專利名稱：微生物的培養(yǎng)方法及利用微生物制造物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將長(zhǎng)鏈脂肪酸作為微生物能夠適宜同化的碳源來(lái)利用，在工業(yè)上高效進(jìn)行微生物的培養(yǎng)、利用微生物生產(chǎn)物質(zhì)的方法。另外，還涉及使用所述碳源，在工業(yè)上高效地使微生物產(chǎn)生聚羥基烷酸酯(以下也稱PHA)的方法。
背景技術(shù)：
在對(duì)環(huán)境問(wèn)題、糧食問(wèn)題、健康以及安全的意識(shí)提高，天然或自然意識(shí)提高等背景下，微生物的培養(yǎng)、利用微生物制造物質(zhì)(發(fā)酵生產(chǎn)、生物轉(zhuǎn)換等)的意義和重要性日益提
尚ο在微生物的培養(yǎng)、利用微生物制造物質(zhì)中，需要有適宜被微生物同化的碳源(用于培養(yǎng)、發(fā)酵等的碳源)。作為該碳源的代表，可以列舉出糖類、油脂、短鏈脂肪酸等。近年，在環(huán)境問(wèn)題等背景下，作為碳源，日益期望可再生碳源(尤其非石油來(lái)源的碳源)、更理想的是不與食物沖突的碳源(所謂不適于食用的碳源)。從該觀點(diǎn)上看，長(zhǎng)鏈脂肪酸(例如來(lái)自植物的長(zhǎng)鏈脂肪酸)應(yīng)該是適宜碳源的候選之一。長(zhǎng)鏈脂肪酸例如可以從椰子、棕櫚(包括棕櫚核)等中獲得。已知椰子、棕櫚等植物作為油脂中的組成脂肪酸，含有長(zhǎng)鏈脂肪酸。作為這些來(lái)源于植物的代表性長(zhǎng)鏈脂肪酸，可以列舉出碳數(shù)12的月桂酸、碳數(shù)14的肉豆蔻酸、碳數(shù)16的棕櫚酸等長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和碳數(shù) 18的油酸等長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸。這些長(zhǎng)鏈脂肪酸被作為表面活性劑、肥皂、化妝品等的工業(yè)原料加以利用。但是， 并沒有在利用微生物的產(chǎn)業(yè)中被廣泛利用。尤其是，并沒有充分進(jìn)行將其作為用于培養(yǎng)微生物及利用微生物制造物質(zhì)的碳源來(lái)利用的研究。報(bào)告了將月桂酸或者油酸單獨(dú)作為碳源使用，培養(yǎng)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，生產(chǎn)PHA的例子(參見非專利文獻(xiàn)1 )。但是，其主要討論了將油酸單獨(dú)作為碳源使用的情況，而沒有討論肉豆蔻酸和棕櫚酸。另外，報(bào)告了將月桂酸或者肉豆蔻酸單獨(dú)作為碳源使用，培養(yǎng)真氧產(chǎn)堿桿菌 (Ralstonia eutropha)，生產(chǎn)PHA的例子(參見專利文獻(xiàn)1)，但是PHA的產(chǎn)量極低，在lg/L 以下。另外，沒有利用棕櫚酸。而且，報(bào)告了將月桂酸鈉等鹽單獨(dú)作為碳源使用，培養(yǎng)大腸埃希氏菌 (Escherichia coli，大腸桿菌)，生產(chǎn)PHA的例子(參見非專利文獻(xiàn)2)。但是沒有利用肉豆蔻酸和棕櫚酸。以上的研究?jī)H停留在培養(yǎng)規(guī)模在幾毫升至幾升的小規(guī)模的實(shí)施上。如上所述，還沒有達(dá)到在工業(yè)上將各種長(zhǎng)鏈脂肪酸作為用于微生物的培養(yǎng)、利用微生物制造物質(zhì)的碳源來(lái)適宜利用的目標(biāo)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2002/0086377號(hào)說(shuō)明書。
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1 :Lee S.、et. al.、Biotechnol Bioeng.、67 :240-244 (2000)； 非專利文獻(xiàn) 2 =Regina V.、et. al.、FEMS MICROBIOLOGY LETTERS、111-117 (2000)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供一種有效利用迄今為止未必被有效產(chǎn)業(yè)利用的長(zhǎng)鏈脂肪酸的方法。具體來(lái)說(shuō)，課題在于提供如下方法，即提供一種將所述長(zhǎng)鏈脂肪酸作為微生物能適宜同化的碳源來(lái)利用，在工業(yè)上高效進(jìn)行微生物的培養(yǎng)以及利用微生物制造物質(zhì)的方法。另外。以提供一種利用所述碳源，在工業(yè)上高效制造PHA的方法。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)將月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸分別單獨(dú)作為碳源使用，培養(yǎng)大腸桿菌，初步地研究了微生物對(duì)各脂肪酸的同化性。結(jié)果認(rèn)為，肉豆蔻酸和棕櫚酸的同化性均極低，將它們作為碳源利用是極其困難的。另外，月桂酸也未必顯示出足夠的同化性。因此本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究，以將作為對(duì)微生物的同化性不充分的長(zhǎng)鏈脂肪酸的月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸，在微生物的培養(yǎng)、利用微生物制造物質(zhì)中適宜利用。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)含有多種長(zhǎng)鏈脂肪酸的組成物或者長(zhǎng)鏈脂肪酸和油脂的混合組成物， 能極為適宜地利用作為用于微生物的培養(yǎng)及利用微生物制造物質(zhì)(例如，PHA制造)的碳源， 從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明是一種微生物的培養(yǎng)方法，包括在包含下述組成物中任意一種的碳源的存在下培養(yǎng)微生物的工序
