專利名稱：發(fā)酵肉湯制劑的制作方法
發(fā)酵肉湯制劑與相關申請的交叉引用本申請要求2009年2月20日遞交的美國臨時申請序列號61/154，235，2009年6 月10日遞交的61/185，865和2010年2月12日遞交的61/304，219的優(yōu)先權，上述每一個臨時申請在此處以其整體引入作為參考。1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及發(fā)酵肉湯制劑、制造其的方法及其用途。2.
背景技術：
在多種培養(yǎng)或發(fā)酵微生物的工藝中，有時候必須在發(fā)酵過程中或結束時殺死混合物中的活細胞。特別是當把含有重組DNA的微生物作為生產(chǎn)宿主來培養(yǎng)并且希望避免任何活的重組生物被釋放至環(huán)境中時。即使微生物不包含重組DNA，也常常希望在加工前殺死細胞以保證活細胞不被釋放到環(huán)境中，無論是在生產(chǎn)的產(chǎn)物中或在廢產(chǎn)物中。許多需要殺死微生物的常規(guī)方法，例如加熱，過于劇烈，可能在殺死細胞前破壞或改變期望的分泌產(chǎn)物。在這種情況下，必須在不殺死細胞的情況下回收產(chǎn)物，這需要使用繁重且代價高的防泄漏工藝和設備。美國專利號5，801，034和5，378，621描述了使用具有1 至5個碳原子的單一有機酸殺死微生物細胞的方法。然而，根據(jù)這些專利的實施例，高水平的有機酸和低PH是最適的。低pH條件對發(fā)酵培養(yǎng)基中的許多目的酶產(chǎn)物的穩(wěn)定性經(jīng)常是不利的，并且高水平的有機酸經(jīng)常抑制希望使用酶產(chǎn)物的下游應用，例如，在由酶產(chǎn)物通過酶催化作用已經(jīng)產(chǎn)生的底物上產(chǎn)生有機物的微生物發(fā)酵。此外，使用高濃度的化學劑殺死微生物細胞可能顯著增加從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收產(chǎn)物的成本。由此，仍然需要開發(fā)在較不劇烈的條件下殺死細胞的方法，其中使用較低濃度的化學劑是所期望的。3.發(fā)明概述許多工業(yè)蛋白質(zhì)，例如酶，經(jīng)常在產(chǎn)生其的發(fā)酵肉湯中商業(yè)提供。通常，蛋白質(zhì)由細胞(重組或非重組)表達和分泌至包含發(fā)酵培養(yǎng)基和細胞的發(fā)酵肉湯中。常常希望在將蛋白質(zhì)用于工業(yè)應用之前失活例如殺死細胞，以避免將復制性細胞釋放至環(huán)境中。本發(fā)明公開滿足了此需要，以基本上不干擾蛋白質(zhì)例如酶的活性的方式失活細胞。在一些方面，本發(fā)明公開提供了制造發(fā)酵肉湯制劑的方法，其包括在一定條件下孵育第一混合物一段時間，所述第一混合物包含(a) —種或多種發(fā)酵肉湯，(b)占第一混合物的0. 至15%重量的量的第一有機酸成分，所述第一有機酸成分包含至少一種1-5 碳有機酸(即，在其主鏈和側鏈中共具有1-5個碳的有機酸)和/或其鹽，和(c)占第一混合物的0. 025%至5%重量的量的第二有機酸成分，所述第二有機酸成分包含至少一種6碳或更多碳有機酸(即，在其主鏈和側鏈中共具有6個或更多個碳的有機酸)和/或其鹽，其中所述孵育條件和時間導致所述一種或多種發(fā)酵肉湯中至少41og的活細胞減少，由此產(chǎn)生發(fā)酵肉湯制劑。在特定的實施方案中，第一有機酸成分的量在如下范圍中，所述范圍的下限選自按重量計第一混合物的 0. 1%,0. 2%,0. 25%,0. 3%,0. 35%,0. 4%,0. 5%,0. 75%或 1%,而上限獨立地選自按重量計第一混合物的0. 3 %，0. 4 %，0. 5 %，0. 75 %，1 %，2 %，3 %，5 %， 7%，10%，12%或15%，例如按重量計第一混合物的0. 2%至1%，0. 2%至0. 5%,0. 至 10%,0. 25%至5%或0. 3%至3%的量，等等。在特定的實施方案中，第二有機酸成分的量在如下范圍中，所述范圍的下限選自按重量計第一混合物的 0. 025%,0. 03%,0. 04%,0. 045%,0. 05%,0. 075%,0. 1%,0. 2%, 0. 25 %，0. 3 %，0. 35 %，0. 4 %，0. 5 %，0. 75 %或1 %，而上限獨立地選自按重量計第一混合物的 0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 75%，1 %，2%，3%或 5%，例如，按重量計第一混合物的0. 04%至3%，0. 2%至0. 5%,0. 至1%，0. 25%至5%或0. 3%至3%的量，等等。該有機酸可合適地為6-至10-碳有機酸，6-至9-碳有機酸或6-至8-碳有機酸。因此，在特定的實施方案中，第二有機酸成分包含6-碳酸和/或其鹽，7-碳酸和/或其鹽， 8-碳酸和/或其鹽，9-碳酸和/或其鹽，或10-碳酸和/或其鹽，或由之組成。孵育時間適宜在下述范圍中，所述范圍的下限選自4小時，6小時，8小時，10小時， 12小時，14小時，16小時，18小時或20小時，而上限獨立地選自12小時，16小時，20小時， 24小時，28小時，32小時或36小時，例如從4小時至36小時，例如從8小時至36小時，從 20小時至28小時，從8小時至16小時，從10小時至20小時，從16小時至30小時，等等。孵育條件包括溫度，所述溫度適宜在下述范圍中，該范圍的下限選自20°C，22°C， 25 "C，28 °C，30 "C，32 °C，34 V，36 °C，38 V 或 40°C，而上限獨立地選自 28 °C，33 V，35 °C， 400C，45°C，50°C或 55°C，例如從 20°C至 50°C，從 25°C至 40°C，從至 33°C，等等。孵育條件包括pH，所述pH適宜在下述范圍中，該范圍的下限選自3. 5，3. 6，3. 7， 3. 8,3. 9，4 或 4. 2，而上限獨立地選自 3. 8,4,4. 2,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9，5，5. 2 或 5. 5， 例如從3. 5至5，從4至4. 7，或4. 2至4. 5的pH?？稍诜跤_始時和/或在孵育期間一次或多次調(diào)節(jié)PH，例如加入pH調(diào)節(jié)劑。在特定的實施方案中，pH調(diào)節(jié)劑是磷酸、硫酸或氫氧化鈉。本文也考慮在某些實施方案中第一和/或第二有機酸成分可在孵育開始時和/或孵育期中起調(diào)節(jié)PH的作用，并因此部分或完全地消除對另外的pH調(diào)節(jié)劑的需要。在某些方面，本發(fā)明方法在混合物中實現(xiàn)一種或多種發(fā)酵肉湯中的活細胞數(shù)的至少51og減少、61og減少、71og減少或81og減少。在特定的實施方案中，所述第一混合物中的活細胞減少，比接受所述條件的第二混合物或替代混合物中的減少，高至少0. 25倍，至少0. 5倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍，其中所述第二混合物或替代混合物只包含一種有機酸成分，該一種有機酸成分的量達到在第一混合物中的第一和第二有機酸成分的總重量百分比。例如，使用與本發(fā)明方法有關的第一有機酸成分的第一量(例如以重量計)和第二有機酸成分的第二量 (以重量計0. 5% )，比在相同或類似條件下以達到所述第一和第二量的總和的第三量(例如1.5%重量百分比)使用單獨第一有機酸成分或第二有機酸成分，導致活細胞數(shù)的更大減少。本發(fā)明方法可用于失活真菌細胞，例如絲狀真菌細胞。在特定的實施方案中，絲狀真菌細胞來自木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、金孢霉屬(Chrysosporium)或脈孢霉屬(Neurospora)。在以下章節(jié)5· 2. 1 中描述了適于本公開的方法、制劑和組合物的其他細胞類型。
在特定實施方案中，第一有機酸成分包含下述或由下述組成醋酸、醋酸鹽、甲酸、甲酸鹽、丙酸、丙酸鹽、或前述兩種或更多種的混合物。在一個實施方案中，第一有機酸成分包含醋酸和/或其鹽，或由醋酸和/或其鹽組成。在特定實施方案中，第二有機酸成分包含下述或由下述組成苯甲酸、苯甲酸鹽、 環(huán)己烷羧酸、環(huán)己烷羧酸鹽、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸鹽、苯乙酸、苯乙酸鹽、或前述兩種或更多種的混合物。在一個實施方案中，第二有機酸成分包含苯甲酸和/或其鹽，或由苯甲酸和/或其鹽組成。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，第一有機酸成分包含所述1-5碳有機酸的鈉、 鉀、鈣或鎂鹽，和/或第二有機酸成分包含所述6碳或更多碳有機酸的鈉、鉀、鈣或鎂鹽。在某些特定的實施方案中，第一有機酸成分包含以重量計0. 2% -0. 4%濃度的醋酸，和第二有機酸成分包含以重量計0. 2% -0. 4%濃度的苯甲酸鈉，和/或孵育時間是M 小時，和/或孵育條件包括40°C的溫度和/或孵育條件包括4至4. 6的pH。在本發(fā)明方法中，第一混合物也可包含一種或多種抗微生物劑，例如以抑制污染性細菌或真菌的生長。在特定的實施方案中，該一種或多種抗微生物劑的量為第一混合物的0. 0005至0. 05%重量，例如，所述混合物的0. 001至0. 025%重量的量。在特定的實施方案中，抗微生物劑包含含有異-α酸、四-異α酸(tetra-iso alpha acids)和/或β 酸的啤酒花提取物。本文也考慮在特定實施方案中第一和/或第二有機酸成分可起抗微生物劑的作用，并因此部分或全部地消除對另外的抗微生物劑的需要。本發(fā)明方法還包括在上述孵育步驟前制備第一混合物的步驟，例如通過組合一種或多種發(fā)酵肉湯以及至少一種1-5碳有機酸和/或其鹽、至少一種6碳或更多碳有機酸和 /或其鹽、和任選地一種或多種其他試劑，例如PH調(diào)節(jié)劑和/或抗微生物劑。在特定的實施方案中，本文描述的方法還包括培養(yǎng)細胞以產(chǎn)生在本發(fā)明中使用的發(fā)酵肉湯中的一種或多種的步驟。例如(但不限于)，可根據(jù)以下章節(jié)5. 2.2中描述的任一種細胞培養(yǎng)方法，制備發(fā)酵肉湯。由此，本公開的組合物和制劑可包括通過本文公開的方法制備的發(fā)酵肉湯。不受任何理論約束，本發(fā)明人相信，使用本文描述的2種有機酸成分與使用單一有機酸成分相比，導致實現(xiàn)細胞失活(例如，如本文描述的，使活細胞數(shù)減少4或更多l(xiāng)og 倍)所需的總有機酸成分的減少，并允許孵育反應在比原可能的情況更高的PH進行，由此最小化對起始發(fā)酵肉湯中的蛋白質(zhì)例如酶的折疊和穩(wěn)定性的副作用。因此，在某些方面，在導致如下發(fā)酵肉湯制劑的條件下進行本發(fā)明方法，所述發(fā)酵肉湯制劑中的一種或多種酶維持其至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %或至少98 %的起始酶活性。本發(fā)明還提供了通過本文描述的方法得到的或可通過本文描述的方法得到的發(fā)酵肉湯制劑。因此，在某些方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含(a) —種或多種含有細胞的發(fā)酵肉湯；(b)包含至少一種1-5碳有機酸和/或其鹽的第一有機酸成分，其量為所述組合物的 0. 2%至1. 5%重量；(c)包含至少一種6碳或更多碳有機酸和/或其鹽的第二有機酸成分， 其量為所述組合物的0. 04%至0. 6%重量。在特定的實施方案中，第一有機酸成分的量在如下范圍中，該范圍的下限選自以重量計組合物的 0. 1%,0. 2%,0. 25%,0. 3%,0. 35%,0. 4%,0. 5%,0. 75%或 1%，而上限獨立地選自以重量計組合物的 0. 3%，0. 4%，0. 5%,0. 75%,1%,2%,3%,5%,7%,10%,12%或15%，例如以重量計組合物的0. 2%至1%，0. 2%至0. 5%,0. 至10%，0. 