專(zhuān)利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的改進(jìn)方法。更具體的，其涉及含有豆粕 (soybean meal)和其它用于促進(jìn)脂肪生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基組合物，更具體的，涉及在液體以及固體培養(yǎng)基中由破囊壺菌(Thraustochytriales)分批發(fā)酵生產(chǎn)的多不飽和脂肪酸。本發(fā)明還涉及發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的新方法。
背景技術(shù)：
必需脂肪酸是指那些在有機(jī)體的健康中必不可少，但動(dòng)物/人體又不能合成，而必須通過(guò)食物來(lái)源提供的脂肪酸。ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸即屬于這類(lèi)脂肪酸，它們?cè)诖竽X功能以及正常生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這兩種必需脂肪酸屬于多不飽和脂肪酸(PUFA)，在刺激皮膚和毛發(fā)生長(zhǎng)、維持骨骼健康、調(diào)節(jié)新陳代謝和保持生殖能力中通常是必需的。在ω-3的位置具有一個(gè)碳-碳雙鍵的多不飽和脂肪酸家族被稱為ω-3脂肪酸。 分別在18、20或22個(gè)碳原子碳鏈的順式構(gòu)型中具有3、5或6個(gè)雙鍵的α -亞麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，被認(rèn)為是對(duì)人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)具有重要作用的ω-3脂肪酸。在ω-3脂肪酸中，長(zhǎng)鏈-PUFA，也縮寫(xiě)成LC-PUFA，按照定義，是指鏈長(zhǎng)超過(guò)18 個(gè)碳原子且含有兩個(gè)或更多雙鍵的脂肪酸。一種在嬰兒營(yíng)養(yǎng)中具有重要作用的脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。這種脂肪酸在人類(lèi)乳汁中存在的濃度很低。足月兒和早產(chǎn)兒都可以從各自的必需脂肪酸中合成LC-PUFA，但爭(zhēng)議集中在母乳喂養(yǎng)的嬰兒比配方奶喂養(yǎng)的嬰兒具有更高的DHA血漿濃度的事實(shí)上。該信息被解讀為意味著配方奶喂養(yǎng)的嬰兒不能合成足夠的DHA以滿足持續(xù)的需求(參見(jiàn)“A shore-based diet rich in energy and ^brain-specifnutrients made human brain evolution possible”(“富含能量的岸基飲食和腦特異性營(yíng)養(yǎng)品使人類(lèi)大腦進(jìn)化成為可能”) Proceedings of the Ghent Conference on Water and Human Evolution by Stephen C. Cunnane Department of Nutritional Sciences, University of Toronto, in http:// users.ugent. be/ mvaneech/Cunnane. html) 0美國(guó)國(guó)立健康研究院公布了推薦的脂肪酸每日攝入量。根據(jù)公布，EPA與DHA推薦的攝入量為650mg/d，α -亞麻酸為2. 22g/d和亞麻酸為4. 44g/d，且飽和脂肪推薦攝入量為不超過(guò)總熱量攝入量的8%或約18g/d。EPA和DHA的唯一可行的常規(guī)來(lái)源是魚(yú)，且僅是被稱為“油魚(yú)”特定種類(lèi)的魚(yú)。為了滿足推薦的DHA每日需求，美國(guó)心臟協(xié)會(huì)的推薦書(shū)(http://www. americanheart. org/ presenter, jhtml ？ identifier = 4632)發(fā)布了一個(gè)科學(xué)公告“我們建議每周至少食用2 次魚(yú)(尤其是富含脂肪的魚(yú))?！缓镜聂~(yú)類(lèi)，如鯖魚(yú)、湖紅點(diǎn)鮭、鯡魚(yú)、沙丁魚(yú)、長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)和鮭魚(yú)富含兩種ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)?！?我們還推薦食用豆腐和大豆、油菜籽、核桃和亞麻子等其它形式以及它們的油。它們含有 α-亞麻酸(LNA)，其可以在體內(nèi)變成ω-3脂肪酸。然而，這種修飾的程度是適度的并存在有爭(zhēng)議。需要更多的研究來(lái)表明α-亞麻酸和心臟病之間的因果關(guān)系。”然而，幾乎沒(méi)有一個(gè)可行的來(lái)源以滿足潛在的需求，因?yàn)樾枨蟾哂谕ㄟ^(guò)食用油魚(yú)獲得的補(bǔ)給。極少數(shù)美國(guó)人能為自己得到這種配額，原因主要有兩個(gè)，可獲得性和成本。因此，從生態(tài)可持續(xù)性的觀點(diǎn)來(lái)看，魚(yú)不是膳食DHA的可行供給來(lái)源。此外，已知魚(yú)含有高含量的汞，而這也限制了它的攝入量，并禁止兒童和孕婦食用。進(jìn)一步地，魚(yú)類(lèi)還含有約六倍量的ω-6脂肪酸，從而抵消了 DHA的治療作用。鑒于傳統(tǒng)的DHA來(lái)源不足，海洋原生生物已經(jīng)成為焦點(diǎn)，通過(guò)其異養(yǎng)生產(chǎn)DHA作為 DHA的替代來(lái)源。因此，改良這些有機(jī)體(organism)的異養(yǎng)生產(chǎn)效率來(lái)生產(chǎn)DHA是非常理
術(shù)目的現(xiàn)有技術(shù)US5340742要求保護(hù)一種培養(yǎng)破囊壺菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌 (Schizochytrium)及其混合物的方法，其培養(yǎng)基中含有小于約3克氯化物/升所述培養(yǎng)基、 碳源、氮源、微量營(yíng)養(yǎng)素和非氯化物鈉鹽，溫度約5°C至約48°C，pH值約5. O至約11. O。Kyle等人在USM07957中描述了一種方法，其中單細(xì)胞食用油含有至少約20%甘油三酯形式的二十二碳六烯酸(DHA)，該方法包括在含有營(yíng)養(yǎng)液的通氣發(fā)酵罐中培養(yǎng)能產(chǎn)生所述單細(xì)胞油的溝鞭藻綱(Dinophyceae)異養(yǎng)微藻，所述營(yíng)養(yǎng)液具有限制性的氮源和至少約10%空氣飽和水平的氧水平，并繼續(xù)培養(yǎng)至每升營(yíng)養(yǎng)液的細(xì)胞密度達(dá)到至少約10克生物質(zhì)(biomass)。Kumar等人在US 6410282中描述了一種在破囊壺菌屬(Thraustochytrid)真菌中能增加二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸水平的方法，其通過(guò)在培養(yǎng)基中于25°C 30°C培養(yǎng)破囊壺菌屬真菌菌株Ulkenia radiata Gaertner 2至5天，該菌株保藏在日本生物科學(xué)與人類(lèi)技術(shù)國(guó)立研究所，登記號(hào)為No. AB22115 ；將破囊壺菌屬真菌菌株接種于含有0. 1至
聚乙烯吡咯烷酮的培養(yǎng)基中，在25°C至30°C培養(yǎng)3天；離心收集細(xì)胞，從細(xì)胞中提取含量增加的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。US6451567描述了一種通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)廣鹽性微生物來(lái)生產(chǎn)脂類(lèi)的方法，其中所述廣鹽性微生物每天每升發(fā)酵培養(yǎng)基能生產(chǎn)約1. 08克長(zhǎng)鏈ω-3脂肪酸。培養(yǎng)基由40克糖/升發(fā)酵培養(yǎng)基組成，鈉離子濃度為發(fā)酵培養(yǎng)基中60%海水。該方法進(jìn)一步公開(kāi)廣鹽性微生物的指數(shù)增長(zhǎng)率在25°C下和30°C下分別為每天至少約5倍和每天7倍。Barclay在US6566123中報(bào)道了包括選自破囊壺菌目(Thraustochytriales)微生物菌群的生物質(zhì)，其中所述微生物菌群通過(guò)如下方法產(chǎn)生在約5°C至約48°C的溫度下，在含有小于約3克氯化物/升所述培養(yǎng)基、碳源、氮源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及非氯化物鈉鹽的培養(yǎng)基中，使所述微生物菌群生長(zhǎng)。Bailey等人在US6607900中描述了以破囊壺菌目的微生物進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)含多烯脂肪酸的脂類(lèi)的方法，產(chǎn)生至少約20%其干細(xì)胞重作為脂類(lèi)，該方法包括向包括所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以足以使所述發(fā)酵培養(yǎng)基的生物質(zhì)密度增加到每升至少約 100克于細(xì)胞重的速率，加入無(wú)酒精碳源和氮源，其中所述方法包括生物質(zhì)密度增加階段和脂類(lèi)生產(chǎn)階段，其中在所述生物質(zhì)密度增加階段，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解氧水平在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中至少約為4%的飽和度，且在所述脂類(lèi)生產(chǎn)階段，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解氧水平在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中小于約3%的飽和度。