(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物；
(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的混合組成物。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種以及油酸，
所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種、 油酸以及油脂。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物包含月桂酸和油酸， 所述混合組成物包含月桂酸、油酸和油脂。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物包含棕櫚酸和油酸， 所述混合組成物包含棕櫚酸、油酸和油脂。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少三種，
所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少三種以及油脂。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種以及油酸，
所述混合組成物包括從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種、 油酸以及油脂。
優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、棕櫚酸和油酸， 所述混合組成物包含月桂酸、棕櫚酸、油酸和油脂。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸， 所述混合組成物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸和油脂。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長(zhǎng)鏈脂肪酸中的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的含有率為20重量％以上。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長(zhǎng)鏈脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕櫚酸的合計(jì)含有率為5重量％以上。優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物的上升熔點(diǎn)為培養(yǎng)溫度+10°C 以下。優(yōu)選的是，所述混合組成物中的脂肪酸的含有率為45重量％以上。優(yōu)選的是，所述微生物為細(xì)菌。優(yōu)選的是，所述微生物為屬于貪銅菌(Cupriavidus)屬或者埃希氏菌 (Esherichia)屬的微生物。優(yōu)選的是，所述微生物為屬于貪銅菌(Cupriavidus)屬的微生物。優(yōu)選的是，所述微生物為鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)0優(yōu)選的是，所述微生物為嵌入了如下聚羥基烷酸酯合成酶基因的鉤蟲貪銅菌，所述聚羥基烷酸酯合成酶基因?yàn)?br> 編碼序列編號(hào)1所表示的氨基酸序列的聚羥基烷酸酯合成酶基因，或者編碼相對(duì)于所述氨基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羥基烷酸酯合成活性的多肽的聚羥基烷酸酯合成酶基因。優(yōu)選的是，所述微生物是屬于埃希氏菌屬的微生物。優(yōu)選的是，所述微生物是大腸埃希氏菌。優(yōu)選的是，所述微生物是酵母。而且，本發(fā)明還涉及一種微生物代謝產(chǎn)物的制造方法，該制造方法包括 在包含所述組成物中任意一種的碳源的存在下，培養(yǎng)微生物的工序、以及
回收所培養(yǎng)的所述微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的工序。優(yōu)選的是，所述微生物代謝產(chǎn)物為聚羥基烷酸酯。優(yōu)選的是，所述聚羥基烷酸酯為3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚體。通過(guò)本發(fā)明，使得能夠有效利用迄今未必被有效產(chǎn)業(yè)利用的長(zhǎng)鏈脂肪酸、尤其是長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸。具體地說(shuō)，通過(guò)將所述長(zhǎng)鏈脂肪酸、尤其是所述長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸作為微生物能適宜同化的碳源來(lái)利用，而使得能夠在工業(yè)上高效進(jìn)行微生物的培養(yǎng)及利用微生物制造物質(zhì)。另外，能夠使用所述碳源，在工業(yè)上高效地制造PHA。
