專利名稱：粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化體以及異源蛋白質(zhì)的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化體以及異源蛋白質(zhì)的制造方法。
背景技術：
利用轉(zhuǎn)化體制備異源蛋白質(zhì)的技術在各個產(chǎn)業(yè)被廣泛應用，所述轉(zhuǎn)化體是利用基因重組技術導入了編碼宿主本身無法生產(chǎn)的異源蛋白質(zhì)的外源基因(異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因)的轉(zhuǎn)化體。在這樣的異源蛋白質(zhì)的制造中，尤其是制造來源于真核生物的蛋白質(zhì)的情況下，認為作為宿主利用屬于真核生物的微生物的方法較為理想。尤其是，從酵母中不含有對人體帶來不良影響的物質(zhì)，且其為單細胞而容易操作等方面考慮，開發(fā)了很多將酵母用作宿主的表達系統(tǒng)。其中，已知與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等出芽酵母相比，屬于裂殖酵母的khizosaccharomyces pombe (下稱粟酒裂殖酵母)的細胞周期和染色體結(jié)構(gòu)、RNA 剪接等與動物細胞更為相似，所生成的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾也與動物細胞接近，因而可進行更為復雜的翻譯后修飾。將粟酒裂殖酵母用作宿主的異源蛋白質(zhì)的制造中，以往在粟酒裂殖酵母中導入表達載體(該載體具有異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因、啟動子以及終止子)，使該表達載體以染色體外基因組(質(zhì)粒)的方式存在。但是，這種情況下，在粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)中這些表達載體有可能從細胞脫離而消失，因此，需要利用營養(yǎng)需求性互補或耐藥性積極維護質(zhì)粒。為此，作為更為穩(wěn)定地生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，公開了利用通過同源重組將表達載體整合到粟酒裂殖酵母的染色體的轉(zhuǎn)化體的方法。專利文獻專利文獻1 日本專利特開2000-262^4號公報發(fā)明概要專利文獻1中記載的轉(zhuǎn)化體中，傳代超過50代后整合到染色體的表達載體仍以未脫離的狀態(tài)存在。但是，在工業(yè)上制造異源蛋白質(zhì)時，要求更長時間的連續(xù)培養(yǎng)中的異源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定生成，因此，希望進一步提高轉(zhuǎn)化體在傳代中的維持穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的目的在于能夠獲得在傳代中的維持穩(wěn)定性更佳，且可穩(wěn)定地制備目標異源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法、其轉(zhuǎn)化體以及利用該轉(zhuǎn)化體的異源蛋白質(zhì)的制造方法為目的。以下表示本發(fā)明的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化體以及利用該轉(zhuǎn)化體的異源蛋白質(zhì)的制造方法?！?〕粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，它是利用具有表達盒和重組位點的載體通過同源重組將所述表達盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizoasccharomyces pombe)的染色體中的轉(zhuǎn)化方法，所述表達盒包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因以及終止子，所述重組位點與所述粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組，其特征在于，所述重組位點的堿基序列為將實質(zhì)上具有同一堿基序列的位點作為靶位點且能夠與該靶位點進行同源重組的序列，該位點分別存在于所述粟酒裂殖酵母的多個染色體中的各個不同的染色體和/或以其間夾有一個以上的必需基因的方式存在于同一染色體的多個位置?！?2〕前述〔1〕所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，在粟酒裂殖酵母的染色體中存在 5個以上的所述靶位點?！?〕前述〔1〕或〔2〕所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，所述靶位點為轉(zhuǎn)座子基因 Tf2中的堿基序列。?！?〕粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，它是利用具有表達盒和重組位點的載體通過同源重組將所述表達盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的染色體的靶位點的轉(zhuǎn)化方法，所述表達盒包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因以及終止子，所述重組位點與所述粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組，其特征在于，所述粟酒裂殖酵母染色體的靶位點為轉(zhuǎn)座子基因Tf2中的堿基序列?！?〕前述1 4中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，選擇在2個以上的所述靶位點上整合有所述表達盒的轉(zhuǎn)化體?！?