專利名稱：新的木質(zhì)素抗性纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及具有修飾連接肽的纖維素酶，所述修飾連接肽賦予對(duì)木質(zhì)素與所述修飾纖維素酶結(jié)合的抗性。本發(fā)明還涉及包含編碼所述修飾纖維素酶的核酸序列的基因構(gòu)建體，從宿主菌株中生產(chǎn)所述修飾纖維素酶的方法和用所述修飾纖維素酶在木質(zhì)素的存在下水解纖維素的方法。
背景技術(shù)：
地球上超過(guò)50%的有機(jī)碳存在于植物細(xì)胞壁中。植物細(xì)胞壁主要包含3種化合物纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。這些化合物共同被稱為“木質(zhì)纖維素”，它們構(gòu)成用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇或其他高附加值產(chǎn)品的糖和其他有機(jī)分子的潛在來(lái)源。因?yàn)槔w維質(zhì)乙醇對(duì)環(huán)境有利以及可持續(xù)的性質(zhì)，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖家呀?jīng)成為正在興起的能源政策的關(guān)鍵特征。對(duì)于纖維素轉(zhuǎn)變有多種技術(shù)正在開(kāi)發(fā)。這里感興趣的是這樣的方法，即通過(guò)所述方法將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理以增加其對(duì)水解酶的敏感性，之后使其酶水解為糖并將這些糖發(fā)酵為乙醇或其他高附加值的有機(jī)分子(例如，丁醇)。常規(guī)預(yù)處理方法包括稀酸蒸汽爆發(fā)(dilute acid steam explosion ；美國(guó)專 ^lJ No. 4, 461, 648) ,Wi^1M1R (ammonia freeze explosion ；AFEX ；Holtzapple et al., 1991)和有機(jī)溶劑提取(organosolv extraction，美國(guó)專利No. 4，409, 032)。水解和發(fā)酵系統(tǒng)可分別(相繼水解和發(fā)酵；SHF)或同時(shí)(同時(shí)糖化和發(fā)酵；SSF)進(jìn)行。在所有的情況下， 半纖維素和纖維素都被分解為可發(fā)酵的糖，而木質(zhì)素被分離并可被用作固體燃料或被用作其他有機(jī)分子的來(lái)源。選擇用于將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的酶高度依賴于所述預(yù)處理方法。稀酸蒸汽爆發(fā)引起半纖維素的顯著的化學(xué)分解，使得用于將半纖維素轉(zhuǎn)化為糖的酶與所述過(guò)程關(guān)系不大。相反地，AFEX或有機(jī)溶劑提取都使得半纖維素和纖維素很大程度上保持完整。與稀酸蒸汽爆發(fā)或AFEX不同，有機(jī)溶劑提取從底物中除去很大部分的木質(zhì)素。在所有情況下，酶水解的主要目標(biāo)是纖維素，使用纖維素酶結(jié)合物其可被轉(zhuǎn)變?yōu)樘?。有兩種基本類型的纖維素酶內(nèi)切葡聚糖酶，其切斷纖維素鏈中間的糖苷鍵，形成新的鏈末端；和纖維二糖水解酶，其從纖維素鏈的末端切斷短的低聚糖。糖苷酶將短的低聚糖分解為單糖。因此這三種酶成分協(xié)同作用形成有效的纖維素分解酶系統(tǒng)。大部分纖維素酶具有相似的分子結(jié)構(gòu)，由催化結(jié)構(gòu)域、連接肽和碳水化合物結(jié)合組件(CBM)組成。真菌CBM(第1家族)由小楔形折疊構(gòu)成。三個(gè)溶劑暴露的疏水(芳香族)殘基位于該折疊的一個(gè)表面并且構(gòu)成纖維素結(jié)合表面(Kraulis et al. , 1989 ；Mattinen et al.，1997)。這些芳香族殘基與所述纖維素聚合物上的葡萄糖環(huán)形成范德華相互作用和芳香族環(huán)極化相互作用(Mattinen et al.，1997 ；Reinikainen et al.，1992，Tormo et al.， 1996)。據(jù)報(bào)道CBM參與木質(zhì)素結(jié)合。例如，從木霉屬(Trichoderma) Cel7A中除去CBM基本上消除與堿提取的木質(zhì)素的結(jié)合以及與由酶水解制備的殘余木質(zhì)素的結(jié)合(Palonen et al.，2004)。
據(jù)報(bào)道催化結(jié)構(gòu)也參與結(jié)合木質(zhì)素。來(lái)自腐質(zhì)霉屬(Humicola sp.)的Cel7B—— 其不具有CBM——廣泛地被木質(zhì)素所結(jié)合(Berlin et al. , 2005b) 0類似地，缺乏CBM的木霉屬Cel5A核心與堿提取的木質(zhì)素結(jié)合，但是程度低于與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的結(jié)合(Palonen et al.，2004)。纖維素酶和半纖維素酶中的天然連接肽，無(wú)論是來(lái)自細(xì)菌還是真菌，長(zhǎng)度均為 6-59個(gè)氨基酸。如果這些肽的具體序列不相似，那么它們的化學(xué)性質(zhì)和氨基酸組成也是相似的，其中氨基酸絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸占多于50%的所述連接肽中的氨基酸(在 Gilkes et al. (1991)中綜述。絲氨酸和蘇氨酸殘基可用O-連接的聚糖修飾，所述O-連接的聚糖在真菌中主要是甘露糖(FUgerstamet al., 1984) 0連接肽還包含幾種常見(jiàn)類型的帶電殘基，全部帶負(fù)電(如Glu或Asp)或全部帶正電(如Lys、Arg或His)。連接肽維持催化結(jié)構(gòu)域相對(duì)于所述CMB的空間定向。Sien等(1991)證明了刪除連接肽改變了糞肥桿菌(Cellulomonas fimi)的CenA的催化結(jié)構(gòu)域和CMB的相對(duì)定向，而未改變兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)。已通過(guò)小角度χ射線散射(SAXS) (Receveur et al.，2002) 和動(dòng)態(tài)光散射(Boisset et al.，1995)研究了連接肽對(duì)特異腐質(zhì)酶(Humicola insolens) 的Cel45A的整體構(gòu)象的影響。這些研究者得出這樣的結(jié)論，即連接肽是伸展的而且是柔性的結(jié)構(gòu)，并且對(duì)所述連接肽的糖基化促成更伸展的構(gòu)象，從而改變了催化結(jié)構(gòu)域和CBM的相對(duì)位置。類似地，通過(guò)NMR對(duì)糞肥桿菌的Cex的分析表明對(duì)連接肽的糖基化在空間上限制了其柔性，導(dǎo)致更伸展的構(gòu)象并且加大催化結(jié)構(gòu)域和CBM之間的平均間隔(Shen et al., 1991)。通過(guò)SAXS對(duì)腐質(zhì)霉(Humicola)的Cel6A_Cel6B嵌合雙纖維素酶的分析表明連接肽是柔性的，采用緊湊而非伸展的構(gòu)象(von Ossowski et al.，2005)。