專利名稱：用于在植物中表達的多結(jié)構(gòu)域酶的修飾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)，特別地涉及用于在植物中增加一種蛋白質(zhì)的表達和 /或活性的方法和組合物。
背景技術(shù)：
近十年來，已經(jīng)設(shè)計了多種異源表達系統(tǒng)用于生產(chǎn)臨床上和農(nóng)藝學(xué)上有用的重組蛋白。在大多數(shù)系統(tǒng)中的重要挑戰(zhàn)在于優(yōu)化重組蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)率和質(zhì)量。近15年來， 在植物的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的優(yōu)化方面(Potenza et al. ,2004, In Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant, 40,1-22 ；Streatf ield, 2007，Plant Biotechnol. J. 5，2-15)、以及植物細胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合體蛋白翻譯后修飾特征的說明和調(diào)節(jié)方面(Gomord and Faye, 2004, Curr. Opin. Plant Biol. 7,171-181 ；Faye et al.，2005，Vaccine，23，1770-1778)已經(jīng)實現(xiàn)了顯著的進展。盡管實現(xiàn)了這些進展，確保重組蛋白的令人滿意的產(chǎn)率和質(zhì)量通常仍然是困難的任務(wù)。強烈影響重組蛋白質(zhì)量和產(chǎn)率的一個因素是在一種異源環(huán)境中表達的多肽鏈的相對固有穩(wěn)定性(Faye et al.，2005)。蛋白水解酶，或蛋白酶，通過指導(dǎo)在關(guān)鍵調(diào)控過程中涉及的蛋白質(zhì)的活化或水解、 或通過促成錯誤折疊蛋白的消除和來自短壽蛋白的氨基酸的選擇性再循環(huán)而促成代謝和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的總體控制(Vierstra，2003，Trends Plant Sci. 8,135-142 ；Schaller, 2004, Planta，220，183-197)。在植物中，這些酶還啟動了開始衰老的器官中的一般的蛋白質(zhì)再循環(huán)以及在發(fā)芽期間的種子或塊莖貯存蛋白的氨基酸組分的動員(MUntZ，2007，J. Exp. Bot. 58,2391-2407)。在植物體內(nèi)的蛋白表達過程中以及在植物體外的提取和后續(xù)下游加工過程中兩者，蛋白酶可能影響不同途徑中的重組蛋白的完整性(Michaud et al. , 1998, Methods Biotechnol. 3,177-188 ；Rivard et al.，2006，Plant Biotechnol. J. 4，359-368)。取決于用于肽鍵水解的對于內(nèi)源蛋白酶可接近的“敏感的”切割位點的數(shù)目，該蛋白質(zhì)可能經(jīng)歷直接影響其最終產(chǎn)率的完全水解或部分修整，這改變了最終蛋白產(chǎn)物的活性或均質(zhì)性。雖然以凈蛋白水平的方式可以獲得感興趣的產(chǎn)率，最終產(chǎn)物可能顯示改變的完整性、結(jié)構(gòu)不均勻性和/或不足的生物活性，這潛在地改變了它的商業(yè)化價值(Faye et al.，2005)。發(fā)明概述在此提供了用于在植物中表達修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的組合物和方法。這些組合物包括表達一種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的植物、種子、植物組織、以及植物部分，其中該多結(jié)構(gòu)域酶的組成為至少一個第一結(jié)構(gòu)域、至少一個第一連接序列、以及至少一個第二結(jié)構(gòu)域。該修飾的多結(jié)構(gòu)域包括異源連接區(qū)域，當(dāng)修飾的多結(jié)構(gòu)域酶表達在植物中時，該區(qū)域不被切割。 進一步提供了用于生產(chǎn)一種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的方法，包括將表達這種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的植物進行培養(yǎng)。包含本發(fā)明的表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物或植物材料的下游用途包括農(nóng)藝學(xué)用途、 藥物用途、以及工業(yè)用途，例如人類食品、動物飼料、生物燃料、工業(yè)酒精、發(fā)酵原料、以及類似物。發(fā)明詳述概述本發(fā)明是針對用于轉(zhuǎn)基因表達多結(jié)構(gòu)域酶的植物的用途。高等植物特別有用于異源蛋白的生產(chǎn)，這是由于植物易于進行大規(guī)模生產(chǎn)，它們不像細菌重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)一樣需要無菌狀態(tài)，并且在植物中由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的水平可以超過總蛋白含量的1 %。迄今為止，在植物中已經(jīng)成功表達了一些商業(yè)上感興趣的蛋白質(zhì)，包括多種抗體、疫苗抗原、 蛋白質(zhì)變應(yīng)原、酶以及酶抑制劑、凝血因子、細胞因子以及激素。然而，表達高水平的穩(wěn)定的并且功能性蛋白仍然是許多科學(xué)和生物技術(shù)意圖(包括生產(chǎn)用于農(nóng)業(yè)和治療目的的蛋白質(zhì))的瓶頸。因此，在此提供了用于改進植物細胞中的多結(jié)構(gòu)域酶的表達量、穩(wěn)定性、和/或活性的方法以及組合物。這些方法包括向植物細胞中引入一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括修飾的多結(jié)構(gòu)域酶，其中在所述多結(jié)構(gòu)域酶中的天然連接序列已經(jīng)被異源連接序列所代替，該異源連接序列不被植物蛋白酶切割。對于“異源的”連接序列，旨在是一種對于被修飾的酶不是天然的(即，并不天然發(fā)生在野生型序列中)的連接序列。該連接序列可以從一種不同種類或生物得到，或可以是合成的連接序列(即，在任何生物中都不是天然存在的) 或可以是修飾的天然連接序列。不被植物蛋白酶所切割的連接區(qū)域不旨在限于由宿主植物生產(chǎn)單一的多肽，但是當(dāng)該多結(jié)構(gòu)域酶的連接區(qū)域是天然序列時旨在是指優(yōu)選生產(chǎn)全長多肽(與產(chǎn)生的多肽的范圍相比較)。該修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的組成為至少一個第一結(jié)構(gòu)域、至少一個異源連接物、以及至少一個第二結(jié)構(gòu)域。該第一結(jié)構(gòu)域和該第二結(jié)構(gòu)域是非異源的序列。對于“非異源的”，是旨在該第一結(jié)構(gòu)域和該第二結(jié)構(gòu)域是從相同的天然多結(jié)構(gòu)域酶得到的并且可以包含較少的修飾，這導(dǎo)致了一種結(jié)構(gòu)域多肽序列，它與天然多肽序列是大于80%—致的、大于85% 一致的、大于90%—致的、大于95%—致的、大于96%—致的、大于97%—致的、大于98% 一致的、或大于99% —致的。在不同的實施方案中，當(dāng)與一種對照核酸構(gòu)建體相比時，編碼在此所述的修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的核酸構(gòu)建體導(dǎo)致了該植物細胞中該酶的表達、穩(wěn)定性和/或活性的增加。在表達、穩(wěn)定性、或活性上的增加是指一種酶活性酶的可測量的量的增加。一種酶的穩(wěn)定性還涉及它的構(gòu)象穩(wěn)定性(反映在酶的三維結(jié)構(gòu)方面)、或它的化學(xué)穩(wěn)定性(是指酶的組成氨基酸的化學(xué)構(gòu)成)。應(yīng)該認識到的是，在異源系統(tǒng)中合成的多肽能夠以大小范圍進行生產(chǎn)。所生產(chǎn)的百分比的多肽可以是全長酶，它被定義為從編碼序列以其整體進行翻譯而得到的多肽；然而，還可以生產(chǎn)更小的多肽或更大的多肽。更小的多肽可以是通過多肽的蛋白質(zhì)分解加工來加工多肽的結(jié)果，而更大的多肽可以是向多肽添加碳水化合物的結(jié)果。本申請描述了一種用于在宿主植物中生產(chǎn)多結(jié)構(gòu)域蛋白的方法，其中所生產(chǎn)的全長多肽的量與當(dāng)該多結(jié)構(gòu)域酶包含天然連接物時所生產(chǎn)的全長多肽的量相比是更大的。用對植物蛋白酶的切割具有抵抗性的異源連接物代替天然連接物將導(dǎo)致更大量的由該宿主植物生產(chǎn)的全長多結(jié)構(gòu)域酶。雖然不受任何特定理論或機理的束縛，這種增加可以歸因于酶的在翻譯方面的增加或在降解方面的降低、和/或酶的在催化活性方面的增加。在另一個實施方案中，這種增加涉及一種全長多結(jié)構(gòu)域酶的在表達、穩(wěn)定性、和/或活性方面的增加。為了本發(fā)明的目的，一種全長多結(jié)構(gòu)域酶是指包括至少一個功能結(jié)合結(jié)構(gòu)域、連接物、以及功能催化結(jié)構(gòu)域的一種多結(jié)構(gòu)域酶。具有“功能結(jié)合結(jié)構(gòu)域”的修飾的蛋白質(zhì)是其中結(jié)合特性實質(zhì)上類似于天然蛋白在其天然環(huán)境中的結(jié)合特性的蛋白質(zhì)、或相對于天然蛋白在其天然環(huán)境中的結(jié)合特性是改進的蛋白質(zhì)。同樣，具有一個“功能催化結(jié)構(gòu)域”的一種修飾的蛋白質(zhì)是其中催化特性實質(zhì)上類似于天然蛋白在其天然環(huán)境中的催化特性的蛋白質(zhì)、或相對于天然蛋白在其天然環(huán)境中的催化特性是改進的蛋白質(zhì)。對于“實質(zhì)上類似”(“基本上類似”)，是指天然蛋白的至少約80%或更大的結(jié)合特性或催化特性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認識到，任何特定的多結(jié)構(gòu)域蛋白的一個或少數(shù)幾個氨基酸的缺失可能對于該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或活性沒有顯著影響。在一個實施方案中，當(dāng)與一種對照相比時，在表達、全長多肽的量、穩(wěn)定性、和/或活性方面的增加是至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約 50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約2倍、至少大約3倍、至少大約4倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約10倍、至少大約20倍、或更大。對于“對照”核酸構(gòu)建體，是指一種包括編碼一種多結(jié)構(gòu)域酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，該多結(jié)構(gòu)域酶具有一個天然連接序列、或已知的將被一種植物蛋白酶所切割的連接序列。除非另外說明，該對照構(gòu)建體包括編碼一種具有一個天然連接序列的多結(jié)構(gòu)域酶的一種核酸。一種“天然結(jié)構(gòu)序列”是指存在于生物體內(nèi)的多結(jié)構(gòu)域序列(該多結(jié)構(gòu)域序列從該生物體得到)中的連接序列(即，天然發(fā)生的連接序列)。因此，本發(fā)明的這些方法在當(dāng)前的實踐(用于栽培多種作物植物為了獲得商業(yè)上所希望的、具有一種多結(jié)構(gòu)域酶的增加的表達、穩(wěn)定性和/或活性的植物材料)與將這些作物植物的殘余物作為一種生物質(zhì)的來源用于生產(chǎn)可發(fā)酵的糖類、或用于農(nóng)業(yè)、藥物和/或人類消費的用途的整合中找到了特定的用途。對于“作物植物”，是指出于生產(chǎn)人類所尋求的、用作口服消費的、或者是在工業(yè)、 藥學(xué)、或商業(yè)過程中加以利用的植物材料的目的而種植的任何植物。本發(fā)明可以應(yīng)用到許多種植物的任何一種，包括但不僅限于玉米、小麥、稻、大麥、大豆、棉花、高粱、燕麥、煙草、 芒草(Miscanthus grass)、柳枝稷(Switch grass)、樹、一般的豆類、油菜(rape)/低芥酸菜籽、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、粟、黑麥、甘蔗、甜菜、可可、茶樹、蕓苔屬(Brassica)、棉花、咖啡、甘薯、亞麻、花生、三葉草；蔬菜(例如，萵苣、番茄、葫蘆、木薯、馬鈴薯、胡蘿卜、蘿
