專利名稱：eIF3m在癌癥的診斷和治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含用于測量eIF;3m表達水平的試劑的癌癥診斷組合物和通過調(diào)節(jié)所述表達水平用于癌癥的治療和預(yù)防的組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，其包含用于測量eIF3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑；包含所述試劑的癌癥診斷試劑盒；通過用所述試劑處理生物樣本以檢測與所述試劑特異性地結(jié)合的物質(zhì)并定量比較個體和正常對照之間的所述物質(zhì)來檢測eIF;3m多核苷酸或蛋白的方法；以及用于癌癥的治療和預(yù)防的方法，其包括用于下調(diào)eIF;3m多核苷酸或蛋白表達的試劑。背景領(lǐng)域癌癥是當(dāng)今世界發(fā)病率和死亡率的最常見原因之一。隨著平均預(yù)期壽命的增加，預(yù)計癌癥發(fā)病率會增加，伴隨發(fā)病年齡降低。ACS(美國癌癥協(xié)會(American Cancer Society))的年度癌癥統(tǒng)計文章報導(dǎo)稱，在2007年，全世界診斷了 1200萬或更多的新癌癥病例，癌癥患者的死亡人數(shù)約為760萬，死亡速率約每天2萬。肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌是最致命癌癥的代表。特別是關(guān)于結(jié)腸癌，其結(jié)腸癌的發(fā)病率在韓國已顯著升高。在韓國的男性中，其是胃癌、肺癌和肝癌之后第四位主要的癌癥相關(guān)死亡的原因。相似的癌癥死亡率的速率見于女性中。大部分病例發(fā)生在50多歲的患者之間，并且其次在60多歲的患者之間。在韓國結(jié)腸癌的最高發(fā)病率的年齡低于例如美國和歐洲的西方世界國家10年。在30多歲的人中，結(jié)腸癌的高發(fā)病頻率占全部病例的5% -10%。 年輕人中的病例是不常見的，除非存在早期結(jié)腸癌的家族病史。影響癌癥發(fā)生的因素在多數(shù)情況下是環(huán)境的，例如飲食的西方化，特別是動物脂肪和蛋白的過量攝入，而不是遺傳。 僅5%的結(jié)腸癌病例是歸因于遺傳因素。根據(jù)這個事實和新近的報道，具有發(fā)展為結(jié)腸癌的高風(fēng)險的人是1)已經(jīng)被結(jié)腸息肉侵襲的人，2)具有結(jié)腸癌家族史的人，3)長期患有潰瘍性結(jié)腸炎的人，4)被頑固性肛瘺侵襲的人。當(dāng)早期被檢測出時，通過內(nèi)窺鏡切除術(shù)或外科手術(shù)幾乎可以完全治愈結(jié)腸癌。此外，即使轉(zhuǎn)移到肝或肺(遠處轉(zhuǎn)移)，通過外科治療仍然可以完全治愈結(jié)腸癌，除非發(fā)現(xiàn)太晚而不能手術(shù)。然而，在無癥狀患者中檢出結(jié)腸癌是非常困難的，因為具有結(jié)腸癌的患者在早期沒有主觀癥狀。因此，即使不放便和疼痛，必須進行定期檢測以在早期檢測結(jié)腸癌，這允許實施外科手術(shù)用于治療。隱血試驗(occult blood test)被認為是相對方便的結(jié)腸癌篩選。然而，該試驗中的陽性反應(yīng)通常確定為假陽性。同樣，并不是所有的陰性反應(yīng)都能保證不存在結(jié)腸癌。也就是說，使用隱血試驗作為準(zhǔn)確診斷方法是不合理的。對結(jié)腸癌的診斷治療進行的廣泛和透徹研究發(fā)現(xiàn)，某些基因及其表達產(chǎn)物可以用作在早期準(zhǔn)確檢測結(jié)腸癌的診斷標(biāo)志物和用作治療結(jié)腸癌的靶標(biāo)，從而導(dǎo)致本發(fā)明。發(fā)明公開技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的是提供用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，其包含用于測量eIF3m 的mRNA或蛋白表達水平的試劑。本發(fā)明的另一目的是提供癌癥診斷試劑盒，其包含用于測量eIF;3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑。本發(fā)明還一目的是提供檢測eIF;3m多核苷酸或蛋白的方法，所述方法包括用所述用于測量eIF;3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑處理生物樣本，檢測所述試劑和與其互補的多核苷酸或蛋白的復(fù)合物，并定量比較個體和正常對照之間的所述復(fù)合物。本發(fā)明還一目的是提供用于癌癥的治療和預(yù)防的組合物，其包含抑制eIF3m多核苷酸表達的寡核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供用于癌癥的治療和預(yù)防的組合物，其包含具有針對 eIF3m多肽的抑制活性的抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的另一目的是提供篩選用于癌癥的治療藥物的方法，所述方法包括用候選化合物處理表達eIF;3m多肽和/或多核苷酸的細胞，并測量所述細胞中eIF;3m多肽或多核苷酸表達水平。