25%至 5%或0. 3%至3%的量，等等。在特定的實施方案中，第二有機酸成分的量在如下范圍中，該范圍的下限選自以重量計組合物的 0. 025 %,0. 03 %,0. 04 %,0. 045 %,0. 05 %,0. 075 %,0. 1 %,0. 2 %, 0. 25 %，0. 3 %，0. 35 %，0. 4 %，0. 5 %，0. 75 %或1 %，而上限獨立地選自以重量計組合物的 0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 75%，1 %，2 %，3%或 5%，例如，以重量計組合物的 0. 04%至 3%，0. 2%至 0. 5%,0. 至 1%，0. 25%至 5%或 0. 3%至 3%的量，等等。應當理解，在本發(fā)明的制劑和組合物中有機酸成分通常至少部分是離解的形式， 當這些成分是離解的形式時，成分的重量百分比不是指離解的離子(例如鈣)的重量而是指用于制備該組合物或制劑的干物質(zhì)(例如酸或鹽)的重量。這些成分離解的程度將取決于其各自的pKa值。優(yōu)選在使有機酸成分的至少20 %，至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少60%或至少70%離解的pH條件和溫度下制造制劑或組合物。在某些方面，本發(fā)明組合物的pH適宜在下述范圍，該范圍的下限選自3. 5，3. 6， 3. 7，3. 8，3. 9，4 或 4. 2，而上限獨立地選自 3. 8，4，4. 2，4. 4，4. 5，4. 6，4. 7，4. 8，4. 9，5，5. 2 或 5. 5，例如從3. 5至5，從4至4. 7，或4. 2至4. 5的pH。在某些方面，本發(fā)明的組合物中的細胞主要或完全是非存活的細胞。例如，在某些實施方案中，如果在組合物中存在活細胞，那么在所述組合物中非存活細胞與活細胞的比例是至少10 1，至少50 1，至少100 1，至少1000 1，至少10，000 1，至少 100, 000 1 或至少 1，000，000 1。在某些方面，細胞包括真菌細胞，例如絲狀真菌細胞。在特定的實施方案中，絲狀真菌細胞來自木霉屬、曲霉屬、青霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢霉屬或脈孢霉屬。在本發(fā)明的組合物的某些實施方案中，第一有機酸成分包含下述或由下述組成 醋酸、醋酸鹽、甲酸、甲酸鹽、丙酸、丙酸鹽、或前述兩種或更多種的混合物。在特定實施方案中，第一有機酸成分包含醋酸和/或其鹽，或由醋酸和/或其鹽組成。在本發(fā)明的組合物的某些實施方案中，第二有機酸成分包含下述或由下述組成 苯甲酸、苯甲酸鹽、環(huán)己烷羧酸、環(huán)己烷羧酸鹽、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸鹽、苯乙酸、苯乙酸鹽，或前述兩種或更多種的混合物。在特定實施方案中，第二有機酸成分包含苯甲酸和/ 或其鹽，或由苯甲酸和/或其鹽組成。在某些實施方案中，第一有機酸成分包含1-5碳有機酸的鈉、鉀、鈣或鎂鹽，和/或第二有機酸成分包含6碳或更多碳有機酸的鈉、鉀、鈣或鎂鹽。在以下章節(jié)5. 2. 4中描述了適用于本發(fā)明的方法和組合物的有機酸的其他細節(jié)和實施方案。在特定的實施方案中，第一有機酸成分包含以重量計0. 2% -0. 4%濃度的醋酸， 和/或第二有機酸成分包含以重量計0. 2% -0. 4%濃度的苯甲酸鈉。本發(fā)明的組合物可包含一種或多種抗微生物劑。在特定的實施方案中，該一種或多種抗微生物劑的量是以重量計組合物的0. 0005至0. 05%，例如是以重量計所述組合物的0. 001至0. 025 %的量。在特定的實施方案中，抗微生物劑包含含有異-α -酸、四-異 α酸和/或β酸的啤酒花提取物。在本發(fā)明的方法、制劑和組合物中使用的發(fā)酵肉湯通常包含一種或多種由細胞分泌的蛋白質(zhì)。所述一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種可為重組表達的和/或為酶，例如外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶或β-葡糖苷酶。在某些實施方案中，發(fā)酵肉湯包含由細胞重組表達和分泌的多種酶，例如外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶或β-葡糖苷酶中的2種或更多種。在以下章節(jié)5. 2. 3中描述了適合在本發(fā)明的組合物和制劑中存在的其他酶。在某些方面，蛋白質(zhì)占本發(fā)明制劑或組合物的3至30重量百分比。在特定的實施方案中，蛋白質(zhì)占本發(fā)明制劑或組合物的5至15重量百分比，7至10重量百分比，6至 12重量百分比，5至20重量百分比，10至25重量百分比，10至20重量百分比，8至15重量百分比，或6至10重量百分比。在某些特定的實施方案中本發(fā)明的制劑或組合物具有1、2或所有3種以下活性(a)內(nèi)切葡聚糖酶活性，范圍從選自 2000，2100，2200，2350，2500 或 ^50CMC U/g 的下限至獨立地選自2400，2600，2800，3000，3200，3500，3750或4000CMC U/g的上限，例如從 2200CMC U/g 至 2800CMC U/g，從 2200CMC U/g 至 3200CMC U/g，從 2500 至!3500CMC U/g,
寸寸；(b) β -葡糖苷酶活性，范圍從選自 300，375，450，475，500，525，550，600，650，或 700pNPG U/g 的下限至獨立地選自 475，525，575，635，700，775，800，850，900 或 950pNPG U/ g 的上限，例如從 525pNPG U/g 至 775pNPGU/g，從 300pNPG U/g 至 800pNPG U/g，從 350pNPG U/g至850pNP⑶/g，等等；和(c)木聚糖酶活性，范圍從選自 1000，1250，1500，1750，2000，2250，2500，2750 或 3000ABX U/g 的下限至獨立地選自 2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000 或 7000ABX U/g 的上限，例如從 2000ABX U/g 至 5000ABX U/g，從 1500ABX U/g 至 4500ABX U/ g,從!3500ABX U/g 至 5500ABX U/g,等等。在另一個方面，本發(fā)明提供了水解纖維素物料的方法，其包括將纖維素物料和任意前述發(fā)酵肉湯制劑或組合物接觸。在一些實施方案中，纖維素物料是植物生物質(zhì)物質(zhì)，例如木質(zhì)素纖維素物質(zhì)，其任選地已被預處理以提高酶促水解。由此，在某些方面本發(fā)明的制劑和組合物還包含未水解的纖維素物料，部分水解的纖維素物料或基本上完全水解的(例如>90%水解的或>95%水解的)纖維素物料。在特定實施方案中，部分水解的纖維素物料(i)是高達40%，高達50%，高達60%，高達70%，高達80%或高達90%水解的纖維素物料；( )是至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，或至少70 %水解的纖維素物料； 或(iii)水解至落入獨立地選自(i)和(ii)的一對值之間的范圍中，例如30% -80%或 40%-90%水解的。注意本文描述的制劑和組合物的成分(例如有機酸)的重量范圍一般不包括纖維素物料或纖維素物料的水解產(chǎn)物。在以下章節(jié)5. 3描述了本發(fā)明的制劑和組合物的其他細節(jié)和實施方案。在一些方面，本發(fā)明提供了通過在本發(fā)明的制劑或組合物中發(fā)酵可以生產(chǎn)有機物質(zhì)的微生物來制備有機物質(zhì)的方法。在一個實施方案中，所述微生物是產(chǎn)乙醇微生物，所述有機物質(zhì)是乙醇。本發(fā)明的組合物可在同時糖化和發(fā)酵反應(“SSF”)或分開的糖化和發(fā)酵反應(“SHF”)中使用。不受任何理論約束，相比于與本發(fā)明的組合物類似或相同但僅包含一種有機酸成分的制劑或組合物(在此分別稱為“替代制劑”或“替代組合物”，在該替代制劑或組合物中所述一種有機酸成分為可失活或殺死發(fā)酵肉湯中的細胞的量)，本發(fā)明的制劑和組合物有利地包含較少的發(fā)酵微生物的抑制劑。由此，在某些實施方案中，在本發(fā)明的制劑或組合物存在下由發(fā)酵微生物產(chǎn)生的有機物質(zhì)的產(chǎn)率，比在替代制劑或組合物存在下有機物質(zhì)的產(chǎn)率，高至少0. 25倍，至少0. 5倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍。例如，當對發(fā)酵微生物使用包含酶、第一量(例如重量)的第一有機酸成分和第二量(0.5%重量)的第二有機酸成分的本發(fā)明組合物或制劑時，由發(fā)酵微生物產(chǎn)生的有機物質(zhì)的產(chǎn)率，比在相同或類似條件下使用包含相同酶和高達所述第一和第二量之和(例如1.5%重量百分比) 的第三量的單獨第一有機酸成分或第二有機酸成分的組合物時的產(chǎn)率，更高。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明制劑和組合物用于SSF反應。該方法包括使包含本發(fā)明的制劑或組合物、發(fā)酵微生物和纖維素底物的SSF反應混合物經(jīng)歷SSF條件。任選地，所述方法包括形成SSF反應混合物的步驟，例如通過組合本發(fā)明的制劑或組合物、乙醇生產(chǎn)者(ethanologen)和任選地纖維素底物。在特定的實施方案中，SSF條件包括缺乏補充的氮源。在另一個特定實施方案中，所述條件有助于纖維素水解為葡萄糖和/或半纖維素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)和有助于葡萄糖和/或半纖維素轉(zhuǎn)化為有機物質(zhì)(例如乙醇)。包含本發(fā)明的制劑或組合物、發(fā)酵微生物和任選地纖維素物料的SSF反應混合物也是本發(fā)明的一部分，本發(fā)明也涵蓋其中纖維素物料已被部分水解和發(fā)酵的SSF反應產(chǎn)物。在其他實施方案中，本發(fā)明制劑和組合物用于SHF反應。該方法包括使包含本發(fā)明的制劑或組合物和纖維素底物的SHF反應混合物經(jīng)歷SHF條件。任選地，所述方法包括形成SHF反應混合物的步驟，例如通過組合本發(fā)明的制劑或組合物和纖維素底物。在特定的實施方案中，SHF條件有助于纖維素水解為葡萄糖和/或半纖維素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)。任選地，然后將SHF反應產(chǎn)物用于發(fā)酵反應中以將得到的葡萄糖和/或半纖維素轉(zhuǎn)化為有機物質(zhì)(例如乙醇)。包含本發(fā)明的制劑或組合物和纖維素物料的SHF 反應混合物也是本發(fā)明的一部分，本發(fā)明也涵蓋其中纖維素物料已被部分水解的SHF反應產(chǎn)物。在以下章節(jié)5. 4和5. 5中描述了水解纖維素物料的方法和制備有機物質(zhì)的方法的其他細節(jié)和實施方案。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含包裝和根據(jù)本發(fā)明的制劑、組合物、 SSF反應混合物、SSF反應產(chǎn)物、SHF反應混合物或SHF反應產(chǎn)物。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含在用發(fā)酵微生物制備有機物質(zhì)的方法中使用的說明書，例如在用產(chǎn)乙醇微生物和以試劑盒中的細胞滅活的全肉湯或組合物水解的纖維素底物制備乙醇的方法中使用的說明書。在以下章節(jié)5. 6中描述了本發(fā)明的試劑盒的其他細節(jié)和實施方案。在以下章節(jié)5. 7中提供了本發(fā)明的方法、制劑和組合物的其他特定實施方案。4.附圖簡述