卜、豌豆、小扁豆、甘藍、花椰菜、西蘭花、抱子甘藍、胡椒(P印per)、以及菠蘿(cucurbits， cassava, potato， carrot， radish， pea， lentils， cabbage， cauliflower， broccoli，Brussels sprouts, peppers, and pineapple)；果樹(例如，柑橘樹、蘋果樹、梨樹、桃樹、杏樹、胡桃樹、鱷梨樹、香蕉樹、以及椰子樹(tree fruits such as citrus, apples, pears, peaches, apricots, walnuts, avocado, banana, and coconut ；) ； ΙΜΜ^ Ψ ( 歹ll女口， 乃馨、以及玫瑰)。如在此使用的，術(shù)語“植物部分”或“植物組織”包括植物細胞、植物原生質(zhì)體、植物可以由之再生的植物細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢(Plant clumps)、以及在以下植物或植物的部分中的完整植物細胞，這些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、 枝、果實、核、穗、穗軸、外殼、莖、根、根尖、花藥，等等。在一個實施方案中，該植物是一種無限生長植物。這些品種在溫帶地區(qū)營養(yǎng)性地進行不限定時期的生長。這些品種可以被工程化以便在液泡中積累所感興趣的多肽并且可以生長直到初霜期(first frost)。在那時，該植物可被允許干燥、收獲干燥，并用于食品、 牲畜飼料、或用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化或其他商業(yè)上有用的過程中。如在此所使用的，“生物質(zhì)”或“原料”是指有用的生物材料(包括感興趣的產(chǎn)物)， 該材料會被收集并且旨在進行進一步加工以便將該感興趣的產(chǎn)物分離或濃縮。該生物質(zhì)或原料可以包括果實或它的多個部分，或種子、葉、或莖或根，其中這些是用于工業(yè)目的而特定感興趣的植物部分?！吧镔|(zhì)”，當(dāng)它指植物材料時包括植物的任何一種結(jié)構(gòu)或多種結(jié)構(gòu)， 該結(jié)構(gòu)包含或代表所感興趣的產(chǎn)品。在此使用的冠詞“一種”和“一個”是指一個或多于一個(即，至少一個)的該冠詞的合乎語法的對象。作為舉例，“要素”(元件)是指一種或多種要素。貫穿本說明書，單詞“包括”或其變體例如“包括了”(" comprises")或“包括”“包含”(“comprising") 應(yīng)被理解為意味著包括一種所陳述的要素、整體或步驟，或成組的要素、整體或步驟，但是不排除任何其他要素、整體或步驟，或成組的要素、整體或步驟?！胺蛛x的”是指“通過人工”從其天然狀態(tài)而被改變；S卩，如果它在自然界中發(fā)生，則它已經(jīng)被改變從其原始環(huán)境移出，或兩者并存。例如，在活的動物中以其天然狀態(tài)而天然存在的一種天然發(fā)生的多核苷酸或多肽是未被“分離的”，但是按照在此采用的術(shù)語，從其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)中分離出的同樣的多核苷酸或多肽則是“分離的”。例如，就多核苷酸而言，術(shù)語分離的是指它從其天然發(fā)生在其中的染色體和細胞中分離出。假如將一種序列從它在其中天然發(fā)生的染色體和細胞中分離出但是將其插入它并不在其中天然發(fā)生的遺傳背景、染色體、或細胞中，則該序列也是分離的。多結(jié)構(gòu)域酶本發(fā)明的這些方法包括修飾的多結(jié)構(gòu)域酶。一種“多結(jié)構(gòu)域酶”或一種“多結(jié)構(gòu)域蛋白”是指包含兩個或更多個結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)。這些區(qū)域可以是在單一的多肽上； 它們還可以在不同的多肽上。結(jié)構(gòu)域通常被視為是可以自主折疊(Wetlaufer(1973)Proc. Natl Acad. Sci. 70 :697-701)的緊湊的、半獨立的單元(Richardson(1981)Advan. Protein Chem. 34 :167-339)。示例性的區(qū)域包括免疫球蛋白超家族恒定域(如CH2或CH3結(jié)構(gòu)域)、受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶的或催化的結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、錨定結(jié)構(gòu)域(dockerin domain)、等等。在不同的實施方案中，在此涵蓋的多結(jié)構(gòu)域酶包括至少一個第一結(jié)構(gòu)域、至少一個第一連接物、以及至少一個第二結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，該多結(jié)構(gòu)域酶包括至少一個第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個第一連接物、以及至少一個第一催化結(jié)構(gòu)域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一種非催化結(jié)構(gòu)域，涉及底物結(jié)合或特定的蛋白質(zhì)相互作用。一經(jīng)結(jié)合，蛋白質(zhì)可能經(jīng)歷構(gòu)象變化。因此，這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谠S多蛋白質(zhì)的功能是必要的。術(shù)語“催化結(jié)構(gòu)域”在此被定義為具有該多結(jié)構(gòu)域酶的催化活性的該酶的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)部分或區(qū)域?！斑B接物”(接頭)(linker)被定義為連接兩個結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。在多個結(jié)構(gòu)域之間的連接在一個結(jié)構(gòu)域相對于另一個的定位中起到重要的結(jié)構(gòu)作用，或該連接僅僅可以將兩個結(jié)構(gòu)域彼此限定在一定的距離之內(nèi)。該連接區(qū)域還可以包括用于蛋白酶切割的位點。多結(jié)構(gòu)域酶的連接區(qū)域典型地是三維地線性的區(qū)域，它是將兩個結(jié)構(gòu)域連接在一起的柔性鉸鏈。高等生物的多種蛋白質(zhì)具有由一串可移動的模塊組成的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu) (Doolittle (1995) Annu Rev Biochem. 64 :287-314)。到現(xiàn)在為止所鑒定的這些模塊具有確定的結(jié)合和/或催化功能(即結(jié)合結(jié)構(gòu)域或催化結(jié)構(gòu)域)，但是一些可以僅充當(dāng)僅為了將結(jié)合表面安排在空間而需要的簡單間隔元件(即，連接區(qū)域)。用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(包括結(jié)構(gòu)域識別和連接序列預(yù)測)的多種軟件應(yīng)用描述 T Lobley(2009)Bioinformatics Advance Access Online, May 7,2009 ；Bryson(2005) Nucl. Acids Res. 33(網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器發(fā)行):W36-38 Jones (1999) J. Mol. Biol. 292 :195-202 ； McGruffin and Jones (2003)Bioinformaticsl9 :8740881 Jones (1999)J. Mol. Biol 287 797-815 Jones(2007)Bioinformatics 23 :538-544 Jones et al (1994)Biochem. 33 3038-3049 ；Ebina et al. (2009) Biopolymers 92 (1) : 1-8 中，并且一些程序在因特網(wǎng)上是可得到的，例如在 www. tuat. ac. jp/ domserv/cgi-bin/DLP-SVM. cgi ；在 www. predictprotein.org/about.html; 以及在 bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/index. html#more。連接物在此提供了用于改進植物中多結(jié)構(gòu)域酶的表達、穩(wěn)定性、和/或活性的方法以及組合物。這些方法包括向植物細胞中引入一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括一種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶，其中在修飾的多結(jié)構(gòu)域酶中的天然連接序列已經(jīng)被異源連接序列所代替，該異源連接序列不被植物蛋白酶切割。該異源結(jié)構(gòu)序列可以對于植物蛋白酶的切割具有抵抗性，由于用蛋白酶不敏感位點代替蛋白酶敏感位點，或通過改變多結(jié)構(gòu)域酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，從而使得蛋白酶敏感位點對于植物蛋白酶是難以進入的?！暗鞍酌该舾械摹蔽稽c是被一種特定的植物蛋白酶識別并且切割的氨基酸殘基或序列。如以上所討論的，對于蛋白酶切割敏感的酶可以經(jīng)歷完全水解，直接影響其最終產(chǎn)率，或可以經(jīng)歷部分修整，由此改變最終蛋白產(chǎn)物的活性或均質(zhì)性。因此，在多結(jié)構(gòu)域蛋白中用異源連接序列代替天然連接序列可以導(dǎo)致酶的在完整性、結(jié)構(gòu)不均勻性和/或生物活性方面的改進。來自不同酶的連接序列很少共享任何明顯的序列同源性，但是它們的氨基酸組成是典型地富含脯氨酸和羥基氨基酸(Gilkes et al. (1991)Microbiol. Rev. S5, 303-315 ； IMM Claeyssens and Tomme (1989) in Tkichalenna reesei Cellulases :Biochemistry, Genetics,Physiology and Application(Kubicek, C. P. ,Eveleigh,D. Ε. ,Esterbauer,H., Steiner, W. , and Kubicek-Pranz, Ε. Μ. ,eds)pp. 1-11,Proceedings,Tricell(1989) Royal Society of Chemistry))。大體上，連接物可以是在大約5至60個氨基酸殘基之間、在大約15至50個氨基酸殘基之間、以及在大約25至45個氨基酸殘基之間。對于T. reeseiCBHl 的連接肽的討論，參見，例如 Srisodsuk et al.，1993，J. Biol. Chem. 268 (28) 20756-20761 (將其通過引用以其整體結(jié)合在此)。在本發(fā)明的一個實施方案中，該天然連接序列被從一種真菌生物或從一種細菌中得到的連接序列所代替。雖然不受任何特定理論或機理的束縛，從細菌或真菌生物得到的
連接序列對于植物酶的切割可以是更不敏感的。通過對于“從......得到”，是指該異源
連接序列是在由生物表達的蛋白質(zhì)中鑒定的并且在此處所涵蓋的修飾的多結(jié)構(gòu)域酶中被用作連接序列。在修飾的多結(jié)構(gòu)域酶中的天然連接序列可以用與真菌或細菌蛋白中鑒定的連接序列相同的連接序列所代替，或可以被進一步修飾以改進植物中的連接序列的功能性 (包括但不局限于，使用植物偏愛密碼子以改進修飾的酶在植物中的表達和/或用植物蛋白酶不敏感位點代替一個或多個植物蛋白酶敏感位點)。在另一個實施方案中，用于改進多結(jié)構(gòu)域酶的表達、穩(wěn)定性、和/或活性的方法包括用一個或多個包括糖基化位點序列的殘基代替連接區(qū)域內(nèi)的一個或多個切割敏感性殘基(或通過加入一個或多個糖基化位點序列)。在許多的多結(jié)構(gòu)域酶中的糖基化的作用包括在催化核心與結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間提供足夠的空間分離，并且包括保護該連接肽免于蛋白水解作用(Srisodsuk et al.，1993，J. Biol. Chem.，268，20756-20761 ；Clarke, 1997, Biodegradation of cellulose. In Enzymology and biotechnology. Technomic Publishing, Pennsylvania, p. 55)。因此，雖然不受任何特定理論或機理的束縛，為了增加糖基化而修飾多結(jié)構(gòu)域酶的連接區(qū)域可以防止修飾的多結(jié)構(gòu)域酶被植物酶蛋白質(zhì)分解降解。在一個實施方案中，該異源連接區(qū)域包括一個或多個N-連接的糖基化位點。 “N-連接糖基化”位點包括對于N-連接糖基化敏感的氨基酸殘基或序列。在不同的實施方案中，該異源連接物包括一個或多個N-連接糖基化共有序列，包括一個或多個Asn-X-Ser/ Thr/Cys序列，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸?？商娲兀蛄硗獾?，該異源連接區(qū)域包括一個或多個0-連接糖基化位點?！?-連接糖基化位點”包括對于0-連接糖基化敏感的氨基酸殘基或序列。迄今為止，還沒有鑒定出對于0-糖基化的共有初級氨基酸序列，然而，已經(jīng)提出了不同的結(jié)構(gòu)基序(參見，例如 Young et al.，1979，Biochemistry. 18(20) :4444-4448 ；Muller et al.