專利名稱：用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的寡核苷酸探針及引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中HBV(乙型肝炎病毒)核酸存在和定量的方法。
背景技術(shù)：
HBV導(dǎo)致了急性和慢性肝炎(乙型肝炎)，而在嚴(yán)重情況下導(dǎo)致肝硬化和肝癌。近來(lái)的研究表明，全世界感染乙型肝炎病毒(HBV)的人數(shù)總計(jì)達(dá)到約300百萬(wàn)。用于直接檢測(cè)感染主體的血液/血清或血漿中的HBV核酸的基于PCR分析，可以提供測(cè)定受感染患者精確病毒載量的優(yōu)點(diǎn)，這種精確的病毒載量對(duì)于醫(yī)師知曉感染的準(zhǔn)確階段是有用的。這可以進(jìn)一步幫助醫(yī)師對(duì)患者提供正確的療法。量化精確的病毒載量也能夠有助于監(jiān)控抗病毒療法的進(jìn)展。目前所用的HBV診斷方法是基于ELISA (酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))的，這是基于血清標(biāo)記物，如HbeAg、HbsAg或抗-HBc IgM、抗-Hbe、抗-HBs或抗-HBc IgG的存在。因?yàn)榛贓LISA的方法不能提供精確的病毒載量，則需要尋找能夠提供定量測(cè)定病毒載量的方法。就前述有關(guān)已知檢測(cè)方法的問(wèn)題而言，還需要有效的方法，才能使其用于檢測(cè)HBV以能夠提供病毒載量的定性和定量測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
MM本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種測(cè)定樣品中HBV核酸存在的方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于檢測(cè)HBV的探針和引物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于檢測(cè)HBV的PCR反應(yīng)混合物。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供包含用于檢測(cè)HBV的探針和引物的試劑盒。因此，本發(fā)明涉及寡核苷酸探針SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 ；引物SEQ ID No. 3、 4、5和6 ；用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含核酸擴(kuò)增試劑、SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中列出的雙重標(biāo)記的探針、引物SEQ ID No. 3、4、5、6和測(cè)試樣品；檢測(cè)乙型肝炎病毒的方法，所述方法包含以下步驟形成包含核酸擴(kuò)增試劑、分別具有對(duì)應(yīng)的引物SEQ ID No. 3和4或SEQ ID No. 5和6的寡核苷酸探針SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2、 測(cè)試樣品的反應(yīng)混合物；和將所述反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR而獲得所述靶序列的拷貝接著測(cè)定用于檢測(cè)所述乙型肝炎病毒的熒光信號(hào)的增加；以及用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包含SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的雙重標(biāo)記的探針，單獨(dú)地或組合地；對(duì)應(yīng)引物對(duì)SEQ ID No. 3、4和5、6，單獨(dú)地或組合地，以及擴(kuò)增試劑。


圖1是使用商購(gòu)試劑盒的HBV陽(yáng)性樣品的實(shí)時(shí)曲線圖。圖2是使用SEQ ID No. 1的HBV陽(yáng)性樣品的實(shí)時(shí)曲線圖。圖3是使用SEQ ID No. 2的HBV陽(yáng)性樣品的實(shí)時(shí)曲線圖。圖4是使用SEQ ID No. 1的HBV陰性樣品的實(shí)時(shí)曲線圖。
圖5是使用SEQ ID No. 2的HBV陰性樣品的實(shí)時(shí)曲線圖。圖6是HBV-標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及寡核苷酸探針SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針是雙重標(biāo)記的探針。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針檢測(cè)乙型肝炎病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針與在5'端具有熒光團(tuán)而在內(nèi)部區(qū)域或在 3'端具有淬滅基團(tuán)的可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述SEQ ID No. 1被設(shè)計(jì)針對(duì)乙型肝炎病毒的表面基因，而SEQ ID No. 2被設(shè)計(jì)針對(duì)乙型肝炎病毒的X-基因區(qū)域。本發(fā)明涉及引物SEQ ID No. 3、4、5和6。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 5分別是正義的引物，而SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6分別是反義的引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4用于SEQ ID No. 1的雙重標(biāo)記的探針，而引物SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6用于SEQ ID No. 2的雙重標(biāo)記的探針。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含核酸擴(kuò)增試劑、SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中列出的雙重標(biāo)記的探針、引物SEQ ID No. 3、4、5、6和測(cè)試樣品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品選自由血液、血清和血漿組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述PCR是實(shí)時(shí)PCR。本發(fā)明涉及檢測(cè)乙型肝炎病毒的方法，所述方法包含以下步驟(a)形成包含核酸擴(kuò)增試劑、分別具有對(duì)應(yīng)的引物SEQ ID No. 3和4或SEQ ID No. 5和6的寡核苷酸探針SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2、測(cè)試樣品的反應(yīng)混合物；和(b)將所述反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR以獲得所述靶序列的拷貝，接著測(cè)定用于檢測(cè)所述乙型肝炎病毒的熒光信號(hào)的增加。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針與在5'端具有熒光團(tuán)，而在內(nèi)部區(qū)域或在 3'端具有淬滅基團(tuán)的可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 5分別是正義的引物，而SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6分別是反義的引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)試樣品選自由血液、血清和血漿組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增試劑包括氯化鎂、Taq聚合酶和用于擴(kuò)增的緩沖液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)本質(zhì)上是定性或定量的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述熒光團(tuán)選自由熒光素及熒光素衍生物FAM、VIC、 J0E、5-(2’ -氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、四甲基若丹明、6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基若丹明和花青染料組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述淬滅基團(tuán)選自由四甲基若丹明[TAMRA]、4’ -(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’ -馬來(lái)酰亞胺、四甲基若丹明、羧基四甲基若丹明和BHQ染料組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述熒光團(tuán)優(yōu)選是在5'端的6-羧基熒光素而所述淬滅基團(tuán)優(yōu)選是在3'端的四甲基若丹明或在內(nèi)部區(qū)域或在3'端的黑洞淬滅基團(tuán) 1_1]。