Barclay在US 7005280中報(bào)道了一種用于生產(chǎn)脂類(lèi)的方法，包括(a)使破囊壺菌目微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；以及(b)從所述微生物中提取脂類(lèi)，其中所述脂類(lèi)含有作為C22 :6n-3 (DHA)的至少94. 0%重量的總ω-3脂肪酸。US7011962描述了一種生產(chǎn)脂類(lèi)的方法，通過(guò)使破囊壺菌目微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并從所述微生物中提取脂類(lèi)，其中所述脂類(lèi)至少約49%的總脂肪酸是ω-3脂肪酸；其中所述微生物在下列條件下生長(zhǎng)時(shí)其指數(shù)增長(zhǎng)率為每天至少約5. 5倍25°C下在軌道搖床上的搖瓶中于M-5培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的指數(shù)生長(zhǎng)期。將12ml含有指數(shù)生長(zhǎng)期所述微生物的培養(yǎng)基接種到含有50ml M-5培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，調(diào)整pH至7. 0，將所述搖瓶以 200rpm的轉(zhuǎn)速在軌道搖床上搖動(dòng)22. 75小時(shí)。Behrens在US7163811中描述了一種通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)溝鞭藻綱的異養(yǎng)微藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述培養(yǎng)基包括(a)氯離子濃度小于或等于約2g/ L;以及(b)鉀離子濃度大于或等于約0. 25g/L;其中，每IO9個(gè)微藻細(xì)胞生產(chǎn)至少約0. 04g DHA。US7022512要求保護(hù)一種選自下組的分離的微生物a)裂殖壺菌 (Schizochytrium)ATCC No. 20888 或其衍生菌株；b)裂殖壺菌 ATCC No. 20889 或其衍生菌株；c)破囊壺菌(Thraustochytrium)ATCCNo. 20890或其衍生菌株；d)破囊壺菌ATCC No. 20891或其衍生菌株；以及e)破囊壺菌ATCC No. 20892或其衍生菌株。破囊壺菌、裂殖壺菌及其混合物生長(zhǎng)在含有非氯化物鈉鹽尤其是硫酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并產(chǎn)生細(xì)胞集聚體(cell aggregate size)的微生物菌群，用于生產(chǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖用食品和包含破囊壺菌、裂殖壺菌及其混合物的食品，以及一種選自亞麻籽、油菜籽、大豆和鱷梨膳食的成分。這類(lèi)食品含有均衡的長(zhǎng)鏈和短鏈ω-3高度不飽和脂肪酸。US 2006(^86649指出，生產(chǎn)含有多烯脂肪酸特別是高度不飽和脂肪酸，如 C18 4n-3、C20 4n_6、C20 5n3、C22 5n_3、C22 5η_6 和 C22 6η_3 的微生物脂類(lèi)的成本一直很高，部分原因是含有高多烯脂肪酸的真核微生物的生長(zhǎng)密度有限。US 2006(^86649還指出，試圖在分批發(fā)酵中獲得高密度存在著一些困難。有限的氧供給在這些高細(xì)胞濃度和較高的溫度下需要實(shí)現(xiàn)高生產(chǎn)率是局限性之一。因此，需要一種在高濃度下生長(zhǎng)微生物的方法，這種高濃度仍然有利于增加含多烯脂肪酸的脂類(lèi)的產(chǎn)量。其進(jìn)一步指出，非常高密度的培養(yǎng)(大于約100g/L的微生物生物質(zhì)，特別是在商業(yè)模式下)，不會(huì)得到高產(chǎn)量的多不飽和脂肪酸，實(shí)際上可能會(huì)導(dǎo)致多烯脂肪酸含量的減少，并因此減少多烯脂肪酸的生產(chǎn)率， 部分原因是由于幾個(gè)因素，包括由于發(fā)酵培養(yǎng)基中微生物發(fā)育的高氧需求，導(dǎo)致保持高溶氧水平存在困難。其指出保持高溶氧水平的方法，包括增加通氣率和/或使用純氧代替空氣通氣和/或增加發(fā)酵罐中的攪拌速率，但是，它也指出，它們可能造成其他問(wèn)題，包括發(fā)酵罐中嚴(yán)重的泡沫問(wèn)題，微生物細(xì)胞破損導(dǎo)致脂類(lèi)釋放到發(fā)酵液中，在那里它們可能被氧化和/或被酶降解，最終轉(zhuǎn)化為基本上只含有非常少量多烯脂肪酸的脂類(lèi)。其

圖1提供的數(shù)據(jù)揭示了溶解氧水平在5至40%之間的各種濃度下獲得的DHA的生產(chǎn)率，溶解氧水平為5%時(shí)生產(chǎn)率為11. 3%至溶解氧水平為40%時(shí)生產(chǎn)率為5. 6。相應(yīng)的DHA g/L的數(shù)據(jù)分別為2. 0至1. 0。因此，US 20060286649氣餒地使用氧氣鼓泡和攪拌的方法提高發(fā)酵效率。此外，其還承認(rèn)(第00 段)當(dāng)向分批發(fā)酵方法中添加基質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生了大量碳源(例如每60g/L生物質(zhì)密度超過(guò)200g/L或以上)，對(duì)微生物有不利的影響。為了規(guī)避這些問(wèn)題，US 20060286649披露了一種新的方法來(lái)生產(chǎn)多烯脂肪酸，包括通過(guò)補(bǔ)料分批的方法實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞至少100g/L的高細(xì)胞密度，以增加生物質(zhì)密度，向其中增加少量的營(yíng)養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)該方法中不需要提高溶解氧的濃度就能達(dá)到高細(xì)胞密度，然后通過(guò)實(shí)際降低氧濃度最好到百分之零，切換到脂類(lèi)生產(chǎn)階段，導(dǎo)致增加多烯脂肪酸的產(chǎn)量。分批培養(yǎng)也有明顯的局限性， US 20060286649的實(shí)施例5得出結(jié)論，在一般情況下，多余的氮對(duì)發(fā)酵性能有負(fù)面影響，觀察到DHA的生產(chǎn)率顯著減少，因?yàn)槿狈ψ銐虻牡?，?huì)對(duì)可利用的碳有限制，分批方法限制了 DHA的生產(chǎn)率。因此，US 2006(^86649最后決定，排除了分批方法作為可行的方案用于高密度培養(yǎng)和利用破囊壺菌目提高DHA生產(chǎn)系統(tǒng)的生產(chǎn)率。他們發(fā)明了分批方法中允許增加增量的營(yíng)養(yǎng)物，而不需要含量非常高的溶解氧水平。據(jù)報(bào)道，在生物質(zhì)密度增加的階段，通過(guò)控制頂空的氧量保持氧濃度約為8%，這已經(jīng)足夠支持干生物質(zhì)密度的生產(chǎn)量在約IOOg/ L或更多，通過(guò)控制發(fā)酵培養(yǎng)基的攪拌速度足以支持細(xì)胞在補(bǔ)料分批模式下的生長(zhǎng)，但避免了細(xì)胞破損。特別是避免超過(guò)8%的溶解氧，從而避免上述指出的導(dǎo)致DHA產(chǎn)量降低的不利影響。然而，補(bǔ)料分批發(fā)酵方法在實(shí)際操作中優(yōu)化生產(chǎn)率和控制污染方面很繁瑣。分批方法比較容易控制和優(yōu)化，培養(yǎng)基組合物的發(fā)酵和接種只涉及一次操作。因此，有必要盡可能克服分批方法的已知限制。此外，還需要探討可替代的發(fā)酵方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過(guò)培養(yǎng)破囊壺菌(Thraustochytriales)實(shí)施異養(yǎng)發(fā)酵的新方法。本發(fā)明包括在高含氧條件下，由破囊壺菌生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其是通過(guò)(a)固態(tài)發(fā)酵，其中固體培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)噴入充足的無(wú)菌空氣，或通過(guò)(b)在深層發(fā)酵 (submerged fermentation)的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)保持溶解氧的飽和度大于8%，獲得大于2g DHA/升發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的各種實(shí)施方案概括如下。在一個(gè)深層發(fā)酵的實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括分批發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法包括分批發(fā)酵，其中，通過(guò)保持培養(yǎng)基中溶解氧水平至少20%，產(chǎn)量高于現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)分批發(fā)酵所獲得的產(chǎn)量，即獲得的DHA產(chǎn)量為1. 