圖1顯示了溫度和制劑化學濃度對殺死里氏木霉(T. Reesei)細胞的影響。圖2顯示了在40°C和pH 4下苯甲酸鈉濃度對殺死里氏木霉(T. Reesei)細胞的影響。圖3顯示了細胞滅活條件對殺死真菌細胞的影響。圖4顯示了具有6個或更多碳的有機酸的化學結構和pKa值。圖5顯示了在40°C和pH 4下具有6個或更多碳的不同有機酸對殺死里氏木霉(T. Reesei)細胞的影響。圖6顯示了在如實施例2描述的洗過的APB水解物上由鼠李糖乳桿菌 (L. rhamnosus)產(chǎn)生的乳酸。圖7顯示了在如實施例2描述的洗過的APB水解物上由Hiermosacc酵母產(chǎn)生的乙醇。圖8顯示了在于如實施例2描述的洗過的APB水解物上進行Thermosacc酵母發(fā)酵期間葡萄糖的積累。5.發(fā)明詳述5. 1 定義如本文使用的，術語“宿主細胞”指可轉(zhuǎn)染用于產(chǎn)生多肽的重組表達載體以表達該多肽的細胞或細胞系。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突變，該后代可能不一定和原始的親本細胞完全相同(在形態(tài)學上或在總基因組互補 DNA(genomic DNA complement)上)。宿主細胞包括被表達載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細胞。 “宿主細胞”指細胞和從絲狀真菌菌株，特別是木霉屬物種菌株，的細胞產(chǎn)生的原生質(zhì)體。當用于細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時，術語“重組”表示所述細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過異源核酸或蛋白質(zhì)的引入或天然核酸或蛋白質(zhì)的改變而被修飾，或所述細胞來源于這樣修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在細胞的天然(非重組)形式中不存在的基因，或表達原本異常表達的、不足表達的或完全不表達的天然基因?！敖z狀真菌”指真菌門(Eumycotina)和卵菌門(Oomycota)的所有絲狀形式(見 Alexopoulos, C. J. (1962)，Introductory MycoIory, Wiley, New York)。這些真菌的特征在于具有由幾丁質(zhì)、葡聚糖和其他復雜多糖組成的細胞壁的營養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學、生理學和遺傳學上和酵母截然不同。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是菌絲的伸長， 并且碳分解代謝是專性需氧的。如本文使用的，術語“木霉屬，，或“木霉屬物種，，指以前或目前被歸類為木霉屬的
任何真菌屬。術語“培養(yǎng)”指在合適生長的條件下在液體或固體培養(yǎng)基中微生物細胞群體的增長。如本文使用的，在本文中可互換使用的術語“纖維素底物”或“纖維素物料”指含有纖維素和/或半纖維素的物料。纖維素底物可為木質(zhì)素纖維素物料，所述木質(zhì)素纖維素物料含有彼此交聯(lián)的和與木質(zhì)素交聯(lián)的纖維素、半纖維素和葡聚糖。這些纖維素底物也可含有其他物質(zhì)，例如果膠、蛋白質(zhì)、淀粉和脂質(zhì)，但通常含有纖維素、半纖維素和葡聚糖作為主要成分?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于在期望的發(fā)酵過程中生產(chǎn)有機物質(zhì)的任何微生物。如本文使用的術語“發(fā)酵肉湯”是指由細胞發(fā)酵產(chǎn)生的制品，該制品未經(jīng)歷過回收和/或純化、或經(jīng)歷過最低程度的回收和/或純化。例如，當微生物培養(yǎng)物被培養(yǎng)至飽和， 并在碳限制條件下孵育以允許蛋白質(zhì)合成(例如由宿主細胞表達酶)并分泌至細胞培養(yǎng)基中時，產(chǎn)生發(fā)酵肉湯。發(fā)酵肉湯可含有在發(fā)酵結束時得到的發(fā)酵物質(zhì)的未分級分離的或已分級分離的內(nèi)容物。通常，發(fā)酵肉湯是未分級分離的，包含用過的培養(yǎng)基和在去除(例如通過離心)微生物細胞(例如絲狀真菌細胞)后存在的細胞碎片。在一些實施方案中，發(fā)酵肉湯含有用過的細胞培養(yǎng)基、細胞外酶、和活的和/或非存活的微生物細胞?！爱a(chǎn)乙醇的”指微生物從碳水化合物產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的能力。在一些實施方案中，產(chǎn)乙醇微生物也可用于產(chǎn)生其他有機物質(zhì)?！棒燃谆w維素單位”或“CMC U”指在50°C和pH 4. 8下在1分鐘內(nèi)釋放1 μ mo 1還原糖(表示成葡萄糖當量)的內(nèi)切葡聚糖酶活性的單位。"pNP-葡糖苷單位”或“pNPG U”指在50°C和pH 4. 8下從對硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷釋放1 μ moi硝基酚的β -葡糖苷酶活性的單位?！唉ˇⅵ秵挝弧被颉唉ˇⅵ?U”指，如使用二硝基水楊酸(DNS)方法(Miller，1959，Anal Chem. ,31 :426-428)測定的，在50mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5. 3中在50°C從1 %的木聚糖(來自樺樹木材)溶液中釋放ι μ mol木糖還原糖當量的木聚糖酶活性的單位。5. 2殺死細胞的方法本發(fā)明提供了殺死培養(yǎng)基中的細胞的方法，由此產(chǎn)生細胞被滅活的全肉湯。在一些實施方案中，該方法包括使細胞接觸具有1至5個碳原子的第一有機酸(以重量計約 0.2%至約的濃度)和具有6個或更多個碳原子的第二有機酸(以重量計約0. 04%至約0.3%的濃度)的組合。在一些實施方案中，該方法包括使細胞接觸具有1至5個碳原子的第一有機酸(以重量計約0. 2%至約0. 5%的濃度)和具有6個或更多個碳原子的第二有機酸(以重量計約0.2%至約0.5%的濃度)的組合。在其他實施方案中，方法包括使細胞接觸具有6個或更多個碳原子的有機酸(以重量計約0. 25%至約0. 5%的濃度)?？梢栽诤线m的PH和溫度下將所述方法進行合適的一段時間，以達到基本上完全(即處理后至少約4、5或61og的活細胞減少)或完全(即處理后沒有活細胞)的細胞滅活。通常，pH為約3. 5至約4. 5，約4至約4. 4，或約3. 9至約4. 2，溫度為約30°C至約40°C，并且在此pH和溫度下進行方法約8至約M小時。在一個實施方案中，在pH約4和溫度約40°C下進行方法約M小時。在一些實施方案中，細胞被殺死但不裂解。在一些實施方案中，一些或全部的細胞被裂解。5. 2.1微生物細胞細胞通常是微生物細胞，例如細菌或真菌細胞，并通常產(chǎn)生至少一種目的分子，例如酶或有機化合物。在一些實施方案中，細胞產(chǎn)生至少一種重組表達的酶。在一些實施方案中，目的分子被分泌至細胞外培養(yǎng)基。在一些實施方案中，目的分子在細胞內(nèi)產(chǎn)生且不被分泌至細胞外培養(yǎng)基中。當分子在細胞內(nèi)產(chǎn)生且不被分泌至細胞外，可能需要裂解已殺死的細胞以將分子釋放至液體培養(yǎng)基。在一些實施方案中，微生物細胞是絲狀真菌細胞，包括天然存在的絲狀真菌，具有天然存在的或誘導的突變的絲狀真菌，和已被遺傳改造的絲狀真菌。在一些實施方案中，真菌細胞是曲霉屬(Aspergillus)，枝頂孢屬(Acremonium)， 短梗霉屬(Aureobasidium),白僵菌屬(Beauveria),煙管菌屬(Bjerkandera)，頭孢霉屬(Cephalosporium)，擬賭菌屬(Ceriporiopsis)，毛殼菌屬(Chaetomium)，金抱霉屬(Chrysosporium)，麥角菌屬(Claviceps),旋孢腔菌屬(Cochiobolus)，鬼傘屬 (Coprinus),革蓋菌屬(Coriolus),棒囊殼屬(Corynascus),隱球酵母屬(Cryptococcus), 黑蛋巢菌屬(Cyathus)，內(nèi)座殼屬(Endothia)，線黑粉菌屬(FilcAasidium)，鐮孢屬 (Fusarium)，粘帚霉屬(Gilocladium)，腐質(zhì)菌屬(Humicola)，Magnaporthe,毀絲霉屬(Myceliophthora),漆斑菌屬(Myrothecium)，毛菌屬(Mucor), Neocallimastix,脈孢霉屬(Neurospora),擬青霉屬(Paeilomyces),青霉屬(Penicillium),原毛平革菌屬(Phanerochaete),射脈菌屬(Phlebia), Piromyces,偵Ij 耳屬(Pleurotus),柄抱殼屬 (Podospora),擬青霉屬(Paecilomyces),梨抱屬(Pyricularia),根毛霉屬(Rhizomucor), 根霉屬(Rhizopus)，裂褶菌屬(Schizophylum)，側孢霉屬(Sporotrychum)，殼多孢屬(Stagonospora), ^ lif M (Talaromyces)，Toypoladium, β M (Trichoderma)， 嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces)，嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)，梭孢殼屬(Thielavia)， Tolypocladium,發(fā)癬菌屬(Trichophyton)和栓菌屬CTrametes)物種或衍生自上述的物種。在一些實施方案中，真菌細胞是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，臭曲霉(Aspergillus foetidus),曰本曲霉(Aspergillus japonicus)，構巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，煙曲霉(Aspergillus fumigatus)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。在一些實施方案中， 真菌細胞是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)，禾谷鐮孢(Fusarium cerealis), Fusarium crookwellense,大刀鍵抱(Fusarium culmorum)，禾本禾斗鍵抱(Fusarium gramin earum)，禾赤鍵抱(Fusarium graminum)，異抱鍵抱(Fusarium heterosporum)， 合歡木鍵抱(Fusarium negundi)，尖鍵抱(Fusarium oxysporum)，多枝鍵抱(Fusarium reticulatum)，粉紅鍵抱(Fusarium roseum)，接骨木鍵刀菌(Fusarium sambucinum)，膚色鍵抱(Fusarium sarcochroum)，擬分枝抱鍵抱(Fusarium sporotrich ioides)，硫色鍵抱 (Fusarium sulphureum), Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides 或 Fusarium venenatum。