問題的解決方案按照本發(fā)明的一方面，本發(fā)明涉及用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，其包含用于測量eIF3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑。如本文所用的術(shù)語“elFIBm”表示真核翻譯因子: 亞基。eIF3是哺乳動物起始因子，分子量大至800kDa。E1F3由稱為eIF3a、b、c…、m的13個非等同亞基(non-identical subunit)組成。已知某些亞基在某些癌癥中顯示異常表達，但是至今在之前的資料中沒有報道關(guān)于本發(fā)明的亞基在某些癌癥中的特異性表達的信息。eIF;3m也稱為PCIDl (含有蛋白1的PCI結(jié)構(gòu)域)，已知作為單純皰疹病毒(HSV)進入的受體或共受體，但是還沒有關(guān)于該亞基與腫瘤發(fā)生以及進一步癌癥治療的關(guān)聯(lián)的報道。此外，在本發(fā)明中，首次公開了 eIF;3m在特異性癌細胞系和癌癥中超表達。本發(fā)明人證實，在人腫瘤組織以及人癌細胞系中，eIF;3m在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達都顯著升高。在本發(fā)明中，還發(fā)現(xiàn)elFIM在肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、黑素瘤和直腸癌中以高水平表達，并且發(fā)現(xiàn)在人結(jié)腸組織的腫瘤部位中保持eIF;3m水平升高的表達。如本文所用的術(shù)語“標(biāo)志物”或“診斷標(biāo)志物”意圖表示能夠通過將癌細胞或患有癌癥的個體區(qū)別于正常細胞或個體來診斷癌癥的物質(zhì)，并且包括有機生物分子，例如多肽、 蛋白或核酸(例如mRNA等)、脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白和糖(單糖，二糖，寡糖等)，所述有機生物分子的量在癌癥細胞中相對于在正常細胞中增加或減少。對于本發(fā)明的目的而言，所述癌癥的診斷標(biāo)志物是eIF;3m多肽或編碼該多肽的多核苷酸，所述多肽或多核苷酸在癌癥細胞中相對于在正常細胞或組織中以高水平特異性地表達。如本文所用的術(shù)語“mRNA表達水平的測量”或相應(yīng)短語意指評價生物樣品中癌癥標(biāo)志物基因的mRNA的存在和表達水平以診斷癌癥的過程，其中測量mRNA的量。用于測量 mRNA水平的分析方法包括但不限于，RT-PCR、競爭性RT-PCR、實時RT-PCR、RNA酶保護試驗 (RPA)、Northern印跡和DNA芯片檢測。如本文所用的術(shù)語“蛋白表達水平的測量”或相應(yīng)短語意指評價生物樣品中從結(jié)腸癌標(biāo)志物基因表達的蛋白的存在和表達水平以診斷癌癥的過程，其中使用與所述蛋白特異性地結(jié)合的抗體測量所述標(biāo)志物基因的蛋白產(chǎn)物的量。用于測量蛋白水平的分析方法包括但不限于，Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)、放射免疫檢測(RIA)、放射免疫擴散、Ouchterlony免疫擴散、火箭免疫電泳、免疫組織染色、免疫沉淀檢測、補體結(jié)合檢測、FACS(熒光激活的細胞分類儀)和蛋白芯片檢測。用于測量mRNA水平的試劑可以示例為引物對、探針或反義核苷酸，其與本發(fā)明的 eIF;3m多核苷酸或其片段有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計所述引物、探針或反義核苷酸序列。如本文所用的術(shù)語“引物”是指具有游離的3'羥基基團的短核酸鏈，其與互補模板形成堿基對，以便作為產(chǎn)生新模板鏈的起點。除引物外，DNA合成或復(fù)制需要合適的緩沖液、適當(dāng)?shù)臏囟?、聚合?DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)和4種三磷酸核苷酸。在本發(fā)明中，對 eIF;3m多核苷酸具有特異性的有義和反義引物可以用于PCR擴增，以便用PCR產(chǎn)物診斷癌癥。根據(jù)本領(lǐng)域的已知信息，可以適當(dāng)改變所述有義和反義引物的長度。如本文所用的術(shù)語“探針”意指諸如RNA或DNA的核苷酸序列的片段，其長度范圍從短至1個堿基至長至數(shù)百個堿基，其可以與目的mRNA特異性地結(jié)合并且用標(biāo)簽進行標(biāo)記用于檢測所述目的mRNA。本發(fā)明中有用的探針可以構(gòu)建為寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針或RNA探針的形式。