具體實(shí)施例方式以下將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。在微生物的培養(yǎng)以及利用微生物制造物質(zhì)中，一般葡萄糖和蔗糖等糖類作為碳源被廣泛利用。由于這些糖類在水中的溶解度高，因此在通常的培養(yǎng)條件下，其溶解于微生物所生長(zhǎng)的培養(yǎng)液等液體中作為碳源的利用效率較高。另一方面，一般，微生物對(duì)在水中溶解度低的碳源利用率(同化性)較低。本發(fā)明的發(fā)明人確認(rèn)了，在微生物對(duì)水中溶解度極低的長(zhǎng)鏈脂肪酸、尤其是長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸(其中尤其是肉豆蔻酸和棕櫚酸)的同化性非常低。此外，在研究了月桂酸、肉豆蔻酸或者棕櫚酸和油脂的混合物的同化性之后，確認(rèn)了隨著混合物中脂肪酸的含量的提高，同化性降低。但是，利用本發(fā)明，能夠?qū)⑦@些脂肪酸作為碳源極有效地利用。本發(fā)明中的碳源包括下列組成物中的任意一種
(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物；
(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂，所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的脂肪酸-油脂混合組成物。本發(fā)明中，通過(guò)將同化性低的各種脂肪酸、油酸組合作為碳源使用，能夠改善同化性，而且，在使得能夠有效利用這些脂肪酸這一點(diǎn)上極有意義。能在所述脂肪酸-油脂混合組成物(2)中使用的油脂并不特別限定，但是優(yōu)選的是包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸或者油酸作為構(gòu)成成分的油脂。具體來(lái)說(shuō)，例如可以列舉出來(lái)源于棕櫚的油脂、來(lái)源于椰子的油脂、來(lái)源于玉米的油脂、來(lái)源于大豆的油脂、來(lái)源于油菜籽的油脂、來(lái)源于油橄欖的油脂、來(lái)源于麻風(fēng)樹的油脂等。從提高同化性同時(shí)有效利用脂肪酸的觀點(diǎn)上來(lái)說(shuō)，所述脂肪酸-油脂混合組成物 (2)中的脂肪酸的含有率為10重量％以上。優(yōu)選的是20重量％以上，更優(yōu)選的是30重量％ 以上，進(jìn)一步優(yōu)選的是40重量％以上，尤其優(yōu)選的是45總量％以上，最優(yōu)選的是50重量％ 以上。所述含有率的上限并不限定，只要低于100重量％即可。這里，脂肪酸的含有率是指， 脂肪酸(這里的“脂肪酸”的概念是不包含構(gòu)成所述油脂的脂肪酸)相對(duì)于脂肪酸和油脂的合計(jì)量的重量比。根據(jù)本發(fā)明的較佳的一實(shí)施方式，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物 (2)包含油酸，并且包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種。作為長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的油酸，不僅其自身對(duì)微生物的同化性高，而且具有提高作為長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸的同化性的效果。因此，通過(guò)將油酸和所述長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸并用，不僅能有效利用長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，而且能協(xié)同達(dá)到高同化性。從有效利用長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的觀點(diǎn)上來(lái)看，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2 )中，相對(duì)于長(zhǎng)鏈脂肪酸(長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的合計(jì))，長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的含有率優(yōu)選的是20重量％以上，更優(yōu)選的是30重量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選的是40 重量％以上，特別優(yōu)選的是50重量％以上。