在一些實施方案中，真菌細胞是蒼煙管菌(Bjerkandera adusta)，干擬蠟 |if (Ceriporiopsis aneirin a), Ceriporiopsis caregiea，淺黃擬￡^菌(Ceriporiopsis gilvescens), Ceriporiopsis pannocinta, Cerporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora，毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)，特異腐質(zhì)霄 (Humicola insolens)，柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)，米赫毛霉(Mucor miehei)， 嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila),粗糙脈胞菌(Neurospora crassa)， Scytalidium thermophilum,太 i^f 斯梭 包殼(Thielavia terrestris), Trametes pleurotus, Trametes villosa, Trametes versicolor, Chaetomium paecilomyces, Endothia mucor,產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum),繩狀青霉(Penicillium funiculosum)，黃 包原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，脈身寸菌(Phlebia radiate)或刺芹側耳(Pleurotus eryngii)。在一些實施方案中，真菌細胞是哈茨木霉 (Trichoderma harzianum), ^ ^ (Trichoderma koningii), ^1^7^ (Trich ο derma longibrachiatum), M(Trichoderma reesei)或參錄色木霄(Trichoderma viride)。5. 2. 2微生物細胞的培養(yǎng)可通過本領域已知的任何培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物細胞，導致表達。通常，使用適于產(chǎn)生一種或多種目的分子(例如一種或多種酶和/或有機化合物)的條件，例如適于表達能夠水解纖維素底物的酶的條件。微生物培養(yǎng)物的發(fā)酵可包括搖瓶培養(yǎng)，小或大規(guī)模發(fā)酵，例如在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中在合適的培養(yǎng)基和允許表達纖維素酶的條件下進行的，連續(xù)、 分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵。培養(yǎng)在包含碳和氮源和無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領域已知的程序進行。合適的培養(yǎng)基、溫度范圍和適于生長和生產(chǎn)目的分子例如生物分子，例如酶或其它蛋白質(zhì)，或有機化合物的其他條件是本領域已知的。發(fā)酵，例如絲狀真菌細胞的發(fā)酵，經(jīng)常以這樣的方式進行，S卩，可以控制含碳底物作為限制性因素，由此對細胞提供含碳底物的良好轉(zhuǎn)化和避免細胞污染實質(zhì)量的未轉(zhuǎn)化底物。后者對水溶性底物不是問題，因為任何剩余的痕量可容易地被洗掉。然而在非水溶性底物的情況下，這可能是個問題，并需要加入產(chǎn)物處理步驟，例如合適的洗滌步驟?？扇缦逻M行發(fā)酵，即培養(yǎng)微生物細胞例如絲狀真菌細胞至穩(wěn)定期，并在限碳條件下維持細胞足以表達一種或多種目的分子的一段時間。5. 2. 3微生物細胞表達的酶在本發(fā)明的方法中使用的微生物細胞可為非重組的和/或重組的，例如非重組的和/或重組的絲狀真菌。在一些實施方案中微生物細胞含有一個或多個可與微生物細胞同源或異源的基因。在一些實施方案中，微生物細胞例如絲狀真菌細胞含有一個或多個可與所述細胞同源或異源的基因，其中所述一個或多個基因編碼可降解纖維素底物的酶。編碼纖維素物料降解酶的基因是本領域技術人員已知的。編碼降解纖維素底物的酶的基因的合適非限制性實例包括，內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖水解酶、β-葡糖苷酶、 木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、 阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、果膠酸裂解酶、果膠裂解酶、果膠酸裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠乙酰酯酶、果膠甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、木糖半乳糖醛酸糖苷酶 (xylogalacturonosidase)、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳依賴性過氧化物酶和漆酶。在本發(fā)明的一些實施方案中，重組微生物細胞例如重組絲狀真菌細胞過表達酶 (一種或多種)，以改進纖維素底物的降解。可選地，微生物細胞可為非重組細胞和過表達酶以改進纖維素底物降解的重組細胞的混合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，微生物細胞例如絲狀真菌細胞過表達β-葡糖苷酶?？蛇x地，微生物細胞可為非重組細胞和過表達 β-葡糖苷酶的重組細胞的混合物。在本文中，術語“β-葡糖苷酶”定義為分類為EC 3.2. 1.21的β _D_葡萄糖苷葡糖水解酶、和/或在某些GH家族，包括但不限于GH家族1，3，7，9或48中催化纖維二糖水解并釋放β-D-葡萄糖的那些酶。過表達的β-葡糖苷酶可來自與宿主細胞相同或不同的物種。值得注意地是，過表達的葡糖苷酶不必是在真菌細胞中表達的真菌葡糖苷酶。在一些實施方案中，可通過表達編碼β-葡糖苷酶的基因，產(chǎn)生β-葡糖苷酶。例如，β-葡糖苷酶可，例如由革蘭氏陽性生物(例如芽孢桿菌(Bacillus)和放線菌(Actinomycetes))或真核宿主(例如木霉、曲霉、酵母(Saccharomyces)和畢赤酵母 (Pichia))，分泌至細胞外空間。應當理解，在一些實施方案中，可在重組微生物中相對天然水平過表達β-葡糖苷酶。在一些實施方案中，如果使用宿主細胞表達β-葡糖苷酶，細胞可經(jīng)遺傳修飾以減少一種或多種細胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達。在一些實施方案中，細胞可含有一個或多個已被缺失或失活的天然基因，特別是編碼分泌蛋白質(zhì)的基因。例如，可缺失或失活一個或多個蛋白酶編碼基因(例如天冬酰胺蛋白酶編碼基因；見Berka等人，Gene 199086 :153-162和USP 6，509，171)或纖維素酶編碼基因。在一個實施方案中，木霉屬物種宿主細胞例如里氏木霉宿主細胞在cbhl、cbh2和egll、和egl2基因中含有失活性缺失， 如在PCT申請?zhí)朩005/001036中描述的。編碼β -葡糖苷酶的核酸可存在于木霉屬物種宿主細胞的核基因組中或可存在于在木霉宿主細胞中復制的質(zhì)粒中?？墒褂玫摩?-葡糖苷酶的實例包括來自棘孢曲霉(Kawaguchi等人，1996，Gene 173 :287-288),河內(nèi)曲霉(Aspergillus kawachi) (Iwashita 等人，1999，App 1. Environ. Microbiol. 65 :5546-5553)，米曲霉(W02002/095014)，雙氮纖維單胞菌(Cellulomonas biazotea) (Wong 等人，1998，Gene 207 :79-86)，扣囊復膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera) (Machida 等人，1988，Appl. Environ. Microbiol. 54 :3147-3155)，栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Wood 等人，2002，Nature 415 :871-880)，里氏木霉葡糖苷酶1(美國專利號6，022，725)，里氏木霉β _葡糖苷酶3 (美國專利號 6，982，159)，里氏木霉β-葡糖苷酶4(美國專利號7，045，332)，里氏木霉β-葡糖苷酶5 (美國專利號7，005，289)，里氏木霉β -葡糖苷酶6 (USPN20060258554)，和里氏木霉 β-葡糖苷酶7(USPN 20040102619)的β-葡糖苷酶。在一些實施方案中，由微生物細胞分泌至細胞外的目的酶可溶于細胞外培養(yǎng)基和 /或細胞滅活的發(fā)酵肉湯中。在一些實施方案中，由微生物細胞分泌至細胞外的目的酶不可溶于細胞外培養(yǎng)基和/或細胞滅活的發(fā)酵肉湯中。在一些實施方案中，細胞外培養(yǎng)基和 /或細胞滅活的肉湯含有可溶和不可溶的目的酶的混合物。5. 2. 4 有機酸本發(fā)明的方法包括在如本文描述的條件下，以本文所述的量，例如以實現(xiàn)活細胞數(shù)量的至少410g，510g，610g，7l0g或Slog減少的量，使有機酸或其鹽接觸培養(yǎng)基中的細胞，以失活細胞。在一些實施方案中，方法包括使細胞接觸以重量計約0. 至約15%，0. 2%至約 1%，或約0.2%至約0.5%濃度的含有1至5個碳原子的第一有機酸(或其鹽)和以重量計約0. 025%至5%，以重量計0. 04%至約0. 3%，或以重量計約0. 2%至約0. 5%的含有6 個或更多個碳原子的第二有機酸(或其鹽)。在多個實施方案中，組合使用以重量計約0. 2， 0. 25,0. 3,0. 35,0. 4,0. 5,0. 55,0. 6,0. 65,0. 7,0. 75,0. 8,0. 85,0. 9,0. 95 或 1 % 中任一濃度的第一有機酸和以重量計約 0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25 或 0. 3,0. 35，0. 4,0. 45或0. 5%中任一濃度的第二有機酸。在一個實施方案中，第一有機酸是以重量計約0. 2%至約0. 5%，或以重量計約0.濃度的醋酸，第二有機酸是以重量計約 0. 04%至約0. 06%，或約0. 044%濃度的苯甲酸。在一個實施方案中，第一有機酸是以重量計約0. 2%至約0. 5%，或以重量計約0.濃度的醋酸，第二有機酸是以重量計約0. 2% 至約0. 5%，或約0. 22%濃度的苯甲酸。在一些實施方案中，方法包括使細胞接觸以重量計約0. 25%至約0. 5%濃度的含有6個或更多個碳原子的有機酸(或其鹽)。在多個實施方案中，使用以重量計約0. 25， 0.3,0. 35，0. 4，0. 45，或0. 5%中任一濃度的含有6個或更多個碳原子的有機酸。在一個實施方案中，含有6個或更多個碳原子的有機酸是以重量計約0. 5%濃度的苯甲酸。