在本發(fā)明的實施方案中，通過測定與本發(fā)明的eIF3m多核苷酸互補的探針是否與目的核苷酸序列雜交，可以實現(xiàn)癌癥發(fā)生的診斷。按照本領(lǐng)域已知的信息可以更改合適的探針和雜交條件的選擇。本發(fā)明中有用的引物或探針可以使用亞磷酰胺固相載體法或其他熟知技術(shù)化學(xué)合成。使用本領(lǐng)域已知的各種手段可以修飾它們的核苷酸序列。修飾的示例性、非限制性實例包括甲基化、加帽、用一個或多個同系物取代天然核苷酸和核苷酸之間的改變，例如不帶電荷的連接物(例如甲基磷酸、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或帶電荷的連接物(例如磷硫酰，二硫代磷酸酯等)。優(yōu)選地，所述引物或探針優(yōu)選含有8個或更多核苷酸。通過將所述引物或探針暴露于本發(fā)明的eIF;3m多核苷酸或使所述引物或探針與本發(fā)明的eIF;3m多核苷酸接觸，可以實現(xiàn)雜交。優(yōu)選地，將這些序列在使非特異性配對最小化的嚴緊條件下彼此雜交。為了檢測與本發(fā)明的eIF;3m多核苷酸共享80% -90%同源性的序列，例如，雜交條件可以包括在 42°C、含有0. 25M Na2HP04、pH7. 2、6. 5% SDS和10%硫酸葡聚糖的緩沖液中雜交過夜并最終在50°C、用含有0. IX SSC^PO. 1% SDS的溶液洗滌。適于檢測與本發(fā)明的elFIBm多核苷酸共享90%同源性的序列的嚴緊條件包括在65°C、在0. 25M Na2HPO4, pH7. 2、6. 5% SDSU0% 硫酸葡聚糖中雜交過夜，并最終在60°C、用含有0. IXSSC和0. SDS的溶液洗滌。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，測量eIF3m蛋白(下文與“elF^ii多肽”交換使用)的表達水平的試劑優(yōu)選為抗體。如本文所用的術(shù)語“抗體”是指指示抗原區(qū)的特異性蛋白分子。對于本發(fā)明的目的而言，所述抗體與本發(fā)明的標(biāo)志物，即eIF;3m多肽特異性地結(jié)合。該抗體可以使用常規(guī)方法自蛋白產(chǎn)生，通?？寺〉奖磉_載體的標(biāo)志物基因編碼所述蛋白。此外，可產(chǎn)生自由所述標(biāo)志物基因編碼的蛋白的部分肽，落入所述抗體的范圍。為了作為抗體而發(fā)揮功能，所述部分肽需要含有至少7個氨基酸殘基，優(yōu)選地9個或更多氨基酸殘基，以及更優(yōu)選地12個或更多氨基酸殘基。不給予本發(fā)明的抗體的形式特定的限制。其中有多克隆抗體、單克隆抗體及其含有互補位的片段以及所有免疫球蛋白抗體。此外，諸如人源化抗體的特殊抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，只要可以使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，針對本發(fā)明的eIF;3m蛋白的任何抗體都可以用于本發(fā)明中。
此外，用于檢測癌癥的診斷標(biāo)志物的本發(fā)明的抗體包括抗體分子的功能性片段以及具有兩個全長輕鏈和兩個全長重鏈的完整形式。所述抗體分子的功能性片段是指，至少保留抗原結(jié)合功能的片段，并且包括Fab、F (ab' )、F(ab' )2、Fv等。如本文所用的術(shù)語“癌癥”是指與細胞死亡調(diào)節(jié)相關(guān)的一類疾病，其中細胞群表現(xiàn)出凋亡不足產(chǎn)生的不受控制的過度生長。所述過度生長的細胞侵襲鄰近組織和器官以破壞正常結(jié)構(gòu)和使正常結(jié)構(gòu)變形，形成腫瘤塊，以上情況定義為癌癥。通常，腫瘤是細胞的異常過度生長所形成的贅生物或?qū)嶓w病變。腫瘤可以是良性的或惡性的。通常生長遠快于良性腫瘤的惡性腫瘤侵襲鄰近組織并有時轉(zhuǎn)移，威脅生命。惡性腫瘤通常視為癌癥?？梢杂脵z測癌癥標(biāo)志物的本發(fā)明的組合物檢測到的癌癥的實例包括髓樣癌、頭頸癌、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食道癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、膽管癌、腎癌、膀胱、前列腺癌、睪丸癌、精原細胞瘤、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤和惡性黑素瘤，但不局限于此。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將所述用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物應(yīng)用于肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤和黑素瘤細胞系以檢查其中癌癥標(biāo)志物的表達水平。當(dāng)應(yīng)用所述組合物時，觀察到eIF;3m蛋白在來自具有癌癥的個體的組織中具有顯著高于來自正常個體的組織中的表達水平。