖1，包括有盒體1，襯墊2，在襯墊2上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其特征是包括有在容器孔中分別放置10XPCR Buffer 1 管 3，2. 5mM dNTPs 1 管 4，SUiTaq DNA 聚合酶 1 管 5，5 μ M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGT CTCCC-3 ‘ 200μ L6，5yM 下游引物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 200yL7，去離子水 1 管，PBST洗液1管8，番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠1管9，體積為2 5mmX 2 5mmX 2 5mm的普通磁體1塊10，陽性對照1管11。 本實(shí)用新型的使用方法，見圖2，其主要步驟為 (1)病菌富集取檢測樣品ImL置于離心管中，然后在每個(gè)離心管內(nèi)加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，磁珠量為IO5-IO6個(gè)/mL，在搖床上室溫?fù)u動2h，轉(zhuǎn)速為150rpm，然后將檢測樣品置于磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側(cè)時(shí)，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然后棄去洗液；Q)PCR擴(kuò)增將富集病菌后的免疫磁珠重懸于50μ L去離子水中，離心混勻后再轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，然后放于PCR儀中，99 °C熱裂解15min，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6yL轉(zhuǎn)移至另一 PCR管中，再在該管內(nèi)加入再加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs4 μ L、5U/μ L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓| 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 μ L，擴(kuò)增條件為 94 °C 2min ；94 °C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸7min，最后4°C保存，陽性樣品可擴(kuò)增出大小為270bp的特異性目標(biāo)片段。(3)結(jié)果分析灌制1.5%瓊脂糖凝膠，取IOyL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照并分析，若陽性對照和檢測樣品在270bp處可見特異性目標(biāo)條帶，陰性對照沒有特異性目標(biāo)條帶，則判定檢測樣品為陽性。免疫磁珠的制備步驟為(1)將N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHS-Biotin)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，調(diào)整生物素濃度為50 μ g/mL ；(2)測定抗體的濃度，并用pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋到10 μ g/mL ；(3)按生物素與抗體的質(zhì)量比為1 10的比例混合，室溫振蕩反應(yīng)4h;(4)將透析分子量為8000-14000的透析膜剪成長度為5-lOcm的小段，然后在 500mL 2% 的 NaHCO3 和 lmmol/L pH 為 8. 0 的 Na2EDTA · 2H20 中將透析膜煮沸 IOmin,再用去離子水徹底清洗透析膜，然后放于lmmol/L Na2EDTA · 2H20中將之煮沸l(wèi)Omin，冷卻后放于4°C冰箱，確保透析膜始終浸沒在溶液內(nèi)，最后用去離子水將透析膜內(nèi)外沖洗干凈，結(jié)扎透析膜的一端后將生物素化的抗體移入透析袋中，然后再結(jié)扎透析袋的另一端，放于250mL PBS中透析過夜，期間更換緩沖液2次；(5)將鏈霉親和素磁珠用碳酸鹽緩沖液洗滌3次，每次2min，然后在磁體上靜置 5min,棄去鏈霉親和素磁珠保存液，鏈霉親和素磁珠保存液為pH7. 4,0. 1% BSA和0. 02 % NaN3的溶液，然后將鏈霉親和素磁珠重懸于相同體積的碳酸鹽緩沖液中；(6)將經(jīng)過透析后的生物素化抗體全部轉(zhuǎn)移至鏈霉親和素磁珠儲存管內(nèi)，在振蕩器上室溫振蕩2h，讓鏈霉親和素和生物素充分反應(yīng)；(7)將連接抗體后的磁珠在磁體上靜置5min，去除未結(jié)合到鏈霉親和素磁珠上的過量抗體，然后用PBST洗滌3次，每次2min，最后將連接抗化后的磁珠重懸于碳酸鹽緩沖液中，從而制備出番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠。所述的鏈霉親和素磁珠購買于!Iomega公司。試劑盒植物病原抽提步驟為(1)植物樣品病原抽提按照種子重量與病原提取液為1 4的比例(g/mL)，稱取 2g番茄種子，置于研缽中用棒杵研磨至種皮破裂，加入SmL普通病原抽提緩沖液，然后將病原抽提緩沖液和種子碎片一同轉(zhuǎn)移到IOmL離心管中，混勻，此時(shí)，抽提緩沖液與種子的種皮內(nèi)外層充分接觸，室溫靜置Ih或4°C過夜后，則種子上攜帶的植物病原的多數(shù)位于抽提緩沖液的上清部分中；(2)抽提緩沖液配方為硫酸鈉0. 13g/mL，聚乙烯吡咯烷酮2g/mL，疊氮化鈉 0. 02g/mL,吐溫-200. 5ml/L,調(diào) pH 值至 7. 4。