〕前述1 5中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，所述載體包含2個以上的表達盒?！?〕前述1 6中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，進行同源重組后，選擇整合于所述染色體的表達盒的總數(shù)為3 40個的轉(zhuǎn)化體。〔8〕前述1 7中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述表達盒中的異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)具有在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因?！?〕由前述1 8中任一項所述的轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化體。〔10〕培養(yǎng)前述9所述的轉(zhuǎn)化體，獲取由該轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的異源蛋白質(zhì)的制造方法。(11)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)通過前述8所述的轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化體，從所述培養(yǎng)液中獲取由該轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的異源蛋白質(zhì)的制造方法。采用本發(fā)明的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，能夠獲得傳代中的維持穩(wěn)定性更佳，且可以穩(wěn)定地制造目標異源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的傳代的維持穩(wěn)定性更佳，能夠更加穩(wěn)定地制造目標異源蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)的制造方法利用傳代的維持穩(wěn)定性更好的轉(zhuǎn)化體，因此能夠更加穩(wěn)定地制造目標異源蛋白質(zhì)。附圖簡要說明

圖1是表示Tf2基因的染色體上的分布的示意圖。圖2是Tf 2整合型載體的結(jié)構(gòu)圖。圖3是表示整合的拷貝數(shù)及其位置的電泳觀察圖。圖4是表示傳代50代后的穩(wěn)定性的對照圖。實施本發(fā)明的方式
(宿主)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是，通過將粟酒裂殖酵母用作宿主，在該宿主的染色體上整合包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因(編碼異源蛋白質(zhì)的基因)以及終止子的表達盒而獲得。本發(fā)明所使用的粟酒裂殖酵母可以為野生型，根據(jù)用途也可以為使特定基因缺失或失活的突變型。作為使特定基因缺失或失活的方法，可采用公知的方法。具體而言，可通過采用拉圖爾法(Nucreic Acids Res (2006) 34 :ell和國際公開第2007/063919號文本等中記載)來使基因缺失。也可通過采用誘變劑的突變分離法(酵母分子遺傳學實驗法，1996年，學會出版中心)、采用PCR(聚合酶鏈式反應)的隨機突變法 (PCR方法及應用(PCR Methods Appl.)，1992年，第2卷，p. 28-33.)等向基因的一部分中引入突變，藉此使該基因失活。作為使特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母宿主，例如記載在國際公開第2002/101038號文本，國際公開第2007/015470號文本等。并且，較好是使用作為宿主而使用的粟酒裂殖酵母中具有用于選擇轉(zhuǎn)化體的標記物的宿主。例如，較好是使用基于某個基因的缺失而在生長中以特定的營養(yǎng)成分為必要成分的宿主。通過在載體上整合所述缺失的基因(營養(yǎng)需求性互補標記物)，使轉(zhuǎn)化體不具有宿主的營養(yǎng)需求性。通過該宿主和轉(zhuǎn)化體的營養(yǎng)需求性的不同，區(qū)別兩者而可獲得轉(zhuǎn)化體。例如，將使乳清苷酸脫羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而形成的尿嘧啶需求性粟酒裂殖酵母作為宿主，利用包含ura4基因(營養(yǎng)需求性標記物)的載體進行轉(zhuǎn)化后，選擇尿嘧啶需求性消失了的宿主，藉此獲得整合有載體的轉(zhuǎn)化體。宿主中缺失而形成營養(yǎng)需求性的基因只要是能夠使用于轉(zhuǎn)化體的選擇的基因則不受限于ura4基因，可以為異丙基蘋果酸脫氫酶基因(Ieul基因)等。〔載體〕本發(fā)明的載體具有包含異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因、在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子和終止子的表達盒，以及與粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組的重組位點。表達盒是指用于表達異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因編碼的異源蛋白質(zhì)所需的DNA的組合，包含異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因、在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子以及終止子。表達盒還可以包含5’ -非翻譯區(qū)、3’ -非翻譯區(qū)中的任一種以上。優(yōu)選的表達盒為同時含有異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因、啟動子、終止子、5’ -非翻譯區(qū)、3’ -非翻譯區(qū)的表達盒。 