按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了包含用于測量eIF;3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑的癌癥診斷試劑盒。本發(fā)明背景中的術(shù)語“診斷”是指，測定生物樣本或組織樣品中本發(fā)明的eIF;3m多肽或多核苷酸的有無，從而鑒定與所述基因的表達相關(guān)的疾病的存在或特征的過程。通過使用本發(fā)明的試劑盒測定所述eIF;3m多肽或編碼其的多核苷酸的表達水平可以實現(xiàn)癌癥標(biāo)志物的檢測。本發(fā)明的試劑盒可以包含用于測量所述癌癥診斷標(biāo)志物的表達水平的引物或探針，選擇性地識別所述癌癥標(biāo)志物的抗體或其保留抗原結(jié)合功能的片段和/或一種或多種適于分析所述多肽或多核苷酸的試劑或組合物。例如，用于定量分析本發(fā)明的多核苷酸或基因的診斷試劑盒可以包含至少一個與編碼所述eIF3m多肽的多核苷酸特異性地結(jié)合的寡核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒特征為，包括實施 RT-PCR所需要的必需元件。RT-PCR試劑盒包括對eIF3m的核苷酸序列或其部分序列具有特異性的引物對、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶、PCR引物和dNTP。只要其利用“mRNA表達水平的測量”的上下文中已知的分析方法，可以使用任何試劑盒而沒有限制。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的癌癥診斷試劑盒可以包含與本發(fā)明的eIF;3m 蛋白特異性地結(jié)合的抗體。只要其利用“蛋白表達水平的測量”的上下文中已知的分析方法，可以使用任何試劑盒而沒有限制。優(yōu)選的是ELISA試劑盒或蛋白芯片試劑盒。使用抗體測量蛋白表達水平是基于所述eIF;3m蛋白和其抗體之間抗原-抗體復(fù)合物的形成。為了測定蛋白表達水平，可以使用各種方法測量抗原-抗體的量。如本文所用的術(shù)語“抗原-抗體復(fù)合物”意指癌癥標(biāo)志物蛋白與對其具有特異性的抗體的結(jié)合產(chǎn)物。通過測量檢測標(biāo)記的信號大小，可以定量測定因此形成的所述抗原-抗體復(fù)合物。例如，可以根據(jù)可疑個體和正常對照之間抗體-抗原復(fù)合物的量的比較，通過測定所述可疑個體中eIF;3m蛋白表達水平的顯著升高來診斷癌癥。在這方面，用對本發(fā)明的 eIF;3m蛋白具有特異性的抗體處理來自具有可疑癌癥的個體的樣品，以形成可以使用試劑盒定量分析的抗原-抗體復(fù)合物，所述試劑盒是基于ELISA檢測、RIA檢測、夾心ELISA檢測、Western印跡檢測、放射免疫擴散檢測、ouchterlony免疫擴散檢測、火箭免疫電泳檢測、免疫組織染色檢測、免疫沉淀檢測、補體結(jié)合試驗、FACS、蛋白芯片檢測或免疫斑點檢測。所述分析數(shù)據(jù)與正常個體的分析數(shù)據(jù)的比較允許與eIF;3m蛋白表達升高有關(guān)的癌癥的診斷。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明涉及檢測eIF;3m多核苷酸或蛋白的方法，所述方法包括用測量eIF;3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑處理生物樣本，檢測所述試劑與與其互補的多核苷酸或蛋白的復(fù)合物，并定量比較個體和正常對照之間的復(fù)合物。詳細而言，可以在mRNA水平或蛋白水平檢測基因的表達。使用熟知的方法，可以實現(xiàn)從生物樣本分離mRNA或蛋白。如本文所用的術(shù)語“生物樣本”意指從中可以測量eIF3m的基因或蛋白表達水平的樣品。本發(fā)明中有用的生物樣本的實例包括組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、腦脊液和尿液，但不局限于此。在本發(fā)明檢測方法的實施方案中，可以將具有可疑癌癥的個體中的表達水平與正常對照中的基因表達水平進行比較，以診斷所述個體中的癌癥發(fā)病率。詳細地說，測量來自具有可疑癌癥的個體的生物樣品的本發(fā)明的標(biāo)志物的表達水平。將該水平與來自正常對照的生物樣品中測量的水平進行比較。當(dāng)所述個體中本發(fā)明的標(biāo)志物的表達水平高于所述正常對照中時，可以確定所述個體受到癌癥侵襲。在編碼本發(fā)明的eIF;3m多肽的多核苷酸被用作標(biāo)志物的情況下，所述方法包括
(a)提供生物樣本；(b)用測量eIF3m的表達水平的試劑處理所述生物樣本；(c)檢測所述試劑與與其互補的多核苷酸的結(jié)合產(chǎn)物；并且(d)定量比較個體和正常對照之間的所述結(jié)合產(chǎn)物。在本發(fā)明的eIF;3m多肽被用作標(biāo)志物的情況下，所述方法包括(a)提供生物樣本；