試劑盒模板DNA快速獲取步驟為取檢測樣品ImL置于離心管中，然后在每個(gè)離心管內(nèi)加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，在搖床上室溫?fù)u動2h，然后將檢測樣品置于磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側(cè)時(shí)，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次 2min，在磁體上靜置5min，然后棄去洗液，將富集病菌后的免疫磁珠重懸于50 μ L去離子水中，離心混勻后再轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，將PCR管放于PCR儀中，99°C裂解15min，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，則其上清部分即為可用于PCR擴(kuò)增的DNA。實(shí)施例2 見圖3，對番茄潰瘍病菌和非番茄潰瘍病菌菌株特異性性驗(yàn)證試驗(yàn)收集 1 株番茄潰瘍病菌(Clavibacter michiganensi s subsp. michiganensis， Cmm)和6株非番茄潰瘍病菌菌株驗(yàn)證本試劑盒的特異性，這6株病菌分別為丁香假單胞桿菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv. syringae，Pss)，番爺細(xì)菌性葉斑病胃(Pseudomonas syringaep pv.toma to, Pst)，番茄細(xì)菌性瘡痂病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv),十字花禾斗蔬菜黑腐致病變禾中(Xanthomonas campestris pv.campestris, Xcc),大丑細(xì)菌斑疫病菌(Xanthomonas campestris phaseoli, Xcp)，舌甘瓜細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonas syringae pv. Iachrymans, Psl)。分別取上述6株非番茄潰瘍病菌菌株和1株番茄潰瘍病菌菌株純菌液(細(xì)菌濃度為107CfU/mL)各ImL置于離心管中，然后在每個(gè)離心管內(nèi)加入50yL番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠(磁珠量約為106/mL)，在搖床上室溫?fù)u動池，轉(zhuǎn)速為150rpm。然后將檢測樣品置于磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側(cè)時(shí)，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用 PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然后棄去洗液。將富集病菌后的免疫磁珠重懸于50 μ L去離子水中，離心混勻后再轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，然后放于PCR儀中，99°C 熱裂解15min，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 μ L轉(zhuǎn)移至另一 PCR 管中，再在該管內(nèi)加入 IOXPCRbuffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓丨物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3‘ 2 μ L，擴(kuò)增條件為 94°C 2min，94°C 30s,62. 5°C 45s, 72°C45s，35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸7min，最后4°C保存。取10 μ L PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照并分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖中只有1號泳道可見特異性目標(biāo)條帶，大小約為270bp， 2-7號泳道均未見特異性目標(biāo)條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本試劑盒特異性針對番茄潰瘍病菌，而在參試的其他6株非番茄潰瘍病菌菌株上均未擴(kuò)增出特異性的目標(biāo)條帶，說明本試劑盒對番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。實(shí)施例3 梯度稀釋番茄潰瘍病菌純菌液直接PCR檢測試驗(yàn)(見圖4)將標(biāo)準(zhǔn)菌培養(yǎng)1濁后，測其吸光值(A600J，待A600nm = 0. 25-0. 3 (此時(shí)菌液濃度約為108CfU/mL)，取此菌液2mL依次10倍稀釋到無菌PBS中，并分別標(biāo)記為10人 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7，然后取 10_5、10_6、10_7 梯度純菌液各 100 μ L 于培養(yǎng)皿中進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。取濃度為ZjXKfjjXlOkfu/mL的梯度純菌液各5μ L于 PCR管中，加入31.6yL去離子水，在PCR儀上99 °C裂解IOmin，然后迅速置于冰上冷卻 5mi n，離心后加入 IOXPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓 | 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3‘ 2 μ L，PCR反應(yīng)成分同實(shí)施例1,然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖中1-4號泳道均可見特異性目標(biāo)條帶，片段大小約為 270bp，且亮度依次減弱；5-7號泳道未見特異性目標(biāo)條帶。