3g/L， 優(yōu)選大于3g/L，更優(yōu)選大于10g/L。在另一個(gè)方面，該方法包括通過(guò)采用一種或多種下列方法保持溶解氧水平至少 20%:包括(a)向培養(yǎng)基中噴入混有氧的空氣，(b)以SOOrpm的轉(zhuǎn)速攪拌培養(yǎng)基，可包括提高攪拌頭(agitation tip)速度至3. 2m/sec, (c)切換到氣體混合模式，其中將純氧與空氣混合并噴入發(fā)酵液中，以保持溶解氧的水平并在需要時(shí)阻止溶解氧低于目標(biāo)水平或者50% 左右或以上的飽和度。本發(fā)明的一個(gè)方面是單獨(dú)或組合利用上述方法來(lái)增加溶解氧的水平，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不良影響，并有助于保持高細(xì)胞密度，不引起細(xì)胞破碎。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括獲得生物質(zhì)密度為大于100g/L細(xì)胞干重，積累的DHA 為2g/L或優(yōu)選大于10g/L的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，獲得高產(chǎn)量的DHA，噴入的氧氣與空氣的比例為 60% 氧氣。本發(fā)明中使用的“噴入(sparged)” 一詞表示在壓力下泵入培養(yǎng)基中，形成大量和有力的微小氣泡流，使培養(yǎng)液與空氣氣泡良好地接觸，并形成良好的攪拌效果。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的分批發(fā)酵的方法進(jìn)一步包括在分批發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，向發(fā)酵液中添加還原糖至高達(dá)450g/L。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的分批發(fā)酵，其中添加無(wú)機(jī)氮或尿素氮，并補(bǔ)充添加來(lái)自含有氨基化合物的有機(jī)氮。所述含肽鍵的有機(jī)氮可以是富含蛋白或富含肽的來(lái)源或者氨基酸。所述富含蛋白的來(lái)源包括含有脫脂大豆粉的脫脂油渣餅。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括輔助添加消泡劑，包括食品級(jí)有機(jī)硅消泡劑。在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法可以是半連續(xù)方法，包括步驟(a)在第一發(fā)酵罐中， 使一批發(fā)酵達(dá)到其中微生物在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期處于活躍分裂狀態(tài)的點(diǎn)，(b)在第一發(fā)酵罐中保留一部分發(fā)酵液，其體積足以給下一批提供活躍分裂的接種物，無(wú)菌轉(zhuǎn)移其余的活性發(fā)酵液至第二反應(yīng)器中，(c)向第一反應(yīng)器中加入無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基以恢復(fù)其體積，并使第一反應(yīng)器進(jìn)行步驟(a)并重復(fù)該步驟至所需的次數(shù)，或任選地(i)允許步驟(d)平衡體積 (balance volumn)或(ii)通過(guò)向第一反應(yīng)器中加入無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基恢復(fù)其體積，使其完成進(jìn)一步的生長(zhǎng)和脂質(zhì)生產(chǎn)，所述脂質(zhì)將在結(jié)束該系列半連續(xù)生產(chǎn)時(shí)收獲，(d)為第二發(fā)酵罐中的發(fā)酵液提供培養(yǎng)條件，發(fā)揮其由于養(yǎng)分供給而受到限制的分裂潛力，從而生產(chǎn)DHA， (e)回收 DHA。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括上述連續(xù)發(fā)酵的方法，包括步驟(a)在第一發(fā)酵罐中，使一批發(fā)酵液達(dá)到其中微生物在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期處于活躍分裂狀態(tài)的點(diǎn)，(b)采取預(yù)防措施避免污染物進(jìn)入，開(kāi)始向第一發(fā)酵罐中加入無(wú)菌培養(yǎng)基，并允許無(wú)菌排出或移出相同體積的發(fā)酵液至第二發(fā)酵罐中，移出速率為第一反應(yīng)器的內(nèi)容物始終保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，(c)為第二批發(fā)酵罐中的發(fā)酵液提供培養(yǎng)條件，發(fā)揮其由于養(yǎng)分供給而受到限制的分裂潛力，從而生產(chǎn)DHA，(d)第二發(fā)酵罐達(dá)到其發(fā)酵能力后，從第二發(fā)酵罐中無(wú)菌排出或移出超過(guò)其能力的培養(yǎng)基，(e)立即回收或隔一段時(shí)間后回收DHA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括權(quán)利要求所述的固態(tài)發(fā)酵的方法，包括步驟 (a)通過(guò)添加剛夠用于濕潤(rùn)的水制備潤(rùn)濕但不流動(dòng)的固體基質(zhì)，其包括⑴含量為不抑制滲透壓水平的葡萄糖，(ii)用于提供碳水化合物、維生素、微量元素的谷物和來(lái)自真核生物的有機(jī)蛋白氮，以及(iii)淀粉酶，(b)將無(wú)菌混合固體基質(zhì)平鋪到托盤(pán)上一薄層，使得該薄層與流經(jīng)托盤(pán)的空氣不抑制地接觸，(c)在無(wú)菌通氣的無(wú)菌條件下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，(d)控制溫度低于26°C。(e)根據(jù)上述方法，其中所述的薄層約3mm厚。(f)根據(jù)上述的方法，其中用于發(fā)酵的微生物是破囊壺菌或裂殖壺菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括向發(fā)酵液中噴入氧氣以保持高含量的溶解氧。 根據(jù)需要，可優(yōu)選將氧氣與空氣按 60%的比例混合噴入。在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法是分批發(fā)酵法，包括在發(fā)酵開(kāi)始加入所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，得到干生物質(zhì)密度至少約100g/L發(fā)酵培養(yǎng)基，一般約120 130g，DHA產(chǎn)量至少約10g/L，一般每升培養(yǎng)基約12 15g。在另一個(gè)方面，碳水化合物養(yǎng)分可以是能發(fā)酵的單糖，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)全部加入，加入的量足以獲得至少100g/L的細(xì)胞干重密度。發(fā)明詳述本發(fā)明也包括固態(tài)發(fā)酵，且為使其區(qū)別于液態(tài)發(fā)酵，后者被稱為“深層發(fā)酵”。在本發(fā)明的方法中，設(shè)計(jì)了在整個(gè)發(fā)酵中提供高濃度溶解氧的方法，可避免已知的保持高濃度溶解氧的不利影響，并獲得DHA產(chǎn)率高于已知的在高溶解氧濃度下常規(guī)分批發(fā)酵法獲得的DHA產(chǎn)率，其中這些不利影響涉及細(xì)胞的高度破碎，抑制脂類(lèi)生產(chǎn)階段的DHA 合成等。分批發(fā)酵，是目前最簡(jiǎn)單和最受歡迎的方法，其優(yōu)化受到進(jìn)一步關(guān)注，并可由以下結(jié)果得以反映。作為替代模式的的固態(tài)發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵的結(jié)果僅是探索性試驗(yàn)的結(jié)果，因?yàn)樗鼈兊拇_較常規(guī)的分批發(fā)酵方法顯示出更高的產(chǎn)率，且由于它們存在很大的進(jìn)一步優(yōu)化和改善的余地而被報(bào)道，隨著時(shí)間的推移，它們可能顯示出比本發(fā)明中更高的產(chǎn)率。然而，即使是目前的初步結(jié)果，它們已經(jīng)表現(xiàn)出優(yōu)于常規(guī)的分批發(fā)酵法，并的確顯示出創(chuàng)造性的方法前景，具有通過(guò)發(fā)酵提高DHA產(chǎn)率的較大潛力。為了比較本發(fā)明方法的DHA產(chǎn)率，現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的分批培養(yǎng)方法有關(guān)DHA在各種溶解氧濃度下g/L的DHA產(chǎn)率，如US2006/(^86649的圖1中公開(kāi)的有關(guān)數(shù)據(jù)正好合適。 該數(shù)據(jù)涉及的是裂殖壺菌ATCC20888，其中在溶解氧為5 20 %范圍內(nèi)，報(bào)道的DHA產(chǎn)率為 2.0 1.0g/L。在不同菌株之間產(chǎn)率會(huì)有差異。然而，該結(jié)果可用于比較相同菌株在不同方法中的產(chǎn)率以作為絕對(duì)有效的可比標(biāo)準(zhǔn)以及用于與其它裂殖壺菌菌株進(jìn)行比較的至少相對(duì)有效的標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上，20%溶解氧，1. 