(b)用對所述eIF;3m蛋白具有特異性的抗體處理所述生物樣本；(c)檢測抗原-抗體復(fù)合物；并(d)定量比較個體和正常對照之間的所述復(fù)合物。按照本發(fā)明還一方面，本發(fā)明涉及用于癌癥的治療和預(yù)防的組合物，所述組合物包含作為活性成分的抑制eIF;3m多核苷酸的表達的寡核苷酸或抑制eIF;3m多肽的活性的抗體或其抗原-結(jié)合片段。在該方面的優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物可以包括抑制本發(fā)明的eIF3m多核苷酸的表達的物質(zhì)。所述eIF;3m表達抑制物質(zhì)可以選自siRNA、shRNA、適體和反義寡核苷酸。如本文所用的術(shù)語“siRNA(小干擾RNA) ”意指介導(dǎo)RNA干擾或基因沉默的約20 個核苷酸的小核酸分子。當(dāng)將siRNA引入細胞時，其被dicer識別從而降解編碼eIF3m的基因，導(dǎo)致eIF;3m基因的特異性抑制(knockdown)。術(shù)語“shRNA”是指短發(fā)夾RNA，其中siRNA靶序列的有義和反義序列被5_9個堿基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)隔開。如本文所用的術(shù)語“適體”是指長度為20-60nt的寡核糖核酸分子。取決于序列， 其具有不同三維結(jié)構(gòu)并且與特異性靶分子結(jié)合以有效地調(diào)節(jié)所述靶分子的功能。最近，RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象已被研究應(yīng)用于在基因水平控制蛋白表達的方法。通常，siRNA已表現(xiàn)出通過與mRNA特異性地結(jié)合來抑制蛋白表達，所述mRNA具有與靶基因互補的序列。為了干擾癌基因或轉(zhuǎn)移基因(metastagenes)的表達，可以將包含按照本發(fā)明的 siRNA或shRNA的組合物根據(jù)適用于基于這些RNA的基因治療的典型方法給予個體。例如， 可以按照 Filleur et al.，Cancer Res. ,63(14) :3919_22，2003 所述的方法，通過 siRNA 的低量靜脈內(nèi)注射來調(diào)節(jié)基因表達。為了增加siRNA的細胞攝取和穩(wěn)定性，按照Chien et al.，Cancer Gene Ther.，12 (3) 321-8，2005，也可以聯(lián)合注射 siRNA 與結(jié)合物?？梢酝ㄟ^直接化學(xué)合成(SuiG et al.，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-5520)或體外轉(zhuǎn)錄(BrummelkampTR et al.，(2002) Science 296 :550-553)制備包含在本組合物中的所述短干擾RNA分子(siRNA)，但是本發(fā)明不限于這些方法。此外，可以從基于RNA聚合酶III的啟動子表達經(jīng)設(shè)計克服siRNA的缺點的shRNA，所述啟動子包含在被引入細胞的腺病毒、慢病毒(rentiviral)或質(zhì)粒表達載體系統(tǒng)中，所述siRNA的缺點包括昂貴的siRNA生物合成和低轉(zhuǎn)染效率，這導(dǎo)致RNA干擾效果的短期持續(xù)性。使用siRNA加工酶(Dicer或RNaseIII)在細胞中將所述shRNA分子加工為功能性siRNA分子，并且隨后誘導(dǎo)靶基因的沉默。如本文所用的術(shù)語“反義”意指寡聚物具有核苷酸堿基的序列和亞基對亞基的骨架，所述骨架允許所述反義寡聚物與RNA中的靶序列通過Watson-Crick堿基配對雜交，從而在靶序列中形成RNA 寡聚物異源雙鏈，通常與mRNA雜交。所述寡聚物可以與所述靶序列具有嚴格的序列互補性或與其接近的互補性。這些反義寡聚物可以阻斷或抑制所述mRNA 的翻譯和/或修飾mRNA的加工以產(chǎn)生所述mRNA的剪接變體。因此，本發(fā)明的反義寡聚物是與編碼eIF;3m多肽的多核苷酸互補的反義寡聚物。對于基因治療，可以通過通常方法給予本發(fā)明的反義寡核苷酸。給予所述組合物可以防止或抑制癌基因表達。例如，如J. S.Kim et al. ,J controlled Release 53,175-182(1998)所述，通過靜電吸引將反義寡脫氧核苷酸裝載到基于多聚左旋賴氨酸的微顆粒載體上，并且靜脈內(nèi)注射所述裝載了寡核苷酸的微顆粒，但是本發(fā)明不限于此方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以包括已知治療劑，所述治療劑直接地或間接地與所述試劑結(jié)合或以未結(jié)合形式存在。能夠與抗體結(jié)合的治療劑包括但不限于，放射性核素、藥物、淋巴因子、毒素和雙特異性抗體。只要其當(dāng)與抗體結(jié)合或與siRNA、shRNA或反義寡核苷酸聯(lián)合給藥時能發(fā)揮對于癌癥的治療效果，在本發(fā)明中可以使用任何已知治療劑。