這里，長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸相對(duì)于長(zhǎng)鏈脂肪酸的含有率是指，長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸相對(duì)于所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)中使用的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的合計(jì)量的重量比。另外，在計(jì)算所述含有率時(shí)， 未考慮構(gòu)成所述油脂的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸。這里，長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸是指月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸，長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸是指油酸。更佳的是，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)包括油酸、而且包含月桂酸或者棕櫚酸。根據(jù)本發(fā)明的適宜的其他實(shí)施方式，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物 (2)包括從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少三種脂肪酸。更適宜的是，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)包括油酸，并且包括從由月桂酸、 肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種。進(jìn)一步適宜的是，所述脂肪酸組成物(1) 或者所述混合組成物(2)包括月桂酸、棕櫚酸和油酸，尤其適宜的是包含月桂酸、肉豆蔻酸、 棕櫚酸以及油酸。特別是從有效利用同化性低的肉豆蔻酸和棕櫚酸的觀點(diǎn)上看，優(yōu)選的是所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)包含肉豆蔻酸和/或棕櫚酸。在這種情況下，優(yōu)選的是，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)中包含的長(zhǎng)鏈脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕櫚酸的合計(jì)含有率為5重量％以上。更優(yōu)選的是10重量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選的是15重量％以上。所述合計(jì)含有率的上限并不特別限定，為了進(jìn)一步提高同化性，70重量％以下優(yōu)選，65重量％以下更優(yōu)選，60重量％以下更為優(yōu)選，55重量％以下尤其優(yōu)選。根據(jù)本發(fā)明的適宜的另一種的實(shí)施方式，本發(fā)明的脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的上升熔點(diǎn)為微生物的培養(yǎng)溫度+10°C以下。更優(yōu)選的是微生物的培養(yǎng)溫度+9°C 以下，進(jìn)一步優(yōu)選的是微生物的培養(yǎng)溫度+8°C以下，尤其優(yōu)選的是微生物的培養(yǎng)溫度+7°C 以下。用于工業(yè)上的大多數(shù)微生物一般生長(zhǎng)最適溫度是37°C以下。因此，大多數(shù)情況下，優(yōu)選的是，本發(fā)明的脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的上升熔點(diǎn)為47°C以下。更優(yōu)選的是46°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選的是45°C以下，尤其優(yōu)選的是44°C以下。但是，本發(fā)明中使用的組成物的上升熔點(diǎn)并不限于上述溫度?？梢愿鶕?jù)微生物的培養(yǎng)溫度適當(dāng)?shù)卦O(shè)定上升熔點(diǎn)， 選擇滿足該上升熔點(diǎn)的組成物。上升熔點(diǎn)的下限不特別規(guī)定。本發(fā)明的發(fā)明人明確了長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的上升熔點(diǎn)為，月桂酸約43°C，肉豆蔻酸約52°C，棕櫚酸約62°C，作為長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的油酸的上升熔點(diǎn)為約12°C。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)含有多種上述脂肪酸，能夠根據(jù)微生物的生長(zhǎng)溫度適宜地調(diào)節(jié)組成物的上升熔點(diǎn)，提高對(duì)微生物的同化性。即使在上升熔點(diǎn)高的肉豆蔻酸和棕櫚酸的情況下，也能適宜地發(fā)揮本發(fā)明的效果。令人驚訝的是，在培養(yǎng)溫度方面，即使是固體狀態(tài)的組成物也能作為碳源有效利用。本發(fā)明中，脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的上升熔點(diǎn)可以通過(guò)以下的方法進(jìn)行測(cè)定