在一些實施方案中，含有1至5個碳原子的有機酸是醋酸、甲酸、丙酸(或其鹽)， 或其組合。在一個實施方案中，含有1至5個碳原子的有機酸是醋酸。在一些實施方案中，含有6個或更多個碳原子的有機酸是苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、 4-甲基戊酸、己二酸、3-甲基戊二酸、苯乙酸(或其鹽)，或其組合。在一個實施方案中，含有6個或更多個碳原子的有機酸是苯甲酸(或其鹽，例如苯甲酸鈉)。在一些實施方案中， 含有6個或更多個碳原子的有機酸含有6至8 (即6、7或8)個碳原子。在一些實施方案中， 含有6個或更多個碳原子的有機酸含有1或2個羧酸官能團。在一些實施方案中，含有6 個或更多個碳原子的有機酸是芳香族有機酸。在一些實施方案中，含有6個或更多個碳原子的有機酸含有7或8個碳和1個苯基基團。5. 3組合物本發(fā)明提供了由如本文描述的用于殺死細胞的方法產(chǎn)生的組合物。在一些實施方案中，組合物是含有如本文描述的有機酸、已殺死的細胞和/或細胞碎片、和培養(yǎng)基的細胞滅活的全肉湯。在一些實施方案中，組合物含有如本文描述的有機酸，和任選地還含有已殺死的細胞和/或細胞碎片。在一個實施方案中，從如本文描述的細胞滅活的全肉湯中移出已殺死的細胞和/或細胞碎片，以提供不含這些成分的組合物。本發(fā)明的細胞滅活的全肉湯或組合物通常含有由用于產(chǎn)生該細胞滅活的全肉湯或組合物的微生物細胞產(chǎn)生的至少一種目的分子(例如生物分子，例如蛋白質(zhì)，例如酶和/或有機物質(zhì))。任選地可向細胞滅活的全肉湯或組合物中加入額外的防腐劑和/或抗微生物劑 (例如制菌劑)，包括但不限于山梨糖醇、氯化鈉、山梨酸鉀和本領域已知的其他防腐劑和/ 或抗微生物劑。在一些實施方案中，可對細胞滅活的全肉湯或組合物補充一種或多種微生物細胞不內(nèi)源表達的或以相對低的水平表達的酶活性。例如，可加入一種或多種酶以改進纖維素底物的降解，例如降解為可發(fā)酵的糖例如葡萄糖或半纖維素糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖)。補充的酶可作為補充劑加入細胞滅活的全肉湯或組合物中，且該酶可為分開的發(fā)酵肉湯的成分，或可為純化的或被最低程度地回收和/或純化的。補充的酶的合適的非限制性實例包括纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、內(nèi)切一β -1,3 )-葡聚糖酶、葡糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α -半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、果膠酸裂解酶、果膠裂解酶、果膠酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠乙酰酯酶、果膠甲基酯酶、β -半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、阿魏酸(ferrulic acid)酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、木糖半乳糖醛酸糖苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳依賴性過氧化物酶、具有木質(zhì)素過氧化物酶和錳依賴性過氧化物酶的組合性能的雜合過氧化物酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、蛋白酶和漆酶。在一些實施方案中，細胞滅活的全肉湯或組合物包括纖維素分解酶，包括但不限于(i)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)或l，4-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，包括l，4-d-葡聚糖葡聚糖水解酶(又稱纖維糊精酶)(EC 3. 2. 1. 74)和1， 4-d-葡聚糖纖維二糖水解酶(外切纖維二糖水解酶，CBH) (EC 3. 2. 1. 91)，和(iii) β -葡糖苷酶(BG)或β -葡萄糖苷葡糖水解酶(EC 3. 2. 1. 21)。在一些實施方案中，細胞滅活的全肉湯或組合物含有一種或多種選自外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶和β-葡糖苷酶的酶。在一個實施方案中，細胞滅活的全肉湯或組合物含有約1000至約2000，約1500至約2500，約2200至約沘00，或約2500CMC U/ g內(nèi)切葡聚糖酶活性和約450至約775，約525至約775，約400至約800，或約650pNPG U/
葡糖苷酶活性?？墒褂帽绢I域已知的方法測定羧甲基纖維素(CMC)活性和對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)活性(見例如 Ghose，Τ. K. , "Measurement of Cellulase Activities,，，Pure & Appl. Chem. 59, pp. 257-268,1987 ；Chen, H. , Hayn, Μ. , Esterbauer, H. "Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei, "Biochimica etBiophysica Acta,1992,1121,54-60)。在一些實施方案中，細胞滅活的全肉湯或組合物含有以重量計約0.2%至約1%， 約0. 2%至約0. 5%，或約0.濃度的醋酸和以重量計約0. 2%至約0. 5%，或約0. 22% 濃度的苯甲酸，PH為約3. 9至約4. 3，約3. 5至約4. 5，約4至約5，約4. 5至約5. 5，約4. 8 至約5. 2，或約4。在一些實施方案中，細胞滅活的全肉湯或組合物含有在發(fā)酵結束時得到的發(fā)酵物質(zhì)的未分級分離的內(nèi)容物。通常，細胞滅活的全肉湯或組合物含有在將微生物細胞(例如絲狀真菌細胞)培養(yǎng)至飽和并在碳限制條件下孵育以允許蛋白質(zhì)合成(例如纖維素酶和/ 或葡糖苷酶表達)后存在的用過的培養(yǎng)基和細胞碎片。在一些實施方案中，細胞滅活的全肉湯或組合物含有用過的細胞培養(yǎng)基、細胞外酶和已殺死的絲狀真菌細胞。在一些實施方案中，可使用本領域已知的方法，透化和/或裂解在細胞滅活的全肉湯或組合物中存在的微生物細胞。本發(fā)明也提供了反應組合物，其含有纖維素物料、如本文描述的細胞滅活的全肉湯或組合物、和在培養(yǎng)基中的發(fā)酵微生物的混合物。在一些實施方案中，反應組合物基本上不含補充的氮源。在一些實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物。在一些實施方案中，該反應組合物與含有以重量計約1. 4%醋酸和約0. 22%苯甲酸的反應組合物相比，其中產(chǎn)生的有機物質(zhì)增加至少約50 %。在一個實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物，有機物質(zhì)是乙醇，并且該反應組合物與含有以重量計約1. 4%醋酸和約0. 22%苯甲酸的反應組合物相比，乙醇的產(chǎn)生增加至少約10倍。如本文描述的細胞滅活的全肉湯或組合物通常是液體，但可含有不溶性成分，例如已殺死的細胞、細胞碎片、培養(yǎng)基成分和/或不溶性酶。在一些實施方案中，可去除不溶性成分以提供澄清的液體組合物。5. 4水解纖維素物料的方法本發(fā)明提供了水解纖維素物料的方法。方法包括使纖維素物料接觸從如本文描述的殺死細胞的方法得到的細胞滅活的全肉湯或組合物，其中所述細胞滅活的全肉湯或組合物為足以使纖維素物料被細胞滅活的全肉湯或組合物中的一種或多種酶酶促水解的量。纖維素底物的合適的非限制性實例包括但不限于，生物質(zhì)、草本物質(zhì)、農(nóng)業(yè)廢料、 林業(yè)廢料、城鎮(zhèn)固體廢物、廢紙、和紙漿和紙渣。在本發(fā)明中使用的纖維素底物的通常形式包括但不限于，樹、灌木和草、小麥、麥秸、甘蔗渣、玉米、玉米殼、玉米核(包括來自玉米核的纖維)、來自谷物例如玉米研磨(包括濕磨和干磨)的產(chǎn)品和副產(chǎn)品、以及城鎮(zhèn)固體廢物、廢紙、和庭院廢物?？蓮摹霸忌镔|(zhì)”(例如樹、灌木、草、水果、花、草本作物、硬木和軟木)，“非原始生物質(zhì)”(例如農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品、商業(yè)有機廢物、建筑和拆除垃圾、城鎮(zhèn)固體廢物和庭院廢物)或“混合生物質(zhì)”(其是原始和非原始生物質(zhì)的混合物)得到纖維素底物。在一些實施方案中，纖維素底物包括木材、木漿、造紙泥、紙漿廢液、刨花板、玉米稈、玉米纖維、稻、紙和紙漿加工廢物、木本或草本植物、果漿、蔬菜漿、浮石(pumice)、酒糟、 草、稻殼、甘蔗渣、棉花、黃麻、大麻、亞麻、竹子、劍麻、馬尼拉麻(abaca)、稻草、玉米棒、酒糟、葉、麥桿、椰子毛、藻類、柳枝稷和其混合物。纖維素底物可就此使用或可以使用本領域已知的常規(guī)方法進行預處理。這些預處理包括化學、物理和生物預處理。例如，物理預處理技術可包括但不限于各種類型的研磨、 粉碎、汽蒸/蒸氣爆破、輻射和水熱解(hydrothermolysis)?；瘜W預處理技術可包括但不限于，稀酸、堿、有機溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳和PH-控制的水熱解。生物預處理技術可包括但不限于，使用溶木質(zhì)素微生物。5. 5在微生物中生產(chǎn)有機物質(zhì)的方法本發(fā)明提供了在微生物，例如發(fā)酵微生物中生產(chǎn)有機物質(zhì)的方法。方法包括用細胞滅活的全肉湯或組合物(如上所述)生產(chǎn)水解的纖維素物料，和在水解的纖維素物料存在下在適于發(fā)酵微生物產(chǎn)生一種或多種目的有機物質(zhì)的條件下培養(yǎng)發(fā)酵微生物。在一些實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物，該方法用于產(chǎn)生乙醇。在一些實施方案中，使用預處理的纖維素物料。纖維素物料的水解和用于產(chǎn)生有機物質(zhì)的發(fā)酵微生物的發(fā)酵可同時或相繼進行。在一些實施方案中，與用含有以重量計約1.4%的醋酸和約0.22%的苯甲酸的組合物水解纖維素物料并在其上培養(yǎng)發(fā)酵微生物的方法相比，使用本文描述的細胞滅活的全肉湯或組合物可以導致有機物質(zhì)的產(chǎn)量增加至少約50%。在一些實施方案中，與用含有以重量計約1. 4%的醋酸和約0. 22%的苯甲酸的組合物水解纖維素物料和在其上培養(yǎng)發(fā)酵微生物的方法相比，有機物質(zhì)(例如乙醇或其它有機分子)的產(chǎn)量增加至少約0.5，1，2，3， 4，5，6，7，8，9，或 10 倍。合適的發(fā)酵微生物能夠?qū)⑻抢缙咸烟恰⒛咎?、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖或寡糖發(fā)酵或轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物(一種或多種)。發(fā)酵微生物的合適的非限制性實例包括真菌生物，例如酵母和細菌。在一些實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物，例如天然存在的產(chǎn)乙醇生物，具有天然存在的或誘導的突變的產(chǎn)乙醇生物、或已被遺傳修飾的產(chǎn)乙醇生物。在一些實施方案中，產(chǎn)乙醇微生物是可將葡萄糖有效發(fā)酵成乙醇的酵母細胞， 例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fagilis)、擬熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)和管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。合適的菌株包括但不限于釀酒酵母D5A(ATCC200062)， 釀酒酵母 Y567 (ATCC24858)，ACA 174(ATCC 60868)，MY91(ATCC 201301)，MY138(ATCC 201302)，C5 (ATCC 201298)，ET7(ATCC 201299)，LA6 (ATCC201300)，0SB21(ATCC 201303)， F23(球形酵母(S. globosus)ATCC90920)，ACA 174(ATCC 60868), A54(ATCC 90921), NRCC 202036(ATCC 46534)， ATCC 24858， ATCC 24858， G 3706(ATCC 42594)， NRRL, Y-265(ATCC 60593)，Sa28 (ATCC 26603)和ATCC 24845-ATCC 24860。在本發(fā)明中適用的其他非釀酒酵母的酵母菌株包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (tozony ID 4922)，S. pastorianus SA 23 (卡爾酵母(S. carlsbergensis) ATCC 26602)，S. pastorianus (卡爾酵母 ATCC 2345), Candida acidothermophilum( ^TjBJ (Issatchenkia orientalis), ATCC