放射性核素的實例包括但不限于，3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59Fe、9°Y、125I、 1311、和 186Re。本發(fā)明中有用的藥物和毒素包括依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、 阿霉素、道諾霉素、去甲柔紅霉素、氨喋呤、更生霉素、絲裂霉素、順鉬和順鉬類似物、博來霉素、埃斯培拉霉素(esperamicins)、5-氟尿嘧啶、美法侖(melphalan)和氮芥，但不限于此。通過抑制eIF;3m基因或蛋白表達，檢查eIF;3m特異性siRNA抑制癌發(fā)生的活性。與對照的比較表明細胞生長和細胞周期相關(guān)的表達模式受到調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了包含抑制eIF;3m蛋白活性的物質(zhì)的組合物。優(yōu)選地，所述抑制活性的物質(zhì)是特異性地識別eIF;3m蛋白的抗體。所述抗體包括所有單克隆抗體和嵌合抗體，所述單克隆抗體和嵌合抗體的人源化抗體和人抗體。只要抗體具有特異性地識別eIF3m的結(jié)合特性，則所述它們包括具有兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈的完整形式，或可以是抗體分子的功能性片段的形式。如本文所用的術(shù)語“抗體分子的功能性片段”意指至少保留抗原結(jié)合功能的片段，所述片段以Fab、F(ab' )、F(ab)2和Fv作為示例。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以包括適于其給藥模式的可接受的載體?；钚猿煞挚梢耘c藥學(xué)上可接受的媒介、賦形劑或添加劑組合。本發(fā)明中有用的藥學(xué)上可接受載體的實例包括生理鹽水、無菌水、林格液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇和脂質(zhì)體。它們可以單獨使用或聯(lián)合使用。必要的話，所述組合物還可以包含其他典型添加劑，例如抗氧化物、緩沖液等。根據(jù)給藥模式，所述組合物可以與稀釋劑、分散劑、表面活性劑，粘合劑和/或潤滑劑配制為注射劑型，例如水溶液、懸液、乳液等，或口服劑型例如丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑等。當(dāng)與載體結(jié)合時，對靶器官或組織具有特異性的抗體或配體可以使活性成分定向于所述器官或組織?？梢栽诒景l(fā)明中使用本領(lǐng)域已知的典型的媒介、賦形劑和添加劑。本發(fā)明并不限于所述媒介、賦形劑和添加劑的實例。所述組合物或制劑可以按照目的或需要通過適合的途徑以治療有效量給予個體。 所述藥物組合物可以口服給藥、胃腸外給藥、皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥或鼻內(nèi)給藥。對于局部免疫抑制治療，如果需要的話，可以使用包括病灶內(nèi)給藥在內(nèi)的適當(dāng)方法給予所述組合物。 胃腸外注射包括肌內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、動脈內(nèi)途徑、腹膜內(nèi)途徑和皮下途徑。包含所述反義寡核苷酸、siRNA或shRNA的組合物的治療有效量可以根據(jù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的各種因素而改變，所述因素包括待實現(xiàn)的反應(yīng)的種類和程度、患者的年齡、體重和健康狀況等。按照本發(fā)明的仍然另一方面，本發(fā)明涉及篩選癌癥治療劑的方法，所述方法包括用候選化合物處理表達eIF;3m多肽和/或多核苷酸的細胞并測量所述細胞中elFIM多肽或多核苷酸表達水平。在本發(fā)明的篩選方法中，所述候選化合物，如果誘導(dǎo)eIF;3m表達水平的增加，則被確定為致癌的。當(dāng)eIF;3m表達水平因而降低時，所述候選化合物被確定為可能的癌癥治療劑。按照所述篩選方法，可以由eIF;3m表達水平很容易地確定所述候選者的活性。本發(fā)明的有益效果如目前所述，eIF;3m可以用作癌癥標(biāo)志物，其允許以高敏感性和特異性診斷癌癥。 特別是，所述癌癥標(biāo)志物對于肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、直腸癌、黑素瘤和結(jié)腸癌的診斷是有用的。此外，當(dāng)給予個體時，eIF;3m表達調(diào)節(jié)劑可以通過抑制eIF;3m基因的超表達來防止癌癥的發(fā)作或進展。附圖簡述