3g/L的產(chǎn)率的結(jié)果可用作評(píng)價(jià)本發(fā)明方法得到的產(chǎn)率的基準(zhǔn)，至少采用20%及更高的溶解氧的分批發(fā)酵，以及將約20%或更高的溶解氧用于半連續(xù)和連續(xù)發(fā)酵方法。在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，雖然沒(méi)有確定溶解氧的百分?jǐn)?shù)，但可以合理的假設(shè)，在深層發(fā)酵中微生物可獲得的氧氣至少為固態(tài)發(fā)酵中微生物可獲得的氧氣， 其中固體基質(zhì)以3mm的厚度在托盤(pán)中發(fā)酵，無(wú)菌空氣流經(jīng)基質(zhì)的表面。與現(xiàn)有技術(shù)知識(shí)的啟示相反，如在最近的US2006/(^86649文獻(xiàn)中詳細(xì)討論了僅在生物質(zhì)增加階段適當(dāng)增加了溶解氧濃度，在脂類(lèi)生產(chǎn)階段減少氧氣供應(yīng)，高濃度還原糖的不利影響，高氮水平的不利影響和可采用的基于脂類(lèi)和DHA產(chǎn)量的提高溶解氧水平的方法的不利影響，其由細(xì)胞破碎、泄漏和脂類(lèi)氧化引起，完全拋棄了通過(guò)發(fā)酵提高含氧量作為可行的提高DHA產(chǎn)率的觀念。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供了持續(xù)、高水平的高于8%，高達(dá) 20 % 30 %的溶解氧，在某些情況下甚至可設(shè)計(jì)高達(dá)50 %，可從破囊壺菌發(fā)酵中獲得該明顯高的DHA產(chǎn)率為約10g/L或更高。最令人驚訝的是，分批發(fā)酵在發(fā)酵剛開(kāi)始添時(shí)加了大于200g/L和直到450g/L的還原糖，其中高濃度還原糖的障礙是可以克服的，用于轉(zhuǎn)換必需的全部氮可在發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)加入，氧含量開(kāi)始迅速下降，細(xì)胞密度上升，可維持在20%或高達(dá)30 50%，同樣沒(méi)有細(xì)胞破碎。這是一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)組合的結(jié)果，微生物能承受高濃度的還原糖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在高含量還原糖的每升發(fā)酵液中，通過(guò)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)的組合提供對(duì)溶解氧的高需求而沒(méi)有細(xì)胞破碎，對(duì)氮的高需求可通過(guò)有機(jī)氮的分批添加來(lái)實(shí)現(xiàn)，它是來(lái)自真核生物蛋白的氨基形式，并不昂貴。在本發(fā)明中，脫脂大豆粉因蛋白含量高、成本低和容易獲得被用來(lái)補(bǔ)充氨基氮。在這方面，可使用其它氮來(lái)補(bǔ)充氨基氮，如低成本的肽或氨基酸。實(shí)現(xiàn)還原糖高濃度發(fā)酵能力的重要性可以從以下事實(shí)看出，一方面，它們不耐受高濃度的還原糖，分批發(fā)酵要求所有的碳源在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)添加，發(fā)現(xiàn)這些微生物不直接利用雙糖或多糖。采用含雙糖的發(fā)酵液用于任一微生物，即裂殖壺菌ATCC MYA 1381、裂壺藻 ATCC觀209、破囊壺菌PRA 148生長(zhǎng)，產(chǎn)生很少量的脂類(lèi)和DHA。單糖是最好的碳源如葡萄糖、果糖等，其似乎沒(méi)有替代物。如果復(fù)合多糖的來(lái)源使用如稻谷、手指小米(ragi)、高粱等，避免一開(kāi)始高濃度的還原糖，隨著時(shí)間的推移，可加入能水解它們的酶，引起簡(jiǎn)單糖類(lèi)的形成，簡(jiǎn)單糖類(lèi)可被微生物吸收，高產(chǎn)DHA。然而，該酶的價(jià)格昂貴，其性能易于重復(fù)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)增加攪拌頭速度高達(dá)3. 2m/sec初始可獲得保持溶解氧含量為20 30%且沒(méi)有細(xì)胞破碎。在發(fā)酵的高級(jí)階段，溶解氧開(kāi)始降至低于30%，除了以所述攪拌頭速度攪拌外，通過(guò)將發(fā)酵罐切換至氣體混合模式，其中純氧與空氣按比例混合并噴入發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基中，可恢復(fù)溶解氧含量且沒(méi)有細(xì)胞破碎，并保持較高DHA產(chǎn)率?；煊屑冄醯目諝饪蓴y帶1 60%氧氣。增加的超過(guò)3. 2m/sec的攪拌頭速度因細(xì)胞裂解而對(duì)微生物產(chǎn)生不利影響。氣體混合下的空氣流動(dòng)可增加至高達(dá)0. 7VVM，高于IVVM導(dǎo)致細(xì)胞裂解。沒(méi)有細(xì)胞破碎的氧氣和空氣比例為 60%氧氣細(xì)胞破碎。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將提高轉(zhuǎn)速、混合氣體下的空氣流動(dòng)以及空氣和氧氣的比例進(jìn)行適當(dāng)組合，有可能維持發(fā)酵過(guò)程中溶解氧百分?jǐn)?shù)高達(dá)30 50%而不導(dǎo)致細(xì)胞破碎。DHA在發(fā)酵液中的g/L產(chǎn)率根據(jù)使用的菌株而有所不同，結(jié)果可見(jiàn)試驗(yàn)7、9和10。 然而，從使用裂殖壺菌ATCC 20889的實(shí)施例no. 7和8得到的結(jié)果可以證明，溶解氧供應(yīng)的增加導(dǎo)致DHA的g/L產(chǎn)率的大幅增加。在實(shí)施例7中，溶解氧濃度保持在20%或以上。氧混合物用于保持溶解氧水平為20%或以上。在實(shí)施例8中，通過(guò)增加空氣流通至高達(dá)SOOrpm 的轉(zhuǎn)速，保持溶解氧含量為20%。然而，從48小時(shí)至發(fā)酵結(jié)束，溶解氧含量在沒(méi)有氧氣泡的情況下幾個(gè)小時(shí)后跌至低于5%。實(shí)施例7的總干生物質(zhì)積累為84g/L，而在實(shí)施例8中總干生物質(zhì)積累為44. 8g/L。相應(yīng)的DHA分別為實(shí)施例7的12g/L和實(shí)施例8的4. 2g/L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)無(wú)機(jī)添加劑安全添加的分批發(fā)酵所需的超量的氮，可以含氨基氮的有機(jī)化合物的形式加入。對(duì)采用半連續(xù)、連續(xù)和固態(tài)發(fā)酵作為在高氧濃度下生產(chǎn)DHA的替代性方法進(jìn)行了探索。它們?cè)谔剿餍栽囼?yàn)中全部產(chǎn)生了令人滿意的DHA量，當(dāng)需要替代分批發(fā)酵法時(shí)，可進(jìn)行優(yōu)化以表現(xiàn)出它們生產(chǎn)DHA的最佳潛力。通過(guò)保持溶解氧含量為30%或更高，在半連續(xù)發(fā)酵中也可獲得100g/L左右的高干生物質(zhì)細(xì)胞密度。固態(tài)發(fā)酵是最簡(jiǎn)單的達(dá)到高含量氧的方法。這是作為一種替代性技術(shù)而研發(fā)，有待進(jìn)一步優(yōu)化以充分發(fā)揮其潛力。固體基質(zhì)發(fā)酵的探索性試驗(yàn)結(jié)果1.5g/kg(試驗(yàn)1)和 1. 87g/kg (試驗(yàn)2~)高于常規(guī)的分批發(fā)酵如在US2006/(^86649中所述的在20%溶解氧發(fā)酵下的1. 3g/LDHA的分批發(fā)酵結(jié)果。雖然沒(méi)有進(jìn)行固體基質(zhì)中溶解氧的測(cè)定，通過(guò)與3mm厚的發(fā)酵培養(yǎng)基表面流經(jīng)的空氣中的氧自由接觸，其與20%溶解氧的狀態(tài)是等同的。通過(guò)改變發(fā)酵條件如培養(yǎng)基組成可能改進(jìn)固體基質(zhì)體系的發(fā)酵效能，通過(guò)引入條件引入發(fā)酵固體基質(zhì)與攜帶有正常或補(bǔ)充氧的空氣的混合。本發(fā)明的深層發(fā)酵包括噴入高體積的空氣-氣體混合物，所產(chǎn)生的泡沫通過(guò)向培養(yǎng)基中添加消泡劑來(lái)解決。優(yōu)選的消泡劑是食品級(jí)消泡劑。更優(yōu)選為有機(jī)硅消泡劑。然而， 其它等效的消泡劑也可用于本發(fā)明中。固體基質(zhì)可由豆粉(soy gritts)、粗小米粉、麩皮等與已知微量的水混合組成，然后進(jìn)行滅菌。之后用已知量的水稀釋制備的種子接種物，再與滅菌的固體基質(zhì)充分混合，鋪于無(wú)菌托盤(pán)上。隨后在最初的48小時(shí)內(nèi)，將托盤(pán)置于18
孵育，然后升溫至22 ^TC,保持該溫度直到培育期達(dá)到120 150小時(shí)。然后將固體基質(zhì)從托盤(pán)中取出，浸漬或研磨，并用合適的溶劑處理用于脂肪酸提取。固體基質(zhì)浸泡在