20381)。在一些實施方案中，產(chǎn)乙醇微生物是重組酵母菌株。合適的重組酵母可含有編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和/或木酮糖激酶的基因(見例如USPN 5，789，210)。在一些實施方案中，產(chǎn)乙醇微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陰性、兼性厭氧細菌細胞，例如來自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細菌細胞。在一些實施方案中，產(chǎn)乙醇微生物來自埃希氏菌屬Escherichia)或克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，例如大腸桿菌 B，大腸桿菌DH5a，大腸桿菌K04(ATCC 55123)，大腸桿菌KOll (ATCC 551 )，大腸桿菌 K012(ATCC55125)，大腸桿菌LY01，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K. oxytoca)M5Al，或產(chǎn)酸克雷伯氏菌 P2 (ATCC 55307)。在一些實施方案中，產(chǎn)乙醇微生物是發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)物種，或來源于運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis) (ATCC31821)。在一些實施方案中，重組發(fā)酵單胞菌菌株可含有例如編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的基因。盡管將纖維素物料水解成葡萄糖和其他小糖是重要的步驟，但同時糖化和發(fā)酵 (SSF)依賴于產(chǎn)乙醇微生物的活培養(yǎng)物將這些糖轉(zhuǎn)化為乙醇。通常將發(fā)酵微生物加至水解產(chǎn)物，允許發(fā)酵進行12-96小時，例如30-80小時。溫度通常是洸-40°C，例如約32°C，pH通常是3-6。發(fā)酵后，可以通過本領域已知的任何方法，回收目的有機物質(zhì)。這些方法包括但不限于蒸餾、提取、層析、電泳程序和差異溶解度。例如，在乙醇發(fā)酵中，可通過常規(guī)蒸餾方法分離和純化乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的乙醇可用作燃料乙醇、飲用乙醇或作為工業(yè)乙雖然不受理論的約束，但相信，未澄清的、細胞滅活的全肉湯可以為產(chǎn)乙醇微生物提供剩余的營養(yǎng)物。這可導致更快的乙醇發(fā)酵和改進乙醇產(chǎn)率。除了糖化的纖維素以外可以不需要向產(chǎn)乙醇微生物提供營養(yǎng)培養(yǎng)基或可以減少補充營養(yǎng)物的量的能力，導致用于乙醇發(fā)酵工藝的原材料成本的降低。在一些實施方案中，在發(fā)酵微生物中生產(chǎn)有機物質(zhì)的方法中使用如本文描述的細胞滅活的全肉湯或組合物，可減少用于發(fā)酵微生物的補充氮源的量和/或類型。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可降低用于發(fā)酵微生物生長所需的酵母提取物、蛋白胨和/或尿素的量。在一些實施方案中，如本文描述的用于在發(fā)酵微生物中生產(chǎn)有機物質(zhì)的方法缺乏或基本上不含用于發(fā)酵微生物的補充氮源和/或營養(yǎng)源。在一些實施方案中，方法和組合物缺乏或基本上不含酵母提取物、蛋白胨和/或尿素。本領域技術人員理解，本發(fā)明的方法和組合物可以無或基本上不含補充氮源，但是痕量的氮源和/或營養(yǎng)源可作為雜質(zhì)存在或以不實質(zhì)性增加全發(fā)酵肉湯的營養(yǎng)值的量加入發(fā)酵微生物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過同時糖化和發(fā)酵產(chǎn)生有機物質(zhì)的方法。方法包括在缺乏補充氮源的情況下組合纖維素物料(例如預處理的纖維素物料)、如本文描述的含有一種或多種能夠水解所述纖維素物料的酶(例如外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、 半纖維素酶和/或β-葡糖苷酶)的細胞滅活的全肉湯或組合物、和發(fā)酵微生物。在有助于纖維素水解成葡萄糖和/或半纖維素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)和有助于葡萄糖和/或半纖維素糖轉(zhuǎn)化為有機物質(zhì)的條件下孵育纖維素物料、細胞滅活的全肉湯或組合物、和發(fā)酵微生物。在一些實施方案中，和使用含有以重量計約1. 4%醋酸和約0. 22% 苯甲酸的細胞滅活的全肉湯或組合物的方法相比，有機物質(zhì)的產(chǎn)量增加至少約50%。在一個實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物，有機物質(zhì)是乙醇，并且和使用含有以重量計約 1. 4%醋酸和約0. 22%苯甲酸的細胞滅活的全肉湯或組合物的方法相比，乙醇的產(chǎn)量增加至少約10倍。在一個實施方案中，使用含有約1000至約2000，約1500至約2500，約2200 至約觀00，或約2500CMC U/g內(nèi)切葡聚糖酶活性和約450至約775，約525至約775，約400 至約800，或約650pNPG U/g β -葡糖苷酶活性、以重量計約0. 2 %至約1 %，約0. 2 %至約0. 5%，或約0.的醋酸、以重量計約0. 2%至約0. 5%，或約0. 22%的苯甲酸(或約 0.沈％苯甲酸鈉)、ρΗ為約3. 9至約4. 3，約3. 5至約4. 5，約4至約5，約4. 5至約5. 5，約 4. 8至約4. 2，或約4的細胞滅活的全肉湯。5. 6試劑盒本發(fā)明也提供試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含含有如本文描述的有機酸組合的細胞滅活的全肉湯或組合物。提供了合適的包裝。如本文使用的，“包裝”是指，通常系統(tǒng)使用的并能夠?qū)⑷绫疚拿枋龅脑噭┖薪M分容納在固定邊界內(nèi)的固體基質(zhì)、材料或容器。試劑盒也可含有使用細胞滅活的全肉湯或組合物的說明書。例如，可提供在水解纖維素底物的方法中使用細胞滅活的全肉湯或組合物的說明書、或在如本文描述的在發(fā)酵微生物中生產(chǎn)有機物質(zhì)的方法中使用的說明書。可以以印刷的形式或以電子介質(zhì)的形式例如軟盤、⑶或DVD，或以可得到該說明書的網(wǎng)站地址的形式，提供說明書。5. 7具體實施方案在一個方面，本發(fā)明提供了殺死發(fā)酵培養(yǎng)物中的細胞的方法。方法包括使在培養(yǎng)基中含有細胞的發(fā)酵培養(yǎng)物接觸含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽和含有6個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽。在一個實施方案中，第一有機酸的濃度是以重量計約 0. 2 %至約1 %，第二有機酸的濃度是以重量計約0. 04 %至約0. 3 %。在一個實施方案中，第一有機酸的濃度是以重量計約0. 2%至約0. 5%，第二有機酸的濃度是以重量計約0. 2%至約0. 5%。以足以實現(xiàn)基本上完全的細胞殺死的溫度和ρΗ和時間，進行該方法，由此產(chǎn)生細胞滅活的全肉湯。在一些實施方案中，時間是約8至約M小時，溫度是約30°C至約40°C， ρΗ是約3. 5至約4. 5，約3. 9至約4. 2，或約4至約4. 4。在一個實施方案中，時間是約M 小時，溫度是約40°C，pH是約4?；旧贤耆募毎麣⑺劳ǔＩ婕爸辽偌s410g，51og，61og， 71og，或81og的活細胞減少。在殺死細胞的方法的一些實施方案中，細胞是微生物細胞(即真菌或細菌)。在一些實施方案中，細胞是真菌細胞，例如絲狀真菌細胞。在一些實施方案中，細胞是絲狀真菌細胞，可以選自木霉屬、曲霉屬、青霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢霉屬和脈孢霉屬。在殺死細胞的方法的一些實施方案中，第一有機酸選自醋酸、甲酸或丙酸。在一個實施方案中，第一有機酸是醋酸。在一些實施方案中，第二有機酸選自苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、 4-甲基戊酸和苯乙酸。在一個實施方案中，第二有機酸是苯甲酸。在一些實施方案中，使用有機酸的鹽，例如苯甲酸鈉。在一個實施方案中，第一有機酸是以重量計約0.濃度的醋酸，第二有機酸是以重量計約0. 044%濃度的苯甲酸(或以重量計約0. 052%濃度的苯甲酸鈉)。在一個實施方案中，第一有機酸是以重量計約0.濃度的醋酸，第二有機酸是以重量計約0. 22%濃度的苯甲酸(或以重量計約0.濃度的苯甲酸鈉)。在殺死細胞的方法的一些實施方案中，細胞分泌至少一種目的酶至細胞外的培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，目的酶是重組表達的。在一些實施方案中，細胞分泌至少一種選自外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶和β -葡糖苷酶的目的酶。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過本文描述的任何殺死細胞的方法產(chǎn)生的細胞滅活的全肉湯。在一個實施方案中，細胞滅活的全肉湯含有一種或多種在殺死細胞前由細胞分泌至細胞外培養(yǎng)基中的酶。在一些實施方案中，細胞滅活的全肉湯含有在細胞外培養(yǎng)基中的至少一種選自外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶和β-葡糖苷酶的酶。在一些實施方案中，細胞滅活的全肉湯含有約1000至約2000，約1500至約2500，約2200至約 2800,或約2500CMC U/g內(nèi)切葡聚糖酶活性和約450至約775，約525至約775，約400至約 800，或約650pNPG U/g β-葡糖苷酶活性。在一個實施方案中，組合物含有約2200至約 2800CMC U/g內(nèi)切葡聚糖酶活性和約450至約775pNPG U/g β -葡糖苷酶活性、和約3. 9至約4. 3的ρΗ。在一些實施方案中，與使用含有以重量計約1.4%醋酸和約0.22%苯甲酸的細胞滅活的全肉湯的方法相比，由發(fā)酵微生物產(chǎn)生的有機物質(zhì)增加至少約50%。在一個實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物。在一個實施方案中，與使用含有以重量計約1.4%醋酸和約0. 22%苯甲酸的細胞滅活的全肉湯的方法相比，由發(fā)酵產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生的乙醇增加至少約10倍。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽和含有6個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽、和目的酶的組合物。