專利名稱：一種用于遺傳轉(zhuǎn)化藻類的新型啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于遺傳轉(zhuǎn)化藻類的新型的啟動(dòng)子、含有該啟動(dòng)子的載體、以及使用該載體的藻類的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
利用作為恒久的且穩(wěn)定的能源的太陽光在能源對(duì)策考慮上是非常重要的。植物類的光合成是能夠最有效地將太陽光能量轉(zhuǎn)化為化學(xué)能量的良好的系統(tǒng)，不但吸收同化環(huán)境中的二氧化碳或過剩的營(yíng)養(yǎng)鹽，還釋放出氧氣。因此，利用植物的技術(shù)的開發(fā)作為能夠解決能源問題的技術(shù)，備受期待。在植物類中，藻類由于生存在大量存在的海水和淡水中，因此，藻類的量也是相當(dāng)大的，另外，藻類具有顯著光合成能力。并且，在藻類中還有產(chǎn)生不飽和脂肪酸或抗腫瘤化合物等有用化合物的種類。另外，硅藻類中有產(chǎn)生有用的無機(jī)物的藻，因此，利用硅藻類的被稱為生物礦化作用的技術(shù)備受關(guān)注。因此，藻類可以稱得上是作為有用資源的重要的生物。通常，在產(chǎn)業(yè)上利用生物的情況下，可使用導(dǎo)入有用的基因的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。為了闡明基因的功能，該遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)還可用于敲除特定基因并抑制其功能的用途。到目前為止，以硅藻和綠藻為中心進(jìn)行著藻類的遺傳轉(zhuǎn)化。但是，相關(guān)的方法是將內(nèi)在性的啟動(dòng)子分離，使基因與其結(jié)合并導(dǎo)入藻類中。其中，在內(nèi)在性的啟動(dòng)子的分離上花費(fèi)大量的精力和實(shí)踐，因此，并非有效的方法。另外，還存在藻類、尤其是海產(chǎn)藻類的遺傳轉(zhuǎn)化效率本身極其低的問題。另外，在藻類以外的植物或動(dòng)物的遺傳轉(zhuǎn)化中，廣泛應(yīng)用的并非內(nèi)在性的啟動(dòng)子， 而是來自病毒的啟動(dòng)子。例如，從十字花科植物感染的花椰菜花葉病毒(CaMV)分離的 CaMV35S啟動(dòng)子不僅限于十字花科植物，還可以用于廣泛植物的遺傳轉(zhuǎn)化。另外，動(dòng)物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化廣泛利用從細(xì)胞巨化病毒(CMV)分離的CMV啟動(dòng)子、從猿猴空泡病毒40(SV40) 分離的SV40啟動(dòng)子。與此相對(duì)，在藻類的遺傳轉(zhuǎn)化中，基本上還沒有使用外來性的病毒啟動(dòng)子的例子。例如，在非專利文獻(xiàn)1中，記載了使用CaMV35S啟動(dòng)子進(jìn)行硅藻Cycrotela cryptica遺傳轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)例，但是沒有得到遺傳轉(zhuǎn)化體。另一方面，在非專利文獻(xiàn)2中，記載了 使用CMV啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子以及勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子向硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)導(dǎo)入⑶S基因后， 所有的情況下，GUS ( β -葡萄糖苷酸酶)均得到表達(dá)。另外，在非專利文獻(xiàn)3中，記載了使用CaMV35S啟動(dòng)子膝溝藻(渦鞭毛藻) Amphidinium和Symbiodinium中導(dǎo)入⑶S基因后，⑶S均得到表達(dá)。但是，根據(jù)其它文獻(xiàn) (非專利文獻(xiàn)4)，無論多么拼命努力，其它的組均沒有出現(xiàn)膝溝藻的遺傳轉(zhuǎn)化成功的報(bào)告。在先技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1 =Dunahay, T. G.等，Journal of Phycology (藻類學(xué)雜志)，vol. 31， pp.1004-1012(1995)非專利文獻(xiàn)2 =Sakaue, K 等，Physiologia plantarum( 7 4 夕才口夕了 · 7°，> 夕，A )vol. 133，pp. 59-67(2008)非專利文獻(xiàn)3 =Lohuis, M. R.等，The Plant Journal (植物雜志)，vol. 13， pp.427-435(1998)非專利文獻(xiàn)4 :Walker，Τ. L.等，Journal of Phycology (藻類學(xué)雜志)，vol. 41， pp.1077-1093(2005)

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，雖然數(shù)量極少，但是存在使用來自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子等的病毒啟動(dòng)子來遺傳轉(zhuǎn)化藻類的報(bào)告例。但是，也有得不到遺傳轉(zhuǎn)化體或者無再現(xiàn)性的報(bào)告。另外，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人的見解，廣泛應(yīng)用于其它的植物類的遺傳轉(zhuǎn)化的CaMV35S啟動(dòng)子對(duì)藻類的適用范圍極其窄。 從藻類的存在量極大，另外，存在藏有各種有用性的種類出發(fā)，作為用于遺傳轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)子，期望能夠適用于廣泛種類的藻類的啟動(dòng)子。