另外，還可以含有所述營養(yǎng)需求性互補標記物、導入到異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)的在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因等基因。異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因是指編碼異源蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明中，“異源蛋白質(zhì)”是指粟酒裂殖酵母本身不生產(chǎn)(野生型的粟酒裂殖酵母不具有編碼該蛋白質(zhì)的基因)的蛋白質(zhì)。對異源蛋白質(zhì)無特別限制，但從工業(yè)價值高的角度考慮，優(yōu)選人或其它哺乳動物所產(chǎn)生的醫(yī)藥品原料蛋白質(zhì)，微生物所產(chǎn)生的工業(yè)用酶蛋白質(zhì)，植物所產(chǎn)生的食品原料蛋白質(zhì)。啟動子和終止子只要是能在作為宿主的粟酒裂殖酵母中起作用而表達異源蛋白質(zhì)的啟動子和終止子即可。作為在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子，可以使用粟酒裂殖酵母本身具有的啟動子(優(yōu)選轉(zhuǎn)錄起始活性高的啟動子)或粟酒裂殖酵母本身不具有的啟動子(來自于病毒的啟動子等)。另外，在載體內(nèi)可以存在兩種以上的啟動子。作為粟酒裂殖酵母本身具有的啟動子，可例舉例如乙醇脫氫酶基因的啟動子、參與硫胺素代謝的nmtl基因的啟動子、參與葡萄糖代謝的果糖-1，6-二磷酸酶基因的啟動子、參與分解代謝物阻抑的轉(zhuǎn)化酶基因的啟動子(參考國際公開第99/23223號文本)、熱休克蛋白質(zhì)基因的啟動子(參考國際公開第2007/26617號文本)等。作為粟酒裂殖酵母本身不具有的啟動子，可例舉例如日本專利特開平5-15380號公報、日本專利特開平7-163373號公報及日本專利特開平10-234375號公報中記載的來源于動物細胞病毒的啟動子，優(yōu)選CMV啟動子、SV40啟動子。作為在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的終止子，可使用粟酒裂殖酵母本身具有的終止子或粟酒裂殖酵母本身不具有的終止子。另外，在載體內(nèi)可以存在兩種以上的終止子。作為終止子，可例舉例如記載在日本專利特開平5-15380號公報，日本專利特開平7-163373號公報、特開平10-234375號公報的來源于人的終止子，優(yōu)選人脂皮質(zhì)蛋白I 的終止子。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有選擇標記物的載體。例如，優(yōu)選使用根據(jù)宿主的營養(yǎng)需求性整合有所述營養(yǎng)需求性互補標記物的載體。在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因是具有使表達的異源蛋白質(zhì)分泌至宿主細胞外的功能的基因。由結(jié)合了分泌信號基因的異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因表達N末端側(cè)結(jié)合有分泌信號的異源蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在宿主內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等處其分泌信號被去除，之后分泌信號被去除了的異源蛋白質(zhì)被分泌至細胞外。分泌信號基因(以及分泌信號) 必須要在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用。作為在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因，可以使用例如記載在國際公開第1996/23890號文本的基因。本發(fā)明的載體是具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)或線狀DNA結(jié)構(gòu)的載體，導入至粟酒裂殖酵母細胞內(nèi)時，較好是以線狀DNA結(jié)構(gòu)導入。即，采用像通常使用的質(zhì)粒DNA那樣具有環(huán)狀DNA 結(jié)構(gòu)的載體時，較好是用限制酶將載體切開為線狀之后，導入到粟酒裂殖酵母的細胞內(nèi)。這樣的情況下，切開具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)的載體的位置在重組位點內(nèi)。由此，切開的載體的兩端分別存在有重組位點的一部分，通過同源重組整個載體整合到染色體的靶位點。只要能夠使載體具有兩端分別存在有重組位點的一部分的線狀DNA結(jié)構(gòu)，除了切開具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)的載體的方法以外，例如還可以通過基于PCR法的酶擴增法或化學合成法來構(gòu)建。為了構(gòu)建本發(fā)明的載體，例如可以優(yōu)選使用pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、 pUC18、pUC19等來源于大腸桿菌的質(zhì)粒。利用來源于大腸桿菌的質(zhì)粒構(gòu)建的載體，通常，具有在大腸桿菌內(nèi)復制時所需的稱為“ori”的復制起始區(qū)域。另外，為了構(gòu)建且擴增本發(fā)明的載體而使用大腸桿菌時，即使不使用如上所述的來源于大腸桿菌的質(zhì)粒，也要利用上述 “ori”，獲得具有“ori”的載體。此時，作為用于同源重組時的載體，優(yōu)選去除了在大腸桿菌內(nèi)復制所需的稱為 “ori”的復制起始區(qū)域的載體。因此，將上述載體整合到染色體中時，可以提高其整合效率 (參考日本專利特開2000-262284號公報)。