(1)將兩端開口的毛細(xì)管(內(nèi)徑1mm、外徑2mm以下，長(zhǎng)5(T80mm)的一端浸入到完全溶解的試樣中，直到試樣充滿約IOmm的高度，迅速用冰片等固化毛細(xì)管內(nèi)部的試樣；
(2)將包含固化的試樣的毛細(xì)管在10°C以下放置24h或者冰上放置Ih后供試驗(yàn)用；
(3)將毛細(xì)管設(shè)置在上升熔點(diǎn)測(cè)定器(ELEXSCIENTIFIC公司生產(chǎn)的EX-871A)上；
(4)將毛細(xì)管浸在裝滿了比預(yù)想熔點(diǎn)低約20°C的溫度的水中，使溫度計(jì)的下端置于水面下30mm的深度；
(5)在以適當(dāng)?shù)姆椒〝嚢枞萜髦械乃耐瑫r(shí)，進(jìn)行加熱，使得最開始以2VMn的速度使水溫升高；
(6)達(dá)到預(yù)想熔點(diǎn)10°C下之后，加熱使水溫以0.5°C /min的加熱速度升高；
(7)試樣在毛細(xì)管中開始上升的溫度為上升熔點(diǎn)。本發(fā)明的脂肪酸組成物(1)和混合組成物(2)的具體組成根據(jù)使用的微生物的種類、微生物產(chǎn)生的物質(zhì)的種類、培養(yǎng)的各種條件(培養(yǎng)基成分、PH、培養(yǎng)溫度等)等而不同，不一定能夠統(tǒng)一規(guī)定。但是，能夠示出幾組適宜的組成。適宜的組成之一是，月桂酸含有率30^70重量％、肉豆蔻酸含有率5 30重量％，棕櫚酸含有率5 30重量％，油酸含有率10 30 重量％。適宜的組成之一是，月桂酸含有率1(Γ40重量％，肉豆蔻酸(TlO重量％、棕櫚酸含有率2(Γ40重量％、油酸3(Γ50重量％。適宜的組成之一是，月桂酸含有率15 45重量％、棕櫚酸含有率15 45重量％、油酸含有率2(Γ50重量％。以上的含有率的數(shù)值是表示相對(duì)于組成物中包含的脂肪酸(這里的“脂肪酸”的概念是不包含構(gòu)成所述油脂的脂肪酸)的合計(jì)量的比例?；旌辖M成物(2)是除去油脂后的含有率。但是，上述組成終究是適宜的組成的例子，本發(fā)明并不限于上述組成。另外，上述組成物也可以根據(jù)需要而增加油脂。本發(fā)明的包含脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的碳源，也可以還含有其他的脂肪酸、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等。作為通過(guò)本發(fā)明培養(yǎng)微生物使微生物產(chǎn)生的代謝物，例如可以列舉出乙醇、丁醇、 丙醇等醇類、乳酸、醋酸、氨基酸、核酸等酸類、脂質(zhì)類、油脂類或聚羥基烷酸酯(PHA)等。PHA 是很多微生物種的細(xì)胞中作為能量貯藏物質(zhì)而產(chǎn)生、貯藏的熱塑性聚酯，具有生物降解性。 現(xiàn)在由于環(huán)保意識(shí)的提高，非石油來(lái)源的塑料受到關(guān)注。尤其是，微生物菌體內(nèi)生成、貯藏的PHA由于能進(jìn)入自然界的碳循環(huán)，因此預(yù)計(jì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的不良影響較小，期望其實(shí)用化。 因此，PHA是使用本發(fā)明生產(chǎn)的物質(zhì)的很好的示例之一。作為PHA的種類，只要是微生物產(chǎn)生的PHA即可，并不特別限定。優(yōu)選的是從碳數(shù) ri6的3-羥基烷酸中選擇的一種單體聚合形成的PHA、從碳數(shù)Γ16的3-羥基烷酸中選擇的兩種以上的單體共聚形成的共聚PHA。例如，可以列舉出由碳數(shù)4的3-羥基烷酸形成的聚羥基丁酸酯(PHB)、碳數(shù)4和6的3-羥基烷酸構(gòu)成的聚羥基丁酸己酸(PHBH)、碳數(shù)4和5 的3-羥基烷酸所構(gòu)成的聚羥基丁酸戊酸酯(PHBV)、碳數(shù)Γ14的3-羥基烷酸所構(gòu)成的聚羥基烷酸酯(PHA)。作為本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)以及利用微生物制造有用物質(zhì)中使用的微生物，并不特別限定，可以適宜地使用從天然分離的微生物、基因操作過(guò)的微生物等。具體來(lái)說(shuō)， 優(yōu)選使用青枯菌(Ralstonia)屬、貪銅菌(Cupriavidus)屬，沃特氏菌(Wautersia)屬、 氣單胞菌(Aeromonas)屬、埃希氏菌(Escherichia)屬、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、芽胞桿菌(Bacillus)屬、固氮菌(Azotobacter)屬、諾卡氏菌 (Nocardia)屬、鞘脂單胞菌(Sphingomonas)屬、叢毛單胞菌(Comamonas)屬等的細(xì)菌類，酵母(Saccharomyces)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、假絲酵母(Candida)屬等的酵母類。當(dāng)然，也可以使用對(duì)所述微生物進(jìn)行人工突變處理得到的變異株及通過(guò)基因工程的方法變異處理的菌株。