，1997，J Biol Chem. 272(40) :24780-24793 ；Yoshida et al. ,1997, J Biol Chem. 272(27) :16884-16888; Gooley et al. (1991)Biochem Biophys Res Commun. 178(3) :1194-1201 ；以及 Christlet Veluraja (2001) Biophys. J. 80 (2) =952-960，它們中的每一個都通過引用以其整體結(jié)合在此)。因此，在不同的實施方案中，該異源連接區(qū)域包括一個或多個0-連接糖基化結(jié)構(gòu)基序，包括但不局限于 Thr-Ala-Pro-Pro、Thr-Val-X-Pro、Ser/Thr-Pro-X-Pro、以及 Thr-Ser-Ala-Pro 的一個或多個?？商娲?，該異源連接序列可以從糖基化蛋白(包括一種植物糖蛋白)的連接序列得到。近年來，已經(jīng)公布了許多糖基化蛋白的序列。SWISSPROT、PIR、PROSITE、PDB、EMBL、 HSSP、LISTA、以及MIM數(shù)據(jù)庫包含糖基化蛋白條目。許多O-連接糖基化蛋白在0-GLYCBASE 數(shù)據(jù)庫(Gupta et al. (1999)Nucleic Acids Research 27:370-372)中列出。在又另一個實施方案中，一種多結(jié)構(gòu)域酶的天然連接區(qū)域可以用一種跨膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的全部或一部分來代替。某些膜蛋白是“跨膜蛋白”并且它們具有與細胞外環(huán)境相互作用的細胞外結(jié)構(gòu)域、與細胞內(nèi)環(huán)境相互作用的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、以及橫跨細胞脂雙層的跨膜結(jié)構(gòu)域。包括“跨膜區(qū)域”的“跨膜結(jié)構(gòu)域”是指位于質(zhì)膜內(nèi)的跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)域，并且還可以包括相應(yīng)的細胞質(zhì)(細胞內(nèi))和細胞外環(huán)。因此，跨膜蛋白的所有或基本上所有的跨膜區(qū)域可以用作一種多結(jié)構(gòu)域酶中的連接序列?？缒さ鞍椎腡MPDB數(shù)據(jù)庫描述于(Ikeda et al. (2003)Nucleic Acids Res. 31 :406-409)?？缒さ鞍椎牡鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDBTM)描述于 Tusnddy et al. (2004) Bioinformatics 20(17) :2964-72 以及 Tusn ady et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33 (Database issue) :D275_8 中。一種多結(jié)構(gòu)域酶的表達、穩(wěn)定性、和/或活性還可以通過去除在連接序列之內(nèi)的蛋白酶切割位點來改進。許多種植物蛋白酶和它們的目標切割位點序列在本領(lǐng)域是已知的。修飾的多結(jié)構(gòu)域酶可以通過用從其他的蛋白質(zhì)得到的連接區(qū)域代替天然連接區(qū)域來產(chǎn)生，或可以通過誘變方法來產(chǎn)生。在一個實施方案中，位點定向誘變或隨機誘變被用來修飾在連接序列之內(nèi)的一個或多個位點以產(chǎn)生對蛋白酶切割更不敏感的連接物。在另一個實施方案中，使用定向進化方法來改進這些連接區(qū)域。在過去的幾年里，定向進化已經(jīng)出現(xiàn)作為接近合理設(shè)計的一個替代方案，使之能夠改進結(jié)構(gòu)和功能特性(如在不同條件下的穩(wěn)定性和性能)或在它們的反應(yīng)和底物特異性方面的改變(Tao and Cornish(2002) Curr Opin Chem Biol 6:858-864)。勝于設(shè)計有限數(shù)目的位點定向突變體，定向進化實現(xiàn)了一種迭代的Darwinian優(yōu)化方法，由此從隨機突變的總體中選出最合適的變體。通過篩選或選擇感興趣的特性來鑒定改進的變體，并且它們的編碼基因然后被用作對于隨后的進
(round of evolution)白勺.* ! (Roodveldt et al. (2005) Current Opinion in Structural Biology 15(1) :50-56)。對于改進的變體的篩選或選擇能夠以兩種途徑來進行篩選或選擇蛋白質(zhì)自身的功能或篩選或選擇一種報告蛋白的活性。篩選或選擇蛋白質(zhì)自身的功能將根據(jù)被評價的多結(jié)構(gòu)域蛋白的活性而變化。用于篩選或選擇一種報告蛋白的活性的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如，美國專利公開20090092982，它描述了一種將蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)的變體)的折疊狀態(tài)和/或穩(wěn)定性與可篩選的(例如可選擇的)表型相結(jié)合的方法，這種表型(例如抗生素抗性)由分開的實體所賦予。這種可篩選的表型被用來評定穩(wěn)定性。纖維素酶在本發(fā)明的不同實施方案中，這種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶是一種纖維素降解酶。植物是纖維素基質(zhì)的豐富來源，因此，在纖維素原料中表達纖維素降解酶將最小化或消除對于酶的外源加入的需要。因此，在此提供了編碼一種修飾的纖維素酶的核苷酸序列。出于本發(fā)明的目的，“纖維素酶”是一種能夠催化l-4-β -D-糖苷鍵的水解的酶，并且是由至少一個催化結(jié)構(gòu)域和至少一個選自下組的其他結(jié)構(gòu)域組成的，該組由催化結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。多種纖維素酶的結(jié)構(gòu)描述于Gilkes et al. (1991)Microbiological Reviews55(2) :303_315，將其通過引用以其整體結(jié)合在此。使用根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因生物質(zhì)的纖維素降解過程比起常規(guī)方法可以更廉價地、容易地、并且更環(huán)境安全地進行。在此涵蓋的修飾的纖維素酶具有連接序列，當(dāng)該修飾的纖維素酶表達于植物中時，該連接序列導(dǎo)致更少的切割。在一些實施方案中，當(dāng)表達于植物中時，小于大約90%的修飾的酶被切割，當(dāng)表達于植物中時，小于大約80%、小于大約70%、小于大約60%、小于大約50 %、小于大約40 %、小于大約30 %、小于大約20 %、小于大約10 %、小于大約5 %、或沒有修飾的酶被切割。由于如以上所討論的蛋白酶敏感的切割位點的代替或保護，該異源連接序列可以導(dǎo)致更少的切割。因此，相對于一種對照纖維素酶，在此所涵蓋的修飾的纖維素酶具有改進的表達、穩(wěn)定性、和/或活性。在不同的實施方案中，用一種改進的連接序列代替一種或多種天然連接序列導(dǎo)致了全長纖維素酶在表達量、穩(wěn)定性、和/或活性方面的增加。這種全長酶包括至少一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域、至少一個異源連接物、以及至少一個催化結(jié)構(gòu)域。這種全長蛋白的一個特殊優(yōu)點是結(jié)合結(jié)構(gòu)域特別是纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保留。雖然不受任何特定理論或機理的束縛，在修飾的纖維素酶中的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在可以導(dǎo)致在不溶性纖維素底物(如微晶纖維素)在水解方面的改進。在一些實施方案中，相應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸殘基471直至499的天然連接序列被異源連接序列所代替。可替代地，與SEQ ID NO :2同源的纖維素酶中的一個天然連接序列被一個異源連接序列所代替。將理解的是，同源纖維素酶序列的天然連接區(qū)域可以比由SEQ ID N0:2的氨基酸殘基471直至499定義的連接區(qū)域短或長1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個氨基酸。在本發(fā)明的不同實施方案中，該核苷酸序列編碼了一種纖維素酶，該纖維素酶包括SEQ ID N0:18、19、或20中列出的連接序列。基于這個信息，連同關(guān)于纖維素酶結(jié)構(gòu)特征的本領(lǐng)域的詳細信息，可以設(shè)計另外的異源連接序列并且測試在植物細胞中的表達。用于監(jiān)測纖維素酶的表達、加工(包括切割)、以及活性的方法在本領(lǐng)域是已知的。在一個實施方案中，修飾的多結(jié)構(gòu)域酶是一種纖維二糖水解酶或一種葡聚糖內(nèi)切酶。纖維二糖水解酶和葡聚糖內(nèi)切酶是結(jié)構(gòu)上類似的并且經(jīng)常由多個結(jié)構(gòu)域組成。至少一個結(jié)構(gòu)域是一個催化核心結(jié)構(gòu)域，該催化核心結(jié)構(gòu)域可以與另外的催化結(jié)構(gòu)域或至少一個纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)相結(jié)合。這兩個結(jié)構(gòu)域是通過具有6-59個氨基酸的相對長的、糖基化的連接肽進行連接的。術(shù)語“纖維二糖水解酶”(CBH)是指如EC 3. 2. 1. 91所分類的一組纖維素酶。這些酶還稱為外切葡聚糖酶或外纖維二糖水解酶。CBH酶已經(jīng)從多種來源分離出來，這些來源包括微生物來源，如細菌、酵母、以及真菌，它們中的每一種被包括在此。在不同的實施方案中，該CBH酶是一種修飾的纖維二糖水解酶I (CBHI)酶。CBHl在微晶纖維素的分解中起著關(guān)鍵作用(Claeyssens et al. (1990)Biochem J 270(1) :251-256 ；以及，Wood et al. (1989) Biochem J 260(1) :37-44)。通常，一種CBHl類型的酶優(yōu)先地從纖維素的還原端水解纖維二糖，而一種纖維二糖水解酶II(CBH2)類型的酶優(yōu)選水解纖維素的非還原端。葡聚糖內(nèi)切酶(l，4-p_D-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC 3. 2. 1. 4)是普遍存在的水解靠近未取代的葡萄糖殘基的1,4-β鍵的酶(Henrissat et al. (1989)Gene81 :83-95)，是由寬范圍的生物產(chǎn)生的，包括真菌、細菌、植物、以及昆蟲。葡糖淀粉酶在本發(fā)明的不同實施方案中，這種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶是一種淀粉降解酶。淀粉降解酶廣泛分布遍及許多動物、植物以及微生物種類。這些酶已經(jīng)被分類為α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，屬于糖苷水解酶家族13、14或15。在不同的實施方案中，本發(fā)明包括一種修飾的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶類(α -1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶類Ε. C. 3. 2. 1. 3)是淀粉水解外切活性的糖酶類。葡糖淀粉酶類催化了連續(xù)的葡萄糖單元從淀粉或相關(guān)的寡聚糖以及多糖分子的非還原端去除，并且可以水解淀粉(淀粉酶和支鏈淀粉)的直鏈糖苷鍵和分支糖苷鍵兩者。商業(yè)上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶類，它們已經(jīng)用于需要淀粉水解的多種多樣的應(yīng)用中。可以通過在本發(fā)明的所收獲的植物材料中的至少一個種類中異源表達葡糖淀粉酶提供葡糖淀粉酶。與其他多糖降解酶類似，大多數(shù)葡糖淀粉酶具有模塊結(jié)構(gòu)，該模塊結(jié)構(gòu)的組成為 催化結(jié)構(gòu)域、淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域、以及高度0-糖基化的連接物，該連接物將這兩個結(jié)構(gòu)域進行連接(Bourne and Henrissat (2001)Curr. Opin. Struct. Biol. 11(5) :593-600 ； Sauer et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1543 (2) :275-293)。對于這類酶的催化部位、作用機理、底物識別、連接區(qū)域、以及多結(jié)構(gòu)域構(gòu)造的描述可以在Sauer et al. (2000)Biochim. Biophys. Acta. 1543(2) :275-293中找到，將其通過引用以其整體結(jié)合在此。在此涵蓋的修飾的葡糖淀粉酶具有連接序列，當(dāng)該修飾的葡糖淀粉酶表達于植物中時，該連接序列導(dǎo)致較少的切割。在一些實施方案中，當(dāng)表達于植物中時，小于大約90% 的修飾的酶被切割，當(dāng)表達于植物中時，小于大約80%、小于大約70%、小于大約60%、小于大約50 %、小于大約40 %、小于大約30 %、小于大約20 %、小于大約10 %、小于大約5 %、 或沒有修飾的酶被切割。