對去除了復制起始區(qū)域的載體的構(gòu)建方法沒有特別限制，優(yōu)選采用日本專利特開 2000-262284號公報記載的方法。即，優(yōu)選預先構(gòu)建在重組位點內(nèi)的切開部位上插入了復制起始區(qū)域的前體載體，在形成所述的線狀DNA結(jié)構(gòu)的同時使復制起始區(qū)域被切除的方法。 由此，能夠簡單地獲得去除了復制起始區(qū)域的載體。另外，也可以是如下方法。即，采用記載在日本專利特開平5-15380號公報、日本專利特開平7-163373號公報、國際公開第96/23890號文本，日本專利特開平10-234375號公報等的表達載體及其構(gòu)建方法，建構(gòu)具有表達盒以及重組位點的前體載體，進一步利用常規(guī)的基因工程手段從該前體載體中去除復制起始區(qū)域而獲得用于同源重組的載體的方法。載體中的表達盒的數(shù)量可以是1個，也可以是2個以上。即使載體中的表達盒的數(shù)量為1個，也可以在粟酒裂殖酵母的染色體的同一處整合2個以上的表達盒。另外，如果載體中的表達盒的數(shù)量為2個以上，則可以在粟酒裂殖酵母的染色體的同一處連續(xù)整合多個表達盒。本發(fā)明的載體較好是具有1 8個表達盒，更好是具有2 4個。如果載體所具有的表達盒數(shù)為2個以上，則容易增加整合到粟酒裂殖酵母的染色體中的表達盒的數(shù)量，且進一步增加異源蛋白質(zhì)的表達量。但是，在本發(fā)明中，后述的靶位點的數(shù)量多時，即使只有1個也可以增加整合的表達盒的數(shù)量。另外，如果載體所具有的表達盒的數(shù)量為8個以下，則容易抑制因載體變得過大而基于同源重組的載體的重組效率降低的問題。如果表達盒的數(shù)量為4個以下，則可以進一步提高重組效率。載體重組位點是具有能夠與粟酒裂殖酵母的染色體中的同源重組的靶位點進行同源重組的堿基序列的部位。另外，靶位點是在粟酒裂殖酵母的染色體上整合表達盒的目標位點。靶位點可通過將載體的重組位點的堿基序列設為與該靶位點進行同源重組的堿基序列來自由設定。為了進行同源重組，需要使所述重組位點的堿基序列和靶位點的堿基序列的同源性為70%以上。另外，從容易發(fā)生同源重組的方面考慮，重組位點的堿基序列和靶位點的堿基序列的同源性較好是90%以上，更好是95%以上。通過使用具有這樣的重組位點的載體，通過同源重組將表達盒整合到靶位點。重組位點的長度(堿基數(shù))較好是20_2000bp。如果重組位點的長度在20bp以上，則容易發(fā)生同源重組。另外，如果重組位點的長度在2000bp以下，則容易防止載體變得過長而難以發(fā)生同源重組的問題。重組位點的長度較好是在IOObp以上，更好是在200pb 以上。另外，重組位點的長度較好是在SOObp以下，更好是在400pb以下?！菜拗鞯陌形稽c〕整合表達盒的靶位點是，粟酒裂殖酵母所具有的3條染色體中，(1)分別存在于多個染色體中的2個以上靶位點，或(2)以其間夾有一個以上的必需基因的方式存在于同一染色體的多個位置的2個以上的靶位點，或同時滿足⑴以及⑵的多個靶位點。這些2個以上的靶位點是，實際上具有同一的堿基序列的部位。其中，實際上同一的堿基序列是指各靶位點的堿基序列彼此的同源性在90 %以上的序列。靶位點之間的同源性較好是在95 % 以上，更好是在99%以上。上述必需基因是指缺失或失活該基因時無法生長的基因，S卩，指對于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的生長不可缺少的基因。因此，對于以夾有該基因的方式導入的表達盒，如果該表達盒脫離，則必需基因也脫離而轉(zhuǎn)化體無法生長。為此，在轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)中，表達盒脫離了的轉(zhuǎn)化體與表達盒未脫離的轉(zhuǎn)化體共同生長的可能性減少，且異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率降低的可能性減少(基于通常表達盒脫離了的轉(zhuǎn)化體的繁殖速度快這一原因)。如此，通過靶位點分散地存在于粟酒裂殖酵母的染色體中，表達盒分散地整合到染色體，因此整合了的表達盒的脫離變得困難，傳代的維持穩(wěn)定性變得極高。因此，能夠穩(wěn)定地以高生產(chǎn)性制造異源蛋白質(zhì)。另外，如上所述，通過使堿基序列為實質(zhì)上同一的靶位點，從而即使不同的位置上存在多個靶位點，也能夠利用一種載體簡單地將載體整合到這些靶位點。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法中，供整合載體的靶位點優(yōu)選為5個以上。如果靶位點為5個以上，則容易增加整合到染色體的表達盒的數(shù)量，因此進一步提高異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性。另外，靶位點較好是10-60個。如果靶位點為10個以上，則更為容易增加整合到染色體的表達盒的數(shù)量，進一步提高異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性。如果靶位點為60個以下，則容易抑制因整合到染色體的表達盒變得過多而異源蛋白質(zhì)的表達量減少的問題。從利用一種載體一次性地將表達盒整合到分散地存在于粟酒裂殖酵母的染色體中的靶位點的方面考慮，作為靶位點優(yōu)選轉(zhuǎn)座子基因Tf2 (3個染色體上分別存在共13個位點，長度(堿基數(shù))約為4900bp的轉(zhuǎn)座子基因，相互之間的堿基序列的同源性在99.7%。 參考下述文獻)中的堿基序列。(文獻名)彌敦道鮑恩等人研究，“反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及其對RNA聚合酶II啟動子的識別對粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)全基因組序列中的轉(zhuǎn)座元件的綜合研究”，基因組研究，2003 年 13 1984-1997但是，靶位點不受限于上述位點。