進(jìn)一步，從通常藻類、尤其是海產(chǎn)藻類的遺傳轉(zhuǎn)化效率非常低考慮，亟待高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的開發(fā)。因此，本發(fā)明所要解決的課題是提供能夠適用于廣泛種類的藻類、且高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述課題，進(jìn)行了深入的研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于被認(rèn)為是編碼柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)DNA病毒(CdebBNAV)的復(fù)制蛋白質(zhì)的基因的上游的啟動(dòng)子，能夠有效地遺傳轉(zhuǎn)化超出目的多種藻類，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及的新型啟動(dòng)子，其特征在于具有下述(1)-03)中任意一種堿基序列。(1)構(gòu)成非編碼區(qū)域的多核苷酸，所述非編碼區(qū)域位于編碼與CdebDNA病毒的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游；(2)缺失、置換或添加了上述多聚核苷酸(1)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的多聚核苷酸， 并且使編碼任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)在藻類細(xì)胞內(nèi)活化的多聚核苷酸；(3)在嚴(yán)格的條件下與上述多聚核苷酸(1)雜交，并且使編碼任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)在藻類細(xì)胞內(nèi)活化的多聚核苷酸。本發(fā)明涉及的載體的特征在于，該載體含有上述新型的啟動(dòng)子，以及編碼任意蛋白質(zhì)的基因。另外，本發(fā)明涉及的藻類的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，該遺傳轉(zhuǎn)化方法包括制備上述載體的工序，以及將上述載體導(dǎo)入藻類細(xì)胞的工序。


圖1為表示含有本發(fā)明涉及的啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)的一例子的圖；圖2為表示含有本發(fā)明涉及的啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)的一例子的圖；圖3為表示確認(rèn)通過本發(fā)明的方法遺傳轉(zhuǎn)化的藻類細(xì)胞等中所包含的導(dǎo)入基因的有無的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的電泳照片；
圖4為表示確認(rèn)通過本發(fā)明的方法遺傳轉(zhuǎn)化的藻類細(xì)胞等中所包含的導(dǎo)入基因的有無的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的電泳照片；圖5是表示用于確定本發(fā)明的啟動(dòng)子的核心元件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖；由該結(jié)果可知在編碼與CdebDNA病毒的復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游區(qū)域的-72到-33之間的序列中含有核心元件；圖6為表示含有本發(fā)明的啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子的圖；圖7為表示海產(chǎn)藻類筒柱藻(C. fusiformis)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的照片；(1) 表示使用了本發(fā)明的啟動(dòng)子的情況的結(jié)果，(2)表示未使用本發(fā)明的啟動(dòng)子的情況的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的第一啟動(dòng)子具有(1)構(gòu)成位于編碼與CdebDNA病毒的復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游的非編碼區(qū)域的多聚核苷酸。CdebDNA病毒是感染硅藻柔弱角毛藻的病毒。迄今為止，對(duì)藻類、尤其是海產(chǎn)藻類顯示感染性的病毒的報(bào)告例很少，近年來，本發(fā)明的發(fā)明人成功地從赤潮異彎藻(，74 K )、膝溝藻、硅藻等的藻類中分離了各種病毒。本發(fā)明涉及的CdebDNA病毒便是本發(fā)明的發(fā)明人分離的海產(chǎn)藻類感染性病毒之一。編碼與復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因，只要是與CdebDNA病毒的復(fù)制相關(guān)的基因并且積極地表達(dá)的基因，就沒有特別的限定。在本發(fā)明中，編碼區(qū)域是指經(jīng)過mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的部分，非編碼區(qū)域是指編碼區(qū)域以外的部分。即，非編碼區(qū)域是指位于ATG等的起始密碼子的上游的部分，除了未被 mRNA轉(zhuǎn)錄的部分，還包括被mRNA轉(zhuǎn)錄但未翻譯成蛋白質(zhì)的部分。通常，啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵的核心元件和促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，在導(dǎo)入基因時(shí)，特別重要的是利用核心元件。作為核心元件已知的有TATA框、啟動(dòng)子元件(Inr)、 下游(夕‘々> ^卜U —卜)元件等，作為調(diào)控元件已知的有CAAT框、GATA框等。