試驗(yàn)結(jié)果表明，在純菌液中直接 PCR的檢測靈敏度為104cfu/mL。實(shí)施例4 梯度稀釋番茄潰瘍病菌純菌液IMS-PCR檢測試驗(yàn)，見圖5，取番茄潰瘍病菌濃度分別為4. 3X106-4. 3X IO1CfuAiL的梯度稀釋純菌液各ImL 置于離心管中，然后在每個(gè)離心管內(nèi)加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠(磁珠量約為IO6個(gè)/mL)，在搖床上室溫?fù)u動濁，轉(zhuǎn)速為150rpm。然后將檢測樣品置于磁力架上靜置 5min，待磁珠被收集到管壁的一側(cè)時(shí)，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次aiiin，在磁力架上靜置5mi n，然后棄去洗液。將富集病菌后的免疫磁珠重懸于50 μ L去離子水中，離心混勻后再轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，將PCR管放于PCR儀中，99°C熱裂解15min，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 μ L轉(zhuǎn)移至另一 PCR 管中，再在該管內(nèi)加入 IOXPCR buffer 5 μ L、2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游引物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3‘ 2 μ L，擴(kuò)增條件為 94°C 2min ；94°C 30s,62. 5°C 45s, 72°C 45s，35個(gè)循環(huán)；72°C 7min，4°C保存。取10 μ L PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照并分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，圖中1-5號泳道均可見特異性目標(biāo)條帶，大小約為270bp，且條帶亮度依次減弱，而6號泳道未見特異性目標(biāo)條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本試劑盒在梯度稀釋的純菌液中可以檢出濃度為IO2CfuAiL的番茄潰瘍病菌，具有較高的檢測靈敏度。實(shí)施例5 梯度稀釋模擬帶菌種子提取液直接PCR試驗(yàn)，見圖6稱取50g經(jīng)檢測不帶番茄潰瘍病菌的種子放于研缽內(nèi)，用缽杵將番茄種子在研缽內(nèi)研碎后，加入200mL普通種子病原提取液，將種子病原提取液及種子碎片全部轉(zhuǎn)移至錐形瓶中4°C冰箱過夜，次日取出經(jīng)抽提病原后的病原提取液，取其上清分裝到小錐形瓶中。 然后取經(jīng)過計(jì)數(shù)后的上一梯度純菌液2mL依次10倍稀釋到種子病原提取液中，并分別標(biāo)記為 10人 10_2、ΙΟ—3、10人 1(Γ5、ΙΟ—6、1(Γ7。取番茄潰瘍病菌濃度為 2. 4X 107_2· 4X IO1CfuAiL 的模擬帶菌種子提取液各5 μ L于PCR管中，再加入31. 6 μ L去離子水，在PCR儀中99°C裂解 lOmin，其余方法同實(shí)施例6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，圖中只有1、2號泳道可見較淡的特異性目標(biāo)條帶，大小約為270bp，其余泳道均未見到明顯目標(biāo)條帶。試驗(yàn)表明直接PCR在模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度僅為106cfu/mL。實(shí)施例6 梯度稀釋模擬帶菌種子提取液IMS-PCR試驗(yàn)，見圖7取4. 3X106-4. 3X IO1CfuAiL梯度稀釋模擬帶菌種子液各ImL置于離心管中，然后在每個(gè)離心管內(nèi)加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，在搖床上室溫?fù)u動池，轉(zhuǎn)速為150rpm，然后將檢測樣品置于磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側(cè)時(shí)，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然后棄去洗液。將富集病菌后的免疫磁珠重懸于50 μ L去離子水中， 離心混勻后再轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，將PCR管放于PCR儀中，99 °C熱裂解15min，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心^ii η,取其上清36. 6 μ L轉(zhuǎn)移至另一 PCR管中，再在該管內(nèi)加入 IOXPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓| 物 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 μ L,其余步驟同實(shí)施例 1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，圖中可見1-5號泳道均可見特異性目標(biāo)條帶，大小約為 270bp，且條帶亮度依次減弱，6號泳道未見特異性目標(biāo)條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本試劑盒在模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度為102cfu/mL，比傳統(tǒng)的ELISA檢測試劑盒的檢測靈敏度高IO4倍。