例如，除了轉(zhuǎn)座子基因Tf2之外，可以將染色體中的多個包含具有前述重組位點的長度以上的長度且實質(zhì)上相同的堿基序列的位點(基因等)作為靶位點。另外，也可以例如在染色體中新導入多個包含具有所述重組位點的長度以上的長度且實質(zhì)上相同的堿基序列的基因(靶位點)而形成靶位點之后，將載體導入到這些多個靶位點?！厕D(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化方法〕本發(fā)明的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法是，利用前述載體，通過同源重組將表達盒整合到作為宿主的粟酒裂殖酵母的染色體的前述靶位點的方法。通過同源重組，將載體整合到染色體的方法本身可以采用公知或周知的方法(例如，參考日本專利特開2000-262^4 號公報)。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是通過該轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化體。所述載體可以整合到存在于粟酒裂殖酵母的染色體中的多處靶位點的1處，也可以是整合到2處以上。在本發(fā)明中，優(yōu)選選擇載體整合到2處以上的轉(zhuǎn)化體。另外，載體可以整合到存在于染色體中的多處的所有靶位點，也可以僅整合到一部分的靶位點。如果整合到染色體的表達盒變得過多，則有可能異源蛋白質(zhì)的表達量減少， 因此整合了載體靶位點數(shù)較好是在20個以下。因此，存在于染色體中的靶位點數(shù)在20以下時，可以在其所有的靶位點整合載體，如果存在于染色體中的靶位點數(shù)超過20個，則整合了載體的靶位點數(shù)優(yōu)選20個以下。更優(yōu)選的整合了載體的靶位點的數(shù)量為2-15個(其中，靶位點數(shù)不足15個時相當于其靶位點的數(shù)量)，進一步優(yōu)選為3-10個(其中，靶位點數(shù)不足10個時相當于其靶位點的數(shù)量)。靶位點為前述轉(zhuǎn)座子基因Tf2時(靶位點數(shù)為 13)，整合了載體的Tf2的數(shù)量較好是2-13個，更好是2-8個。如前所述，所述載體可以具有2個以上的表達盒。因此，整合到染色體的表達盒的總數(shù)為載體中的表達盒數(shù)和整合了載體的靶位點的數(shù)量的乘積。基于本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)化體中，其染色體中的表達盒的總數(shù)較好是2-40個，更好是2-20個。如果整合到染色體的表達盒變得過多，則有可能異源蛋白質(zhì)的表達量減少，因此整合到染色體的表達盒的總數(shù)較好是在40個以下，更好是在20個以下。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法中，通常，在進行同源重組之后，選擇獲得的轉(zhuǎn)化體。作為選擇方法，可例舉例如以下所示的方法。通過可利用所述營養(yǎng)需求性標記物選擇轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基進行篩選，從所得的克隆中選擇出多個克隆。接著，將這些克隆分別進行液體培養(yǎng)后， 考察各培養(yǎng)液中的異源蛋白質(zhì)的表達量，選擇出異源蛋白質(zhì)的表達量較多的轉(zhuǎn)化體。此外， 通過對這些選擇出的轉(zhuǎn)化體進行基于脈沖場凝膠電泳法的基因組分析，可考察出整合到染色體中的載體數(shù)或表達盒數(shù)。可以通過調(diào)節(jié)整合條件等在一定程度上可調(diào)節(jié)整合到染色體的載體的數(shù)量，但是，認為也可以通過載體的大小(堿基數(shù))或結(jié)構(gòu)來改變整合效率或整合數(shù)。本發(fā)明的目的在于獲得異源蛋白質(zhì)的表達效率高的轉(zhuǎn)化體，其目的并不在于僅僅獲得表達盒的總數(shù)更多的轉(zhuǎn)化體。通常，預測表達盒的數(shù)量越多表達效率越高，但是，認為如果表達盒的數(shù)量過多，則增加對于細胞的生存或繁殖的負荷，進而異源蛋白質(zhì)的表達效率降低。另外，認為如果載體過大，則降低整合到染色體的概率，難以提高整合的載體數(shù)，進而獲得轉(zhuǎn)化體的本身變得困難。認為載體的大小不僅受到表達盒的數(shù)量的影響，還受到異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的長度(堿基數(shù))的影響。因此，認為與異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因短的情況相比，在異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因長的情況下，整合的表達盒的數(shù)量受到限制。另外，認為異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因不僅基于其長度，而且還基于其序列的結(jié)構(gòu)等基因的種類而變化。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是通過本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化體。該轉(zhuǎn)化體具有2 個以上的表達盒，與具有1個相同的表達盒的轉(zhuǎn)化體相比其表達效率更高。認為獲得異源蛋白質(zhì)表達效率高的轉(zhuǎn)化體的最佳的表達盒的總數(shù)，如前所述根據(jù)異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的長度或種類等要素而不同。但是，只要通過同源重組法生成一定的比例以上的轉(zhuǎn)化體，就可以通過選擇獲得轉(zhuǎn)化體，并且通過測定獲得的轉(zhuǎn)化體的異源蛋白質(zhì)的表達效率，可以從獲得的轉(zhuǎn)化體中選擇異源蛋白質(zhì)的表達效率高的株。