由于如以上所討論的蛋白酶敏感的切割位點的代替或保護，該異源連接序列可以導(dǎo)致較少的切割。在本發(fā)明的不同實施方案中，該修飾的葡糖淀粉酶包括 SEQ ID N0:18、19、或20中列出的連接序列。因此，相對于一種對照葡糖淀粉酶，在此所涵蓋的修飾的葡糖淀粉酶具有改進的表達、穩(wěn)定性、和/或活性。植物表達盒本發(fā)明的這些組合物還包括用于在感興趣的一種植物細胞中轉(zhuǎn)化并表達多結(jié)構(gòu)域酶的核酸序列。這些核酸序列可以存在于DNA構(gòu)建體或表達盒中。如此處使用的“表達盒”表示能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎兄笇?dǎo)一種特定核苷酸序列的表達的一種核酸分子，包含可操作地連接到感興趣的核苷酸序列(即，編碼感興趣的多肽的一種核苷酸序列)(它被可操作地連接到終止信號)的啟動子。它還典型地包括用于核苷酸序列的正確翻譯所需要的序列。包含這種感興趣的核苷酸序列的表達盒可能是嵌合體的，意味著它的至少一種組分對于它的至少一種其他組分是異源的。該表達盒也可以是天然發(fā)生的但已經(jīng)是以有用于異源表達的一種重組體形式獲得的表達盒。然而，典型地，該表達盒對于宿主是異源的，即，該表達盒的特定DNA序列并不天然發(fā)生于該宿主細胞內(nèi)，并且必須通過轉(zhuǎn)化事件而被引入該宿主細胞或該宿主細胞的祖先(ancestor)中。在該表達盒中的核苷酸序列的表達可以在組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的控制之下，該啟動子只有在該宿主細胞暴露于一些特定的外部刺激時才引發(fā)轉(zhuǎn)錄。另外，該啟動子對于一種特定的組織或器官或發(fā)育階段也可以是特異性的。本發(fā)明涵蓋了具有表達盒的植物的轉(zhuǎn)化，這些表達盒能夠在植物細胞中指導(dǎo)多結(jié)構(gòu)域酶的表達。該表達盒將在5'至3'的轉(zhuǎn)錄方向上包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(例如，一種啟動子)以及一種編碼修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的多核苷酸。該表達盒可以任選地包括在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。此外，該構(gòu)建體還進一步包括另外的調(diào)控元件，從而促進修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)運。該表達構(gòu)建體的調(diào)節(jié)序列被可操作地連接到編碼修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的多
12核苷酸上。對于“可操作地相連”，是指在調(diào)節(jié)元件與第二序列之間的功能性連接，其中該調(diào)節(jié)元件引發(fā)和/或介導(dǎo)了相應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或易位。通常，可操作地連接意味著被連接的核苷酸序列是連續(xù)的。這些調(diào)控元件包括啟動子、增強子、以及用于將細胞質(zhì)合成的蛋白靶向該植物細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)的信號序列。所表達的多結(jié)構(gòu)域酶還可以被靶向到某些細胞器(如液泡)中以緩解毒性問題。 為了液泡靶向的多結(jié)構(gòu)域酶的表達，用包括液泡靶向序列(如形成煙草甲殼酶基因)的載體轉(zhuǎn)化植物。在這種情況下，所表達的多結(jié)構(gòu)域酶將被存貯在液泡中，其中它們將不能夠降解纖維素并且危害植物。在本發(fā)明的一個實施方案中，該液泡分選信號序列是由大麥多氨基氧化酶2(BPA02)信號序列衍生的。BPA02具有一種用于進入分泌途徑的N端信號肽。 這個信號肽的C-末端延伸的存在導(dǎo)致BPAO在植物細胞中的液泡定位(參見Cervelli et al. (2004)The Plant Journal 40:410-418)。在另一個實施方案中，有用的液泡分選信號描述于美國申請?zhí)?2/359,421中，將其通過引用以其整體結(jié)合在此。在本發(fā)明的不同的實施方案中，修飾的多結(jié)構(gòu)域酶編碼序列被融合到在植物中活性的啟動子上并且被轉(zhuǎn)化到核基因組或質(zhì)體基因組中。葉綠體表達具有的優(yōu)點是，該多結(jié)構(gòu)域酶對于質(zhì)體是較少損害的，因為它包含很少的或沒有纖維素。在其他的實施方案中，該構(gòu)建體在轉(zhuǎn)錄的5'到3'的方向上包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即，啟動子)、一種編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號序列的多核苷酸、以及一種編碼修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的多核苷酸。示例性的信號序列包括SEKDEL(SEQID NO 23)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列、Y玉米蛋白27kD信號序列、以及大豆的大豆球蛋白GYl信號序列。在本發(fā)明的方法中有用的其他方法對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言將是清楚的。在本發(fā)明的實踐中可以使用任何能夠在感興趣的植物中驅(qū)動表達的啟動子。這種啟動子可以是天然的或模擬的或外來的或與該宿主植物是異源的。當(dāng)在此用來提及核酸序列(例如，DNA或RNA序列)或基因時，術(shù)語“異源的”和“外源的”是指源自對于特定的宿主細胞是外來的來源、或者如果源自相同的來源是自其原始形式被修飾的一種序列。因此， 在宿主細胞中的異源基因包括對于該特定宿主細胞是內(nèi)源性的但是已經(jīng)通過例如使用DNA 改組而修飾的一種基因。這些術(shù)語還包括一種天然發(fā)生的DNA序列的非天然發(fā)生的多份拷貝。因此，這些術(shù)語是指一種DNA區(qū)段，它是外來的或與該細胞異源的或與該細胞同源的但是處于該宿主細胞核酸的位置中(其中通常找不到該元件)。表達了外源DNA區(qū)段以產(chǎn)生外源性多肽。“同源的”核酸(如DNA)序列是與它被引入其中的宿主細胞天然相關(guān)聯(lián)的一種核酸(例如DNA或RNA)序列。有待包括的啟動子的選擇取決于幾個因素，包括但不限于效率、可選擇性、誘導(dǎo)性、所希望的表達水平、以及細胞或組織優(yōu)先的表達。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，通過適當(dāng)?shù)剡x擇并且相對于該序列來定位啟動子以及其他的調(diào)節(jié)區(qū)域而調(diào)整一種序列的表達是一種慣例。一些適當(dāng)?shù)膯幼觾H僅或者主要在某些細胞類型中啟動轉(zhuǎn)錄。因此，如在此所使用的，一種細胞類型或組織優(yōu)先的啟動子是優(yōu)選在靶組織中驅(qū)動表達、但也可以在其他細胞類型或組織中導(dǎo)致某種表達的啟動子。用于鑒定并表征在植物基因組DNA中的啟動子區(qū)的方法包括例如以下參考文獻中描述的那些Jordano，et al.，Plant Cell,l 855-866(1989) ；Bustos,et al. ,Plant Cell,1 :839-854(1989) ；Green,et al. ,EMBO J. 7， 4035-4044(1988) ；Meier, et al.，Plant Cell，3，309-316 (1991)；以及 Zhang, et al.， Plant Physiology 110:1069-1079(1996)。為了驅(qū)動綠色組織(如葉和莖)中的轉(zhuǎn)錄而在光合組織中活躍的啟動子也是本發(fā)明感興趣的。最適合的是僅僅或主要在此類組織中驅(qū)動表達的啟動子。該啟動子可以遍及該植物組成性地、或?qū)τ诰G色組織差異性地、或?qū)τ谄渲邪l(fā)生表達的綠色組織的發(fā)育階段差異性地、或響應(yīng)外部刺激來賦予表達。此類啟動子的實例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)啟動子，如來自美洲落葉松(Larix laricina)的 RbcS 啟動子、松樹 cab6 啟動子(Yamamoto et al. (1994)Plant Cell Physiol. ；35 :773-778)、來自小麥的 Cab-I 基因啟動子(Fejes et al. (1990)Plant Mol. Biol. 15 :921-932)、來自菠菜的 CAB-I 啟動子(Lubberstedt et al. (1994)Plant Physiol. 104 :997-1006)、來自水稻的 cablR 啟動子(Luan et al. (1992)Plant Cell 4 971-981)、來自玉米的丙酮酸正磷酸雙激酶(PPDK)啟動子(Matsuoka et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA90 :9586-9590)、煙草 LhcblM 啟動子(Cerdan et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33 :245-255)、擬南芥SUC2蔗糖-H+同向轉(zhuǎn)運體啟動子(Truernit et al. (1995) Planta 196 :564-570)、以及來自菠菜的類囊體膜蛋白啟動子psaD、psaF、psaE、PC、FNR、 atpC、atpD、cab、rbcQ。在美國專利申請?zhí)?007/0006346中描述了在莖、葉和綠色組織中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的其他啟動子，通過引用將該申請以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。Hudspeth & Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))已經(jīng)描述了一種編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用標準分子生物學(xué)技術(shù)，用于這種基因的啟動子可以用來在轉(zhuǎn)基因植物中以一種綠色組織特異的方式驅(qū)動任何基因的表達。在本發(fā)明的其他一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子可能是令人希望的。誘導(dǎo)型啟動子響應(yīng)于外部刺激(如化學(xué)試劑或環(huán)境刺激)而驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。例如，誘導(dǎo)型啟動子可以響應(yīng)于激素類(如赤霉酸或乙烯)、或響應(yīng)于光或干旱而賦予轉(zhuǎn)錄。用一種化學(xué)上誘導(dǎo)型啟動子，通過葉敷一種化學(xué)誘導(dǎo)劑，可以在適當(dāng)?shù)臅r間活化轉(zhuǎn)化到植物中的多結(jié)構(gòu)域酶基因的表達。可以得到許多種轉(zhuǎn)錄終止子用于表達盒中。這些負責(zé)對越過該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄終止和正確的mRNA聚腺苷酸化。該終止區(qū)可以是與該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然在一起的、可以與感興趣的可操作地連接的DNA序列天然在一起的、可以與該宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一種來源(即，對于該啟動子、該感興趣的DNA序列、該宿主植物、或它們的任何組合是外來的或異源的)。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子是已知在植物中發(fā)揮作用的那些，并且包括CAMV 35S終止子、tml終止子、胭脂堿合成酶終止子以及豌豆rbcS E9終止子。這些終止子可以在單子葉植物和雙子葉植物中使用。此外，可以使用一種基因的天然轉(zhuǎn)錄終止子。在某些實施方案中，該表達盒將包括一種選擇性標記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細胞。 利用選擇性標記基因來選擇轉(zhuǎn)化的細胞或組織。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多序列增強了來自轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達并且這些序列可以與本發(fā)明的基因結(jié)合使用來增加它們在轉(zhuǎn)基因植物中的表達。已經(jīng)顯示不同的內(nèi)含子序列增強了特別是在單子葉植物的細胞中的表達。例如， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在將玉米Adhl基因的內(nèi)含子引入玉米細胞中時顯著增強了在其同源啟動子下的野生型基因的表達。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1是特別有效的并且增強了在與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(Callis et al.