實(shí)施例7 自然感染番茄潰瘍病菌的出口種子檢測試驗(yàn)，見圖8選取5批可能自然感染番茄潰瘍病菌的出口番茄種子，各稱量2g置于研缽中用棒杵研磨至種皮破裂，加入8mL普通病原抽提緩沖液，然后將病原抽提緩沖液和種子碎片一同轉(zhuǎn)移到IOmL離心管中，混勻。此時(shí)，抽提緩沖液與種皮的內(nèi)外層充分接觸，室溫靜置Ih 或4°C過夜對種皮上的病原進(jìn)行抽提，則種子上攜帶的植物病原大部分被抽提到緩沖液的上清部分中。然后再取上清部分ImL置于離心管中，在每個(gè)離心管內(nèi)加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，在搖床上室溫?fù)u動池，轉(zhuǎn)速為150rpm。然后將檢測樣品置于磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側(cè)時(shí)，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然后棄去洗液。將富集病菌后的免疫磁珠重懸于50 μ L去離子水中，離心混勻后再轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，將PCR管放于PCR儀中，99°C熱裂解15min，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 μ L轉(zhuǎn)移至另一 PCR 管中，再在該管內(nèi)加入 IOXPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4u L、5U/yL Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2μ L，5yM 下游弓丨物 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 μ L,其余步驟同實(shí)施例 1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，圖中可見1-5號泳道可見特異性目標(biāo)條帶，大小約為270bp， 其中2、3號泳道條帶較亮，1、4、5泳道條帶較淡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在可能自然感染番茄潰瘍病菌的5批出口番茄種子中均能擴(kuò)增出特異性的目標(biāo)條帶，而采用ELISA方法時(shí)從同樣的5 批種子中只有2批檢測為陽性。同時(shí)試驗(yàn)表明，本試劑盒在實(shí)際的種子病原檢測中具有較高的實(shí)用價(jià)值，能直接對帶菌番茄種子進(jìn)行檢測，具有較大的推廣應(yīng)用基礎(chǔ)以上所述僅為本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例，并不用以限制本實(shí)用新型，凡在本實(shí)用新型的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求1. 一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，包括有盒體⑴，襯墊0)，在襯墊⑵上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其特征是包括有在容器孔中分別放置 IOXPCR Buffer 1 管(3)，2. 5mM dNTPs 1 管(4)，5U TaqDNA 聚合酶 1 管(5)， 5μΜ 上游弓丨物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 1 管(6)，5 μ M 下游引物 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 1 管(7)，去離子水 1 管(12)，PBST 洗液 1 管(8)，番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠1管(9)，體積為2 5mmX2 5mmX2 5mm的普通磁體1塊 (10)，陽性對照1管(11)。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種在番茄潰瘍病菌基因水平上快速檢測的試劑盒，屬于植物檢疫和植物保護(hù)領(lǐng)域。一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其特征是包括有在容器孔中分別放置10×PCR Buffer 1管(3)，2.5mM dNTPs 1管(4)，5U Taq DNA聚合酶1管(5)，5μM上游引物5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′1管(6)，5μM下游引物5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3′1管(7)，去離子水1管(12)，PBST洗液1管(8)，番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠1管(9)，體積為2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁體1塊(10)，陽性對照1管(11)。
文檔編號C12Q1/04GK201962293SQ201020509428

公開日2011年9月7日 申請日期2010年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月29日
發(fā)明者劉箐, 閔現(xiàn)華 申請人:甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心