1溶劑如甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、醋酸乙酯等中16 M小時(shí)，接著收集提取物。然后通過(guò)氣相色譜分析提取物。在由微生物生產(chǎn)脂類(lèi)的半連續(xù)發(fā)酵法中，通過(guò)在20 30°C，pH值4. 0 7. 0以及最初M小時(shí)內(nèi)高于50%氧飽和度，在隨后的48小時(shí)內(nèi)高于30%的由PID控制的氧和氣體混合的條件下，進(jìn)行分批發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)胞干重發(fā)酵的生物質(zhì)高達(dá)約85g/L，不讓其達(dá)到發(fā)酵液的細(xì)胞干重100g/L即排出部分發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)向該分批發(fā)酵中補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，使發(fā)酵在相似的條件下繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)生細(xì)胞干重的發(fā)酵生物質(zhì)，再次排出部分發(fā)酵物質(zhì)并再次補(bǔ)充培養(yǎng)基。重復(fù)該循環(huán)。以上描述的半連續(xù)發(fā)酵法也適合于培養(yǎng)基中細(xì)胞干重的發(fā)酵培養(yǎng)基生物質(zhì)密度達(dá)到大于100g/L的方法。將排出的發(fā)酵培養(yǎng)基收集于另一個(gè)生物反應(yīng)器中，其中或者立即從該批發(fā)酵培養(yǎng)基中提取脂類(lèi)，或者在20 30°C，pH值3. 0 6. 0下生產(chǎn)脂類(lèi)，在一段時(shí)間內(nèi)不讓其干重生物質(zhì)密度超過(guò)100g/L，然后回收生產(chǎn)的脂類(lèi)，接著獲取脂類(lèi)生產(chǎn)的很多生物質(zhì)。也可使干重生物質(zhì)密度進(jìn)一步盡可能地提高，然后回收脂類(lèi)。在探索性試驗(yàn)中獲得18gDHA/L的產(chǎn)率，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化可進(jìn)一步改善。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從微生物中生產(chǎn)脂類(lèi)的連續(xù)發(fā)酵法是在溫度20 30°C pH 值4. 0 7. 0的條件下，在最初48小時(shí)于發(fā)酵罐中以高于50%的純氧混合空氣進(jìn)行分批發(fā)酵，然后以一定的速率持續(xù)排出發(fā)酵物質(zhì)，并以約相同速率向第一發(fā)酵罐中持續(xù)補(bǔ)充新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基，以這種方式，發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積保持基本恒定的培養(yǎng)基生物質(zhì)密度，沒(méi)有達(dá)到或超過(guò)細(xì)胞干重100g/L。將排出的培養(yǎng)基收集于第二個(gè)生物反應(yīng)器中，其中或者提取脂類(lèi)，或者一段時(shí)間內(nèi)在有益于脂類(lèi)生產(chǎn)的溫度下，于pH值3. 0 6. 0進(jìn)行進(jìn)一步的脂類(lèi)生產(chǎn)步驟，然后回收產(chǎn)生的脂類(lèi)；將用于排出的培養(yǎng)基的該方法重復(fù)應(yīng)用于隨后排出的培養(yǎng)基的分批發(fā)酵中。以上描述的連續(xù)發(fā)酵法可適合于培養(yǎng)基中的細(xì)胞干重的發(fā)酵生物質(zhì)密度達(dá)到大于100g/L的方法。下面的實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍，而應(yīng)僅理解為解釋說(shuō)明。在本發(fā)明構(gòu)思內(nèi)的其它變化，包括新的培養(yǎng)基組成、新的微生物菌株或新的破囊壺菌菌種可用于替代用于本發(fā)明這些探索性和示例試驗(yàn)中的破囊壺菌及其菌株，其應(yīng)形成并被視為本發(fā)明不可分割的部分。此外，任何修改、變化和替換對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員而言是清楚的， 這種變化也應(yīng)包括在本發(fā)明的實(shí)施方案中。整個(gè)發(fā)明中，在相關(guān)的情況下，提及的單數(shù)也包括同類(lèi)的復(fù)數(shù)，因而“一種培養(yǎng)基”包括一種或多種具有相同功能的培養(yǎng)基。整個(gè)發(fā)明中，使用的表述如干重量、干物質(zhì)、干生物質(zhì)是指干物質(zhì)含量。實(shí)施例1固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)DHA將30ml水與IOOg粗Ragi (手指小米)粉混合并高壓滅菌。將2g葡萄糖、2g甘油和0. 02g淀粉酶溶解于100ml水中并高壓滅菌。將實(shí)施例1制備的IOml種子液接種到 IOOrnl含水培養(yǎng)基中，在旋渦混合器中充分混合。將所含物倒入到滅菌后的Ragi粉中，充分混合。將混合固體基質(zhì)以3mm層厚鋪于托盤(pán)上。將托盤(pán)置于通有無(wú)菌氣體的培養(yǎng)箱內(nèi)，控制溫度低于^°C，120個(gè)小時(shí)。移除托盤(pán)，將固體培養(yǎng)基從托盤(pán)中散開(kāi)，充分混合并磨碎。將磨碎的固體裝入含有甲醇的柱子內(nèi)。將固體基質(zhì)在甲醇中充分浸泡16個(gè)小時(shí)，收集甲醇。通過(guò)浸泡8個(gè)小時(shí)用甲醇進(jìn)行再萃取，收集甲醇層。合并甲醇層，然后分析總脂肪和DHA含量，分別為1.5g和 0.35g。這相當(dāng)于產(chǎn)率為1.5g DHA/kg含加入其中的水的固體基質(zhì)。實(shí)施例2固態(tài)發(fā)酵ATCC PRA 148 生產(chǎn) DHA(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-破囊壺菌(Thraustochytrid)ATCC PRA 148在含有IOOml水、5g葡萄糖、0. 5g酵母提取物、3. 5g大豆粉和4. Og海鹽的250ml 錐形燒瓶中制備IOOml的種子培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)pH值至5并高壓滅菌。將一滿環(huán)的破囊壺菌 ATCC PRA 148轉(zhuǎn)接到燒瓶中，于22°C、220RPM培養(yǎng)72小時(shí)。(B)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)DHA將50ml水與IOOg粗水稻粉混合，并高壓滅菌。將2g葡萄糖、2g甘油、3g大豆蛋白胨和0. 02g淀粉酶溶于IOOml水中，并高壓滅菌。將IOml實(shí)施例1㈧制備的種子液接種到IOOml含水培養(yǎng)基中，在旋渦混合器中充分混合。將所含物倒入到滅菌后的米飯中，充分混合。將混合的固體基質(zhì)以3mm層厚鋪于托盤(pán)上。將托盤(pán)置于通有無(wú)菌氣體的培養(yǎng)箱內(nèi)， 控制溫度在18 20°C之間，144個(gè)小時(shí)。移除托盤(pán)，將固體培養(yǎng)基從托盤(pán)中散開(kāi)，充分混合。將固體裝入含有甲醇的柱子內(nèi)。將固體基質(zhì)在甲醇中充分浸泡16個(gè)小時(shí)，收集甲醇。通過(guò)再浸泡8小時(shí)用甲醇進(jìn)行再萃取，收集甲醇層。合并甲醇層，然后分析總脂肪和DHA含量，分別為2. 6g和0. 5g。這相當(dāng)于產(chǎn)率為1.87g DHA/kg含加入其中的水的固體基質(zhì)。實(shí)施例3-蔗糖發(fā)酵(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-裂殖壺菌 Gchizochytrium limacinum)ATCC MYA 1381在含有IOOml水、0. 2g葡萄糖、2g蔗糖、0. 25g酵母提取物、4g大豆粉和3. 2g海鹽的250ml錐形燒瓶中制備IOOml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 5并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC MYA 1381轉(zhuǎn)接到燒瓶中，于22°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g蔗糖、7g淀粉、2g細(xì)菌淀粉酶、1. 125g酵母提取物、30g大豆粉、1. 125g磷酸氫二銨和24g海鹽的IOOOml錐形燒瓶中制備750ml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 5并高壓滅菌。將從IOOml種子燒瓶中制備的7. 5ml 種子液接種于其中。將燒瓶置于搖床中，在下培養(yǎng)58小時(shí)。(B)深層分批發(fā)酵將5000ml水加入到5L的發(fā)酵罐中。將20g葡萄糖、200g蔗糖、15g酵母提取物、 35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氫二銨和160g海鹽加入到發(fā)酵罐中，溶解所有組分。用稀 HCl將發(fā)酵罐所含物質(zhì)的pH值調(diào)至3. 5。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行滅菌后，用IN氫氧化鈉將pH 值調(diào)至7. 5。通過(guò)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移500ml實(shí)施例1的接種物。將溫度維持在22°C 12小時(shí)。允許溫度升至^°C，但不應(yīng)再超過(guò)該溫度。溶解氧不應(yīng)低于20%，攪拌器RPM升至800RPM。培養(yǎng)基的pH值不應(yīng)低于5. 0。間歇性取樣，分析生物質(zhì)和DHA含量。120小時(shí)后，停止發(fā)酵，并獲得下述結(jié)果。積累的總生物質(zhì)為濕重320g，干物質(zhì)含量為43%。DHA為6g，即1. 2g/L。因此，很明顯該微生物不能利用二糖。實(shí)施例4-乳糖發(fā)酵(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-裂殖壺菌ATCC MYA 1381