圖1表示成對的患者組織中eIF3亞基的表達水平。使用表1所列的引物進行所有qRT-PCR反應(yīng)并且通過AQ方法定量。圖2表示癌細胞系和人結(jié)腸組織中eIF3m(真核翻譯因子: 亞基)的表達。圖3表示患者樣品中的eIF3m的表達升高。通過qRT_PCR分析來自結(jié)腸腺癌患者的20對正常-腫瘤組織的eIF;3m在轉(zhuǎn)錄水平的表達。圖4表示正常人組織和人癌細胞系中eIF;3m的Northern印跡。圖5表示用來自結(jié)腸癌患者的正常/腫瘤組織對的qRT-PCR和flfestern印跡的數(shù)據(jù)。圖6表示人組織中eIF3m的免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果。
圖7表示通過SiRNA沉默eIF3m的表達導(dǎo)致細胞增殖速率的降低。將eIFiBm siRNA-Ι轉(zhuǎn)染的HCT-116 (wt)細胞孵育96小時。陰性對照包括無siRNA的單獨緩沖液(BF) 和非人陰性對照SiRNA(NC)。圖8表示通過siRNA-3的elFIBm表達的沉默導(dǎo)致細胞增殖的降低。eIF3m siRNA-3 轉(zhuǎn)染的HCT-116(wt)細胞孵育96小時。陰性對照包括無siRNA的單獨緩沖液(BF)和非人陰性對照SiRNA(NC)。圖9表示在HCT-116細胞的免疫沉淀物中的eIF3m和RNA。(a)來自免疫沉淀的細胞裂解物的eIF3m的Western印跡。空白載體對照(pFLAG_CMV2)在輸入對照 (IC)或抗FLAG抗體結(jié)合的親和性凝膠的免疫沉淀物(IP)中未顯示出任何可檢出的條帶。然而，在pFLAG-CMV2-eIF;3m轉(zhuǎn)染的HCT-116細胞的IP中，出現(xiàn)具有指定大小的條帶。 (b)從免疫沉淀物提取后，在甲醛凝膠上分辨的RNA?？瞻纵d體對照未得到RNA，但是在 pFLAG-CMV2-eIF3m轉(zhuǎn)染的細胞中出現(xiàn)RNA。圖10表示相關(guān)分子的腫瘤學(xué)分析結(jié)果。圖11表示在eIF3m siRNA-1轉(zhuǎn)染后0、M、48、72和96小時，在HCT-116細胞中通過 Wfestern印跡檢測的巨噬細胞遷移抑制因子(MIF) (a)和金屬硫蛋白2A(MT2A) (b)的蛋白表達。還檢測了人β肌動蛋白，用于上樣對照(laoding control) 0 (c)在eIF3m siRNA-I 轉(zhuǎn)染后0、Μ、48、72和96小時，在HCT-116細胞中通過RT-PCR檢測的MIF和ΜΤ2Α的轉(zhuǎn)錄水平。圖12表示通過PCR產(chǎn)物測序確認的反應(yīng)的特異性。在eIF3msiRNA-l轉(zhuǎn)染后不同時間，在HCT-116細胞中通過qRT-PCR測量的(通過用β肌動蛋白mRNA表達標(biāo)準(zhǔn)化的相對定量)，MIF (a)和MT2A (b)的mRNA水平。圖13表示在eIF3m siRNA-I轉(zhuǎn)染后0,24,48,72和96小時，HCT-116細胞中細胞分裂周期25同系物(CDC25A)蛋白的可調(diào)型表達。還檢測了人β肌動蛋白，用于上樣對照。圖14表示當(dāng)沉默一正^！表達時，此！“-！化結(jié)腸癌細胞系的亞G0/G1群增加。處理后每M小時通過流式細胞儀測量siRNA轉(zhuǎn)染的細胞的核含量，以檢查細胞周期進程。BF和 NC對照在有絲分裂細胞周期階段未顯示出任何顯著的細胞周期差異。eIF3m siRNA-I處理在M小時增加亞G0/G1階段，并且保持升高，直至96小時。圖15表示處理后每M小時通過流式細胞儀測量siRNA轉(zhuǎn)染的細胞的核含量，以檢查細胞周期進程。整個培養(yǎng)期中，BF和NC對照中的亞G0/G1期沒有顯著差異，但是eIF;3m siRNA-3處理后的亞G0/G1階段升高，直至96小時。發(fā)明方式通過以下實施例可以獲得對本發(fā)明的更好的理解，提出這些實施例是為了舉例說明，而不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明。實施例1 結(jié)腸組織遵照赫爾辛基協(xié)定(Helsinki Treaty)，獲得人結(jié)腸組織。按照實驗方案從患者切除組織并保存在-80°C，直至使用。實施例2 細胞培養(yǎng)本發(fā)明所用的所有的細胞系獲自ATCC(American Type Culture Collection(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，Manassas，VA)和Korean Cell Line Bank(韓國細胞系庫)(首爾，韓國)。每種細胞系保持在補充了 10% 85(胎牛血清，Invitrogen)的維持液中。實施例3 實時定量RT-PCR使用Trizol試劑(Invitrogen)按照生產(chǎn)商使用說明，提取、洗滌總RNA。用DNA 酶處理I分離物，以去除殘留的基因組DNA，然后通過RNeasy柱^jiagen)進行純化。使用 Nanodrop 1000 (Thermo Scientific)定量 RNA。用數(shù)微克的總 RNA 合成 cDNA，使用 1μ 1 的在 50mM Tris-Hcl (pH8. 