進行上述選擇的同時，可以測定轉(zhuǎn)化體中的表達盒的數(shù)量，且建立表達效率和表達盒的數(shù)量之間的關系。如果以某一種異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因作為對象，則通常在一定程度上表達盒的數(shù)量越多表達效率越高。但是，認為有可能在不同的異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因之間，表達盒的數(shù)量和表達效率之間的關系不一定具有同樣的關系。本發(fā)明者的之前的發(fā)明(日本專利特開2000-262^4號公報記載的發(fā)明)中，提供了染色體的1處具有2個以上表達盒的轉(zhuǎn)化體。但是，與多個表達盒僅存在于染色體的 1處的情況相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中表達盒分散地整合到染色體，因此傳代的維持穩(wěn)定性變得極高。這可能是因為，例如與表達盒集中存在于1處的情況相比，繁殖以及表達的負荷被分散，另外，即使1處的表達盒脫離也能夠保留其它部分的表達盒。并且，雖然可以對2種以上的靶位點的每個靶位點，使用不同的載體(重組位點的堿基序列不同的載體)導入表達盒，且獲得多處具有表達盒的轉(zhuǎn)化體，但是本發(fā)明中對多個靶位點利用相同的載體同時導入表達盒，因此轉(zhuǎn)化體的制造變得非常容易?！伯愒吹鞍踪|(zhì)的制造方法〕本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)的制造方法是培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，獲取由該轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的方法。作為培養(yǎng)液，可使用公知的酵母培養(yǎng)用培養(yǎng)基，只要是含有粟酒裂殖酵母可利用的碳源、氮源、無機鹽類等而能高效地進行粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可。作為培養(yǎng)液，既可以使用天然培養(yǎng)基，也可以使用合成培養(yǎng)基。作為碳源，可例舉例如葡萄糖、果糖、蔗糖等糖。作為氮源，可例舉例如，氨、氯化銨、乙酸銨等無機酸或無機酸的銨鹽、胨、酪蛋白
氨基酸等。作為無機鹽類，可例舉例如，磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉。作為培養(yǎng)可以采用公知的酵母培養(yǎng)方法，例如可以通過振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)等進行。另外，培養(yǎng)溫度較好是23-37°C。培養(yǎng)時間可適當決定。培養(yǎng)既可以是分批培養(yǎng)，也可以是連續(xù)培養(yǎng)。異源蛋白質(zhì)的獲取可以采用公知的蛋白質(zhì)的獲取方法。例如，培養(yǎng)后將菌體從培養(yǎng)液分離、且破壞分離了的菌體而獲得含有目標異源蛋白質(zhì)的成分，通過采用公知的蛋白質(zhì)提純方法從該成分獲取目標異源蛋白質(zhì)。另外，由利用具有結(jié)合了分泌信號基因的異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的表達載體而獲得的轉(zhuǎn)化體中，異源蛋白質(zhì)被分泌至培養(yǎng)液中。因此，此時可以通過公知的蛋白質(zhì)提純方法，從培養(yǎng)液中獲得目標異源蛋白質(zhì)。使用將異源蛋白質(zhì)分泌至培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)化體，且采用以連續(xù)培養(yǎng)來培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法，可有效地獲取異源蛋白質(zhì)。可例舉例如下述方法從培養(yǎng)了一定時間的培養(yǎng)液中獲取異源蛋白質(zhì)并同時回收培養(yǎng)上清，向該培養(yǎng)上清中再次添加培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，反復進行上述操作來連續(xù)地進行培養(yǎng)。
實施例下面示出實施例和比較例，對本發(fā)明進行詳細說明。但是，本發(fā)明并不受到下述記載的限定?！矊嵤├?〕可通過一次轉(zhuǎn)化整合表達盒的基因座的確定通過染色體的測序，明確了在裂殖酵母的染色體中存在多個被認為可適用于一次性地將表達盒同時整合到多處，且高度保存的序列的重復(wood等，自然415卷871-880 頁，2002年)。因此，利用桑格研究所(the Sanger Institute)的數(shù)據(jù)庫GeneDB (http // www. genedb. org/genedb/)，進行了通過一次轉(zhuǎn)化即可徹底整合表達盒的基因座的確定。首先，確認在著絲?；驈椭破鹗键c可見大量的富含AT(AT-rich)的序列的重復。 但是，這些序列在一級序列上的同源性并不高，不適合外源基因的導入。接著，可知還存在很多被認為是來源于LTR或Tf2轉(zhuǎn)座子的序列。對于前者，已知存在 174 個(Bowen 等，基因組研究(Genome Research)刊物，13 卷，1984-1997 頁，2003 年)，但其同源性仍然并不高。但是，Tf2的13個序列以99%以上的同源性分散在整個染色體。其結(jié)構(gòu)示于圖1。如此，除了 Tf2-7和Tf2-8相互鄰接之外均分散在染色體上，其之間必然存在生長所需的必需基因。因此，判斷能夠?qū)⑦@些序列作為基因整合的部位來利用。并且，推斷在染色體末端區(qū)域重復具有4個相同的基因(Mandell等，基因組生物學(Genome Biology)刊物，6卷，Rl頁，2004年)。但是，在亞端粒區(qū)域中基因的轉(zhuǎn)錄被抑制，因此不適合作為外源基因的表達場所。端粒本身也由重復的序列構(gòu)成，但是預料其長度根據(jù)細胞周期而變化等現(xiàn)象，因此不適于異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)?！矊嵤├?〕Tf2整合型載體的制備通過以下方法制備可將綠色熒光蛋白(GFP)的表達盒整合到Tf2基因座上的載體 pTf2-ura4-EGFP (R)(圖 2)。即，利用從細胞提取全基因組DNA的試劑盒(凱杰公司Oliagen)制DNeasy)，純化粟酒裂殖酵母的全基因組DNA，以其中的1 μ g作為模板，利用5’末端側(cè)導入了限制酶BsiWI 的識別序列(CGTACG)的引物對 5，-AAGGCCTCGTACGTGAAAGCAAGAGCAAAACGA-3，以及 5，-AAG GCCTCGTACGTGCTTTGTCCGCTTGTAGC-3，，通過 PCR 法擴增粟酒裂殖酵母的 Tf 2-2 (GeneDB 收錄的系統(tǒng)名SPAC167. 08基因)的DNA片段(約3950個堿基對)。將擴增的DNA片段的兩末端用限制酶BsiWI處理，通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純，制備成插入片段。接著，對染色體整合用載體pXL4 (Idiris等，酵母刊物23卷83_99頁，2006年)， 也使用相同的限制酶BsiWI進行酶切，獲得含有氨芐青霉素抗性基因(ApR)以及大腸桿菌的復制起始點(PBR322-ori)的區(qū)域(約2130個堿基對)。對該DNA片段，進一步利用脫磷酸酶(寶生物株式會社制的CIAP)進行脫磷酸化處理，通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純，制備載體的片段。利用連接試劑盒(寶生物株式會社制DNA連接試劑盒ver. 2)，連接上述插入片段和載體片段之后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 (東洋紡株式會社制)，制備重組質(zhì)粒pTf2-2 (6071個堿基對)。將0. 1 μ g的上述構(gòu)建的載體pTf2-2作為模板，利用引物對5’-GGGGTACCAAGCTTC TAGAGTCGACTCCGGTGCTACGACACTTT-3，(5，末端具有限制酶 KpnI、HindIII、XbaI、Sail 的識別序列)以及 5，-GGGGTACCAGGCCTCTCGAGGCTAGCCATTTCCAGCGTACATCCT-3’(5，末端具有限制酶KpnI、StuI、XhoI.Nhel的識別序列)，通過PCR法擴增全長，獲得6060個堿基對的片段。用KpnI酶切其兩末端，且通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純后，利用連接試劑盒自我環(huán)化， 制備轉(zhuǎn)座子基因Tf2-2序列的內(nèi)部進一步包含多克隆位點(MCQ的6058個堿基對的載體 pTf2(MCS)。利用限制酶KpnI以及NheI雙酶切上述構(gòu)建載體pTf2(MCS)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純6040個堿基對的片段。并且，在粟酒裂殖酵母的尿嘧啶需求性標記物 ura4 (GeneDB收錄的系統(tǒng)名SPCC330. 05c，乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因)的兩端，通過 PCR法制備附加有限制酶KpnI和NheI的識別序列的片段，利用限制酶KpnI以及NheI雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純2206個堿基對的片段。用連接試劑盒連接這兩個片段， 制備轉(zhuǎn)座子基因Tf2-2序列的內(nèi)部進一步包含多克隆位點(MCQ的8246個堿基對的載體 pTf2(MCS)-ura40用限制酶&111酶切上述構(gòu)建載體？1€2(1 ^)-111^4，且用補平試劑盒(寶生物株式會社制，DNA Blunting kit)將獲得的8246個堿基對的片段的兩末端平端化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純之后經(jīng)過脫磷酸化制得載體片段。并且，利用限制酶SpeI和Bstll07I雙酶切pTL2EGFPl，切出1720個堿基對的GFP表達盒，利用補平試劑盒將其兩末端平端化后， 通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純而制得插入片段。利用連接試劑盒，連接上述載體以及插入片段，制得Tf2整合型載體PTf2-ura4-EGFP (R)(圖2)。
〔實施例3〕轉(zhuǎn)化體的獲取利用限制酶BsiWI酶切3 μ g的在實施例2中制得的Tf2整合型載體 PTf2-ura4-EGFP(R)，通過R崎等的方法(R崎等，核酸研究刊物，18卷，6485-6489頁，1990 年)，轉(zhuǎn)化裂殖酵母ARCO10株(基因型h-leul-32 ura4_D18)。將轉(zhuǎn)化物涂布于添加亮氨酸的基本培養(yǎng)基(MMA+leu)的表面，在32°C下培養(yǎng)4天。從長出來的約500個尿嘧啶需求性恢復菌落中，通過利用熒光觀察裝置(GFP Viever TR-100，池田理化株式會社制)的肉眼觀察，篩選了 96個顯示綠色熒光蛋白(GFP)的熒光的菌落。刮取各個菌落，接種至Iml的不含亮氨酸的合成培養(yǎng)基SDC-Leu (SD Medium-LEU, 凱畢歐杰(Qbiogene)株式會社制)，在M孔培養(yǎng)板中振蕩培養(yǎng)約M小時。分別獲取0. Iml 的菌體增殖液，接種至Iml的YES液體培養(yǎng)基(5g/l的酵母提取物(BD株式會社(Becton， Dickinson and Company)制)，30g/l的葡萄糖(和光純藥株式會社制)、250g/l的SP Supplements (凱畢歐杰(Qbiogene)株式會社制))，在M孔培養(yǎng)板中再次振蕩培養(yǎng)約M 小時。之后，利用熒光強度測定裝置(Spectra Max Gemini XS，日本分子儀器株式會社 (molecular device)制)，測定每Iml的菌體培養(yǎng)夜的熒光強度，篩選GFP顯示的熒光強度最高的克隆。〔實施例4〕染色體上的整合位置以及拷貝數(shù)的分析從實施例3制得的轉(zhuǎn)化體中提取總DNA成分。將該DNA為模板，將載體側(cè)的通用引物5’ -GGTGATGACGGTGAAAACCT-3’分別與表1所示的13個各Tf2基因特異性引物對結(jié)合，用KOD Plus (東洋紡株式會社制)進行PCR，對染色體上的表達載體的整合位置以及拷貝數(shù)進行分析。其結(jié)果，如圖3所示，確認到Tf2_l、2、6、7、8的5處整合有共計5個表達盒。表 權(quán)利要求