在一些實施方案中，組合物也含有已殺死的細胞和培養(yǎng)基，其中細胞在接觸第一和第二有機酸之前在該培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)生目的酶。在一個實施方案中，第一有機酸以約0.2%至約重量的濃度存在于組合物中，第二有機酸以約0. 04%至約0. 3 %重量的濃度存在。在一個實施方案中，第一有機酸以約0. 2%至約0. 5%重量的濃度存在于組合物中，第二有機酸以約0. 2%至約0. 5% 重量的濃度存在。在一些實施方案中，第一有機酸選自醋酸、甲酸或丙酸。在一個實施方案中，第一有機酸是醋酸。在一些實施方案中，第二有機酸選自苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸和苯乙酸。在一個實施方案中，第二有機酸是苯甲酸。在一些實施方案中，使用有機酸的鹽，例如苯甲酸鈉。在一個實施方案中，第一有機酸是以重量計約0.濃度的醋酸，第二有機酸是以重量計約0. 044%濃度的苯甲酸(或以重量計約0. 052%濃度的苯甲酸鈉)。 在一個實施方案中，第一有機酸是以重量計約0.濃度的醋酸，第二有機酸是以重量計約0.22%濃度的苯甲酸(或以重量計約0. %濃度的苯甲酸鈉)。在一些實施方案中，組合物含有一種或多種選自外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶和β -葡糖苷酶的酶。 在一個實施方案中，組合物含有約1000至約2000，約1500至約2500，約2200至約觀00，或約2500CMC U/g內(nèi)切葡聚糖酶活性和約450至約775，約525至約775，約400至約800，或約650pNPG U/g β -葡糖苷酶活性。在一些實施方案中，ρΗ是約3. 9至約4. 3，約3. 5至約 4. 5，約4至約5，約4. 5至約5. 5，約4. 8至約5. 2，或約4。在一個實施方案中，組合物含有約2200至約^OOCMC U/g內(nèi)切葡聚糖酶活性和約450至約775pNPG U/g β -葡糖苷酶活性。以及約3. 9至約4. 3的ρΗ。在另一個方面，本發(fā)明提供了水解纖維素物料的方法，包括使纖維素物料接觸通過如本文描述的殺死細胞的方法產(chǎn)生的細胞滅活的全肉湯、或接觸包含含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽、含有6個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽、和至少一種目的酶的如本文描述的組合物，其中細胞滅活的全肉湯或組合物為有效地引起纖維素物料被細胞滅活的全肉湯或組合物中的一種或多種酶酶促水解的量。在一些實施方案中，使用的組合物還包括培養(yǎng)基和已殺死的細胞，其中細胞在接觸第一和第二有機酸之前在該培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)生目的酶。在一些實施方案中，纖維素物料是植物生物質(zhì)物質(zhì)。在一個實施方案中，纖維素物料是木質(zhì)素纖維素物質(zhì)。在一些實施方案中，預處理纖維素物料以增強酶促水解。本發(fā)明也提供用通過如本文描述的殺死細胞的方法產(chǎn)生的細胞滅活的全肉湯、或用如本文描述的包含含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽、含有6個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽、至少一種目的酶和任選地發(fā)酵培養(yǎng)基及已殺死的細胞的組合物進行水解而產(chǎn)生的、水解的纖維素物料。在另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生有機物質(zhì)的方法。方法包括將生產(chǎn)有機物質(zhì)的微生物在培養(yǎng)基中在水解的纖維素物料存在的情況下在適于該微生物產(chǎn)生所述有機物質(zhì)的條件下進行發(fā)酵，其中所述水解的纖維素物料通過用由如本文描述的殺死細胞的方法產(chǎn)生的細胞滅活的全肉湯、或用如本文描述的包含含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽、 含有6個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽、至少一種目的酶和任選地發(fā)酵培養(yǎng)基及已殺死的細胞的組合物進行水解而產(chǎn)生。在一個實施方案中，微生物是產(chǎn)乙醇微生物，有機物質(zhì)是乙醇。在一個實施方案中，和用下述細胞滅活的全肉湯或組合物水解纖維素物料的方法相比，在培養(yǎng)基中的有機物質(zhì)的濃度增加至少約50%，其中所述細胞滅活的全肉湯或組合物，除了含有以重量計約1.4%的醋酸和約0. 22%的苯甲酸外，與在本方法中使用的細胞滅活的全肉湯或組合物相比含有類似、基本上相同或完全相同的成分。在一個實施方案中，和使用含有以重量計約1. 4%的醋酸和約0. 22%的苯甲酸的細胞滅活的全肉湯或組合物的方法相比，由發(fā)酵產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生的乙醇增加至少約10倍。在一些實施方案中，纖維素物料的酶促水解和微生物的發(fā)酵同時進行。在其他實施方案中，纖維素物料的酶促水解在微生物發(fā)酵之前發(fā)生。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過同時糖化發(fā)酵產(chǎn)生有機物質(zhì)的方法。方法包括 (a)在缺乏補充氮源的情況下組合纖維素底物、通過如本文描述的殺死細胞的方法產(chǎn)生的細胞滅活的全肉湯或如本文描述的包含含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽、含有6 個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽、至少一種目的酶和任選地發(fā)酵培養(yǎng)基及已殺死的細胞的組合物、和發(fā)酵微生物；在有助于纖維素水解成葡萄糖和/或半纖維素糖(例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖)和有助于葡萄糖和/或半纖維素轉(zhuǎn)化成有機物質(zhì)的條件下在培養(yǎng)基中孵育纖維素底物、細胞滅活的全發(fā)酵肉湯或組合物、和發(fā)酵微生物，其中和用下述細胞滅活的全肉湯或組合物水解纖維素物料的方法相比，在培養(yǎng)基中的有機物質(zhì)的濃度增加至少約50%，所述細胞滅活的全肉湯或組合物，與在本方法中使用的細胞滅活的全肉湯或組合物相比，除了含有以重量計約1.4%的醋酸和約0. 22%的苯甲酸外，含有類似、基本上相同或完全相同的成分。在一個實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物，有機物質(zhì)是乙醇。在一個實施方案中，和使用含有以重量計約1. 4%的醋酸和約0. 22%的苯甲酸的細胞滅活的全肉湯或組合物的方法相比，由發(fā)酵產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生的乙醇增加至少約10倍。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生有機物質(zhì)的反應組合物。反應組合物含有纖維素底物、通過如本文描述的殺死細胞的方法產(chǎn)生的細胞滅活的全肉湯或如本文描述的包含含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽、含有6個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽、至少一種目的酶和任選地發(fā)酵培養(yǎng)基和已殺死的細胞的組合物、和在培養(yǎng)基中的發(fā)酵微生物的混合物。反應組合物基本上不含補充氮源，并且和用下述細胞滅活的全肉湯或組合物水解纖維素物料的方法相比，在培養(yǎng)基中的有機物質(zhì)的濃度增加至少約50%，其中， 所述細胞滅活的全肉湯或組合物，除了含有以重量計約1.4%的醋酸和約0. 22%的苯甲酸外，與在本方法中使用的細胞滅活的全肉湯或組合物相比含有類似、基本上相同或完全相同的成分。在一個實施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物，有機物質(zhì)是乙醇。在一個實施方案中，和含有以重量計約1. 4%的醋酸和約0. 22%的苯甲酸的細胞滅活的全肉湯或組合物的反應組合物相比，由發(fā)酵產(chǎn)乙醇生物產(chǎn)生的乙醇增加至少約10倍。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含在包裝中的通過如本文描述的殺死細胞的方法產(chǎn)生的細胞滅活的全肉湯或如本文描述的包含含有1至5個碳原子的第一有機酸或其鹽、含有6個或更多個碳原子的第二有機酸或其鹽、至少一種目的酶和任選地發(fā)酵培養(yǎng)基和已殺死的細胞的組合物。在一些實施方案中，試劑盒還包含在用發(fā)酵微生物制備有機物質(zhì)的方法中使用的說明書，例如在用產(chǎn)乙醇微生物和以試劑盒中的細胞滅活的全肉湯或組合物水解的纖維素底物制備乙醇的方法中使用的說明書。以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。6.實施例實施例1殺死細胞的條件真菌細胞計數(shù)的確定用無菌水連續(xù)稀釋等分試樣的里氏木霉150小時發(fā)酵物至IO3的稀釋系數(shù)。然后將100 μ 1稀釋物樣品在購自DifCO (REF#213200)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上涂板并在 25°C孵育。然后在孵育3天后計數(shù)孵育的PDA板上的菌落形成單位(CFU)。通過瓊脂上存在的分開的生長的單細胞群來表征CFU，在瓊脂上存在的CFU的數(shù)乘以涂板的稀釋度就是在原始樣品中存在的CFU數(shù)。將黑曲霉和繩狀青霉的分開的孢子懸浮物在購自DifCO (REF#213200)的PDA上涂板并在25°C孵育3天。然后在無菌情況下將含有黑曲霉和繩狀青霉菌落的PDA的部分分別地移出，并分別置于含有由5g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖組成的酵母提取物葡萄糖 (YEG)培養(yǎng)基的分開搖瓶中。然后在設定為200rpm和33°C的旋轉(zhuǎn)搖床上孵育搖瓶3天。移出生長培養(yǎng)物樣品并用無菌水連續(xù)稀釋至IO4的稀釋系數(shù)。然后將100 μ 1稀釋物樣品在 PDA上涂板并在25°C孵育。然后計數(shù)孵育的PDA板上的CFU。在不同溫度下用醋酸和苯甲酸鈉殺死里氏木霉細胞將里氏木霉發(fā)酵肉湯分成5份等分試樣并如下表1所述配制。然后使用10% (w/ w)硫酸將配制的肉湯調(diào)整為pH 4.0。然后將每份制劑再分成3份等分試樣，一份等分試樣在10°C孵育，另一份等分試樣在孵育，第三份等分試樣在40°C孵育。孵育M小時后使用10% (w/w)氫氧化鈉將所有等分試樣調(diào)整為pH4. 8。然后用無菌水將每份等分試樣連續(xù)稀釋，在PDA上涂板并在25°C孵育。然后計數(shù)孵育的PDA板上的CFU。表 1
里氏木霉發(fā)酵肉湯的配制描述
權利要求
1.一種制備發(fā)酵肉湯制劑的方法，其包括孵育第一混合物，所述第一混合物包含(a)一種或多種發(fā)酵肉湯，(b)以重量計所述混合物的0.至15%的量的第一有機酸成分，其包含至少一種1-5 碳有機酸和/或其鹽，和(c)以重量計所述混合物的0.025%至5%的量的第二有機酸成分，其包含至少一種6 碳或更多碳有機酸和/或其鹽，其中孵育時間和條件導致所述一種或多種發(fā)酵肉湯中至少41og的活細胞減少，由此產(chǎn)生發(fā)酵肉湯制劑。