該作者稱所述緊湊結(jié)構(gòu)可能與所述Cel6A和Cel6B的連接肽的低水平0-連接的糖基化有關(guān)。連接肽調(diào)節(jié)糖基水解酶與纖維素的結(jié)合以及它們的酶活性。從糞肥桿菌的CenA 纖維素酶中除去連接肽不僅改變了其結(jié)構(gòu)，而且降低了它的催化效能。盡管對(duì)纖維素的吸附?jīng)]有受到影響，然而除去連接肽破壞了所述結(jié)合的酶與結(jié)晶纖維素底物微晶纖維素的解吸附。據(jù)報(bào)道從木霉屬Cel7A上部分除去連接肽降低了其對(duì)結(jié)晶纖維素的結(jié)合能力，而對(duì)催化活性的影響可忽略不計(jì)(Srisodsuk et al.，1993)。完全除去所述Cel7A連接肽使纖維素分解活性降低50%。這些研究使用了基本純的纖維質(zhì)底物微晶纖維素和細(xì)菌纖維素。 然而，這些底物不能完全代表由商業(yè)預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素的異質(zhì)性，特別是因此它們并不含有木質(zhì)素。已經(jīng)報(bào)道了熱穩(wěn)定性改善的里氏木霉Cel7A和Cel6A的變體(美國(guó)專利 No. 7，375，197 ；WO 2005/028636 ；美國(guó)公開(kāi)文本 No. 2007/0173431 ；公開(kāi)文本 No. 2008/167214 ；WO 2006/074005 ；公開(kāi)文本 No. 2006/0205042 ；美國(guó)專利 No. 7，348，168 ； WO 2008/025164)。具體地，用脯氨酸代替里氏木霉Cel6A中413位上的絲氨酸，或用脯氨酸代替其他第6家族纖維素酶中413位的等效位置上的氨基酸，使熱穩(wěn)定性增加(W0 2008/025164)。已經(jīng)證明在里氏木霉Cel6A和其他第6家族纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域中的 103、134、136、186、365和410位的等效位置上的突變導(dǎo)致受葡萄糖的抑制降低(美國(guó)公開(kāi)文本No. 2009-0186381)。已經(jīng)為紡織物應(yīng)用制造出用于洗滌制劑的具有對(duì)蛋白酶和表面活性劑的抗性的變體(W0 99/01544 ；W094/07998 ；和美國(guó)專利No. 6，114，296)。在大部分情況下，突變特別地指向所述酶的催化結(jié)構(gòu)域。在一些情況下，所述碳水化物結(jié)合組件是靶標(biāo)。僅在很少的情況下將所述連接肽確定為起到關(guān)鍵作用或作為修飾目標(biāo)。修飾了腐質(zhì)霉第45家族內(nèi)切葡聚糖酶的連接肽以降低蛋白質(zhì)水解(W0 94/07998 ； 美國(guó)專利No. 6，114，296)，并修飾了里氏木霉Cel7A的連接肽以增加熱穩(wěn)定性(美國(guó)專利 No. 7，375，197)。除此以外，連接肽區(qū)域一般不作為酶改進(jìn)的特定靶標(biāo)。木質(zhì)素對(duì)纖維素酶系統(tǒng)的不利作用被廣泛記載。從硬木(山楊)中除去木質(zhì)素被證明增加通過(guò)酶水解的糖產(chǎn)率(Kong et al.，199幻。類似地，從軟木(道格拉斯氏杉)中除去木質(zhì)素被證明會(huì)增加對(duì)纖維素的酶水解，該作用是由于所述酶對(duì)所述纖維素的可及性提高引起的(Mooney et al.，1998)。其他研究組已經(jīng)證明從里氏木霉中純化的纖維素酶與分離的木質(zhì)素結(jié)合(Chernoglazov et al. , 1988)并且已經(jīng)推測(cè)了不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域在所述酶-木質(zhì)素相互作用中的作用(Palonen et al.，2004)。當(dāng)將木質(zhì)素加回至純纖維素系統(tǒng)中時(shí)，觀察到了里氏木霉纖維素酶與木質(zhì)素的結(jié)合和失活(Escoffier et al.，1991)。僅在一例中報(bào)道了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶沒(méi)有任何顯著影響(Meunier-Goddik and Penner，1999)。 其他報(bào)道稱一些半纖維酶可能對(duì)木質(zhì)素和木質(zhì)素降解產(chǎn)物有抗性，甚至可被其激活(Kaya et al.，2000)。因此，一般認(rèn)為木質(zhì)素是對(duì)纖維素的酶水解的嚴(yán)重限制。開(kāi)發(fā)木質(zhì)素抗性纖維素酶在將纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)榘ㄆ咸烟堑目扇苄蕴且陨a(chǎn)乙醇和其他產(chǎn)物的商業(yè)化中表現(xiàn)出很大的困難。然而，所述木質(zhì)素抗性酶必須保持它們的纖維素結(jié)合親和力和天然纖維素水解活性。很多方法已被證明可減少木質(zhì)素對(duì)纖維素酶系統(tǒng)的負(fù)作用。非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白；BSA)已經(jīng)被證明可阻斷纖維素酶和木質(zhì)素表面的相互作用(Yang and Wyman，2006 ；美國(guó)公開(kāi)文本No. 2004/0185M2A1 ；美國(guó)公開(kāi)文本 No. 2006/088922A1 ；W02005/024037A2 ；W02009/429474A1)。其他化學(xué)阻斷劑和表面活性劑已經(jīng)被證明具有類似的作用(Tu et al. ,2007 ；US 7, 354, 743) 0近來(lái)，已經(jīng)報(bào)道了表現(xiàn)出與木質(zhì)素的相互作用減少或被木質(zhì)素滅活程度降低的修飾纖維素酶。例如，W02010/012102報(bào)道在里氏木霉Ce 16A(TrCel6A)和其他第6家族纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)1四、322、363、365和410位的等效位置上的突變引起在木質(zhì)素存在時(shí)的水解活性的升高。類似地，W02009/149202公開(kāi)了顯示出與木質(zhì)素或乙醇的親和力降低或者熱穩(wěn)定性提高的纖維素酶變體，這是由TrCel6A的連接肽和催化結(jié)構(gòu)域的63、77、129、 147、153、161、194、197、203、237、247、254、281、285、289、294、327、339、344、356、378 和 382 位的等效位置上的突變引起的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及修飾纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及具有修飾連接肽的修飾纖維素酶，所述修飾連接肽使得在木質(zhì)素存在下的纖維素水解活性提高并且/或者木質(zhì)素與所述修飾纖維素酶的結(jié)合減少。本發(fā)明還涉及包含編碼所述修飾纖維素酶的核酸序列的基因構(gòu)建體，從宿主菌株中生產(chǎn)所述修飾纖維素酶的方法和用所述修飾纖維素酶在木質(zhì)素的存在下水解纖維素的方法。