1.粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，它是利用具有表達盒和重組位點的載體通過同源重組將所述表達盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的染色體中的轉(zhuǎn)化方法， 所述表達盒包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因以及終止子，所述重組位點與所述粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組，其特征在于，所述重組位點的堿基序列為將實質(zhì)上具有同一堿基序列的位點作為靶位點且能夠與該靶位點進行同源重組的序列，該位點分別存在于所述粟酒裂殖酵母的多個染色體中的各個不同的染色體和 /或以其間夾有一個以上的必需基因的方式存在于同一染色體的多個位置。
2.如權(quán)利要求1所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，在粟酒裂殖酵母的染色體中存在5個以上的所述靶位點。
3.如權(quán)利要求1或2所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述靶位點為轉(zhuǎn)座子基因Tf2中的堿基序列。
4.粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，它是利用具有表達盒和重組位點的載體通過同源重組將所述表達盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的染色體的靶位點的轉(zhuǎn)化方法，所述表達盒包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因以及終止子，所述重組位點與所述粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組，其特征在于，所述粟酒裂殖酵母染色體的靶位點為轉(zhuǎn)座子基因Tf2中的堿基序列。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，選擇在2 個以上的所述靶位點上整合有所述表達盒的轉(zhuǎn)化體。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述載體包含2個以上的表達盒。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，進行同源重組后，選擇整合于所述染色體的表達盒的總數(shù)為3 40個的轉(zhuǎn)化體。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述表達盒中的異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)具有在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因。
9.轉(zhuǎn)化體，其特征在于，由權(quán)利要求1 8中任一項所述的轉(zhuǎn)化方法獲得。
10.異源蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化體，獲取由該轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)。
11.異源蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)通過權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化體，從所述培養(yǎng)液中獲取由該轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供用于獲得傳代中的維持穩(wěn)定性更佳且能夠穩(wěn)定地制備目標異源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法。并且，提供基于該方法獲得的轉(zhuǎn)化體以及利用該轉(zhuǎn)化體的異源蛋白質(zhì)的制造方法。利用具有表達盒和重組位點的載體通過同源重組將所述表達盒整合到粟酒裂殖酵母的染色體的轉(zhuǎn)座子基因Tf2位點的轉(zhuǎn)化方法，所述表達盒包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因以及終止子，所述重組位點與所述粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組。還提供基于該方法獲得的轉(zhuǎn)化體以及利用該轉(zhuǎn)化體的異源蛋白質(zhì)的制造方法。
文檔編號C12N1/19GK102292442SQ201080006331
公開日2011年12月21日 申請日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月27日
發(fā)明者東田英毅, 依地熱斯·阿里木江, 浜祐子 申請人:旭硝子株式會社