本發(fā)明的發(fā)明人調(diào)查了編碼與CdebDNA病毒的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游區(qū)域的堿基序列，發(fā)現(xiàn)了作為CAAT框I的5，-CAAT-3，、作為GATA框的5，-WGATAR-3，(式中，W表示A或T，R 表示A或G)、以及作為啟動(dòng)子元件(Inr)的5’ _YYA+1N(A/T)YY_3’(式中，Y表示C或Τ)， 但是沒有發(fā)現(xiàn)常見于真核生物等的啟動(dòng)子的TATA框。因此，上述基因的上游序列中發(fā)現(xiàn)的 Inr在羽紋目硅藻(羽狀目硅藻)和輻射目硅藻(中心目硅藻)兩者中作為核心元件發(fā)揮作用，認(rèn)為可以遺傳轉(zhuǎn)化，但是另一方面，使用含有與上述Inr序列酷似的^ir的羽紋目硅藻內(nèi)在性啟動(dòng)子(Cf fcpA-lA)時(shí)，不能遺傳轉(zhuǎn)化輻射硅藻目硅藻。結(jié)論認(rèn)為用本發(fā)明涉及的多聚核苷酸(1)能夠較高地發(fā)揮遺傳轉(zhuǎn)化，至少不是TATA框或啟動(dòng)子元件等的原因， 極有可能是完全未知的序列作為核心元件在發(fā)揮作用。作為上述多聚核苷酸(1)可以舉出具有序列號(hào)1和序列號(hào)5的堿基序列的多聚核苷酸。并且，序列號(hào)5的堿基序列相當(dāng)于編碼與CdebDNA病毒的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游序列中的從Inr上游的大約30個(gè)堿基開始的大約40個(gè)堿基，在該序列中，Inr根本不能認(rèn)為是CAAT框或GATA框。本發(fā)明涉及的第二啟動(dòng)子為( 缺失、置換或添加了上述多聚核苷酸(1)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的多聚核苷酸，并且使編碼任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)在藻類細(xì)胞內(nèi)活化的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸O)中，缺失、置換或添加的核苷酸的數(shù)目?jī)?yōu)選為1以上200以下，更優(yōu)選為1以上100以下，進(jìn)一步優(yōu)選為1以上70以下，進(jìn)一步優(yōu)選為1以上30以下， 進(jìn)一步優(yōu)選為1以上20以下，進(jìn)一步優(yōu)選為1以上10以下，特別優(yōu)選為1以上5以下。本發(fā)明涉及的第三啟動(dòng)子為( 在嚴(yán)格的條件下與上述多聚核苷酸(1)雜交，并且使編碼任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)在藻類細(xì)胞內(nèi)活化的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸(3)中，所謂嚴(yán)格的條件是指在含有0. SDS的2X SSC中、在 65°C下雜交后，用0. IX SSC-O· ISDS洗滌2次。另外，在上述多聚核苷酸( 和C3)中，所謂使編碼任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)在藻類細(xì)胞內(nèi)活化的多聚核苷酸是指通過導(dǎo)入到藻類細(xì)胞內(nèi)，可以使結(jié)合于其下游的編碼任意蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸(2)和(3)中，與上述多聚核苷酸(1)的同源性優(yōu)選為50%以上，更優(yōu)選為70%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為80%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為 95%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上，特別優(yōu)選為99%以上。上述多聚核苷酸(1)-(3)可以從編碼與CdebDNA病毒或其變異體的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游分離。但是，也可以化學(xué)合成。這些多聚核苷酸(1)-03)可以從模板通過PCR擴(kuò)增使用。本發(fā)明的載體含有上述啟動(dòng)子和編碼任意的蛋白質(zhì)的基因。載體的種類只要是能夠?qū)朐孱惣?xì)胞的載體，就沒有特別的限定，可以使用質(zhì)粒載體和病毒載體中的任意一種。但是，由于很難說感染藻類、尤其是海產(chǎn)藻類的病毒的研究已經(jīng)得到充分發(fā)展，因此優(yōu)選使用質(zhì)粒載體。在此，“任意的蛋白質(zhì)”沒有特別的限定，只要是期望生產(chǎn)的有用的蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明涉及的載體還可以含有通常的載體所含有的其它的序列。作為相關(guān)的序列，例如可以舉出用于確定導(dǎo)入了本發(fā)明的載體的藻類的標(biāo)記基因、或在藻類細(xì)胞中作用的終止子。作為本發(fā)明的載體的制備方法，可以使用通常的方法。例如，將上述各序列與供體載體用限制性內(nèi)切酶剪切后退火(了二一 U )，通過DNA連接酶連接即可?；蛘撸部梢酝ㄟ^利用了 clonase (々口 f 一 S )反應(yīng)的簡(jiǎn)單的公知方法，將各序列克隆到載體。本發(fā)明涉及的藻類的遺傳轉(zhuǎn)化方法，特征在于，包括制備上述載體的工序，以及將上述載體導(dǎo)入藻類細(xì)胞的工序。本發(fā)明的載體的制備方法如上所述，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。作為本發(fā)明的載體導(dǎo)入藻類細(xì)胞的方法，可以使用基因槍法、玻璃珠攪拌法、微量注射法、農(nóng)桿菌法(7 V 口 〃夕于‘” &法)、醋酸鋰法、磷酸鈣法、原生質(zhì)體法等公知的方法。但是，在海產(chǎn)藻類的情況下，需要在高鹽濃度的培養(yǎng)基中增殖，因此，電穿孔法不適合。利用本發(fā)明的載體遺傳轉(zhuǎn)化的藻類細(xì)胞能夠通過利用與導(dǎo)入的標(biāo)記基因相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)來確定。實(shí)施例以下通過列舉實(shí)施例來更具體地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明根本不受下述實(shí)施例的限制，可以在符合前述和后述的宗旨的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)卦黾幼兏M(jìn)行實(shí)施，它們均包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1本發(fā)明涉及的CdebDNA病毒啟動(dòng)子的分離(1)感染海產(chǎn)藻類的病毒的基因組DNA的提取按照 Tomaru，Y.等，Aquatic Microbial Ecology, vol. 50，pp. 103-112(2008) 記載的方法，從以輻射硅藻目硅藻柔弱角毛藻為宿主的柔弱角毛藻DNA病毒(CdebDNAV) CdebDNAV 18株提取基因組。具體地，首先，通過用0. 22 μ m過濾器(MILLIP0RE社制，Millex-GS,孔徑 0. 22 μ m)將病毒液(IOmL)過濾，除去藻細(xì)胞的碎片等。向得到的濾液中添加40%聚乙二醇6000溶液(Woko社制)使得最終濃度為10W/V%，在4°C下靜置一晚。將該液轉(zhuǎn)移至離心分離用試管(Nalgen社制，UltraBottleAssemblies)中，使用超速離心機(jī)(BECKMAN社制， Ultracentrifuge L8-70M)在57000X g、4°C下離心分離1. 5小時(shí)后，除去其上清液。通過向得到的沉淀中添加混合磷酸緩沖液(IOmM磷酸二氫鈉、IOmM磷酸氫鈉，pH 7.2, 5mL)，洗滌病毒粒子。再次，在217000Xg、4°C下離心分離4小時(shí)，同樣地除去其上清液后，將得到的沉淀溶解到滅菌后的精制水(Millipore社制，milliQ(注冊(cè)商標(biāo))，300yL)中。將該溶液轉(zhuǎn)移至1. 5mL容量的微量離心管(印pendorf管)，添加蛋白水解酶K和10%肌氨酰使得各自最終濃度為lmg/mL和lw/V%，在55°C下恒溫放置1. 5小時(shí)。然后，使用通常的方法進(jìn)行苯酚/氯仿處理和氯仿處理，在得到的上清液中添加其十分之一量的3M醋酸鈉(pH 4. 8)，進(jìn)一步添加其2. 5倍量的乙醇。將該溶液在_80°C下靜置1小時(shí)。然后，使用微量高速離心機(jī) (KUB0TA社制，KUB0TA3740)在14000rpm、4°C下離心分離10分鐘，將得到的沉淀用70%乙醇洗滌后，干燥。將其溶解到滅菌milliQ水(20yL)中，得到DNA溶液。進(jìn)一步，使用上述文獻(xiàn)(TomarU，Y.等Q008))記載的十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)進(jìn)行精制。首先，向上述DNA溶液中添加TE緩沖液(IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，ImM EDTA (pH 8.0)),使其總量為 200 μ L。向該 DNA 溶液中添加 CTAB 溶液(1. 6Μ NaCl, 0. IM EDTA, 2w/v% CTAB, 200 μ L)，在 65°C下恒溫放置1小時(shí)。向該溶液添加氯仿G00 μ L)，振動(dòng)攪拌5分鐘后，使用前述的微量高速離心機(jī)在14000rpm、4°C下離心分離10分鐘。向該溶液中添加2倍量的乙醇，在_80°C 下靜置1小時(shí)。然后，使用相同的微量高速離心機(jī)，在14000rpm、4°C下離心分離10分鐘，將得到的沉淀用70%乙醇洗滌后，干燥。將該沉淀溶解到滅菌milliQ水(300yL)中，得到 DNA溶液。(2) CdebDNA病毒啟動(dòng)子的分離將上述⑴得到的CdebDNA病毒的基因組DNA的序列信息使用Blast (DDBJ)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較，進(jìn)一步使用ORF finder (NCBI)，檢索CdebDNA病毒DNA所含的0RF，檢測(cè)出編碼可認(rèn)為與病毒的復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)的區(qū)域。將該序列中的認(rèn)為是翻譯起始點(diǎn)的ATG序列的上游+107至-370的區(qū)域，通過使用了 CdPlL/attBl引物(序列號(hào)2)和CdPl_2R/attB4引物(序列號(hào)3)的PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。并且，在序列號(hào)2中5-31的堿基序列和序列號(hào)3中 5- 的堿基序列，顯示為用于后述的質(zhì)粒的構(gòu)筑的BP clonase反應(yīng)所必要的attB序列。另外，得到的CdebDNA病毒啟動(dòng)子的堿基序列如序列號(hào)1所示。并且，序列號(hào)1中所示的ATG 為起動(dòng)密碼子，不含在啟動(dòng)子中。PCR反應(yīng)的條件如以下所示。作為PCR反應(yīng)液，混合10X緩沖液(TaKaRa社制， 5 μ L)、dNTP Mix (TaKaRa 社制，4 μ L)、Ex Taq (TaKaRa 社制，0· 25 μ L, 5U/ μ L)、CdebDNA 病毒的基因組DNA (1 μ L)、以及2種引物(1 Opmol/ μ L，各5 μ L)，最后添加混合滅菌miIliQ水使總量為50 μ L。接著，重復(fù)在98. 0°C下10秒、在45. 0°C下30秒、72. 0°C下60秒的循環(huán) 40次，最后在72. 0°C下反應(yīng)5分鐘。為了確認(rèn)片斷的擴(kuò)增，進(jìn)行了電泳。電泳使用TAE緩沖液(三醋酸緩沖液)和瓊脂糖S (二 7 # > ”一 >社制)1. 5%凝膠。作為電泳用試劑，使用向PCR產(chǎn)物各9 μ L分別添加IOX加樣緩沖液(TaKaRa社制)IyL混合而成的混合物。另外，作為DNA分子量標(biāo)記使用IOObp Ladder (，夕■一)(Τ0Υ0Β0社制，代碼No. DNA_030x，2 μ L)，同時(shí)進(jìn)行電泳。另夕卜， 使用Mupid電泳槽(ADVANCE社制)，在100V的條件下電泳約30分鐘。電泳結(jié)束后，使用溴化乙錠，通過常規(guī)方法(Sambrook and Russell 2001)染色，在紫外線照射下拍攝照片。實(shí)施例2含有本發(fā)明涉及的CdebDNA病毒啟動(dòng)子的載體的制備(1)各輸入性克隆質(zhì)粒的制備使用Multisite Gateway (注冊(cè)商標(biāo))Pro Kit (invitrogen 社制)制備分別導(dǎo)入了由上述實(shí)施例1得到的CdebDNA病毒啟動(dòng)子、作為導(dǎo)入基因的耐博萊霉素基因(ble) (Drocourt，D.等，Nucleic Acids Research, 18, p. 4009 (1990)),以及筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)的 fcp 終止子(Poulsen, N.等，F(xiàn)EBSJournal，272， pp. 3413-3423(2005))的輸入性克隆質(zhì)粒。具體地，利用30% PEG8000/30mM氯化鎂溶液(invitrogen社制)將具有用于質(zhì)粒的構(gòu)筑的clonase反應(yīng)所必要的attB序列的、上述實(shí)施例1中得到的CdebDNA病毒啟動(dòng)子溶液精制。即，向CdebDNA病毒啟動(dòng)子溶液(25 μ L)中添加滅菌milliQ水(75 μ L)形成100 μ L的溶液。向該溶液中添加混合30% PEG8000/30mM氯化鎂溶液(50 μ L)，使用微量高速離心分離機(jī)(KUB0TA社制，KUB0TA3740)在HOOOrpm下離心分離15分鐘。然后，取出上清液，將得到的沉淀溶解到滅菌milliQ水(10 μ L)中。接著，將該溶液(50fmoles)與供體載體(invitrogen社制，pD0NR221 P1-P4, IOOng/μ L)混合，通過向該溶液中添加滅菌 milliQ水形成總量為SyL的混合液。并且，該供體載體具有用于質(zhì)粒的構(gòu)筑的BP clonase 反應(yīng)所必要的attP序列。向該混合液中進(jìn)一步添加混合BP clonase (商標(biāo))Il酶混合物 (Enzyme Mix) (invitrogen社制，2 μ L)，在25°C下反應(yīng)1小時(shí)。然后，向反應(yīng)液中添加蛋白水解酶!((invitrogen社制，1 μ L)，在37°C下處理10分鐘。將該反應(yīng)液(2. 5 μ L)混合到 One Shot (注冊(cè)商標(biāo))Mach 1 (注冊(cè)商標(biāo))TIk化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(T1E chemically competent cells) (invitrogen社制，25 μ L)中，在冰上靜置30分鐘。然后，在42°C下進(jìn)行30秒熱激處理后，立刻轉(zhuǎn)移至冰上，靜置2分鐘。然后，添加SOCGnvitrogen社制，250mL)，在37°C 下振動(dòng)培養(yǎng)1. 5小時(shí)。將培養(yǎng)的菌液075 μ L)涂抹到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl、l. 5%瓊脂)。將該培養(yǎng)基在7 ^千^ 工一力一恒溫箱(夕4〒？夕社制)內(nèi)在37°C下倒置培養(yǎng)一晚(10小時(shí)左右)。將得到的菌落用接種環(huán)接種到LB液體培養(yǎng)基(IOmL)上，在37°C下振動(dòng)培養(yǎng)一晚。使用Pure Yield 質(zhì)粒中量純化系統(tǒng)(PlasmidMinipr印System) (Promega社制)從該培養(yǎng)液(3mL)提取導(dǎo)入了具有LRclonase反應(yīng)所必要的attL序列的CdebDNA病毒啟動(dòng)子的輸入性克隆質(zhì)粒。另外，與上述實(shí)施例1同樣地?cái)U(kuò)增具有用于質(zhì)粒的構(gòu)筑的BP clonase反應(yīng)所必要 attB序列的耐博萊霉素基因(ble)，與上述同樣地導(dǎo)入到作為具有BP clonase反應(yīng)所必要的attP序列的供體載體的pD0NR221 P4r_P3r，得到導(dǎo)入了具有LR clonase反應(yīng)所必要的 attL序列的抗生素耐藥性基因的輸入性克隆質(zhì)粒。進(jìn)一步，與上述實(shí)施例1同樣地?cái)U(kuò)增具有用于質(zhì)粒的構(gòu)筑的BP clonase反應(yīng)所必要attB序列的筒柱藻的fcp終止子，與上述同樣地導(dǎo)入到作為具有BP clonase反應(yīng)所必要的attP序列的供體載體的pD0NR221 P3-P2，得到導(dǎo)入了具有LR clonase反應(yīng)所必要的 attL序列的終止子的輸入性克隆質(zhì)粒。(2)目標(biāo)質(zhì)粒的制備fflil^ffi Gateway (iiil ) Vector Conversion System with One Shot ( 冊(cè)商標(biāo))ccdB Survival (注冊(cè)商標(biāo))感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen社制)，向pBluescript SK-(Stratagene社制)中組合具有LR clonase反應(yīng)所必要的attR序列的Reading Frame Casette，制備目標(biāo)質(zhì)粒。首先，對(duì)于pBluescript SK-Q μ g)，使用限制性內(nèi)切酶EcoRI 20U (Τ0Υ0Β0社制， ου/μ L)在37°C下消化3小時(shí)。通過按照常規(guī)方法向該反應(yīng)液中添加乙醇，使DNA沉淀回收。接著，使用T4DNA聚合酶使末端平滑化。即，向回收的DNA中添加10X緩沖溶液 (5 μ L)、2. 5mM dNTP (TAKARA 社制，2 μ L)、T4DNA 聚合酶(Τ0Υ0Β0 社制，0. 5U/ μ L，1 μ L)以及滅菌milliQ水(42yL)，制備總量為50yL的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在12°C下恒溫放置15 分鐘。立刻向該反應(yīng)液中添加滅菌milliQ水(350 μ L)，按照常規(guī)方法進(jìn)行苯酚/氯仿處理和氯仿處理后，持續(xù)進(jìn)行乙醇沉淀回收DNA。接著，為了防止用限制性內(nèi)切酶剪切后的質(zhì)粒再次環(huán)化，使用 CIAP(TaKaRa 社制，Calfintestine Alkaline Phosphatase)進(jìn)行該剪切碎片的5’末端的脫磷酸處理。向?qū)嵤┝似交幚淼腄NA中添加10XCIAP緩沖液(5 μ L) 和CIAP (0. IU/μ L, 1 μ L)，制備反應(yīng)液，利用滅菌milliQ水使得總量為50 μ L。將該反應(yīng)液在37°C下恒溫放置15分鐘，繼續(xù)在56°C下恒溫放置15分鐘后，再次添加CIAP (0. IU/ μ L， 1口0，在371下恒溫放置15分鐘，繼續(xù)在56°C下恒溫放置15分鐘。向該反應(yīng)液中分別添加10% SDS溶液O. 5yL)、500mM EDTA溶液(0. 5 μ L)、蛋白水解酶K溶液QOmg/μ L， 0. 5μ L)后，在56°C下恒溫放置30分鐘，繼續(xù)在75°C下恒溫放置10分鐘。然后，按照常規(guī)方法實(shí)施苯酚/氯仿處理和氯仿處理。接著，通過乙醇沉淀回收DNA，溶解到滅菌milliQ水 (10 μ L)中。將得到的具有平滑末端的pBluescript SK-和 Reading Frame Casette A (invitrogen 社制，RfA)混合，使用 pGEM-T Vector Systems Kit (Promega 社制)附帶的 T4DNA連接酶連接。首先，向高壓釜滅菌后的0. 2mL容量的PCR用試管中添加2 X快速連接緩沖液(Promega社制，5 μ L) ^pBluescript SK-(lOOng/μ L, 0. 5 μ L)、RfA (5ng/μ L，2 μ L)、 T4DNA連接酶(卩1~011^83社制，3。/^1^，1口1^)和滅菌milliQ水(1. 5 μ L)，制備總計(jì)為10 μ L 的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在室溫下保存1小時(shí)，在4°C下恒溫放置一晚(16小時(shí)以上)。將該連接性(’彳夕.'一 * 3 > )溶液(5μ L)混合到 ccdB SurvivalCompetent Cells (invitrogen 社制，50 μ L)，在冰上靜置30分鐘。然后，在42°C進(jìn)行30秒熱激處理后，立刻轉(zhuǎn)移到冰上，靜置2分鐘。接著，添加S0C(250mL)，在37°C下振動(dòng)培養(yǎng)1. 5小時(shí)。將培養(yǎng)的菌液(300 μ L) 涂抹到含有25 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)基上。將該培養(yǎng)基在、 千〉工一力一恒溫箱內(nèi)在37°C下倒置培養(yǎng)一晚。將得到的菌落用接種環(huán)接種到LB液體培養(yǎng)基(IOmL)上，在37°C下振動(dòng)培養(yǎng)一晚。使用Pure Yield質(zhì)粒中量純化系統(tǒng)(Promega社制)從該培養(yǎng)液(3mL)提取目標(biāo)質(zhì)粒。(3)表達(dá)克隆質(zhì)粒載體的制備通過使用Multisite Gateway Pro Kit (invitrogen 社制)在上述實(shí)施例 2(1)中得到的輸入性克隆質(zhì)粒與上述實(shí)施例2 (2)中得到目標(biāo)質(zhì)粒之間進(jìn)行LRclonase反應(yīng)，制備啟動(dòng)子、抗生素耐藥性基因以及終止子連接而成的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體。具體地，將分別組合了啟動(dòng)子、抗生素耐藥性基因、終止子的三種輸入性克隆質(zhì)粒 (分別lOfmoles)和目標(biāo)載體(20fmoles)混合，進(jìn)一步通過添加滅菌milliQ水制備總量為8μ L的混合液。向該溶液中添加混合LR ClonaseII PLUS Enzyme Mix (invitrogen社制，2yL)，在25°C下反應(yīng)16小時(shí)。然后，向該反應(yīng)液中添加蛋白水解酶!((invitrogen社制，1 μ L)，在37°C處理10分鐘。將該反應(yīng)液(2. 5 μ L)混合到One Shot (注冊(cè)商標(biāo))Mach 1(注冊(cè)商標(biāo))TIkK學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen社制，25 μ L)中，在冰上靜置30分鐘。然后，在42 °C下進(jìn)行30秒熱激處理后，立刻轉(zhuǎn)移至冰上，靜置2分鐘。然后，添加SOC (250mL)， 在37°C下振動(dòng)培養(yǎng)1. 5小時(shí)。將培養(yǎng)的菌液075 μ L)涂抹到含有50 μ g/mL氨芐西林的LB 瓊脂培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)基在7 ^千- 一力一恒溫箱內(nèi)在37°C下倒置培養(yǎng)一晚。將得到的菌落用接種環(huán)接種到LB液體培養(yǎng)基(IOmL)上，在37°C下振動(dòng)培養(yǎng)一晚。使用Pure Yield 質(zhì)粒中量純化系統(tǒng)(Promega社制)從該培養(yǎng)液(3mL)提取表達(dá)克隆質(zhì)粒載體。G) DNA序列的確認(rèn)為了確認(rèn)制備得到了作為目標(biāo)的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體，使用雙脫氧法(Dideoxy)確定堿基序列。使用上述實(shí)施例2 (3)制備的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體(200ng)為模板，進(jìn)行循環(huán)序列測(cè)定PCR。其反應(yīng)條件如以下所示。反應(yīng)液(IOyL)由模板DNAdOOng/μ LJyL)、Big Dye 終結(jié)者循環(huán)測(cè)序(Big Dye Terminator CycleSequencing)ver. 3. 1 (AppliedBiosystems 社制，0. 5 μ L)、5X序列測(cè)定緩沖液O μ L)、引物(1. 6pmol/ μ L，0. 66 μ L)、滅菌蒸餾水 (4.84yL)構(gòu)成。引物使用Μ13Μ3引物(序列號(hào)4)。作為反應(yīng)條件，在95°C下加熱5分鐘后，進(jìn)行96°C下10秒、50°C下5秒、60°C下4分鐘的反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至1. 5mL容量的微量離心管，添加3M醋酸鈉(1 μ L)、99· 5%乙醇(25 μ L)和125mM EDTA 溶液(1 μ L)，用手指彈的方式進(jìn)行充分混合后，在室溫下放置15分鐘。在14000rpm、4°C 下離心分離20分鐘后，用黃色槍頭(4 - 口一f 7 )小心除去上清液，添加70%乙醇 (35 μ L)，充分混合。再次，在14000rpm、4°C下離心分離10分鐘后，用黃色槍頭將上清液完全除去，在開蓋的狀態(tài)下，在室溫下放置10分鐘，使沉淀干燥。向干燥的顆粒中添加甲酰胺(Applied Biosystems社制，10 μ L)，使用高知大學(xué)綜合研究中心基因?qū)嶒?yàn)設(shè)施內(nèi)的ABI PRISM(注冊(cè)商標(biāo))3100-AVant Genetic Analyzer (Applied Biosystems社制)進(jìn)行解析。預(yù)先，使用基因解析軟件Vector NTI Advance Ver 10. O (invitrogen 社制，http://www. invitrogen. com/vntigateway)，向目標(biāo)質(zhì)粒的堿基序列中組合啟動(dòng)子、抗生素耐藥性基因以及終止子的堿基序列，由此，制作表達(dá)基因質(zhì)粒載體的堿基序列。接著，通過使用Vector NTI Advance Ver 10. O的AlignX進(jìn)行校正(τ·，O >卜)，將該在計(jì)算機(jī)上制作的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體的堿基序列與通過上述方法實(shí)驗(yàn)確定的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體的堿基序列進(jìn)行比較，確認(rèn)到上述實(shí)施例2C3)制備的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體中導(dǎo)入了目標(biāo)基因。
得到的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。實(shí)施例3含有本發(fā)明涉及的CdebDNA病毒啟動(dòng)子的載體的制備使用耐^ 一義七才7〗J * >基因(nat) (Krugel等，1993年)作為抗生素耐藥性基因，作為終止子使用來自假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)的fcp終止子 (Poulsen, N.等，Journal of Phycology, 42, pp. 1059-1065 (2006))，與上述實(shí)施例 2 同樣地制備含有CdebDNA病毒啟動(dòng)子的載體。得到的表達(dá)克隆質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖2所示。比較例1-4含有以往病毒啟動(dòng)子的載體的制備與上述實(shí)施例2同樣地操作，制備具有羽紋目硅藻的內(nèi)在性啟動(dòng)子，另外，導(dǎo)入了耐博萊霉素基因(ble)作為抗生素耐藥性基因和筒柱藻的fcp終止子作為終止子的質(zhì)粒載體(比較例1)、以及制備具有輻射目硅藻的內(nèi)在性啟動(dòng)子，另外，導(dǎo)入了耐7 —> 七才^ * >基因(nat)作為抗生素耐藥性基因和來自假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)的fcp終止子作為終止子的質(zhì)粒載體(比較例2)。另外，與上述實(shí)施例2同樣地操作，制備具有來自花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子(CaMV 啟動(dòng)子)，另外，導(dǎo)入了耐博萊霉素基因(ble)作為抗生素耐藥性基因和筒柱藻的fcp終止子作為終止子的質(zhì)粒載體(比較例3)、以及制備導(dǎo)入了耐^ 一才^ 'J ν >基因(nat) 作為抗生素耐藥性基因和來自假微型海鏈藻的fcp終止子作為終止子的質(zhì)粒載體(比較例 4)。