2.權利要求1的方法，其中所述第一有機酸成分為以重量計所述第一混合物的0.2% 至 1%，0. 2%至 0. 5%，0. 至 10%，0. 25%至 5%，或0. 3%至 3%的量。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述第二有機酸成分為以重量計所述第一混合物的 0. 04%至 3%，0. 2%至 0. 5%,0. 至 1%，0. 25%至 5%，或0. 3%至 3%的量。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述時間是8小時至36小時。
5.權利要求2的方法，其中所述時間是20小時至28小時。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述條件包括20°C至50°C的溫度。
7.權利要求6的方法，其中所述條件包括25°C至40°C的溫度。
8.權利要求7的方法，其中所述條件包括至33°C的溫度。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述條件包括3.5至5的pH。
10.權利要求9的方法，其中所述條件包括4至4.7的pH。
11.權利要求10的方法，其中所述條件包括4.2至4. 5的pH。
12.權利要求1至11中任一項的方法，其中，以導致所述一種或多種發(fā)酵肉湯中活細胞數(shù)量的至少51og減少、61og減少、71og減少或Slog減少的時間和條件，進行所述孵育。
13.權利要求1至12中任一項的方法，其中所述活細胞的減少，與接受所述條件的第二混合物相比，高至少0. 5倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍，其中所述第二混合物只包含所述第一有機酸成分和所述第二有機酸成分中的一種，其量達到在所述第一混合物中的第一和第二有機酸成分的總重量百分比。
14.權利要求1至13中任一項的方法，其中所述細胞是真菌細胞。
15.權利要求14的方法，其中所述真菌細胞是絲狀真菌細胞。
16.權利要求15的方法，其中所述絲狀真菌細胞來自木霉屬、曲霉屬、青霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢霉屬或脈孢霉屬。
17.權利要求1至16中任一項的方法，其中第一有機酸成分包含下述或由下述組成 醋酸、醋酸鹽、甲酸、甲酸鹽、丙酸、丙酸鹽、或前述兩種或更多種的混合物。
18.權利要求17的方法，其中第一有機酸成分包含醋酸和/或其鹽，或由醋酸和/或其鹽組成。
19.權利要求1至18中任一項的方法，其中第二有機酸成分包含下述或由下述組成 苯甲酸、苯甲酸鹽、環(huán)己烷羧酸、環(huán)己烷羧酸鹽、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸鹽、苯乙酸、苯乙酸鹽、或前述兩種或更多種的混合物。
20.權利要求19的方法，其中第二有機酸成分包含苯甲酸和/或其鹽，或由苯甲酸和/ 或其鹽組成。
21.權利要求1至20中任一項的方法，其中所述第一有機酸成分包含所述1-5碳有機酸的鈉、鉀、鈣或鎂鹽，和/或其中所述第二有機酸成分包含所述6碳或更多碳有機酸的鈉、 鉀、鈣或鎂鹽。
22.權利要求1至16中任一項的方法，其中所述第一有機酸成分包含以重量計 0. 2% -0. 4%濃度的醋酸和第二有機酸成分包含以重量計0. 2% -0. 4%濃度的苯甲酸鈉。
23.權利要求22的方法，其中所述時間是M小時，所述條件包括40°C的溫度，和4至 4. 6 的 pH。
24.權利要求1至23中任一項的方法，其中所述一種或多種發(fā)酵肉湯中的至少一種含有由所述細胞分泌的一種或多種蛋白質(zhì)。
25.權利要求對的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種由所述細胞重組表達。
26.權利要求M或權利要求25的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種是酶。
27.權利要求沈的方法，其中所述酶是外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶或 β-葡糖苷酶。
28.權利要求沈的方法，其中所述一種或多種發(fā)酵肉湯中的至少一種含有由細胞重組表達和分泌的多種酶。
29.權利要求觀的方法，其中所述多種酶各自是外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶或β-葡糖苷酶。
30.權利要求1至四中任一項的方法，其中所述條件導致發(fā)酵肉湯制劑具有所述一種或多種發(fā)酵肉湯的酶活性的至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %或至少 98%。
31.權利要求1至30中任一項的方法，其中蛋白質(zhì)占所述第一混合物的5至15重量百分比。
32.權利要求1至31中任一項的方法，還包括在所述孵育期中對所述第一混合物加入 PH調(diào)節(jié)劑的步驟。
33.權利要求32的方法，其中所述pH調(diào)節(jié)劑是磷酸。
34.權利要求32的方法，其中所述pH調(diào)節(jié)劑是硫酸。
35.權利要求32的方法，其中所述pH調(diào)節(jié)劑是氫氧化鈉。
36.權利要求1至35中任一項的方法，其中所述第一混合物還包含一種或多種抗微生物劑。
37.權利要求36的方法，其中所述一種或多種抗微生物劑是以重量計所述第一混合物的0. 0005至0. 05%的量。
38.權利要求37的方法，其中所述一種或多種抗微生物劑是以重量計所述第一混合物的0. 001至0. 025%的量。
39.權利要求37或權利要求38的方法，其中抗微生物劑包含含有異-α-酸、四-異 α酸和/或β酸的啤酒花提取物。
40.權利要求1至39中任一項的方法，還包括在所述孵育步驟之前制備所述第一混合物。
41.權利要求40的方法，其中通過如下程序制備所述第一混合物，所述程序包括組合一種或多種發(fā)酵肉湯和至少一種1-5碳有機酸和/或其鹽，至少一種6碳或更多碳有機酸和/或其鹽、和任選地一種或多種其他試劑。
42.權利要求41的方法，其中所述一種或多種其他試劑包括pH調(diào)節(jié)劑和/或抗微生物劑。
43.通過權利要求1至42中任一項的方法得到的或可通過權利要求1至42中任一項的方法得到的發(fā)酵肉湯制劑。
44.權利要求43的發(fā)酵肉湯制劑，其包含一種或多種選自外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶和β-葡糖苷酶的細胞外酶。
45.權利要求43或權利要求44的發(fā)酵肉湯制劑，其具有2200至^OOCMCU/g的內(nèi)切葡聚糖酶活性和525至775pNPG U/g的β -葡糖苷酶活性。
46.權利要求43或權利要求44的發(fā)酵肉湯制劑，其具有2200至3200CMCU/g的內(nèi)切葡聚糖酶活性，300至800pNPG U/g的β -葡糖苷酶活性，和2000至5000ABX U/g的木聚糖酶活性。
47.一種組合物，其包含(a) —種或多種包含細胞的發(fā)酵肉湯；(b)以重量計所述組合物的0. 2%至1. 5%的量的、包含至少一種1-5碳有機酸和/或其鹽的第一有機酸成分；(c) 以重量計所述組合物的0. 04%至0. 6%的量的、包含至少一種6碳或更多碳有機酸和/或其鹽的第二有機酸成分。
48.權利要求47的組合物，其中所述第一有機酸成分是以重量計所述組合物的0.2% 至 1%，0. 2%至 0. 5%，0. 至 10%，0. 25%至 5%、或0. 3%至 3%的量。
49.權利要求47或權利要求48的組合物，其中所述第二有機酸成分是以重量計所述組合物的 0. 04%至 3%，0. 2%至 0. 5%,0. 至 1%，0. 25%至 5%，或0. 3%至 3%的量。
50.權利要求47至權利要求49中任一項的組合物，其中所述細胞主要或完全是非存活細胞。
51.權利要求50的組合物，其中如果在所述組合物中存在活細胞，那么在所述組合物中非存活細胞與活細胞的比例是至少10 1，至少50 1，至少100 1，至少1000 1， 至少 10，000 1，至少 100,000 1 或至少 1，000，000 1。
52.權利要求47至51中任一項的組合物，其具有3.5至5的pH。
53.權利要求52的組合物，其具有4至4.7的pH。
54.權利要求53的組合物，其具有4.2至4. 5的pH。
55.權利要求47至M中任一項的組合物，其中所述細胞包含真菌細胞。
56.權利要求55的組合物，其中所述真菌細胞是絲狀真菌細胞。
57.權利要求56的組合物，其中所述絲狀真菌細胞來自木霉屬、曲霉屬、青霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢霉屬或脈孢霉屬。
58.權利要求47至57中任一項的組合物，其中所述第一有機酸成分包含下述或由下述組成醋酸、醋酸鹽、甲酸、甲酸鹽、丙酸、丙酸鹽、或前述兩種或更多種的混合物。
59.權利要求58的組合物，其中所述第一有機酸成分包含醋酸和/或其鹽，或由醋酸和 /或其鹽組成。
60.權利要求47至59中任一項的組合物，其中所述第二有機酸成分包含下述或由下述組成苯甲酸、苯甲酸鹽、環(huán)己烷羧酸、環(huán)己烷羧酸鹽、4-甲基戊酸、4-甲基戊酸鹽、苯乙酸、 苯乙酸鹽、或前述兩種或更多種的混合物。
61.權利要求60的組合物，其中所述第二有機酸成分包含苯甲酸和/或其鹽，或由苯甲酸和/或其鹽組成。
62.權利要求47至61中任一項的組合物，其中所述第一有機酸成分包含所述1-5碳有機酸的鈉、鉀、鈣或鎂鹽和/或其中所述第二有機酸成分包含所述6碳或更多碳有機酸的鈉、鉀、鈣或鎂鹽。
63.權利要求47至57中任一項的組合物，其中所述第一有機酸成分包含以重量計 0. 2% -0. 4%濃度的醋酸和第二有機酸成分包含以重量計0. 2% -0. 4%濃度的苯甲酸鈉。
64.權利要求47至63中任一項的組合物，其包含由所述細胞分泌的一種或多種蛋白質(zhì)。
65.權利要求64的組合物，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種由所述細胞重組表達。
66.權利要求64或權利要求65的組合物，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種是酶。
67.權利要求66的組合物，其中所述酶是外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶或 β-葡糖苷酶。
68.權利要求64的組合物，其含有由細胞重組表達和分泌的多種酶。
69.權利要求68的組合物，其中所述多種酶各自是外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、半纖維素酶或葡糖苷酶。
70.權利要求47至69中任一項的組合物，其中蛋白質(zhì)占所述組合物的5至15重量百分比。
71.權利要求47至70中任一項的組合物，其還包含一種或多種抗微生物劑。
72.權利要求71的組合物，其中所述一種或多種抗微生物劑是以重量計所述組合物的 0. 0005 至 0. 05%的量。
73.權利要求72的組合物，其中所述一種或多種抗微生物劑是以重量計所述組合物的 0. 001 至 0. 025%的量。
74.權利要求72或權利要求73的組合物，其中抗微生物劑包括含有異-α-酸、四-異 α酸和/或β酸的啤酒花提取物。
75.—種試劑盒，其包含(a)包裝和(b)權利要求43或45中任一項的發(fā)酵肉湯制劑或權利要求47至74中任一項的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有有機酸和/或有機酸鹽的發(fā)酵肉湯制劑、和制備和使用所述制劑的方法。
文檔編號C12N9/42GK102325872SQ201080008621
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月19日 優(yōu)先權日2009年2月20日
發(fā)明者A·凱利, J·麥克勞克林, T·T·黃 申請人:丹尼斯科美國公司