在含有IOOml水、0. 2g葡萄糖、2g乳糖、0. 25g酵母提取物、4g大豆粉和3. 2g海鹽的250ml錐形燒瓶中制備IOOml的液體培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 5并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC MYA 1381接種到燒瓶中，于22°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g乳糖、7g淀粉、2g淀粉酶、1. 125g酵母提取物、 30g大豆粉、1. 125g磷酸氫二銨和Mg海鹽的IOOOml錐形燒瓶中制備750ml的種子培養(yǎng)基。 用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7. 5并高壓滅菌。將從IOOml種子燒瓶中制備的7.5ml種子液接入其中。將燒瓶置于搖床中，在下培養(yǎng)58小時(shí)。(B)深層分批發(fā)酵將5000ml水加入到5L的發(fā)酵罐中。將20g葡萄糖、20g乳糖、9g酵母提取物、35g 甘油、35g大豆粉、14g磷酸氫二銨和160g海鹽加入到發(fā)酵罐中，溶解所有組分。用稀HCl 將發(fā)酵罐所含物質(zhì)的PH值調(diào)至3. 5。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行滅菌后，用IN氫氧化鈉將pH值調(diào)至7. 5。通過(guò)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移500ml實(shí)施例1的接種物。將溫度維持在22°C 12小時(shí)。允許溫度升至^°C，但不應(yīng)再超過(guò)該溫度。溶解氧不應(yīng)低于20%，攪拌器RPM升至800RPM。培養(yǎng)基的pH值不應(yīng)低于5. 0。間歇性取樣，分析生物質(zhì)和DHA含量。120小時(shí)后，停止發(fā)酵，并獲得下述結(jié)果。積累的總生物質(zhì)為濕重320g，干物質(zhì)含量為43%，即生產(chǎn)27. 5g/L的干物質(zhì)生物質(zhì)。DHA為3. 5g，即0. 7g/L。這也反映出該微生物不能利用乳糖進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)施例5-半連續(xù)發(fā)酵在含有250ml水、5g葡萄糖，2g甘油、2. 25g酵母提取物、1. 25g大豆粉和1. Og海鹽的500ml錐形燒瓶中制備種子培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)pH值至5并高壓滅菌。將一滿斜面的裂殖壺菌ATCC MYA 1381轉(zhuǎn)接到燒瓶中，于^°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。將該種子培養(yǎng)基接種至含有2500ml水、50g葡萄糖、20g甘油、22. 5g酵母提取物、 12. 5g大豆粉、Ig尿素和1. Og海鹽的2. 5L培養(yǎng)基的5L接種物制備發(fā)酵罐中。維持溫度 ^°C，轉(zhuǎn)速600RPM下48小時(shí)。用混有空氣的純氧將溶解氧維持在50%以上。發(fā)酵48小時(shí)后，獲得的濕生物質(zhì)的值為160g/L，濕度為70%。在無(wú)菌條件下，將接種物轉(zhuǎn)接至含有20g/L葡萄糖、20g/L乳糖，9g酵母提取物、 35g/L甘油、5g/L大豆粉、14g/L磷酸氫二銨和30g/L海鹽的250L發(fā)酵罐中。260RPM下進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)PID控制用氧和空氣的混合氣體將前對(duì)小時(shí)的溶解氧維持在飽和度的50%以上，接下來(lái)的48小時(shí)維持在30%以上。發(fā)酵52小時(shí)后，濕生物質(zhì)為120g/L，濕度為72. 5%。通過(guò)無(wú)菌轉(zhuǎn)移管(transfer line)將200L的發(fā)酵液無(wú)菌轉(zhuǎn)移至另一個(gè)發(fā)酵罐中。將200L新鮮的高壓滅菌后培養(yǎng)基補(bǔ)入到生物反應(yīng)器中，在與上述相同的條件下在繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。含有排出的發(fā)酵液的發(fā)酵罐維持在23°C，？!1值調(diào)至4.5。通過(guò)PID控制，用氧和空氣的混合氣體將溶解氧維持在飽和度的15%左右。72小時(shí)后，收獲發(fā)酵液，分析脂類(lèi)產(chǎn)量。總脂肪含量為45g/L，DHA為18g/L。實(shí)施例6 連續(xù)發(fā)酵在含有50ml水、0. 25g葡萄糖、0. Ig甘油、0. 125g酵母提取物、0. 12g大豆粉和0.15g海鹽的50ml錐形燒瓶中制備種子培養(yǎng)基。將pH值調(diào)至5并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC MYA 1381接種至燒瓶中，于、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。將該種子培養(yǎng)基接種至含有2500ml水、50g葡萄糖、20g甘油、22. 5g酵母提取物、 12. 5g大豆粉、Ig尿素和1. Og海鹽的2. 5L培養(yǎng)基的第一 5L發(fā)酵罐中。維持溫度26V，轉(zhuǎn)速600RPM 48小時(shí)。用混有空氣的純氧將溶解氧維持在50%以上。發(fā)酵48小時(shí)后，濕生物質(zhì)為200g/L，濕度為74%。將蠕動(dòng)泵連接至發(fā)酵罐的取樣管，以5ml/min的流速，無(wú)菌轉(zhuǎn)移至第二發(fā)酵罐(7L容積)中。以相同的5ml/min的流速將新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基無(wú)菌泵入到第一發(fā)酵罐中。將含有泵入的發(fā)酵液的第二發(fā)酵罐維持在23°C，將pH值調(diào)至4.5。通過(guò)PID (潛在積分微分控制器(Potential-htegral-Derivative controller))控制，用氧和空氣的混合氣體將溶解氧維持在飽和度的15%左右。從開(kāi)始以5ml/min流速通過(guò)取樣管從第一發(fā)酵罐中收集發(fā)酵液起16小時(shí)以后，從第二發(fā)酵罐中連續(xù)收獲發(fā)酵液。分析從第二發(fā)酵罐中收獲的發(fā)酵液的脂類(lèi)產(chǎn)量?？傊竞繛?0g/L，DHA為6g/L。獲得的生物質(zhì)的濕重為 220g/L，干物質(zhì)含量為34%。實(shí)施例7 使用高溶解氧的分批發(fā)酵-ATCC 20889(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-裂殖壺菌 Gchizochytrium)ATCC 20889在含有IOOml水、0. 2g葡萄糖、2g麥芽糖糊精、0. 25g酵母提取物、4g大豆粉和 3. 2g海鹽的250ml錐形燒瓶中制備IOOml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將pH值調(diào)至5. 5 并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC 20889接種至燒瓶中，于^°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。在含有750ml水、1. 5g葡萄糖、15g麥芽糖糊精、1. 125g酵母提取物、30g大豆粉、
1.125g磷酸氫二銨和24g海鹽的IOOOml錐形燒瓶中制備750ml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將PH值調(diào)至5. 5并高壓滅菌。將從IOOml種子燒瓶中制備的7. 5ml種子液接種其中。 將燒瓶置于搖床中，在26°C下培養(yǎng)48小時(shí)。(B)深層分批發(fā)酵將5000ml水加入到5L的發(fā)酵罐中。將20g葡萄糖、200g麥芽糖糊精、15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氫二銨和160g海鹽加入到發(fā)酵罐中，溶解所有組分。 用稀HCl將發(fā)酵罐所含物質(zhì)的pH值調(diào)至3. 5。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行滅菌后，用IN氫氧化鈉將 PH值調(diào)至5. 5。通過(guò)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移500ml的實(shí)施例1的接種物。將溫度維持在12小時(shí)。允許溫度升至^°C，但不應(yīng)再超過(guò)該溫度。溶解氧不應(yīng)低于20%，攪拌器RPM升至800RPM。此外，將發(fā)酵罐切換到氧氣混合物以維持溶解氧。 培養(yǎng)基的PH值不應(yīng)低于5. 0。間歇性取樣，分析生物質(zhì)和DHA含量。120小時(shí)后，停止發(fā)酵，并獲得下述結(jié)果。積累的總生物質(zhì)為濕重觀(^/1，濕度為 70%，干物質(zhì)濃度為84g/L。積累的脂肪總量為34g/L，DHA為12g/L。實(shí)施例8 無(wú)氧氣混合物的分批發(fā)酵-ATCC 20889(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-裂殖壺菌 Gchizochytrium)ATCC 20889在含有IOOml水、0. 2g葡萄糖、2g麥芽糖糊精、0. 25g酵母提取物、4g大豆粉和 3. 2g海鹽的250ml錐形燒瓶中制備IOOml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將pH值調(diào)至5. 5 并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC 20889接種至燒瓶中，于^°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。在含有750ml水、1. 5g葡萄糖、15g麥芽糖糊精、1. 125g酵母提取物、30g大豆粉、 1. 125g磷酸氫二銨和24g海鹽的IOOOml錐形燒瓶中制備750ml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將PH值調(diào)至5. 5并高壓滅菌。將從IOOml種子燒瓶中制備的7. 5ml種子液接種其中。 將燒瓶置于搖床中，在26°C下培養(yǎng)48小時(shí)。(B)無(wú)氧氣混合物深層分批發(fā)酵將5000ml水加入到5L的發(fā)酵罐中。將20g葡萄糖、200g麥芽糖糊精、15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氫二銨和160g海鹽加入到發(fā)酵罐中，溶解所有組分。 用稀HCl將發(fā)酵罐所含物質(zhì)的pH值調(diào)至3. 5。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行滅菌后，用IN氫氧化鈉將 PH值調(diào)至5. 5。通過(guò)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移500ml實(shí)施例1的接種物。將溫度維持在12小時(shí)。允許溫度升至^°C，但不應(yīng)再超過(guò)該溫度。通過(guò)將轉(zhuǎn)速升至800RPM維持溶解氧在20%。此外，當(dāng)氧氣水平下降時(shí)，繼續(xù)發(fā)酵并監(jiān)控溶解氧(DO) 的下降。記錄下降過(guò)程，發(fā)現(xiàn)從48小時(shí)以后至發(fā)酵結(jié)束，溶解氧小于5%。培養(yǎng)基的pH值不應(yīng)低于5. 0。間歇性取樣，分析生物質(zhì)和DHA含量。120小時(shí)后，停止發(fā)酵，并獲得下述結(jié)果。積累的總生物質(zhì)為濕重160g/L，濕度為 72%。脂肪總量為 18g/L，DHA 為 4. 2g/L。實(shí)施例9 高溶解氧的分批發(fā)酵-ATCC 20888(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-裂殖壺菌 Gchizochytrium)ATCC 20888在含有IOOml水、0. 2g葡萄糖、2g麥芽糖糊精、0. 25g酵母提取物、4g大豆粉和 3. 2g海鹽的250ml錐形燒瓶中制備IOOml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將pH值調(diào)至5. 5 并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC 20888接種至燒瓶中，于^°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。在含有750ml水、1. 5g葡萄糖、15g麥芽糖糊精、1. 125g酵母提取物、30g大豆粉、 1. 125g磷酸氫二銨和24g海鹽的IOOOml錐形燒瓶中制備750ml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將PH值調(diào)至5. 5并高壓滅菌。將從IOOml種子燒瓶中制備的7. 5ml種子液接種其中。 將燒瓶置于搖床中，在26°C下培養(yǎng)48小時(shí)。(B)深層分批發(fā)酵將5000ml水加入到5L的發(fā)酵罐中。將20g葡萄糖、200g麥芽糖糊精。15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氫二銨和160g海鹽加入到發(fā)酵罐中，溶解所有組分。用稀HCl將發(fā)酵罐所含物質(zhì)的pH值調(diào)至3. 5。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行滅菌后，用IN氫氧化鈉將PH值調(diào)至5. 5。通過(guò)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移500ml實(shí)施例1的接種物。將溫度維持在12小時(shí)。允許溫度升至^°C，但不應(yīng)再超過(guò)該溫度。溶解氧不應(yīng)低于20%，攪拌器RPM升至800RPM。此外，將發(fā)酵罐切換到氧氣混合物以維持溶解氧。 培養(yǎng)基的PH值不應(yīng)低于5. 0。間歇性取樣，分析生物質(zhì)和DHA含量。120小時(shí)后，停止發(fā)酵，并獲得下述結(jié)果。積累的總生物質(zhì)為濕重沈58/1，濕度 68%。積累的脂肪總量為26g/L, DHA為6. 7g/L。實(shí)施例10 高溶解氧的分批發(fā)酵-ATCC 20891(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-裂殖壺菌 Gchizochytrium)ATCC 20891在含有IOOml水、0. 2g葡萄糖、2g麥芽糖糊精、0. 25g酵母提取物、4g大豆粉和3. 2g海鹽的250ml錐形燒瓶中制備IOOml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將pH值調(diào)至5. 5 并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC 20891接種至燒瓶中，于^°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。在含有750ml水、1. 5g葡萄糖、15g麥芽糖糊精、1. 125g酵母提取物、30g大豆粉、 1. 125g磷酸氫二銨和24g海鹽的IOOOml錐形燒瓶中制備750ml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將PH值調(diào)至5. 5并高壓滅菌。將從IOOml種子燒瓶中制備的7. 5ml種子液接種其中。 將燒瓶置于搖床中，在26°C下培養(yǎng)48小時(shí)。(B)深層分批發(fā)酵將5000ml水加入到5L的發(fā)酵罐中。將20g葡萄糖、200g麥芽糖糊精、15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氫二銨和160g海鹽加入到發(fā)酵罐中，溶解所有組分。 用稀HCl將發(fā)酵罐所含物質(zhì)的pH值調(diào)至3.5。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行滅菌后，用IN氫氧化鈉將 PH值調(diào)至5. 5。通過(guò)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移500ml實(shí)施例1的接種物。將溫度維持在12小時(shí)。允許溫度升至^°C，但不應(yīng)再超過(guò)該溫度。溶解氧不應(yīng)低于20%，攪拌器RPM升至800RPM。此外，將發(fā)酵罐切換到氧氣混合物以維持溶解氧。 培養(yǎng)基的PH值不應(yīng)低于5. 0。間歇性取樣，分析生物質(zhì)和DHA含量。120小時(shí)后，停止發(fā)酵，并獲得下述結(jié)果。積累的總生物質(zhì)為濕重190g/L，濕度為 71%。脂肪總量為 21g/L，DHA 為 3. 6g/L。實(shí)施例11-高溶解氧的分批發(fā)酵-ATCC 20889(A)開(kāi)始種子培養(yǎng)-裂殖壺菌 Gchizochytrium)ATCC 20889在含有IOOml水、0. 2g葡萄糖、2g麥芽糖糊精、0. 25g酵母提取物、4g大豆粉和 3. 2g海鹽的250ml錐形燒瓶中制備IOOml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將pH值調(diào)至5. 5 并高壓滅菌。將一滿環(huán)的裂殖壺菌ATCC 20889接種至燒瓶中，于^°C、220RPM培養(yǎng)48小時(shí)。在含有750ml水、1. 5g葡萄糖、15g麥芽糖糊精、1. 125g酵母提取物、30g大豆粉、
1.125g磷酸氫二銨和24g海鹽的IOOOml錐形燒瓶中制備750ml的種子培養(yǎng)基。用IN氫氧化鈉將PH值調(diào)至5. 5并高壓滅菌。將從IOOml種子燒瓶中制備的7. 5ml種子液接種其中。 將燒瓶置于搖床中，在26°C下培養(yǎng)48小時(shí)。(B)深層分批發(fā)酵將5000ml水加入到5L的發(fā)酵罐中。將350g葡萄糖、8g酵母提取物、20g大豆粉、
2.5g磷酸氫二銨和160g海鹽加入到發(fā)酵罐中，溶解所有組分。用稀HCl將發(fā)酵罐所含物質(zhì)的PH值調(diào)至3.5。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行滅菌后，用IN氫氧化鈉將pH值調(diào)至5. 5。通過(guò)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移500ml實(shí)施例1的接種物。將溫度維持在12小時(shí)。允許溫度升至^°C，但不應(yīng)再超過(guò)該溫度。溶解氧不應(yīng)低于20%，攪拌器RPM升至800RPM。此外，將發(fā)酵罐切換到氧氣混合物以維持溶解氧。 培養(yǎng)基的PH值不應(yīng)低于5. 0。間歇性取樣，分析生物質(zhì)和DHA含量。120小時(shí)后，停止發(fā)酵，并獲得下述結(jié)果。積累的總生物質(zhì)為濕重四58/1，濕度 68%，即干物質(zhì)濃度為94g/L。積累的脂肪總量為37g/L，DHA為13. 2g/L。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在250 400g/L范圍內(nèi)改變葡萄糖的添加量，在120 140小時(shí)范圍內(nèi)改變發(fā)酵時(shí)間，以及在一定范圍內(nèi)合理地改變培養(yǎng)基的其它組分，表1和表2所示為用約350g葡萄糖，并且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中維持溶解氧水平為30%或更高的分批發(fā)酵結(jié)果。
表 權(quán)利要求
1.在高含氧條件下，由破囊壺菌(Thraustochytriales)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法， 包括(a)固態(tài)發(fā)酵，其中固體培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)噴入充足的無(wú)菌空氣，或(b)在深層發(fā)酵的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)保持溶解氧的飽和度大于8%，獲得大于2g DHA/升發(fā)酵培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，(b)包括分批發(fā)酵，半連續(xù)或連續(xù)發(fā)酵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，包括分批發(fā)酵，其中通過(guò)保持培養(yǎng)基中的溶解氧為至少20%，獲得DHA的產(chǎn)量大于1. 3g/L，優(yōu)選大于3g/L，更優(yōu)選大于10g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，包括向培養(yǎng)基中噴入混有氧的空氣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，包括用攪拌器攪拌培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，包括增加攪拌頭速度直到3.2m/sec,切換到氣體混合模式，其中將純氧與空氣混合并噴入發(fā)酵罐的發(fā)酵液中，以保持溶解氧的水平并在需要時(shí)阻止溶解氧低于目標(biāo)水平或者50%左右或以上的飽和度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，獲得的生物質(zhì)密度為大于100g/L細(xì)胞干重，積累的 DHA為汝/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中氧氣與空氣的比例為 60%氧氣。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其包括在分批發(fā)酵開(kāi)始時(shí)向發(fā)酵液中添加還原糖至高達(dá) 400g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其中添加無(wú)機(jī)氮或尿素氮，并補(bǔ)充添加來(lái)自含氨基化合物的有機(jī)氮。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的方法，其中所述含肽鍵的有機(jī)氮是富含蛋白或富含肽的來(lái)源或者氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述富含蛋白的來(lái)源包括脫脂大豆粉。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、8和10的任一項(xiàng)所述的方法，其包括添加消泡劑，所述消泡劑包括有機(jī)硅消泡劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中半連續(xù)發(fā)酵包括下述步驟a.在第一發(fā)酵罐中，使一批發(fā)酵液達(dá)到其中微生物在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期處于活躍分裂狀態(tài)的占，b.在第一發(fā)酵罐中保留一部分發(fā)酵液，其體積足以給下一批提供活躍分裂的接種物， 無(wú)菌轉(zhuǎn)移其余的活性發(fā)酵液至第二反應(yīng)器中，C.向第一反應(yīng)器中加入無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基以恢復(fù)其體積，并使第一反應(yīng)器進(jìn)行步驟(a) 并重復(fù)該步驟至所需的次數(shù)，或任選地(i)允許步驟(d)平衡體積或(ii)通過(guò)向第一反應(yīng)器中加入無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基恢復(fù)其體積，使其完成進(jìn)一步的生長(zhǎng)和脂質(zhì)生產(chǎn)，所述脂質(zhì)將在結(jié)束該系列半連續(xù)生產(chǎn)時(shí)收獲，d.為第二發(fā)酵罐中的發(fā)酵液提供培養(yǎng)條件，發(fā)揮其由于養(yǎng)分供給而受到限制的分裂潛力，從而生產(chǎn)DHA，e.回收DHA。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述連續(xù)發(fā)酵包括下列步驟a.在第一發(fā)酵罐中，使一批發(fā)酵液達(dá)到其中微生物在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期處于活躍分裂狀態(tài)的占，b.采取預(yù)防措施避免污染物進(jìn)入，開(kāi)始向第一發(fā)酵罐中加入無(wú)菌培養(yǎng)基，并允許無(wú)菌排出或移出相同體積的發(fā)酵液至第二發(fā)酵罐中，移出速率為使第一反應(yīng)器的內(nèi)容物始終保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，c.為第二發(fā)酵罐中的發(fā)酵液提供培養(yǎng)條件，發(fā)揮其由于養(yǎng)分供給而受到限制的分裂潛力，從而生產(chǎn)DHA，d.第二發(fā)酵罐達(dá)到其發(fā)酵能力后，從第二發(fā)酵罐中無(wú)菌排出或移出超過(guò)其能力的培養(yǎng)基，e.立即回收或隔一段時(shí)間后回收DHA。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固態(tài)發(fā)酵包括下列步驟a.通過(guò)添加剛夠用于濕潤(rùn)的水制備潤(rùn)濕但不流動(dòng)的固體基質(zhì)，其包括⑴含量為不抑制滲透壓水平的葡萄糖，( )用于提供碳水化合物、維生素、微量元素的谷物和來(lái)自真核生物的有機(jī)蛋白氮，以及(iii)淀粉酶，b.將無(wú)菌混合固體基質(zhì)平鋪到托盤(pán)上一薄層，使得該薄層與流經(jīng)托盤(pán)的空氣不抑制地接觸，c.在無(wú)菌通氣的無(wú)菌條件下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，d.控制溫度低于^°C。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的薄層約3mm厚。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于發(fā)酵的微生物是破囊壺菌或裂殖壺菌 (Schizochytrium)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包括向發(fā)酵液中噴入氧氣以保持高含量的溶解氧。
全文摘要
本發(fā)明包括在高含氧條件下，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵或者分批、半連續(xù)或連續(xù)的深層發(fā)酵，由破囊壺菌(Thraustochytriales)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法。在發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)添加大于200g/L和直到450g/L的葡萄糖，進(jìn)行分批發(fā)酵得到產(chǎn)量大于10g/L的DHA。該方法包括保持至少20％～30％的溶解氧，有時(shí)高達(dá)50％左右或以上。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102333880SQ201080009447
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者奈克旭·拉特蘭, 桑迪普·奧羅拉, 維尼塔·皮特, 艾拉潘·甘尼森, 蘇倫德拉·塔盧里 申請(qǐng)人:V.B.醫(yī)療私人有限公司