，Genes Develop. 1 1183-1200 (1987))。在同一個實驗體系中，來自玉米青銅色1基因(maize bronze lgene)的內(nèi)含子在增強表達方面具有相似的效果。常規(guī)地已經(jīng)將內(nèi)含子序列結(jié)合到植物轉(zhuǎn)化載體中，典型地在非翻譯前導(dǎo)序列之內(nèi)。也已知許多源自病毒的非翻譯前導(dǎo)序列增強了表達，并且這些序列在雙子葉植物的細胞中是特別有效的。確切地說，已經(jīng)顯示來自煙草花葉病毒01^，“1-序列”)、玉米枯黃斑點病毒(MCMV)、以及苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列在增強表達方面是有效的(例如，Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15 :8693-8711 (1987) ；Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15 :65-79(1990))。本領(lǐng)域中已知的其他前導(dǎo)序列包括但不限于細小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如，EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5'非編碼區(qū))(Elroy-Mein，0.，F(xiàn)uerst, T. R. , and Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130(1989))；馬鈴薯 Y 病毒屬前導(dǎo)序列，例如 TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)(Allison et al. , 1986) ；MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)；病毒學(xué)(154 9-20)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)前導(dǎo)序列(Macejak, D. G.， and Samow, P.，Nature 353 :90-94(1991))；來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mRNA的未翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA 4) (Jobling, S. Α.，and Gehrke, L.，Nature 325 :622-625(1987))； 煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV) (Gallie, D. R. et al.，Molecular Biology of RNA, pages 237-256(1989))；以及玉米枯黃斑點病毒前導(dǎo)序列(MCMV) (Lomme 1，S. A. et al.， Virology 81:382-385(1991))。還參見 Della-Cioppa et al.，Plant Physiology 84: 965-968(1987)。還應(yīng)當(dāng)認識到可以將編碼這種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的核苷酸序列進行優(yōu)化用于在所轉(zhuǎn)化的宿主細胞中增加表達。換言之，可以使用用于改進表達的宿主細胞偏愛密碼子來合成這些核苷酸序列，或可以按照一種宿主偏愛密碼子使用頻率來使用密碼子進行合成。通常，這種基因的GC含量將會增加。參見例如，Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92 :1-11的對于宿主偏愛密碼子使用的討論。在本領(lǐng)域中可以獲得多種方法用于合成植物偏愛基因。參見例如，美國專利號5，380，831和5，436，391，以及Murray et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17 :477_498，通過引用結(jié)合于此。植物在本發(fā)明中有用的植物包括對于修飾的多結(jié)構(gòu)域酶是轉(zhuǎn)基因的植物。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認識到，植物可以表達一種或多種另外的多肽序列，這種或這些多肽序列與一種或多種感興趣的次級性狀相關(guān)聯(lián)或促成這種或這些性狀。這些多肽可以是細胞質(zhì)表達的、可以靶向一種亞細胞器、或可以是由該植物細胞分泌的。感興趣的次級性狀包括農(nóng)藝學(xué)性狀，這些性狀主要是對種子公司、種植者、或谷粒處理機有益的，例如除草劑抗性、 病毒抗性、細菌性病原體抗性、昆蟲抗性、線蟲抗性、以及真菌抗性。參見例如美國專利號 5，569, 823 ；5, 304，730 ；5, 495, 071 ；6, 329，504 ；以及 6，337，431。一種感興趣的次級性狀還可以是提高植物活力或產(chǎn)量的性狀(包括允許植物在不同的溫度、土壤條件以及日光和降水量水平下生長的性狀)、或是允許鑒定展現(xiàn)出感興趣性狀的一種植物的性狀(例如，選擇性標記基因、種皮顏色等)。有益于產(chǎn)生具有所希望的次級性狀的植物的大量基因在本領(lǐng)域中是可獲得的。
所選擇的植物的類型取決于多種因素，包括例如收獲的植物原料的下游使用、植物物種對轉(zhuǎn)化的適應(yīng)性、以及在植物將要生長、收割、和/或加工之下的條件。普通技術(shù)人員將進一步認識到用于選擇用于本發(fā)明適當(dāng)?shù)闹参锓N類的另外的因素包括高產(chǎn)量潛力、 良好的莖強度、對特殊病害的抵抗力、耐旱性、快速干燥以及足以允許儲存和輸送至市場而具有最小損失的谷物質(zhì)量。進一步考慮到本發(fā)明的構(gòu)建體可以被引入具有改進的對于具體的下游用途是適合的或最佳的特性的植物種類中。例如，在具有改變的淀粉代謝的植物中自然發(fā)生的遺傳變異性在本發(fā)明的這些方法中是有用的。許多此類植物在編碼淀粉降解酶或淀粉合成酶的同種型的基因中攜帶多種突變。例如，已經(jīng)鑒定出多種植物，它們對于糯性基因(wx)、直鏈淀粉擴充基因(ae)、 暗胚乳基因(du)、角質(zhì)基因(h)、皺縮基因(sh)、易脆基因(bt)、粉質(zhì)基因(fl)、不透明基因(O)、或甜質(zhì)基因(su)的突變體等位基因中的一種或多種是雜合的或純合的。參見例如，美國專利號 4，428，972 ；4，767，849 ；4，774，328 ；4789738 ；4，789，557 ；4，790，997 ； 4，792，458 ；4，798，735 ；以及4，801，470，通過引用結(jié)合在此。這些植物可以以它們天然形式進行使用，或可以進行修飾以展示一種或多種感興趣的附加性狀。對于具有增加的營養(yǎng)品質(zhì)的植物，可以獲得幾個玉米品種，如具有增加的賴氨酸(Crow' s Hybrid Corn Company, Mil ford, 111)、增加的蛋白(BASF)以及增加的油 (Pfister Hybrid Corn Company, El Paso, 111.商標為KERNOIL )水平的那些。其他適當(dāng)?shù)母哂陀衩装ū环Q為伊利諾高油(IHO)以及亞歷山大高油(Alexo)的玉米種群，它們的樣品可以從 University of Illinois Maize Genetics Cooperative—Stock Center (Urbana, 111.)獲得。還可以獲得甜玉米，其中存在著在正常情況下在未成熟玉米粒中發(fā)現(xiàn)的淀粉量的降低以及葡萄糖、蔗糖和/或水溶性多糖的量的增加(Creech，R. and Alexander, D. Ε. In Maize Breeding and Genetics ；D. B. ffalden, Ed. ；John Wiley and Sons :New York, 1978 ；pp. 249-264) 在幾種植物品種中(例如，玉米(Shannon & Garwood，1984)、豌豆 (Bhattacharyya et al.，1990)、馬鈴薯(Hovenkamp-Hermelink et al.，1987)、擬南芥 (Caspar et al. ，1985 ；Lin et al. ，1988a ；Lin et al. ，1988b) UR'M^· (Hanson et al.， 1988))，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有一種改變的碳水化合物構(gòu)成的突變體。幾十年來褐色中脈(Bmr) 玉米已經(jīng)被用作一種替代物用于改進青貯雜交體的可消化性。在反芻動物的攝入以及可消化性方面的改進是源自降低在Bmr突變的雜化體中的木質(zhì)素含量。具有令人希望的、用于下游加工的性狀(如在此說明)的另外的品種(自然發(fā)生的和轉(zhuǎn)基因的)對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是熟知的。本發(fā)明中有用的植物還包括(但不限于)產(chǎn)生可食用的花的作物，例如花椰菜(Brassica oleracea)、朝鮮薊(Cynara scolvmus)、以及紅花(紅花屬，例如紅花) artichoke (Cynara scolvmus), and saff lower (Carthamus, e. g. tinctorius) ； 7_K 果，例如蘋果(蘋果屬，例如蘋果)、香蕉(芭蕉屬，例如小果野蕉)、漿果(例如荼薦子屬植物， 荼薦子屬，例如紅醋栗)、櫻桃類(例如甜櫻桃，李屬，例如歐洲甜櫻桃)、黃瓜(黃瓜屬， 例如黃瓜)、葡萄(葡萄屬，例如葡萄)、檸檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、堅果(例如胡桃，胡桃屬，例如胡桃；花生，Arachis hypoaeae)、橙(柑桔屬，例如柚)、桃(李屬O^imus)，例如桃)、梨(梨屬(Pyra)，例如西洋梨)、胡椒(茄屬，例如珊瑚櫻)、李子(李屬，例如歐洲李)、草莓(草莓屬，例如麝香草莓)(fruits such as apple (Malus, e. g. domesticus), banana(Musa, e. g. acuminata), berries (such as the currant, Ribes, e. g. rubrum), cherries (such as the sweet cherry, Prunus, e. g. avium), cucumber(Cucumis, e.g.sativus), grape(Vitis, e.g.vinifera), lemon(Citrus limon)， melon (Cucumis melo), nuts(such as the walnut, Juglans, e. g. regia ；peanut, Arachis hypoaeae), orange(Citrus, e. g. maxima), peach(Prunus, e. g. persica), pear(Pyra, e. g. communis)，pepper (Solanum, e. g. capsicum)，plum (Prunus, e. g. domestica)， strawberry (Fragaria，e. g. moschata))、番茄(番茄屬，例如番茄)；葉類，例如苜蓿(苜蓿屬，例如紫苜蓿)、甘蔗(Saccharum)、甘藍(例如Brassica oleracea)、菊苣(菊苣屬 (Cichoreum)，例如菊苣)、韭(蔥屬，例如韭蔥)、萵苣(萵苣屬，例如萵苣)、菠菜(菠菜屬，例如菠菜(oleraceae))、煙草(煙草屬，例如煙草)；根類，例如竹芋(竹芋屬，例如竹芋)、甜菜(甜菜屬，例如甜菜)、胡蘿卜(胡蘿卜屬，例如野胡蘿卜)、木薯(木薯屬， 例如木薯)、蕪菁(蕓苔屬，例如蕪青)、蘿卜(蘿卜屬，例如蘿卜)、山藥(薯蕷屬，例如山 藥)tomato(Lycopersicon, e. g. esculentum) ；leafs，such as alfalfa (Medicago， e. g. sativa) , sugar cane (Saccharum), cabbages(such as Brassica oleracea), endive(Cichoreum, e.g.endivia), leek (Allium，e. g. porrum), lettuce(Lactuca， e· g· sativa)，spinach (Spinacia e· g· oleraceae)，tobacco (Nicotiana，e. g. tabacum)； roots，such as arrowroot (Maranta，e.g.arundinacea), beet (Beta，e· g·vulgaris)， carrot (Daucus, e. g. carota), cassava (Manihot, e. g. esculenta), turnip (Brassica, e. g. rapa), radish (Raphanus，e. g. sativus) yam (Dioscorea, e· g· esculenta)、 甘暮 (Ipomoea batatas)；種子，例如豆(菜豆屬，例如菜豆)、豌豆(豌豆屬，例如豌豆)、大豆(大豆屬，例如大豆)、小麥(小麥屬，例如普通小麥)、大麥(大麥屬，例如大麥)、玉米 (玉蜀黍?qū)?，例如玉蜀?、水稻(稻屬，例如Oryza sativa) ((Phaseolus, e. g. vulgaris)， pea (Pisum, e. g. sativum)，soybean (Glycine, e. g. max)，wheat (Triticum，e. g. aestivum)， barley (Hordeum，e. g. vulgare) , corn (Zea, e. g. mays), rice (Oryza, e.g. sativa))； 草類，例如芒草(芒屬，例如巨芒)以及柳枝稷(黍?qū)?，例如柳枝稷MMiscanthus grass (Miscanthus，e. g.，giganteus) and switchgrass (Panicum，e. g. virgatum))；樹，例如白楊(楊屬，例如歐洲山楊)、松樹(Pinus)；灌木，例如棉花(例如Gossypium hirsutum) (poplar (Populus, e. g. tremula), pine (Pinus) ；shrubs, such as cotton (e· g·，Gossypium hirsutum))；以及塊莖，例如甘藍(蕓苔屬，例如甘藍(oleraceae))、馬鈴薯(茄屬，例如馬鈴暮)(tubers, such as kohlrabi (Brassica, e. g. oleraceae)，potato (Solanum, e. g. tuberosum))、以及類似物。植物轉(zhuǎn)化在此描述的表達構(gòu)建體能以幾種本領(lǐng)域公認的方式引入植物細胞中。術(shù)語“引入” 在多核苷酸(例如，感興趣的核苷酸構(gòu)建體)的背景下是意指以這樣一種方式將多核苷酸呈現(xiàn)在植物中，即該多核苷酸得到了進入植物細胞的內(nèi)部的途徑。在有待引入多于一個多核苷酸時，這些多核苷酸可以作為單個核苷酸構(gòu)建體的一部分、或作為分開的核苷酸構(gòu)建體來組裝，并且可以位于相同的或不同的轉(zhuǎn)化載體上。因此，這些多核苷酸可以在單一的轉(zhuǎn)
17化事件中、在多個分開的轉(zhuǎn)化事件中、或者例如在植物中作為育種試驗計劃的一部分被引入感興趣的宿主細胞中。本發(fā)明的這些方法并不依賴于用于將一個或多個多核苷酸引入植物中的一種具體的方法，只要這個或這些多核苷酸得到了進入該植物的至少一個細胞的內(nèi)部的途徑。用于將多核苷酸引入植物中的方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于瞬時轉(zhuǎn)化法、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、以及病毒介導(dǎo)法?！八矔r轉(zhuǎn)化”在多核苷酸的背景下意指多核苷酸被引入植物中而并不整合到該植物的基因組中。在被引入植物中的多核苷酸的背景下，對于“穩(wěn)定引入”或“被穩(wěn)定地引入”是指被引入的多核苷酸被穩(wěn)定地結(jié)合到該植物基因組中，并且因此該植物用該多核苷酸被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化?！胺€(wěn)定的轉(zhuǎn)化”或“被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化”是意指被引入植物中的多核苷酸(例如，在此描述的核苷酸構(gòu)建體)整合到該植物的基因組中并且能夠被其子代更具體地說是被多個連續(xù)世代的子代遺傳?？捎糜谥参镛D(zhuǎn)化的眾多轉(zhuǎn)化載體對于植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是已知的，并且與本發(fā)明相關(guān)的基因可以與任何這樣的載體結(jié)合使用。載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)以及用于轉(zhuǎn)化的目標物種。對于某些目標物種，不同的抗生素或除草劑選擇標記可能是優(yōu)選的。在轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇標記包括nptll基因，它賦予了對卡那霉素及相關(guān)抗生素的抗性(Messing & Vierra. Gene 19:259—268(1982) ；Bevan et al. , Nature 304 :184-187(1983)) ；bar基因，它賦予了對于除草劑草丁膦的抗性(White et al. ,Nucl. Acids Res 18:1062(1990) ；Spencer et al. Theor.Appl. Genet 79 :625-631 (1990))； hph基因，它賦予了對抗生素潮霉素的抗性(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4 =2929-2931)；以及dhfr基因，它賦予了對于甲氨蝶呤的抗性(Bourouis et al.， EMBO J. 2 (7) :1099-1104(1983)) ；EPSPS基因，它賦予了對草甘膦的抗性(美國專利號 4，940，935和5，188, 642)；以及甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶基因，它提供了使甘露糖代謝的能力 (美國專利號 5，767，378 和 5，994，629)。用于植物再生的方法在本領(lǐng)域中也是熟知的。例如，Ti質(zhì)粒載體已用于遞送外來 DNA、以及直接的DNA攝取、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、以及微粒轟擊。此外，可以將來自農(nóng)桿菌屬的細菌用來轉(zhuǎn)化植物細胞。以下是對用于轉(zhuǎn)化雙子葉和單子葉植物兩者的代表性技術(shù)、以及一種代表性的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)的說明。許多使用根癌農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化的載體是可獲得的。這些典型地攜帶至少一個 T-DNA邊界序列，并且包括如pBmi9的載體(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))。對于在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中有用的載體的構(gòu)建，參見例如美國專利申請公開文件號2006/(^60011，該公開通過引用結(jié)合在此。不使用根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化回避了在選擇的轉(zhuǎn)化載體中對T-DNA序列的需要，并且因此除了例如以上描述的含有T-DNA序列的載體之外，可以使用缺乏這些序列的載體。不依賴于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊、原生質(zhì)體攝入(例如，PEG和電穿孔)以及微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇主要取決于對被轉(zhuǎn)化的品種的優(yōu)先選擇。對于這樣的載體的構(gòu)建， 參見例如美國申請?zhí)?0060260011，該公開通過引用結(jié)合在此。為了本發(fā)明的核苷酸序列在植物質(zhì)體中的表達，使用了質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPH143(W097/32011，實例36)。將該核苷酸插入pPH143中由此替換PR0T0X編碼序列。然后將這種載體用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及對于大觀霉素具有抗性的轉(zhuǎn)化體的選擇?？商娲兀瑢⒃摵塑账嵝蛄胁迦隤PH143中這樣它替換了 aadH基因。在此情況下，針對PR0T0X抑制劑的抗性選擇了轉(zhuǎn)化體。對于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的并且包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)以及不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng)桿菌技術(shù)涉及通過原生質(zhì)體或細胞直接攝入外源性遺傳物質(zhì)。 這可以通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝入、粒子轟擊介導(dǎo)的遞送、或顯微注射來完成。這些技術(shù)的實例由 Paszkowski et al.，EMBO J. 3 :2717-2722 (1984) ；Potrykus et al.，Mol. Gen. Genet. 199 :169-177(1985) ；Reich et al. , Biotechnology 4:1001-1004(1986)；以及 Klein et al.，Nature 327:70-73(1987)進行了描述。在各自情況下，使用本領(lǐng)域中已知的標準技術(shù)將這些轉(zhuǎn)化的細胞再生為全植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)，因為它的轉(zhuǎn)化效率高并且它的對于許多不同物種的實用性寬廣。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化典型地涉及將攜帶感興趣的外源DNA(例如，pCIB200或pCIB2001)的二元載體轉(zhuǎn)移到合適的農(nóng)桿菌菌株中，這可能依賴于由宿主農(nóng)桿菌菌株攜帶的或者在共同存在的Ti質(zhì)體上或染色體上的vir基因的互補物(例如，用于 PCIB200 和 pCIB2001 的菌株 CIB542(Uknes et al. Plant Cell 5 159-169(1993)))。將重組二元載體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌是使用攜帶該重組二元載體的大腸桿菌、 一種輔助大腸桿菌菌株(攜帶一種質(zhì)粒如PRK2013并且能夠使該重組二元載體移動到目標農(nóng)桿菌菌株)通過一種三親本雜交方法來完成的?？商娲?，該重組二元載體可以通過DNA 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中(Hofgen & ffillmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877(1988))。通過重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化目標植物品種通常涉及該農(nóng)桿菌與來自該植物的外植體的共培養(yǎng)，并且遵循本領(lǐng)域熟知的科學(xué)試驗計劃。將轉(zhuǎn)化的組織在存在于二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間的攜帶有抗生素或除草劑抗性標記的選擇性培養(yǎng)基上再生。另一種用基因轉(zhuǎn)化植物細胞的方法涉及在植物組織和細胞上注入惰性的或生物學(xué)活性的粒子。美國專利號4，945，050,5, 036，006、以及5，100，792 (都是授予Sanford等人)中披露了這種技術(shù)。通常，這種方法涉及在有效穿透細胞的外表面并提供結(jié)合在其內(nèi)部中的條件下向細胞注入惰性的以及生物學(xué)活性的粒子。當(dāng)使用惰性粒子時，可以通過用含所希望的基因的載體包被這些粒子來將該載體引入細胞中?？商娲?，目標細胞可以被該載體圍繞使得該載體通過激發(fā)該粒子而被帶入該細胞中。也可以將生物學(xué)活性粒子(例如，干酵母細胞、干細菌或噬菌體，各自包含有待引入的DNA)注入植物細胞組織中。多數(shù)單子葉植物品種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在也已經(jīng)變成了常規(guī)操作。優(yōu)選的技術(shù)包括使用 PEG或電穿孔技術(shù)的直接基因轉(zhuǎn)移進入原生質(zhì)體、以及粒子轟擊進入愈傷組織。用單一 DNA 種類或多種DNA種類(即，共轉(zhuǎn)化)可以進行轉(zhuǎn)化，并且這兩種技術(shù)都適合用于本發(fā)明中。 共轉(zhuǎn)化可能具有避免完全型載體構(gòu)建以及生成對于感興趣的基因與選擇性標記具有非伴性基因座的轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)點，能夠在隨后的世代中去除該選擇性標記(如果這被認為是令人希望的)。然而，使用共轉(zhuǎn)化的一個缺點是小于100%的頻率，分離的DNA種類以該頻率整合到基因組中(Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096(1986))。專利申請EP 0 292 435、EP 0 392 225、以及WO 93/07278描述了從優(yōu)良近交系玉米用于制備愈傷組織和原生質(zhì)體、使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、以及從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植株的技術(shù)。Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2 :603-618(1990))以及Fromm 等人(Biotechnology 8 :833-839(1990))已經(jīng)發(fā)表了使用粒子轟擊用于轉(zhuǎn)化源于A188的玉米系的技術(shù)。此外，W093/07278 和 Koziel 等人(Biotechnology 11:194-200(1993)) 描述了通過粒子轟擊用于轉(zhuǎn)化優(yōu)良近交系玉米的技術(shù)。這種技術(shù)利用了從授粉之后 14-15天的玉米穗切下的1.5-2. 5mm長的未成熟玉米胚以及用于轟擊的一臺PDS-IOOOHe Biolistics 裝置。水稻的轉(zhuǎn)化也可以通過利用原生質(zhì)體或粒子轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來進行。 就Japonica型和hdica型已經(jīng)對原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進行了描述(Siang et al. Plant Cell Rep 7:379-384(1988) ；Shimamoto et al. Nature 338:274-277(1989) ；Datta et al. Biotechnology 8:736-740(1990))。使用粒子轟擊，兩種類型也是常規(guī)地可轉(zhuǎn)化的 (Christou et al. Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO 93/21335 描述了通過電穿孔用于轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)。專利申請EP O 332 581描述了用于產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化以及再生早熟禾亞科原生質(zhì)體的技術(shù)。這些技術(shù)允許轉(zhuǎn)化鴨茅屬和小麥。而且，小麥轉(zhuǎn)化已經(jīng)由Vasil等人(Biotechnology 10 :667-674(1992))進行了說明，其中使用了微粒轟擊進入C型長期可再生的愈傷組織的細胞中，并且還由 Vasil 等人(Biotechnologyl 11 1553-1558 (1993))和 Weeks et al. (Plant Physiol. 102 :1077-1084(1993))進行了說明，其中使用了對未成熟胚和未成熟胚衍生的愈傷組織的微粒轟擊。然而，對于小麥轉(zhuǎn)化的一種優(yōu)選的技術(shù)涉及通過離子轟擊未成熟胚的小麥轉(zhuǎn)化，并且包括在基因送遞之前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊之前，將任意數(shù)目的胚(長度為0. 75-lmm)鋪板在具有3%蔗糖(Murashiga & Skoog， Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))以及 3mg/12，4-D 的 MS 培養(yǎng)基上用于誘導(dǎo)體細胞坯，這允許在黑暗中進行。在選擇的進行轟擊的那天，將胚從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出并且放置在滲壓劑上(即，具有以希望的濃度(典型地是15%)添加的蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。允許這些胚發(fā)生質(zhì)壁分離2-3小時，然后進行轟擊。每個靶板二十個胚是典型的，盡管不是關(guān)鍵性的。使用標準方法使一種適當(dāng)?shù)臄y帶基因的質(zhì)粒(如PCIB3064或 PS0G35)沉淀在微米大小的金顆粒上。使用約IOOOpsi的爆破壓力，使用標準的80目網(wǎng)篩， 用DuPontBIOLISTICS 氦裝置射擊每個板的胚。在轟擊之后，將這些胚放回到黑暗中恢復(fù)約M小時(仍在滲壓劑上)。M小時后，從滲壓劑上取出這些胚并將其放回到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在再生之前它們在這里停留約1個月。約一個月之后，將具有發(fā)育中的胚性愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(MS+lmg/升NAA、5mg/升GA)上，該再生培養(yǎng)基進一步包含適當(dāng)?shù)倪x擇劑(在PCIB3064的情況下是10mg/l的basta而在pS0G35的情況下是^ig/ 1的甲氨蝶呤)。約一個月之后，將發(fā)育的嫩枝轉(zhuǎn)移到更大的被稱為“GA7”的無菌容器中， 這些容器包含半濃度的MS、2 %的蔗糖、以及相同濃度的選擇劑。也已經(jīng)說明了使用農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化單子葉植物。參見WO 94/00977以及美國專利號5，591，616，這兩者均通過引用結(jié)合在此。還參見Negrotto et al. ,PlantCell Reports 19 :798-803(2000),通過引用結(jié)合在此。例如，水稻(Oryza sativa)可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物?？梢允褂貌煌乃驹耘嘧兎N(Hiei et al. , 1994，Plant Journal 6 :271-282 ；Dong et al. , 1996, Molecular Breeding 2 :267-276 ；Hiei et al.，1997，Plant Molecular Biology, 35 :205-218)。還
20有，以下描述的各種培養(yǎng)基組分可以在量上變化或者被替換。通過在MS-CIM培養(yǎng)基(MS 基礎(chǔ)鹽，4. 3g/升；維生素B5 (200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺， 500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2，4-D(lmg/ml)，2ml/升；用 IN KOH 調(diào)節(jié) pH 到 5. 8 ； 植物凝膠，3g/升)上培養(yǎng)由成熟的胚開始胚性反應(yīng)和/或建立培養(yǎng)物?；蛘邔⒃谂囵B(yǎng)物反應(yīng)的初始階段的成熟胚或者將已建立的培養(yǎng)系進行接種并且與含有所希望的載體構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(農(nóng)桿菌)進行共同培養(yǎng)。將來自甘油母液的農(nóng)桿菌在固體YPC 培養(yǎng)基(100mg/L大觀霉素或任何其他適當(dāng)?shù)目股?上進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)大約2天。 將農(nóng)桿菌重新懸浮于液態(tài)MS-CIM介質(zhì)中。將該農(nóng)桿菌培養(yǎng)物稀釋至0D600為0. 2-0. 3，并且添加乙酰丁香酮直到最終濃度為200uM。在將該溶液與這些水稻培養(yǎng)物混合之前添加乙酰丁香酮以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌用于將DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞中。為了接種，將這些植物培養(yǎng)物浸入細菌懸浮液中。去除該液體的細菌懸浮物并將接種過的培養(yǎng)物放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上并且在 22°C下培養(yǎng)兩天。然后將這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到具有替卡西林(400mg/升)的MS-CIM培養(yǎng)基中以抑制農(nóng)桿菌的生長。對于使用PME選擇性標記基因的構(gòu)建體(Reed et al. , In Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant37 :127-132)，在7天后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有甘露糖作為碳水化合物來源(具有2%的甘露糖、300mg/升的替卡西林的1^)的選擇培養(yǎng)基中，并且在黑暗中培養(yǎng)3-4周。然后將抗性菌落轉(zhuǎn)移到再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基(不具有2，4-D、0. 5mg/升的IAAUmg/ 升的玉米蛋白、200mg/升的特美汀、2%的甘露糖以及3%的山梨糖醇的MS)中并且在黑暗中生長14天。然后將增殖中的菌落轉(zhuǎn)移到另一輪的再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并且移到光照生長室中。將再生的嫩枝轉(zhuǎn)移到帶有GA7-1培養(yǎng)基(不含激素以及2%的山梨糖醇的MS)的GA7 容器中培養(yǎng)2周，然后在它們足夠大并具有足夠的根時將其移到溫室中。將植株移栽到溫室的土壤中(用于再生)長至成熟，并且收獲Tl代種子。通過用本發(fā)明的核酸序列的轉(zhuǎn)化而獲得的植物可以是各種各樣的植物品種的任何一種，包括單子葉植物和雙子葉植物的那些；然而，在本發(fā)明的方法中所使用的植物優(yōu)先選自以上提出的農(nóng)藝學(xué)上重要的目標作物的列表。本發(fā)明的一種基因連同對于生產(chǎn)和質(zhì)量重要的其他特征的表達可以通過育種結(jié)合到植物系中。育種的方法和技術(shù)在本領(lǐng)域中是己知的。參見例如 Welsh J. R. , Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons,NY(1981) ；Crop Breeding,Wood D. R. (Ed. )American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983) ；Mayo 0. , The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press, Oxford(1987) ；Singh, D. P.，Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986)；以及 Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co. , Berlin(1986)。對于質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，使煙草“Xanthienc”的種子在T瓊脂培養(yǎng)基上以1〃圓形陣列在每個板上發(fā)芽七個，并且在播種12-14天后用Ium的鎢粒子進行轟擊(M10，Biorad, Hercules, Calif.)，這些粒子包被有基本上如所描述的來自pPH143和pPH145的DNA (Svab, Z. and Maliga，P. (1993)PNAS 90，913-917)。將轟擊的苗在T培養(yǎng)基上孵育兩天，在此之后將其葉子切除并且在強光中(350-500umol光子/m2/s)將背軸側(cè)向上放置于含有500 μ g/ ml 二鹽酸大觀霉素(Sigma，St. Louis, Mo.)的 RMOP 培養(yǎng)基上(Svab，Ζ.，Hajdukiewicz, P. and Maliga，P. (1990)PNAS 87,8526-8530)。將轟擊后三到八周出現(xiàn)在褪色的葉子下面出現(xiàn)的抗性嫩枝亞克隆到相同的選擇性培養(yǎng)基上，允許其形成愈傷組織、并將次級嫩枝分離出并進行亞克隆。在獨立的亞克隆中經(jīng)轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組拷貝的完整分離(同質(zhì)體性，homoplasmicity)是由DNA印跡雜交的標準技術(shù)進行評定的(Sambrook et al.， (1989)Molec μ Lar Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) BamHI/EcoRI 酶切的總細胞 DNA (Mettler，I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5,346349)在的Tris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠上被分離、轉(zhuǎn)移到尼龍膜 (Amersham)上、并且用sup. 32P標記的隨機配對的DNA序列進行探測，這些DNA序列對應(yīng)于 0. 7kb BamHI/HindHI DNA片段，該片段來自包含rps 7/12質(zhì)體靶向序列的一部分的pC8。 使同質(zhì)體的(homoplasmic)嫩枝在含有大觀霉素的MS/IB培養(yǎng)基上無菌地生根(McBride， K. Ε. et al. (1994) PNAS 91，7301-7305)并轉(zhuǎn)移到溫室中。被工程化進入以上描述的轉(zhuǎn)基因的種子以及植物中的遺傳特性通過有性生殖或營養(yǎng)生長被傳代，并且由此可以被維持并在子代植物中使之遺傳。一般而言，維持和遺傳使用了已知的為滿足特定的目的(如耕種、播種或收割)而開發(fā)的農(nóng)業(yè)方法。在植物育種中可以進一步使用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物和種子的有利的遺傳特性。取決于所希望的特性，可以采取不同的育種措施。