作為制造PHA中使用的微生物，例如可以列舉出鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)等貪銅菌屬、廣泛產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes latas)等產(chǎn)堿桿菌屬、惡臭假單胞 lif (Pseudomonas putida)、iMftfx^-MM (Pseudomonas f luorescens)> 參錄月農(nóng)單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、食樹月旨假單胞菌(Pseudomonas resinovorans)、食油假單胞 |if (Pseudomonas oleovorans) ^jix-^-lfi |1 Μ> lEL^v^lfilf lif (Bacillus megaterium)等芽胞桿菌屬、固氮菌屬、諾卡氏菌屬、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水氣單胞菌 (Aeromonaso hydrophila)等氣單胞菌屬、青枯菌(Ralstonia)屬、沃特氏菌(Wautersia) 屬、叢毛單胞菌(Comamonas)屬等(Microbiological Reviews,450-472 項(xiàng)，1990 年)。也可以通過(guò)使用基因工程的方法導(dǎo)入PHA合成酶基因等，人為實(shí)施使之生產(chǎn)PHA的改良的生物細(xì)胞。也可以利用例如埃希氏菌(Esherichia)屬等革蘭氏陰性細(xì)菌、芽胞桿菌(Bacillus) 屬等的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、酵母(Saccharomyces)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、假絲酵母 (Candida)屬等的酵母類，植物等的高等生物細(xì)胞，但是從能夠儲(chǔ)存大量PHA這一點(diǎn)上看， 優(yōu)選使用微生物。在生產(chǎn)作為PHA的一種的3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚體(PHBH)中，可以使用例如豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等本身生產(chǎn)PHBH的微生物，也可以使用通過(guò)對(duì)本身不生產(chǎn)PHBH的微生物使用基因工程的方法、導(dǎo)入聚羥基烷酸酯合成酶基因，而人為施加了使之生產(chǎn)PHBH的改良的生物細(xì)胞。作為導(dǎo)入基因的宿主微生物，例如可以適宜使用鉤蟲貪銅菌。另外，作為聚羥基烷酸酯合成酶基因，可以使用來(lái)源于豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌的聚羥基烷酸酯合成酶基因或者其改良體。作為改良體，可以使用編碼在天然的聚羥基烷酸酯合成酶中缺失、添加、插入或者置換了氨基酸殘基的聚羥基烷酸酯合成酶的堿基序列。具體來(lái)說(shuō)，可以使用嵌入了如下聚羥基烷酸酯合成酶基因的鉤蟲貪銅菌，所述聚羥基烷酸酯合成酶基因?yàn)榫幋a序列編號(hào)1中表示的氨基酸序列的聚羥基烷酸酯合成酶基因，或者編碼相對(duì)于所述氨基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羥基烷酸酯合成活性的多肽的聚羥基烷酸酯合成酶基因。在利用本發(fā)明培養(yǎng)微生物時(shí)，使用在培養(yǎng)基中添加碳源的方法。關(guān)于培養(yǎng)基組成、 碳源的添加方法、培養(yǎng)規(guī)模、通氣攪拌條件和培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間，根據(jù)培養(yǎng)的微生物的種類適當(dāng)決定即可，并不特別限定。優(yōu)選的是連續(xù)或者間歇性地添加碳源。本發(fā)明中的碳源可以在添加到培養(yǎng)基中時(shí)已經(jīng)是混合組成物，也可以是分別添加各組成成分，在培養(yǎng)基內(nèi)
混合ο本發(fā)明的PHA等微生物代謝產(chǎn)物的制造方法只要是通過(guò)上述培養(yǎng)方法使微生物內(nèi)儲(chǔ)存微生物代謝產(chǎn)物，此后，再使用公知的方法從菌體內(nèi)回收微生物代謝產(chǎn)物即可。在微生物代謝產(chǎn)物是PHA的情況下，例如，可以通過(guò)以下的方法進(jìn)行。培養(yǎng)結(jié)束后，從培養(yǎng)液中用離心分離機(jī)等分離菌體，將該菌體用蒸餾水和甲醇等有機(jī)溶劑洗凈、干燥。從該干燥菌體中用氯仿等有機(jī)溶劑提取PHA。從該含有PHA的溶液中利用過(guò)濾等除去菌體成分，在濾液中加入甲醇、己烷等弱溶劑，使PHA沉淀。接著，在利用過(guò)濾、離心分離除去上清液之后，可以干燥并回收PHA。本發(fā)明的發(fā)明人確認(rèn)了本發(fā)明在2. 5L規(guī)模的培養(yǎng)下能夠適宜實(shí)施，而且在 16000L以上的規(guī)模也能適宜地再現(xiàn)。該5000倍以上的放大的實(shí)現(xiàn)，意味著在較大工業(yè)規(guī)模中的制造中，適宜地并且最大限度地發(fā)揮了本發(fā)明的效果。