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包含SEQID No. 1和SEQ ID No. 2的雙重標(biāo)記的探針，單獨(dú)地或組合地；對(duì)應(yīng)引物對(duì)SEQ ID No. 3、4和5、6，單獨(dú)地或組合地；以及擴(kuò)增試劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增試劑包括氯化鎂、Taq聚合酶和用于擴(kuò)增的緩沖液。本發(fā)明牛物序列的列表SEQ ID No. 1和對(duì)應(yīng)引物3和4具有如下表1中所示的序列標(biāo)識(shí)號(hào)表-權(quán)利要求
1.寡核苷酸探針SEQID No. 1和SEQ ID No. 2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述探針是雙重標(biāo)記的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述探針檢測(cè)乙型肝炎病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述探針與在5'端具有熒光團(tuán)而在內(nèi)部區(qū)域或 3'端具有淬滅基團(tuán)的可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述SEQID No. 1被設(shè)計(jì)成針對(duì)乙型肝炎病毒的表面基因，而SEQ ID No. 2被設(shè)計(jì)成針對(duì)乙型肝炎病毒的X-基因區(qū)域。
6.引物SEQ ID No. 3、4、5 和 6。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的引物，其中所述引物SEQID No. 3和SEQ ID No. 5分別是正義的引物，而SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6分別是反義的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的引物，其中所述引物SEQID No. 3和SEQ ID No. 4用于SEQ ID No. 1的雙重標(biāo)記的探針，而引物SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6用于SEQ ID No. 2的雙重標(biāo)記的探針。
9.一種用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含核酸擴(kuò)增試劑、SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中列出的雙重標(biāo)記的探針、引物SEQ ID No. 3、4、5、6和測(cè)試樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的PCR反應(yīng)混合物，其中所述樣品選自由血液、血清和血漿組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述PCR是實(shí)時(shí)PCR。
12.—種檢測(cè)乙型肝炎病毒的方法，所述方法包括以下步驟(a)形成包含核酸擴(kuò)增試劑、分別具有相應(yīng)的引物SEQID No. 3和4或SEQ ID No. 5和 6的寡核苷酸探針SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2、測(cè)試樣品的反應(yīng)混合物；和(b)將所述反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR以獲得所述靶序列的拷貝，接著測(cè)定用于檢測(cè)所述乙型肝炎病毒的熒光信號(hào)的增加。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述探針與在5'端具有熒光團(tuán)而在內(nèi)部區(qū)域或在3'端具有淬滅基團(tuán)的可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述引物SEQID No. 3和SEQ ID No. 5分別是正義的引物，而SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6分別是反義的引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述測(cè)試樣品選自由血液、血清和血漿組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述擴(kuò)增試劑包括氯化鎂、Taq聚合酶和用于擴(kuò)增的緩沖液。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述檢測(cè)本質(zhì)上是定性的或定量的。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述熒光團(tuán)選自由熒光素及熒光素衍生物FAM、 VIC, J0E、5-(2’ -氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、 四甲基若丹明、6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基若丹明和花青染料組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述淬滅基團(tuán)選自由四甲基若丹明[TAMRA]、 4’ -(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’ -馬來(lái)酰亞胺、四甲基若丹明、羧基四甲基若丹明和BHQ染料組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求18和19所述的方法，其中所述熒光團(tuán)優(yōu)選是在5'端的6-羧基熒光素，而所述淬滅基團(tuán)優(yōu)選是在3'端的四甲基若丹明或在內(nèi)部區(qū)域或在所述3'端的黑洞淬滅基團(tuán)1[BHQ1]。
21.一種用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包含SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的雙重標(biāo)記的探針，單獨(dú)地或組合地；對(duì)應(yīng)引物對(duì)SEQ ID No. 3、4和5、6，單獨(dú)地或組合地；以及擴(kuò)增試劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述擴(kuò)增試劑包括氯化鎂、Taq聚合酶和用于擴(kuò)增的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測(cè)和量化乙型肝炎病毒的方法。本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的SEQ ID No.1和2中列出的寡核苷酸探針以及SEQ ID No.3、4、5和6中列出的各自的引物[正義和反義]。本發(fā)明也提供了用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的PCR反應(yīng)混合物，和用于檢測(cè)HBV的試劑盒，所述試劑盒包括所述混合物以及說(shuō)明書(shū)包裝。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102317474SQ201080007639
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日
發(fā)明者曼尤拉·賈甘納特, 皮拉里塞蒂·文卡塔·蘇巴拉奧, 錢(qián)德拉塞克哈爾·布哈斯卡拉恩·奈爾 申請(qǐng)人:彼格泰格私人有限公司