相關(guān)的技術(shù)是在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的， 并且包括但不限于雜交、近交、回交育種、多系育種、品種混合(variety blend)、種間雜交、 非整倍體技術(shù)、等等。因此，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物可以用來改良植物系的育種， 這些植物系例如增加了常規(guī)方法(例如除草劑或殺蟲劑處理)的效力，或由于它們經(jīng)修飾的遺傳特性而允許免除所述的方法。用途從在此說明的轉(zhuǎn)基因植物中收獲的植物材料在下游農(nóng)藝學(xué)和工業(yè)使用中是有用的，這些使用例如人類食品、動物飼料、生物燃料、工業(yè)酒精、發(fā)酵原料、以及類似物。因此， 在此提供了用于生產(chǎn)一種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的方法，這些方法包括將表達這種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的植物進行培養(yǎng)。還涵蓋了用于生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括使一種表達修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的植物發(fā)酵，連同通過向混合飼料中加入一種表達修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的植物用于增強動物飼料可消化性的方法。在一個實施方案中，該植物材料可以用來配制用于人類消費的食品或飲料或動物飼料，可以用來配制具有易于消化的淀粉并且因此具有更多可引出的能量的食物，或可以用來改進這種食品或飼料的營養(yǎng)品質(zhì)(例如，增加的維生素含量、增加的油含量、增加的蛋白含量、等等)。這種食品、飼料或飲料可以是面粉、生面團、面包、面制品(pasta)、餅干、蛋糕、增稠劑、啤酒、麥芽飲料或一種食品添加劑。這種食品、飼料、或啤酒產(chǎn)品可以具有降低的變應(yīng)原性和/或增加的可消化性。此外，一種生面團產(chǎn)品與從這些相同物種的非轉(zhuǎn)基因種子或谷粒制成的生面團相比可以具有增加的強度和體積。這種食品、飼料、或飲料可以具有超級可消化的蛋白質(zhì)和/或超級可消化的淀粉。這種食品、飼料、或飲料可以是低變應(yīng)原性的。從本發(fā)明的收獲的植物材料中提取的油可以用作用于化學(xué)修飾的原料、生物可降解材料的成分、混合的食品產(chǎn)品的成分、食用油或烹調(diào)油的成分、潤滑劑或它的成分、生物柴油或它的成分、休閑食品的成分、發(fā)酵工藝的原料、或化妝品的成分。所收獲的本發(fā)明的植物材料還可以與其他成分組合以生產(chǎn)一種有用的產(chǎn)品。產(chǎn)品中所包括的具體成分將根據(jù)該產(chǎn)品的最終用途來確定。示例性的產(chǎn)品包括動物飼料、用于化學(xué)修飾的原料、生物可降解材料、混合的食品產(chǎn)品、食用油、烹調(diào)油、潤滑劑、生物柴油加工原料、休閑食品、化妝品、清洗劑和洗滌劑的組合物(例如，衣物洗滌劑類、盤子清洗洗滌劑類、以及硬表面清洗組合物類)、以及發(fā)酵工藝原料。包含在此說明的所收獲的植物材料的產(chǎn)品還包括完整的或部分地完整的豬、家禽、以及牛的飼料，寵物食品，以及人類食品產(chǎn)品(例如擠出式休閑食品、面包)、作為一種食品粘合劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料、可發(fā)酵的混合物、 食品增補劑、運動飲料、營養(yǎng)食品棒、多種維生素增補劑、食物飲料、以及谷類食品。結(jié)合在此說明的所收獲的植物材料的產(chǎn)品包括例如紙板、紙產(chǎn)品、以及工業(yè)材料。這些產(chǎn)品可以結(jié)合粗收獲的植物材料、或可以結(jié)合所收獲的植物材料的一種經(jīng)加工或提取的形式(例如， 從所收獲的植物材料中提取的油、蛋白質(zhì)、淀粉、等)。以下實例是作為說明而并不作為限制而提供的。實驗在此使用的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的并且由J. Sambrook， Ε.F.Fritsch 禾口 Τ·Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)以及由 Τ. J. Silhavy, Μ.L. Berman,禾口 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984)以及由 Greene Publishing Assoc.禾口 Wiley-Interscience(1987)出版的Ausubel,F. Μ·等人，Current Protocols in Molecular Biology進行了描述。實例1 雙子葉植物優(yōu)化的多個纖維素酶基因使用Vector NTI 9. 0中的回譯程序設(shè)計了雙子葉植物的合成基因。使用對于雙子葉植物偏愛密碼子將六種蛋白序列回譯成雙子葉植物優(yōu)化的編碼序列。將額外的序列加到每種纖維素酶基因編碼序列的5’和3’端用于克隆以及差異性地靶向到多個亞細胞區(qū)室。 為了構(gòu)建雙子葉植物瞬時表達載體，將AscI、BamHI、和煙草Kozak序列添加在5’端。將靶向ER的序列以及McI-NotI克隆位點添加在3’端。引入沉默突變以去除干擾克隆策略的任何限制性酶切位點。通過GENEART(德國)合成了多種合成基因。實例2 構(gòu)建植物表達載體設(shè)計了能夠在轉(zhuǎn)基因植物中指導(dǎo)具有新穎連接物的一種優(yōu)化的纖維二糖水解酶基因(CBHl)的表達的多種表達載體。表1概述了所產(chǎn)生的這些序列和載體。使用組成型CaMV 35S啟動子來驅(qū)動這些雙子葉植物的優(yōu)化的纖維素酶基因的表達。煙草表達的纖維素酶通過融合到煙草I3Rla信號序列(SEQ ID N0 13)以及ER滯留序列(SEQ ID NO 14)上而靶向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上。煙草表達載體使用二元載體PGR106，該載體含有馬鈴薯病毒X(PVX)擴增子(Lu等人，2003，EMBO J，22 :5690-5699)。載體組分信息如表1中所示。表1:序列說明
權(quán)利要求
1.一種用于在植物細胞中表達多結(jié)構(gòu)域酶的方法，包括向所述植物細胞中引入核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括編碼修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的核苷酸序列，其中所述多結(jié)構(gòu)域酶包括至少一個第一結(jié)構(gòu)域、至少一個第一連接序列、以及至少一個第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域以及所述第二結(jié)構(gòu)域是非異源的序列，其中在所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶中的天然連接序列已經(jīng)被異源連接序列所代替，其中所述異源連接序列是不被植物蛋白酶切割的連接序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異源連接序列源自微生物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的所述異源連接序列當(dāng)在所述植物細胞中表達時是糖基化的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異源連接序列被修飾以去除至少一個植物蛋白酶切割位點。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物細胞表達所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶，其中全長多結(jié)構(gòu)域酶是由所述植物細胞產(chǎn)生的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異源連接序列選自下述組成的組SEQID NO 18、19、和 20。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多結(jié)構(gòu)域酶選自下述組成的組纖維素酶和葡糖淀粉酶。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物細胞選自下述組成的組稻、小麥、包括玉米的作物(corn)、大豆、糖甜菜(sugar beet)、和甘蔗植物細胞。
9.一種植物細胞，包括一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括編碼修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的核苷酸序列，其中所述多結(jié)構(gòu)域酶包括至少一個第一結(jié)構(gòu)域、至少一個第一連接序列、以及至少一個第二結(jié)構(gòu)域，其中在所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶中的天然連接序列已經(jīng)被異源連接序列所代替，其中所述第一結(jié)構(gòu)域以及所述第二結(jié)構(gòu)域是非異源序列，其中在所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶中的天然連接序列已經(jīng)被異源連接序列所代替，其中所述異源連接序列是不被植物蛋白酶切割的連接序列。
10.如權(quán)利要求9所述的植物細胞，其中所述異源連接序列源自微生物。
11.如權(quán)利要求9所述的植物細胞，其中所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的所述異源連接序列當(dāng)在所述植物細胞中表達時是糖基化的。
12.如權(quán)利要求9所述的植物細胞，其中所述異源連接序列被修飾以去除至少一個植物蛋白酶切割位點。
13.如權(quán)利要求9所述的植物細胞，其中所述植物細胞表達所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶，其中全長多結(jié)構(gòu)域酶是由所述植物細胞產(chǎn)生的。
14.如權(quán)利要求9所述的植物細胞，其中所述異源連接序列選自下述組成的組SEQID NO :18、19、以及 20。
15.如權(quán)利要求9所述的植物細胞，其中所述多結(jié)構(gòu)域酶是纖維素酶。
16.如權(quán)利要求9所述的植物細胞，其中所述植物細胞選自下述組成的組稻、小麥、包括玉米的作物(corn)、大豆、糖甜菜(sugar beet)、和甘蔗植物細胞。
17.一種植物，包括如權(quán)利要求9-16中任一項所述的植物細胞。
18.由如權(quán)利要求17所述的植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。
19. 一種從植物生物質(zhì)生產(chǎn)可發(fā)酵糖的方法，所述方法包括(a)獲得包括核酸構(gòu)建體的植物，該核酸構(gòu)建體包括編碼修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的核苷酸序列，其中所述多結(jié)構(gòu)域酶包括至少一個第一結(jié)構(gòu)域、至少一個第一連接序列、以及至少一個第二結(jié)構(gòu)域，其中在所述修飾的多結(jié)構(gòu)域酶中的天然連接序列已經(jīng)被異源連接序列所代替，其中所述第一結(jié)構(gòu)域以及所述第二結(jié)構(gòu)域是非異源序列，其中所述異源連接序列是不被植物蛋白酶切割的連接序列，并且其中所述多結(jié)構(gòu)域酶涉及植物材料到可發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化；(b)使所述植物在其中核酸構(gòu)建體被表達的條件下生長；和(c)在一種生物質(zhì)轉(zhuǎn)化方法中使用所述植物。
全文摘要
在此提供了用于在植物中表達多結(jié)構(gòu)域酶的組合物和方法。該組合物包括表達修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的植物、種子、植物組織、以及植物部分。該修飾的多結(jié)構(gòu)域酶具有異源連接區(qū)域，當(dāng)該修飾的多結(jié)構(gòu)域酶表達在植物中時，該異源連接區(qū)域不被切割。在不同的實施方案中，該連接區(qū)域包括在SEQ ID NO18、19、或20中提出的序列。進一步提供了用于生產(chǎn)一種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的方法，包括將表達這種修飾的多結(jié)構(gòu)域酶的植物進行培養(yǎng)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物材料的下游用途包括農(nóng)藝學(xué)用途和工業(yè)用途，例如人類食品、動物飼料、藥物制劑、生物燃料、工業(yè)酒精、發(fā)酵原料，以及類似物。
文檔編號C12N9/34GK102307994SQ201080006811
公開日2012年1月4日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者S.邁爾斯 申請人:先正達參股股份有限公司