在本發(fā)明中，將所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)作為碳源使用而帶來(lái)的同化性提高是指，由于含有多種難以同化的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸(月桂酸、肉豆蔻酸或者棕櫚酸)，或者含有難以同化的所述長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和容易同化的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸(油酸)，與將其單獨(dú)使用的情況相比，難以同化的所述長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的同化性提高的意思。 或者，由于含有難以同化的所述長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和油脂，與將其單獨(dú)使用的情況相比，難以同化的所述長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的同化性提高的意思。另外，本發(fā)明中，同化性的提高是指，每小時(shí)的碳源的消耗量增加，結(jié)果微生物菌體的產(chǎn)量和微生物產(chǎn)生的物質(zhì)的產(chǎn)量增加的意 )思ο
微生物菌體的產(chǎn)量可以通過(guò)吸光度法、干燥菌體重量測(cè)定法等公知的方法測(cè)定。 微生物產(chǎn)生的物質(zhì)的產(chǎn)量可以通過(guò)GC法、HPLC法等公知的方法測(cè)定。細(xì)胞中貯藏的PHA的含量，可以按照加藤等的方法(Appl. MicroBiol. Biotechnol.，第45卷，第363頁(yè)，(1996); Bull. Chem. Soc.，第69卷，第515頁(yè)(1996))，用氯仿等有機(jī)溶劑從培養(yǎng)細(xì)胞提取、干燥細(xì)胞中貯藏的PHA來(lái)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例
以下，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。各組成物的上升熔點(diǎn)利用前面述及的方法算出。(實(shí)施例1)大腸桿菌的培養(yǎng)
使用各種碳源，培養(yǎng)E. coli HBlOl株(寶生物公司(夕力才社)生產(chǎn))。作為預(yù)培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基(10g/L細(xì)菌用胰蛋白胨(Bact0-trypt0ne)，5g/L細(xì)菌用酵母抽提物(Bacto-yeast extract), 5g/L NaCl)。生長(zhǎng)試驗(yàn)中使用 M9 培養(yǎng)基(6g/L Na2HPO4, 3g/L KH2PO4,0. 5g/L NaCl, lg/L NH4Cl, ImM MgSO4,0. OOlw/v% 硫胺，0. ImM CaCl2)。將大腸桿菌(Ε. coli)的甘油菌(glycerol stock)在預(yù)培養(yǎng)基上接種，于37°C培養(yǎng)12小時(shí)，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。之后，將預(yù)培養(yǎng)液以2v/v%的濃度接種在加入了 50ml的M9培養(yǎng)基的500ml用的坂口搖瓶(Sakaguchi flask)中。接著，作為碳源，將表1所示的各種脂肪酸組成物以0. 25w/v%的濃度加入到坂口搖瓶中，在37°C振蕩培養(yǎng)96小時(shí)。碳源一并添加到坂口搖瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離回收菌體，用甲醇洗凈后，冷凍干燥，測(cè)定干燥菌體重量。結(jié)果示于表1。表1
權(quán)利要求
1.一種微生物的培養(yǎng)方法，包括在包含下述組成物中任意一種的碳源的存在下培養(yǎng)微生物的工序，(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物，(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的混合組成物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、 肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種以及油酸，所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種、 油酸以及油脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物包含月桂酸和油酸，所述混合組成物包含月桂酸、油酸和油脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物包含棕櫚酸和油酸，所述混合組成物包含棕櫚酸、油酸和油脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、 肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少三種，所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少三種以及油脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、 肉豆蔻酸、棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種以及油酸，所述混合組成物包括從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種、 油酸以及油脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、棕櫚酸和油酸，所述混合組成物包含月桂酸、棕櫚酸、油酸和油脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸，所述混合組成物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸和油脂。