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供木質(zhì)素抗性纖維素酶。本發(fā)明的木質(zhì)素抗性纖維素酶包含連接肽，所述連接肽使木質(zhì)素對(duì)所述修飾纖維素酶造成的失活程度下降，從而增加了在木質(zhì)素存在下的纖維素水解活性。具體地，本發(fā)明涉及包含修飾連接肽的修飾纖維素酶，所述修飾連接肽與纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合組件可操作地連接，所述修飾連接肽長(zhǎng)度為約6至60個(gè)氨基酸，其中至少約50%是脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失，所述氨基酸替換、插入或缺失導(dǎo)致相對(duì)于衍生出所述修飾連接肽的親本連接肽，(a)所述連接肽理論等電點(diǎn)下降并且/或者(b)所述連接肽中的蘇氨酸 絲氨酸的比例增加。所述連接肽中的氨基酸替換、插入或缺失可導(dǎo)致所述連接肽的理論等電點(diǎn)下降至少0. 2單位并且/或者所述連接肽的蘇氨酸絲氨酸比例提高至少約10%。可通過(guò)以下一種或多種對(duì)所述連接肽的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)所述修飾連接肽的理論等電點(diǎn)的下降(a)用酸性氨基酸來(lái)替換一個(gè)或多個(gè)中性或堿性氨基酸；(b)用中性氨基酸來(lái)替換一個(gè)或多個(gè)堿性氨基酸；(c)插入一個(gè)或多個(gè)酸性氨基酸；和(d)除去一個(gè)或多個(gè)堿性氨基酸。可通過(guò)以下一種或多種對(duì)所述連接肽的修飾來(lái)提高蘇氨酸絲氨酸的比例(a)用蘇氨酸替換一個(gè)或多個(gè)非蘇氨酸氨基酸；(b)用蘇氨酸替換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸；(c)插入一個(gè)或多個(gè)蘇氨酸殘基；(d)除去一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基；和(e)用非蘇氨酸氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸。所述修飾連接肽使得與包含親本連接肽的親本纖維素酶相比，所述修飾纖維素酶的纖維素水解活性升高并且/或者對(duì)木質(zhì)素的結(jié)合下降，所述親本連接肽可操作地連接在與所述修飾纖維素酶中存在的相同的纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合組件之間。 所述修飾連接肽可使得與親本纖維素酶相比在木質(zhì)素存在下纖維素水解活性提高至少約 10%并且/或者對(duì)木質(zhì)素的結(jié)合下降至少20%。這種在木質(zhì)素存在下的木質(zhì)素結(jié)合下降和/或纖維素酶活性升高對(duì)從木質(zhì)纖維素底物生產(chǎn)可發(fā)酵糖、醇或糖醇例如從纖維素生產(chǎn)乙醇的工業(yè)具有潛在價(jià)值。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是顯示出纖維素水解活性的任意多肽。在本發(fā)明的修飾纖維素酶的一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域是糖基水解酶第5、6、7、45 或61家族的纖維素酶元件。例如，所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是里氏木霉Cel6A(SEQ ID No 1)的氨基酸83-447、里氏木霉Cel7A(SEQ ID NO 3)的氨基酸1-437、里氏木霉 Cel7B(SEQ ID NO 4)的氨基酸1至375、里氏木霉Cel5A(SEQ ID NO 2)的氨基酸71至 397、里氏木霉Cel45A(SEQ ID NO 5)的氨基酸1至165或里氏木霉Cel61A(SEQ ID NO 6) 的氨基酸1至235。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可顯示出與里氏木霉Cel6A(SEQ ID NO 1)的氨基酸 83-447或里氏木霉Cel7A(SEQ ID NO :3)的氨基酸1-437約60%的氨基酸序列同一性。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的氨基酸替換的里氏木霉Cel6A(SEQ ID NO 1)的氨基酸 83-447 :Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、K129E、 M134I、M134Q、M134T、M134V、M134Y、L136V、L136I、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G213D、 A322D、Q363E、G365D、G365E、G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q、R410S 和 S413P。 可以很容易地通過(guò)用人工比對(duì)或用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意序列比對(duì)算法(例如但不局限于BLAST算法)比對(duì)兩個(gè)序列的氨基酸來(lái)確定序列同一性。在本發(fā)明的纖維素酶的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述碳水化合物結(jié)合組件是纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。例如，所述碳水化合物結(jié)合組件可以是里氏木霉Cel6A的CBD (SEQ ID NO 49)、里氏木霉 Cel7A 的 CBD(SEQ ID NO :50)、里氏木霉 Cel7B 的 CBD (SEQ ID NO :51)、里氏木霉 Cel5A 的 CBD (SEQ ID NO :48)、里氏木霉 Cel61A 的 CBD (SEQ ID N0:53)、里氏木霉 Cel45A的CBD(SEQ ID NO :52)、里氏木霉Cipl的CBD (SEQ ID NO :54)或里氏木霉膨脹素(Swollenin)的CBD(SEQ ID NO :55)。例如，所述CBM可表現(xiàn)出與里氏木霉Cel6A(SEQ ID NO 1)的氨基酸3-39約50%的氨基酸序列同一性，并且可包含芳香族氨基酸對(duì)35位上的絲氨酸的替換。任意一種或全部所述修飾連接肽、纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域或碳水化合物結(jié)合組件均可來(lái)自由包括但不限于以下的生物體產(chǎn)生的一種或多種真菌纖維素酶木霉屬(Trichoderma ssp.)、曲霉屬(Aspergillus ssp.)、肉座菌屬(Hypocrea ssp.)、腐質(zhì)霉屬(Humicola ssp.)、鏈抱霉屬(Neurospora ssp.)、Orpinomyces ssp.、赤霉菌屬(Gibberella ssp. )、Emericella ssp·、毛殼毒屬(Chaetomium ssp·)、金抱子菌屬 (Chrysosporium ssp.)、毀絲霉屬(Myceliophthora ssp.)、,廉刀菌屬(Fusarium ssp.)、 青毒屬(Penicillium ssp· )、Magnaporthe ssp·、Phanerochaete ssp·、檢菌屬(Trametes ssp)、埃杜香 (Lentinula edodes)、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、 Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)、Amorphotheca resinae、Leucosporidium scotti、 美 H13 小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)、Thermomyces lanuginosa 禾口嗜熱側(cè)抱霉 (Sporotrichum thermophile)。本發(fā)明還涉及包含編碼如上所述的修飾纖維素酶的DNA的基因構(gòu)建體，并且涉及用于表達(dá)和分泌所述修飾纖維素酶的包含所述基因構(gòu)建體的基因修飾微生物。所述基因修飾微生物是細(xì)菌、酵母或絲狀真菌，例如鏈霉菌屬(Str印tomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、糖酵母屬(Saccharomyces)、曲霉屬 (Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、肉座菌屬(Hypocrea)、鏈孢霉屬(Neurospora)、木
(Trichoderma)(Chrysosporium) ^^ ^Μ (Myceliophthora)白勺禾中。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)如上所述的修飾纖維素酶的方法，包括以下步驟在誘導(dǎo)所述修飾纖維素酶表達(dá)和分泌的條件下培養(yǎng)包含編碼所述修飾纖維素酶的基因構(gòu)建體的基因修飾微生物，并從培養(yǎng)基中回收所述修飾纖維素酶。這種生產(chǎn)如上所述的修飾纖維素酶的方法可包括用編碼所述修飾纖維素酶的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的步驟。本發(fā)明還涉及水解纖維素底物的方法，包括使所述底物與如上述的修飾纖維素酶在木質(zhì)素存在的條件下接觸。例如，本發(fā)明的修飾纖維素酶可被用于工業(yè)處理木質(zhì)纖維素以生產(chǎn)可發(fā)酵糖、糖醇或燃料酒精。本發(fā)明涉及包含纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、CBM和選自以下的修飾連接肽的修飾纖維素酶linkTrCel6A-G72D(SEQ IDNO:29)
linkTrCel6A-S45N(SEQ IDNO:27)
linkTrCel6A-T76A(SEQ IDNO:30)
linkTrCel6A-G40D(SEQ IDNO:26)
linkTrCel6A-V81D(SEQ IDNO:31)
linkTrCel6A-R63L(SEQ IDNO:28)
linkTrCel6A-P71T(SEQ IDNO:32)linkTrCel6A-G40D-S45N-R63L-P71T-G72D-T76A-V81D(SEQ ID NO :34)；linkTrCel6A-A 1 (SEQ ID NO :35)
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linkTrCel6A-A2(SEQ ID NO :36)；linkTrCel6AK — E(SEQ ID NO :33)IinkTrCeIAs ^ T(SEQ ID NO :37)linkTrCel6AK —E/s —T(SEQ ID NO :38)linkTrCel7AK —e(SEQ ID NO :40)linkTrCel7AK —E/s —T(SEQ ID NO :41)


圖 1 示出了 Α.質(zhì)粒載體 YEp!352/PGK91-l Δ NheI-alphass-TrCe 16A-S413P,該載體指導(dǎo)親本和修飾木霉屬Cel6A(TrCel6A)纖維素酶從重組釀酒酵母中的表達(dá)和分泌；還示出了 B.轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pC/XCel6A-pyr4-TV，該質(zhì)粒指導(dǎo)親本和修飾木霉屬Cel6A (TrCe 16A)纖維素酶從重組里氏木霉中的表達(dá)和分泌。圖2包含兩幅散點(diǎn)圖。所述數(shù)據(jù)涉及對(duì)包含親本纖維素酶TrCel6A_S413P (Wt)、 空載體轉(zhuǎn)化株的濾出物(陰性對(duì)照)和修飾纖維素酶(TrCel6A變體)的一個(gè)96孔培養(yǎng)板的篩選。A圖是實(shí)施例6中描述的高通量測(cè)定1的在BSA處理的木質(zhì)素存在下的酶活性 (+BSA)對(duì)在未經(jīng)處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(-BSA)作圖的散點(diǎn)圖。B圖是實(shí)施例7中描述的高通量測(cè)定2的在BSA處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(+BSA)對(duì)在未經(jīng)處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(-BSA)的散點(diǎn)圖。圖3是顯示如測(cè)定1所測(cè)量的修飾纖維素酶(TrCel6A變體)的標(biāo)準(zhǔn)化為親本纖維素酶TrCel6A-S413P(wt)的-BSA +BSA纖維素酶活性比例的柱形圖。圖4是木質(zhì)素抗性TrCel6A變體和親本纖維素酶TrCel6A_S413P (Wt)的相對(duì)木質(zhì)素結(jié)合常數(shù)og和相對(duì)比活度的散點(diǎn)圖。圖5包含兩幅散點(diǎn)圖。數(shù)據(jù)涉及對(duì)集合體iTrCeieA變體(TrCel6A-S35F-G40D_S4 5N-R63L-P71T-G72D-T76A-V81D-S413P)加親本纖維素酶 TrCel6A_S413P (Wt)的篩選。A 圖是高通量測(cè)定1的在BSA處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(+BSA)對(duì)在未經(jīng)處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(-BSA)的散點(diǎn)圖(實(shí)施例6)。B圖是高通量分析2的在BSA處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(+BSA)對(duì)在未經(jīng)處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(-BSA)的散點(diǎn)圖(實(shí)施例 7)。圖 6 是親本纖維素酶 iTrCel6A-S413P (TrCel6Awt)和集合體 iTrCeieA 變體 CTrCel6 A-S35F-G40D-S45N-R63L-P71T-G72D-T76A-V81D-S413P)的木質(zhì)素結(jié)合變化譜圖。圖7是引入TrCel6A連接肽序列以產(chǎn)生新的TrCel6A連接肽變體的氨基酸替換的圖示。圖8是高通量測(cè)定2的在BSA處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(+BSA)對(duì)在未經(jīng)處理的木質(zhì)素存在下的酶活性(-BSA)的散點(diǎn)圖。數(shù)據(jù)涉及對(duì)新的連接肽變體(A1、A2、R —E 和R —E/S —Τ)加親本纖維素酶TrCel6A-S413P(Wt)的篩選。Wt數(shù)據(jù)通過(guò)線性回歸進(jìn)行擬合，其中將y軸截距固定為0。圖9顯示TrCel6AK —E和TrCel6AK ——τ連接肽變體的木質(zhì)素結(jié)合變化譜對(duì)親本纖維素酶TrCel6A-S413P(Wt)的木質(zhì)素結(jié)合變化譜。圖10顯示純化的木霉屬表達(dá)的TrCel6A親本和修飾纖維素酶的SDS-(A圖)和IEF-PAGE (B 圖)凝膠。圖11顯示在有纖維素酶誘導(dǎo)碳水化合物的微量培養(yǎng)物中產(chǎn)生的TrCel6A(來(lái)自菌株BTR2i;3)和新iTrCeieA連接肽變體(來(lái)自菌株P(guān)667A、P668D、P671B和P673B)的相對(duì)豐度，通過(guò)使用TrCel6A-特異多克隆抗體的免疫分析檢測(cè)得。圖12顯示TrCe17AK — E和TrCel7APE/s―連接肽變體的木質(zhì)素結(jié)合變化譜對(duì)親本纖維素酶TrCel7A(Wt)的木質(zhì)素結(jié)合變化譜。圖13顯示純化的從里氏木霉表達(dá)的TrCel7A變體的SDS-PAGE凝膠。圖14顯示用于破壞里氏木霉宿主菌株P(guān)297J中的cel7a(A圖)、cel7b(B圖)和 cel6a(C圖)基因的載體圖譜。用于轉(zhuǎn)化載體的線性化的限制性內(nèi)切位點(diǎn)顯示在每個(gè)載體圖譜上。圖15顯示用于表達(dá)來(lái)自里氏木霉轉(zhuǎn)化株的親本和修飾TrCel7A纖維素酶的基本載體。用于掉換Cel7A變體編碼序列的限制性內(nèi)切位點(diǎn)以帶下劃線的粗體字顯示。圖16顯示由表達(dá)修飾或野生型TrCel7A纖維素酶的菌株BTR213、P297Jaux和轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的微量培養(yǎng)濾出物的TrCel7A含量(以總蛋白質(zhì)的％表示)。黑條-Cel7a基因被破壞的親本P297Jaux菌株和BTR213、P297Jaux4的親本菌株?；覘l-表達(dá)！"rCePA-LROl 的P^7Jaux4轉(zhuǎn)化株。條紋條-表達(dá)TrCel7A-LR018的P297Jaux4轉(zhuǎn)化株。方格條-表達(dá)野生型iTrCePA的P297Jaux4轉(zhuǎn)化株。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及修飾纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及具有修飾連接肽的纖維素酶，所述修飾連接肽賦予對(duì)木質(zhì)素與所述修飾纖維素酶結(jié)合的抗性。本發(fā)明還涉及包含編碼所述修飾纖維素酶的核酸序列的基因構(gòu)建體，從宿主菌株生產(chǎn)所述修飾纖維素酶的方法和用所述修飾纖維素酶在木質(zhì)素的存在下水解纖維素的方法。以下說(shuō)明是僅作為示例而不是對(duì)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的必要特征的組合構(gòu)成限制的優(yōu)選實(shí)施方案。提供的標(biāo)題不意欲限制本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案。術(shù)語(yǔ)如“包括”和“包含”不意欲進(jìn)行限制。此外，除非另有說(shuō)明，否則單數(shù)形式的使用包括復(fù)數(shù)，并且“或(或者)”是指 “和/或(并且/或者)”。除非本文另有說(shuō)明，否則本文所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義。修飾纖維素酶“纖維素酶”被定義為能夠切斷纖維素聚合物中的β_1，4糖苷鍵的任何酶。纖維素酶可以是內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2. 1.4)，其切斷纖維素聚合物的內(nèi)β_1，4糖苷鍵以減小所述聚合物的聚合度并且/或者釋放低聚糖。纖維素酶還可以是外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3.2. 1.91)，其從所述纖維素聚合物末端釋放小的低聚糖，主要是纖維二糖。定義“纖維素酶”還包括與纖維素相互作用促進(jìn)其水解的蛋白質(zhì)，包括但不局限于膨脹素和擴(kuò)展蛋白(expansin) ο纖維素聚合物可以是天然纖維素，例如由植物或藻類或其他生物體產(chǎn)生的纖維素，可以是純的或者是植物生物質(zhì)——其也包含木質(zhì)素和半纖維素——中的幾種成分之一。所述纖維素聚合物還可以是纖維素衍生物，如羧甲基纖維素或羥乙基纖維素。本文使用的纖維素酶包含纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合組件(CBM)，以及位于所述催化結(jié)構(gòu)域和所述CMB之間的連接肽。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、CBM和連接肽可以是彼此同源的——即，屬于與在自然界中分離的相同的纖維素酶——或者對(duì)于至少一個(gè)其他結(jié)構(gòu)域是異源的——即，從來(lái)自相同的或不同的來(lái)源生物體的兩種或多種不同的天然纖維素酶中分離。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、CBM和連接肽的氨基酸序列可以是“天然的”或“野生型”——即，如在自然界中產(chǎn)生的未修飾纖維素酶中存在的——或者它們可以從天然或野生型纖維素酶通過(guò)其氨基酸序列的修飾獲得。纖維素酶可包含其他功能結(jié)構(gòu)域，例如，其他纖維素酶或半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、 CMB、粘附結(jié)構(gòu)域(cohesion)、錨定結(jié)構(gòu)域(dockerin)或纖連蛋白樣0^3)結(jié)構(gòu)域，并且仍被視為纖維素酶。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、CBM和連接肽可從中分離或衍生的纖維素酶的實(shí)例包括來(lái)自各種微生物的纖維素酶，所述微生物例如木霉屬(Trichoderma ssp.)、曲霉屬(Aspergillus ssp.)、肉座菌屬(Hypocrea ssp.)、腐質(zhì)霉屬(Humicola ssp·)、 鏈抱霉屬(Neurospora ssp·)、 Orpinomyces ssp.、赤霉菌屬(Gibberella ssp·)、 Emericella ssp·、毛殼霄屬(Chaetomium ssp·)、金抱子菌屬(Chrysosporium ssp·)、 毀絲霉屬(Myceliophthora ssp·)、鍵刀菌屬(Fusarium ssp·)、青霉屬(Penicillium ssp. )、Magnaporthe ssp.、Phanerochaete ssp.、檢菌屬(Trametes ssp)、埃杜香恭(Lentinula edodes)、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽短柄霉 (Aureobasidium pullulans)、Amorphotheca resinae、Leucosporidium scotti、美_ 小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)、Thermomyces lanuginosa、嗜熱側(cè)抱霉(Sporotrichum thermophile)或Thermobif ida fusca。本發(fā)明的實(shí)施不局限于所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、 CBM和連接肽可來(lái)源的纖維素酶。本文使用的“修飾纖維素酶”是包含與親本纖維素酶相同的纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和CBM，以及“修飾連接肽”的纖維素酶，所述修飾連接肽已通過(guò)氨基酸缺失、插入或替換進(jìn)行修飾以相對(duì)于親本連接肽(a)降低所述連接肽的理論等電點(diǎn)，并且/或者(b)提高所述連接肽的蘇氨酸絲氨酸比例。蛋白質(zhì)或肽的等電點(diǎn)是所述肽具有零靜電荷時(shí)所在的pH，即所述蛋白質(zhì)或肽上帶負(fù)電和帶正電的官能基團(tuán)處于靜電平衡所在的PH。具有高pi值的肽和蛋白質(zhì)包含較多的堿性氨基酸，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸，而具有低Pl值的肽和蛋白質(zhì)有較多的谷氨酸和天冬氨酸殘基。肽例如連接肽的Pl可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用互聯(lián)網(wǎng)上可自由獲取的很多程序中的任何一種容易地計(jì)算得出，所述程序如可在ExPASy Proteomics krver上獲取的 ProtParam 工具(參見(jiàn) URL au. expasy. org/tools/protparam. html)。本文使用的“親本纖維素酶”是包含親本連接肽、纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、CBM和可存在于所述修飾纖維素酶中的任意其他功能結(jié)構(gòu)域的纖維素酶。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、 CBM和任意其他功能結(jié)構(gòu)域與所述修飾纖維素酶中的對(duì)應(yīng)催化結(jié)構(gòu)域和CBM相同。此外，除了沒(méi)有通過(guò)氨基酸插入、缺失或替換修飾以(a)降低所述連接肽的等電點(diǎn)，并且/或者(b) 增加所述連接肽的蘇氨酸絲氨酸比例外，所述親本連接肽與所述修飾纖維素酶的所述修飾連接肽相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、CBM和親本連接肽相對(duì)于天然存在的纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、CBM或連接肽可包含氨基酸替換、插入或缺失，條件是這些氨基酸替換也出現(xiàn)在所述修飾纖維素酶中，并且對(duì)于所述親本連接肽，這樣的氨基酸替換、 插入或缺失與所述天然存在的連接肽相比不會(huì)(a)降低所述連接肽的等電點(diǎn)，并且/或者 (b)增加所述連接肽的蘇氨酸絲氨酸比例。纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域盡管不必然，但是一般是所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中較大的那個(gè)，并且是進(jìn)行水解反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域。纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是很多糖基水解酶(GH)家族之一的元件，例如，第5、6、7、45和61GH家族。給定GH家族的成員有共同的三維結(jié)構(gòu)、保守氨基酸區(qū)域同源性和共同的催化機(jī)制(Davies and Henrissat，1995和其中的參考文獻(xiàn))?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括第5、6、7、45和61GH家族中的那些纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域。例如，所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是里氏木霉Cel6A (SEQ ID No 1)的氨基酸83-447、里氏木霉Cel7A (SEQ ID NO :3)的氨基酸1-437、里氏木霉Cel7B (SEQ ID NO 4)的氨基酸1-375、里氏木霉Cel5A (SEQ ID NO :2)的氨基酸71至397、里氏木霉 Cel45A(SEQ ID NO 5)的氨基酸1至165或里氏木霉Cel61A(SEQ ID NO 6)的氨基酸1至 235。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解給定纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、缺失或替換來(lái)改變并仍被視為纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域。對(duì)于本文描述的發(fā)明的目的，如果一個(gè)蛋白質(zhì)顯示出與在提交時(shí)被鑒定為屬于相同的GH家族的任意其他纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列上有至少約60%的同一性，則認(rèn)為所述蛋白質(zhì)是纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域。例如，所述蛋白質(zhì)可顯示出與相同的GH家族中的任意其他纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的氨基酸同一性，或者其間的任意百分比的同一性。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可顯示出與里氏木霉Cel6A(SEQ ID NO 1)的氨基酸83-447或里氏木霉Cel7A (SEQ ID No⑶的氨基酸1-437約60%的氨基酸序列同一性。所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換的里氏木霉 Cel6A(SEQ ID NO 1)的氨基酸 83-447 :Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、 K129E、L136V、L136I、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G231D、A322D、Q363E、G365D、G365E、 G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q、R410S。可容易地通過(guò)使用人工比對(duì)或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意序列比對(duì)算法比對(duì)兩條序列的氨基酸來(lái)確定序列同一性，所述比對(duì)或算法例如，但不局限于=BLAST算法 (BLAST禾口BLAST 2. 0 ；Altschul et al.,Nuc. Acids Res. 25 :3389_3402，1997 ；和Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)；由 Smith & Waterman 公開(kāi)的算法，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981) ；Needleman & Wunsch 的同源性比對(duì)算法，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)； Pearson & Lipman 的相似性搜索方法，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA85 :2444 (1988)； 這些算法的計(jì)算機(jī)運(yùn)行(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison, Wis.)；或者人工比對(duì)禾口肉目艮檢查(參見(jiàn)，例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995Supplement))。在對(duì)纖維素酶進(jìn)行BLAST比對(duì)和序列同一性確定的情況下，僅考慮包含所述催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。表1A、IB、1C、ID、IE、IF和IG顯示來(lái)自第7、6、5、61 和45GH家族纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域分別與里氏木霉纖維素酶Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A、 Cel61A、Cipl和膨脹素進(jìn)行BLAST比對(duì)得到的氨基酸序列同一性百分比。全部所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域與來(lái)自里氏木霉的相應(yīng)GH家族纖維素酶的整個(gè)催化結(jié)構(gòu)域或高度保守區(qū)域有至少40%的同一性，并且很多顯示有至少60%的同一性。表IA 第7家族纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域與里氏木霉Cel7A的序列同一性
權(quán)利要求
1.一種修飾纖維素酶，包括位于纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合組件之間的修飾連接肽，所述修飾連接肽長(zhǎng)度為約6至60個(gè)氨基酸，其中至少約50%的氨基酸是脯氨酸、 絲氨酸或蘇氨酸，所述修飾連接肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失，所述氨基酸替換、插入或缺失導(dǎo)致相對(duì)于衍生出所述修飾連接肽的親本連接肽，(a)所述連接肽的理論等電點(diǎn)下降；或者(b)所述連接肽中的蘇氨酸絲氨酸的比例增加；或者(c)(a)和(b)都發(fā)生；所述修飾連接肽使得與包含親本連接肽的親本纖維素酶相比，所述修飾纖維素酶在木質(zhì)素存在下的纖維素水解活性升高并且/或者對(duì)木質(zhì)素的結(jié)合下降。
2.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述修飾連接肽包含約20至約50個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述修飾連接肽使得與親本纖維素酶相比，在木質(zhì)素存在下的纖維素水解活性升高至少10%，并且/或者對(duì)木質(zhì)素的結(jié)合下降至少1/6。
4.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述氨基酸述替換、插入或缺失導(dǎo)致所述連接肽的理論等電點(diǎn)下降至少0.2單位并且/或者所述連接肽中的蘇氨酸絲氨酸比例提高至少約 10%。
5.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域是糖基水解酶第5、6、7、 9、12、45或61家族的元件。
6.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述修飾連接肽、纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)自真菌纖維素酶。
7.權(quán)利要求6的修飾纖維素酶，其中所述真菌纖維素酶來(lái)自木霉屬(Trichoderma ssp·)、曲霉屬(Aspergillus ssp·)、肉座菌屬(Hypocrea ssp·)、腐質(zhì)霉屬(Humicola ssp.)、鏈抱霉屬(Neurospora ssp. ) > Orpinomyces ssp.、赤霉菌屬(Gibberella ssp·)、 Emericella ssp.、毛殼霉屬(Chaetomium ssp.)、金抱子菌屬(Chrysosporium ssp·)、毀絲霉屬(Myceliophthora ssp.)、鍵刀菌屬(Fusarium ssp·)、青霉屬(Penicillium ssp·)、 Magnaporthe ssp. > Phanerochaete ssp.、檢菌屬(Trametes ssp) ^ ^ (Lentinula edodes)、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma pi 1 iferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum> 羅倫 β急球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽 fei 柄 β (Aureobasidium pullulans)、Amorphotheca resinae、Leucosporidium scotti、美 HH 小克銀漢霉 (Cunninghamella elegans)、Thermomyces lanuginosa 或口譽(yù)熱偵!| 3 M (Sporotrichum thermophile)。
8.權(quán)利要求7的修飾纖維素酶，其中所述真菌纖維素酶是里氏木霉(Trichoderma reesei) Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A、Cel45A 或 Cel61A。
9.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，還包含至少一個(gè)選自以下的其他功能結(jié)構(gòu)域糖基水解結(jié)構(gòu)域、碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域、粘附結(jié)構(gòu)域、錨定結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
10.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述修飾連接肽的理論等電點(diǎn)下降是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的a.用酸性氨基酸來(lái)替換一個(gè)或多個(gè)中性或堿性氨基酸；b.用中性氨基酸來(lái)替換一個(gè)或多個(gè)堿性氨基酸；c.插入一個(gè)或多個(gè)酸性氨基酸；d.除去一個(gè)或多個(gè)堿性氨基酸；或e.a至d的至少任兩項(xiàng)或多項(xiàng)的結(jié)合，并且其中蘇氨酸絲氨酸的比例的提高是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的a.用蘇氨酸替換一個(gè)或多個(gè)非蘇氨酸氨基酸；b.用蘇氨酸替換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸；c.插入一個(gè)或多個(gè)蘇氨酸；d.除去一個(gè)或多個(gè)絲氨酸；e.用非蘇氨酸氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸；或f.a至e的任兩項(xiàng)或多項(xiàng)的結(jié)合。
11.一種分離的基因構(gòu)建體，包含編碼權(quán)利要求1的修飾纖維素酶的核酸序列。
12.—種分離的基因修飾微生物，包含權(quán)利要求11的基因構(gòu)建體。
13.權(quán)利要求12的分離的基因修飾微生物，其中所述基因修飾微生物是酵母或絲狀真菌的種。
14.權(quán)利要求13的分離的基因修飾微生物，其中所述酵母是糖酵母屬 (Saccharomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)或漢遜氏酵母屬(Hansenula)的種，所述絲狀真菌是木霉屬CTrichoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、毀絲霉屬 (Myceliophthora)或鏈孢霉屬(Neurospora)的種。
15.一種生產(chǎn)修飾纖維素酶的方法，包括以下步驟(i)用如權(quán)利要求15限定的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主微生物以產(chǎn)生重組菌株；(ii)選出表達(dá)所述修飾纖維素酶的重組菌株；并且 (iii)在誘導(dǎo)所述修飾纖維素酶表達(dá)的條件下在深層液體發(fā)酵中培養(yǎng)選出的重組菌株。
16.一種水解纖維素底物的方法，包括使所述底物與權(quán)利要求1的修飾纖維素酶在木質(zhì)素存在下接觸。
17.—種生產(chǎn)可發(fā)酵糖、糖醇或燃料酒精的方法，包括將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物與權(quán)利要求1的修飾纖維素酶接觸。
18.—種修飾纖維素酶，包含位于纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合組件之間的修飾連接肽，所述修飾連接肽選自linkTrCel6A-G72D(SEQ ID NO :29)； linkTrCel6A-S45N(SEQ ID NO :27)； linkTrCel6A-T76A(SEQ ID NO :30)； linkTrCel6A-G40D(SEQ ID NO :26)； linkTrCel6A-V81D(SEQ ID NO :31)； linkTrCel6A-R63L(SEQ ID NO :28)； linkTrCel6A-P71T(SEQ ID NO :32)；linkTrCel6A-G40D-S45N-R63L-P71T-G72D-T76A-V81D(SEQ ID NO :34)；linkTrCel6A-A 1(SEQ ID NO :35)；linkTrCel6A-A2(SEQ ID NO :36)；linkTrCel6AK —e(SEQ ID NO :33)；linkTrCel6As —T(SEQ ID NO :37)；linkTrCel6AK —E/s —T(SEQ ID NO :38)； linkTrCel7AK —e(SEQ ID NO :40)；禾口 linkTrCel7AK —E/s —T(SEQ ID NO :41)9與包含親本連接肽的親本纖維素酶相比，所述修飾纖維素酶表現(xiàn)出在木質(zhì)素存在下的纖維素水解活性升高和/或?qū)δ举|(zhì)素的結(jié)合下降。
19.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域顯示出與里氏木霉 Cel6A(SEQ ID NO 1)的氨基酸 83-447 或與里氏木霉 Cel7A (SEQ ID NO 3)的氨基酸 1-437 至少60%的氨基酸序列同一性。
20.權(quán)利要求19的修飾纖維素酶，其中里氏木霉Cel6A的氨基酸83-447包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、KU9E、Mi;34I、 M134Q、M134T、M134V、M134Y、L136V、L136I、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G213D、A322D、 Q363E、G365D、G365E、G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q、R410S 和 S413P。
21.權(quán)利要求1的修飾纖維素酶，其中所述碳水化合物結(jié)合組件表現(xiàn)出與選自以下的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物結(jié)合組件至少50%的氨基酸序列同一性SEQ ID NO :48, SEQ ID NO :49,SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54 禾口 SEQ ID NO :55。
全文摘要
提供了修飾纖維素酶，所述修飾纖維素酶顯示出在木質(zhì)素存在下的纖維素水解活性的提高并且/或者對(duì)木質(zhì)素的結(jié)合的降低，所述修飾連接肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失，使得與衍生出所述連接肽的親本連接肽相比，(a)所述連接肽的理論等電點(diǎn)下降并且/或者(b)所述連接肽中的蘇氨酸∶絲氨酸的比例增加。還提供了包含編碼修飾纖維素酶的核酸序列的基因構(gòu)建體，從宿主菌株中生產(chǎn)所述修飾纖維素酶的方法和用所述修飾纖維素酶在木質(zhì)素的存在下水解纖維素的方法。
文檔編號(hào)C12P19/14GK102333865SQ201080009528
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者B·R·斯科特, J·A·拉維尼, J·J·托馬舍克, N·瑪斯里, P·圣皮埃爾, T·C·懷特 申請(qǐng)人:埃歐金能源公司