實(shí)施例4羽紋目硅藻的遺傳轉(zhuǎn)化使用上述實(shí)施例2、上述比較例1以及上述比較例3的質(zhì)粒載體，將羽紋目硅藻三角褐指藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。具體地，使各質(zhì)粒載體附著到平均粒徑l.lym的鎢粒子M17上。另外，將羽紋目硅藻三角褐指藻以每個(gè)培養(yǎng)基5X107細(xì)胞涂抹到固體培養(yǎng)基上。使用粒子槍(Bio-Rad社制， Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System)，將上述鎢粒子以 He 氣壓 1350psi 或IlOOpsi打入細(xì)胞內(nèi)。接著，用含有博萊霉素150μ g/mL的1. 0%瓊脂f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)該細(xì)胞。結(jié)果如表1所示。另外，用PCR確認(rèn)用上述含抗生素培養(yǎng)基繁殖的細(xì)胞的菌落進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。使用IOOmL的培養(yǎng)基培養(yǎng)繁殖的菌落，回收藻類細(xì)胞后，通過與上述實(shí)施例1 (1)同樣的方法， 提取基因組DNA。以得到的基因組DNA作為模板，使用與導(dǎo)入的抗生素基因(ble)特異性結(jié)合的引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)的條件基本上與上述實(shí)施例1(2)同樣地操作，使循環(huán)次數(shù)為 40次，退火溫度為60°C。對(duì)得到的擴(kuò)增DNA分析后的電泳照片如圖3所示。圖3中，“M”為分子量標(biāo)記，“1”為導(dǎo)入了抗生素基因(ble)的質(zhì)粒載體的泳道，“2”為三角褐指藻野生菌株的泳道，“3-5”為用含有來自花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子和抗生素基因(ble)的質(zhì)粒載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的菌株的泳道，“6-8”為用含有本發(fā)明涉及的啟動(dòng)子和抗生素基因(ble)的質(zhì)粒載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的菌株的泳道。實(shí)施例5輻射硅藻目硅藻的遺傳轉(zhuǎn)化使用實(shí)施例3、上述比較例2以及上述比較例4的質(zhì)粒載體，與上述實(shí)施例4同樣地操作，將輻射目硅藻角毛藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。但是，向培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基添加500yg/mL ) 一義七才；^丨」* >。結(jié)果如表1所示。
[表 1]
權(quán)利要求
1.一種啟動(dòng)子，其特征在于，該啟動(dòng)子具有下述(1)-(3)任意一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)，(1)構(gòu)成非編碼區(qū)域的多核苷酸，所述非編碼區(qū)域位于編碼與CdebDNA病毒的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游；(2)缺失、置換或添加了上述多聚核苷酸(1)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的多聚核苷酸，并且使編碼任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)在藻類細(xì)胞內(nèi)活化的多聚核苷酸；(3)在嚴(yán)格的條件下與上述多聚核苷酸(1)雜交，并且使編碼任意蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)在藻類細(xì)胞內(nèi)活化的多聚核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其中，上述多聚核苷酸(1)具有序列號(hào)5的堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其中，上述多聚核苷酸(1)具有序列號(hào)1的堿基序列。
4.一種載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的啟動(dòng)子，以及編碼任意蛋白質(zhì)的基因。
5.一種藻類的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，該遺傳轉(zhuǎn)化方法包括制備權(quán)利要求4所述的載體的工序，以及將上述載體導(dǎo)入藻類細(xì)胞的工序。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種可適用于廣泛種類的藻類的、且高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明涉及的啟動(dòng)子以具有構(gòu)成非編碼區(qū)域的多核苷酸等為特征，所述非編碼區(qū)域位于編碼與CdebDNA病毒的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的上游。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102292440SQ20108000517
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者外丸裕司, 足立真佐雄, 長(zhǎng)崎慶三 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人高知大學(xué)