3)中的 50μΜ oligo(dT)作為引物，然后通過 Superscript III 轉(zhuǎn)錄酶 Gnvitrogen)在 20 μ 1 的含有 75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0. 5mM dNTP和 40U RNase Out (Invitrogen)的RT混合物中進行逆轉(zhuǎn)錄。通過與1 μ 1的RNaseHQ單位)在37°C孵育 20分鐘去除模板RNA。自10倍連續(xù)稀釋的克隆到pCR2. 1 Τ0Ρ0的擴增子，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線， 所述擴增子的范圍從1. OX 101°)拷貝/ y 1至1. OX IO2拷貝/ μ 1。使用通過Superscript RT III (Invitrogen, USA)和5pmoles的正向和反向引物(表1)合成的1/10的cDNA，在 QuantiFast SYBR Green PCR 預(yù)制混合物(Master mix, Qiagen, Germany)中，按照以下熱曲線(thermal profile)進行實時PCR分析在LightCycler480 (Roche Applied Science, Switzerland)上 50°C保持 2 分鐘，95°C保持 10 分鐘，95°C 30 秒 -58°C 30 秒 -72°C 30 秒， 重復(fù)40個循環(huán)。通過用GAPDH或ACTB標(biāo)準(zhǔn)化的相對定量(RQ)或絕對定量(AQ)法分析數(shù)據(jù)。表 權(quán)利要求
1.用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，其包含用于測量eIF;3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述用于測量eIF3m的mRNA表達水平的試劑與 eIF3m mRNA特異性地結(jié)合，并且選自引物對、探針和反義寡核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述用于測量eIF3m的蛋白表達水平的試劑是抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述癌癥標(biāo)志物在選自肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、黑素瘤和直腸癌的癌癥中被靶定。
5.癌癥診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求1-4中之一所述的組合物。
6.如權(quán)利要求5所述的癌癥診斷試劑盒，其基于RT-PCR試劑盒、競爭性RT-PCR試劑盒、實時RT-PCR試劑盒、DNA芯片試劑盒或蛋白芯片試劑盒。
7.檢測eIF;3m多核苷酸的方法，其包括(a)提供生物樣本；(b)用權(quán)利要求2所述的試劑處理所述生物樣本；(c)檢測所述試劑與與其互補的多核苷酸的結(jié)合物；以及(d)定量比較個體和正常對照之間的結(jié)合物。
8.檢測eIF;3m蛋白的方法，其包括(a)提供生物樣本；(b)用對所述eIF;3m蛋白具有特異性的抗體處理所述生物樣本；(c)檢測所形成的抗原-抗體復(fù)合物；以及(d)定量比較個體和正常對照之間的復(fù)合物。
9.用于癌癥治療和預(yù)防的組合物，其包含抑制eIF3m多核苷酸表達的寡核苷酸。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述寡核苷酸是對eIF;3m基因具有特異性的反義寡核苷酸、適體、siRNA或shRNA。
11.用于癌癥的治療和預(yù)防的組合物，其包含具有針對eIF3m多肽的抑制活性的抗體或其抗原-結(jié)合片段。
12.如權(quán)利要求9或11所述的組合物，其中所述癌癥選自肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、黑素瘤和直腸癌。
13.篩選癌癥的治療藥物的方法，其包括用候選化合物處理表達eIF;3m多肽和/或多核苷酸的細胞；并且測量所述細胞中 eIF3m多肽或多核苷酸表達水平。
全文摘要
本申請公開了檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，其包含用于測量eIF3m的mRNA或蛋白表達水平的試劑；包含所述試劑的癌癥診斷試劑盒；通過用所述試劑處理生物樣本以檢測與所述試劑特異性地結(jié)合的物質(zhì)并定量比較個體和正常對照之間的所述物質(zhì)來檢測eIF3m多核苷酸或蛋白的方法；以及用于癌癥的治療和預(yù)防的方法，其包括用于下調(diào)eIF3m多核苷酸或蛋白的表達的試劑。
文檔編號C12N15/11GK102282268SQ201080001653
公開日2011年12月14日 申請日期2010年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者李娟受, 洪性惠, 鄭珍淑, 金仁厚, 高晟豪 申請人:國立癌中心