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長(zhǎng)鏈脂肪酸中的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的含有率為20重量％以上。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長(zhǎng)鏈脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕櫚酸的合計(jì)含有率為5重量％以上。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物的上升熔點(diǎn)為培養(yǎng)溫度+10°C以下。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述混合組成物中的脂肪酸的含有率為45重量％以上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物為細(xì)菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物為屬于貪銅菌屬或者埃希氏菌屬的微生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物為屬于貪銅菌屬的微生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物為鉤蟲貪銅菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物為嵌入了如下聚羥基烷酸酯合成酶基因的鉤蟲貪銅菌，所述聚羥基烷酸酯合成酶基因?yàn)榫幋a序列編號(hào)1所表示的氨基酸序列的聚羥基烷酸酯合成酶基因，或者編碼相對(duì)于所述氨基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羥基烷酸酯合成活性的多肽的聚羥基烷酸酯合成酶基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物是屬于埃希氏菌屬的微生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物是大腸埃希氏菌。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述微生物是酵母。
21.—種微生物代謝產(chǎn)物的制造方法，所述制造方法包括在包含下列組成物中任意一種的碳源的存在下培養(yǎng)微生物的工序、以及回收所培養(yǎng)的所述微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的工序，(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物，(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的混合組成物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的制造方法，其特征在于，所述微生物代謝產(chǎn)物為聚羥基烷 酸酯。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的制造方法，其特征在于，所述聚羥基烷酸酯為3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚體。
全文摘要
將迄今為止未必被有效產(chǎn)業(yè)利用的長(zhǎng)鏈脂肪酸作為碳源來(lái)利用，在工業(yè)上高效進(jìn)行微生物的培養(yǎng)以及利用微生物制造物質(zhì)。在包含下列組成物中任意一種的碳源的存在下，培養(yǎng)微生物；(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸以及油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物；(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸以及油酸所構(gòu)成的組中選擇的至少一種脂肪酸和油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量%以上的混合組成物。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102325883SQ20108000773
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者佐藤俊輔, 藤木哲也 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘化