專利名稱：用于擴(kuò)增丙型肝炎病毒核酸的方法
用于擴(kuò)增丙型肝炎病毒核酸的方法發(fā)明人Ann D. Kwong, James Daniel Frantz, Douglas J. Bartels, Chao Lin, Benjamin Shames, Sheila Seepersaud, Judith A. Lippke, Tara L. Kieffer, Yi Zhou, Eileen Z. Zhang 禾口 James C. Sullivan代理機(jī)構(gòu)案卷號(hào)VPI/08-120W0相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2009年1月21日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/146，083的優(yōu)先權(quán)，該文獻(xiàn)的全部教導(dǎo)在此通過(guò)引用方式并入本文。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是黃病毒科的正的有義單鏈RNA病毒。HCV是世界范圍內(nèi)慢性肝病的主要誘因，并且仍然是輸血后非甲型非乙型肝炎的最常見(jiàn)的誘因之一。在感染HCV 的人員中，20% -25%可能能夠在急性感染之后清除該病毒，但是75% -80%將產(chǎn)生慢性丙型肝炎感染(見(jiàn)，例如 Frontiers in Viral Hepatitis 的序言，編者R. F. Chinazi，J. -P. Sommadossi, and C. Μ. Rice, p. xi.，Elsevier (2003)) 這經(jīng)常導(dǎo)致復(fù)發(fā)性和逐漸惡化的肝的炎癥，經(jīng)常形成更嚴(yán)重的狀態(tài)，例如肝硬化和肝細(xì)胞癌。獲得HCV基因組的信息并對(duì)其進(jìn)行定量能夠促進(jìn)開發(fā)多種用于診斷和/或治療患者中的HCV感染的方法。一般地，分析HCV基因組的相對(duì)長(zhǎng)的片段將提供從多個(gè)相對(duì)較短的片段不能獲得的更多的序列信息。然而，一般難以通過(guò)常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增那些在PCR擴(kuò)增之前需要逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟的長(zhǎng)的RNA基因組(例如，超過(guò)51Λ)。當(dāng)試圖擴(kuò)增具有例如大于8，000個(gè)堿基對(duì)的HCV基因組或全長(zhǎng)HCV基因組時(shí)，這種情況尤其更具挑戰(zhàn)。另外，一般難于以相對(duì)高的重現(xiàn)性從獲自臨床和流行病學(xué)研究的樣品擴(kuò)增如此長(zhǎng)的 HCV基因組。因此，需要新的擴(kuò)增和測(cè)定HCV基因組的方法。特別是需要具有相對(duì)高的重現(xiàn)性 (例如大于80%，大于85%，或大于90%)的新的擴(kuò)增和測(cè)定具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)(例如全長(zhǎng)HCV)的HCV核酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一般地提供了擴(kuò)增HCV核酸的方法，測(cè)定HCV核酸的方法，其試劑盒和引物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了從HCV感染的樣品擴(kuò)增丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法。該方法包括通過(guò)兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板的區(qū)段，其中第一步PCR使用第一外引物和第二外引物，并且第二步PCR使用第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括使用RT引物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT) 形成互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法。該方法包括通過(guò)兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板的區(qū)段，其中第一步PCR使用第一外引物和第二外引物，并且第二步PCR 使用第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物。該方法還包括對(duì)擴(kuò)增的HCV核酸進(jìn)行測(cè)序。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括使用RT引物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT)形成互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增和/或測(cè)定HCV感染的樣品中的HCV核酸的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含含有第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含含有第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含RT引物、包含第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)，和包含第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 1 ；第一外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :2 ；第二外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4 ；第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 5 ；并且第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7 5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中η是H6的整5，-GAGTAGTGTTGGGTCG--3，(SEQ ID NO2)5，-CACGCTGTGATAAATG--3，(SEQ ID NO3)5，-CAVGCTGTGATATATG--3，(SEQ ID NO4)5，-GGTGCTTGCGAGTGCC--3，(SEQ ID NO5)5，-TAGCCAGCCGTGAACC--3，(SEQ ID NO6)禾口5，-TARCCAGCRACGAACC--3，(SEQ ID NO7),其中V是A、C或G ；并且R是A或G。在另一個(gè)實(shí)施方式中，RT引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID NO 1 ；第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、 2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸； 第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:13或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID N0:14的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中 η 是 1-26 的整數(shù)；5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 10)；5，-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3，(SEQ ID NO 11)；5’-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 13)；禾口5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO: 14)，其中V是A、C或G;R是A或G ；并且Y是C、T或U。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，RT引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID NO 1 ；第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、 2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸； 第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:17所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:16和SEQ ID N0:17的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中 η 是 1-26 的整數(shù)；5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 10)；5，-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3，(SEQ ID NO 11)；5’-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 15)；5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 16)；禾口5，-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO: 17)，其中V是A、C或G;R是A或G ；并且Y是C、T或U。在另一個(gè)實(shí)施方式中，RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 1 ；第一外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置丄至^中的或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸； 第二外引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的5，末端的位置1至12的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 8 ；第一外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :9 ；第二外引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO: 11 ；第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 12 ；并且第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 14 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(SEQ ID NO 8)；5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO :10)；5，-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3，(SEQ ID NO :11)；5’-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ IDNO :12)；5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO :13)；
5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO: 14)，其中V是A、C或G;R是A或G ；并且Y是C、T或U。在另一個(gè)實(shí)施方式中，RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 8 ；第一外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :9 ；第二外引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO: 11 ；第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 15 ；并且第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 16 或 SEQ ID NO 17 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘ (SEQ ID NO 8)；5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 10)；5，-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3，(SEQ ID NO 11)；5’-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 15)；5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 16)；5，-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO: 17)，其中V是A、C或G;R是A或G ；并且Y是C、T或U。本發(fā)明可用于從例如臨床分離體(例如源自感染了 HCV的患者的組織的那些)擴(kuò)增HCV核酸。使用本發(fā)明的PCR方法，可以以相對(duì)高的重現(xiàn)性例如大于80%，大于85%或大于90%的成功率擴(kuò)增并測(cè)序具有例如大于8，000個(gè)堿基對(duì)的HCV基因組序列，甚至是使用IO3至104IU/ml的樣品。本發(fā)明的PCR方法還可用于擴(kuò)增并測(cè)序小于103IU/ml的HCV 樣品中的HCV基因組。HCV基因組的序列信息可用于開發(fā)診斷和/或治療患者中的HCV感染，也可用于其它多種實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，例如，產(chǎn)生包含HCV基因組或其片段的載體。例如，本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)或跟蹤HCV患者對(duì)特定治療法的抗性譜或應(yīng)答(例如，顯示出特定的多態(tài)性)； 以及用于其診斷試劑盒。


圖1的示意圖顯示了本領(lǐng)域已知的HCV基因組。圖2的示意圖顯示了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中的HCV基因組和引物位置。圖3和4顯示了電泳圖像，其中顯示了本發(fā)明的RT-PCR方法的靈敏性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增、測(cè)定、鑒定、測(cè)序和/或定量HCV核酸分子的特定核酸序列的方法和試劑盒。HCV具有大約9600個(gè)核苷堿基的正的有義RNA基因組。圖1是大約9. 5kb HCV RNA的示意圖。如圖1所示，RNA的5’和3’末端分別是5’ UTR和3’ UTR區(qū)。從5’ UTR區(qū)至3’ UTR區(qū)，有編碼下列的序列活性結(jié)構(gòu)蛋白、核心蛋白(C)、包膜蛋白(El和E2)和P7 蛋白，以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2，NS3，NS4a，NS4b，NSfe*NS5b。RNA的3，末端包含多聚A或多聚U尾巴，這取決于HCV的類型。5’ UTR和3’ UTR區(qū)不被翻譯成蛋白質(zhì)，但是對(duì)于病毒RNA 的翻譯和復(fù)制具有重要意義。具體地，5’UTR具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES-內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))，其啟動(dòng)包含3000個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的翻譯，所述蛋白質(zhì)隨后被細(xì)胞的和病毒的蛋白酶切割為活性結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白(C)、包膜蛋白(El和E2)和P7蛋白)以及非結(jié)構(gòu)的較小的蛋白，包括NS2，NS3, NS4a, NS4b,蛋白。HCV非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白被認(rèn)為
提供了病毒復(fù)制的必需的催化機(jī)構(gòu)。NS蛋白衍生自多聚蛋白的蛋白水解切割。HCV NS蛋白3(NS;3)含有絲氨酸蛋白酶活性，其輔助加工多數(shù)病毒酶類，因此被認(rèn)為對(duì)于病毒復(fù)制和感染力是必不可少的。已經(jīng)證明NS3的前181個(gè)氨基酸(病毒多聚蛋白的殘基1027-1207) 含有NS3的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，其處理HCV多聚蛋白的所有4個(gè)下游位點(diǎn)。HCV NS3絲氨酸蛋白酶及其相關(guān)的輔因子NS4A輔助加工所有的病毒酶類。5’ UTR是HCV基因組的最高度保守的部分，而兩個(gè)包膜蛋白(El和似)的序列在不同的HCV分離體之間是高度可變的。通常而言，已經(jīng)通過(guò)準(zhǔn)種和基因型對(duì)HCV的遺傳異質(zhì)性進(jìn)行了分類。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“準(zhǔn)種”是指被感染的個(gè)體內(nèi)的HCV群體的遺傳異質(zhì)性。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因型”和“亞型”是指在不同的HCV分離體之間觀察到的遺傳異質(zhì)性。本領(lǐng)域已知有多種HCV 的型和亞型，包括例如，基因型la，lb, lc, 2a，2b，2c，3a，3b，4a，5a和6a (使用Simmonds等 A, 1994, Hepatology 19 :1321-24 ；Zein，2000，Clin. Microbiol. Rev. 13 :223-235 的分類系統(tǒng))。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“HCV”包括HCV的任意型和亞型，包括基因型la，lb, lc,2a,2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a和6a，及其變體。一般地，“變體”包括相對(duì)于參考病毒、基因或蛋白具有一個(gè)或多個(gè)變化的序列。變體的來(lái)源包括例如基因突變和多態(tài)性。同樣，術(shù)語(yǔ)“HCV核酸” 包括全長(zhǎng)HCV以及具有部分序列的HCV的片段。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了擴(kuò)增獲自HCV感染的樣品的HCV核酸的方法使用RT 制備互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板(cDNA)。然后通過(guò)使用兩步PCR擴(kuò)增 DNA模板的區(qū)段。DNA模板區(qū)段包括要被擴(kuò)增的靶HCV核酸分子，通過(guò)兩步PCR產(chǎn)生靶HCV 核酸分子的擴(kuò)增子。RT和PCR過(guò)程各自獨(dú)立地使用本文公開的一個(gè)或多個(gè)引物(例如，SEQ ID NO 1-17)。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增的靶HCV核酸分子具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)。在其它實(shí)施方式中，擴(kuò)增的靶HCV核酸分子具有大于9，000個(gè)堿基對(duì)。在其它實(shí)施方式中，擴(kuò)增的靶 HCV核酸分子包含編碼C, El, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A和NS5B蛋白的基因組。在其它實(shí)施方式中，擴(kuò)增的靶HCV核酸分子具有全長(zhǎng)核苷酸?？梢詮闹袡z測(cè)靶HCV核酸分子的樣品是任意的HCV感染的體液、細(xì)胞或細(xì)胞碎片。 來(lái)自于“其中HCV的存在待測(cè)的患者”的樣品可以是例如血液、血清、血漿和其它體液或組織?！癏CV感染的樣品”包括任意數(shù)量的HCV RNA。在一些實(shí)施方式中，HCV感染的樣品來(lái)自 HCV陽(yáng)性樣品。如本文使用的詞語(yǔ)“HCV陽(yáng)性樣品”意思是該樣品包括數(shù)量大于1000IU/mL的 HCV RNA。在一些實(shí)施方式中，HCV感染的樣品包括數(shù)量小于或等于1000IU/mL的HCV RNA, 例如，10IU/mL 至 1000IU/mL，100IU/mL 至 1000IU/mL，500IU/mL 至 1000IU/mL，或 700IU/mL 至1000IU/mL。在一些實(shí)施方式中，靶HCV核酸分子所源自的HCV感染的樣品是HCV感染的患者的血漿?！耙铩笔沁@樣的寡核苷酸在與模板核酸分子結(jié)合后能夠作為合成起始點(diǎn)，例如， 在擴(kuò)增或RT反應(yīng)中。本發(fā)明的引物的長(zhǎng)度不是重要的。通常而言，引物長(zhǎng)度介于5-150個(gè)核苷酸，例如10-100個(gè)核苷酸，15-80個(gè)核苷酸，15-50個(gè)核苷酸，25-80個(gè)核苷酸，28-80個(gè)核苷酸，20-45個(gè)核苷酸，15-35個(gè)核苷酸，或25-35個(gè)核苷酸。例如，可以在SEQ ID N0 1-17 的任一項(xiàng)及其變體的5’末端添加1-100個(gè)核苷酸的另外的序列(例如具有1-50，1-30或1-20個(gè)核苷酸的I1aq)。在一些實(shí)施方式中，在本文公開的引物(例如SEQ ID NO :1-14的寡核苷酸及其變體)的5’末端添加1-100個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列(例如1-50，1-30或1_20 個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列)，但不在3’末端添加。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物在它們的 3，末端包含SEQ ID NO 1-17或其變體。術(shù)語(yǔ)“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”在通篇可以相互替換地使用。除非另有指明，否則，當(dāng)多核苷酸序列以一系列單字符和/或三字符縮寫的形式呈現(xiàn)時(shí)，序列是以5’至 3’的方向呈現(xiàn)(根據(jù)常規(guī)做法)。本說(shuō)明書通篇使用的用于指稱包含特定核堿基序列的核酸的縮寫是常規(guī)的單字符縮寫。因此，當(dāng)包括于核酸中時(shí)，天然存在的編碼核堿基的縮寫如下腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)0在本發(fā)明中，使用RT引物進(jìn)行RT步驟，所述RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO 8 5，_(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO 1)或5' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' (SEQ ID NO :8)。SEQ ID NO 1的“η”通常是H6的整數(shù)，更通常是4_20的整數(shù)，再更通常是10_20
的整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，RT引物是10_80mer。在其它實(shí)施方式中，RT引物是15_80mer。 在其它實(shí)施方式中，RT引物是15-50mer。在其它實(shí)施方式中，RT引物是15-30mer。在其它實(shí)施方式中，RT引物是18-30mer。在一些實(shí)施方式中，RT引物在其3’末端包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :8。在一些實(shí)施方式中，使用如上所述的RT引物在HCV基因組的3’非翻譯區(qū)(3’UTR) 引發(fā)靶HCV RNA。一般地，可以以單獨(dú)的步驟進(jìn)行RT步驟。任選地，其可以在組合的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中進(jìn)行。RNA的RT-PCR擴(kuò)增是本領(lǐng)域熟知的，其描述見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5，322，770和5，310，652 ；Myers and Gelfand,1991,Biochemistry 30(31) :7661-7666; 美國(guó)專利號(hào) 5，527，669 ；Young 等人，1993，J. Clin. Microbiol. 31 (4) :882-886 ；和 Young 等人，1995，J. Clin. Microbiol. 33 (3)損-657。一般地，在RT步驟中，按照實(shí)驗(yàn)室中通常進(jìn)行的制備RNA模板的方式從HCV感染的樣品中分離包含靶核酸的HCV RNA。在一些實(shí)施方式中，使用載體RNA從HCV感染的樣品分離HCV RNA0可用于本發(fā)明的載體RNA的實(shí)例包括多聚-A RNA和細(xì)菌的tRNA。在一些具體實(shí)施方式
中，使用細(xì)菌的tRNA。使用RT引物和一種或多種RT酶從HCV RNA模板制備互補(bǔ)性DNA模板。本領(lǐng)域已知的任意合適的RT條件和RT酶均可用于本發(fā)明?？捎糜诒景l(fā)明的RT酶的具體實(shí)例包括M-MuLV (莫洛尼鼠白血病病毒)，例如superscript，I^rimeScript， PowerScript, Accuscript, ArrayScript 禾口 MultiScribe ；AMV(禽成髓細(xì)胞瘤病毒)；禾口 HIV (人類免疫缺陷病毒)。然后，cDNA模板可用于使用兩步PCR的擴(kuò)增。一般地，兩步PCR使用第一步PCR和第二步PCR。在第一步PCR中，通過(guò)使用外引物對(duì)即第一外引物和第二外引物擴(kuò)增包含靶 HCV核酸的HCVcDNA模板(或HCV cDNA模板的區(qū)段)，以產(chǎn)生第一擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)。例如，然后，使用內(nèi)引物對(duì)即第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物通過(guò)第二步PCR進(jìn)一步擴(kuò)增第一步PCR 的至少一部分?jǐn)U增產(chǎn)物(或擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)段)，以產(chǎn)生第二擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)。如在常規(guī)PCR中一樣，在擴(kuò)增反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)中，可以通過(guò)變性使樣品中的任意雙鏈核酸分子變?yōu)閱捂?。然后在引物與靶核酸分子之間可以發(fā)生雜交。通常而言，內(nèi)引物對(duì)或外引物對(duì)可以是相同或不同的長(zhǎng)度。例如，對(duì)于每個(gè)內(nèi)引物對(duì)和外引物對(duì)，第一引物可以由四個(gè)核苷酸組成；而第二引物可以由22個(gè)核苷酸組成。在一些實(shí)施方式中，每個(gè)外引物和內(nèi)引物獨(dú)立地是15-80mer。在其它實(shí)施方式中，每個(gè)外引物和內(nèi)引物獨(dú)立地是15-50mer。在其它實(shí)施方式中，每個(gè)外引物和內(nèi)引物獨(dú)立地是 25-80mer。在其它實(shí)施方式中，每個(gè)外引物和內(nèi)引物獨(dú)立地是^-80mer。在其它實(shí)施方式中，每個(gè)外弓I物和內(nèi)弓丨物獨(dú)立地是25-50mer。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物和第一外引物獨(dú)立地在HCV基因組的5’UTR引發(fā)， 并且第二內(nèi)引物和第二外引物獨(dú)立地在HCV基因組的NS5B區(qū)引發(fā)。在具體的實(shí)施方式中， 第一內(nèi)引物和第一外引物被引發(fā)的5’ UTR區(qū)包含如圖2所示的針對(duì)Fl和F2引物的區(qū)域 (獨(dú)立地)；并且第二內(nèi)引物和第二外引物被引發(fā)的NS5B區(qū)包含如圖2所示的針對(duì)Rl和R2 引物的區(qū)域(獨(dú)立地)。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一外引物包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列5，-GAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO :2)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一外引物包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO :9)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一外引物在其3’末端包含SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一外引物包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一外引物在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二外引物包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列5，-CACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 3)；5，-CAVGCTGTGATATATG-3，(SEQ ID NO :4)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二外引物包含SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的5，末端的位置1至12中的1、 2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 10)；5，-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3，(SEQ ID NO: 11)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二外引物在其3，末端包含SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二外引物包含SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二外引物在其3’末端包含SEQ ID N0:10或SEQ IDNO :11所示的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列5，-GGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO :5)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:12的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO: 12)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)外引物包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 15的5’末端的位置1至16中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO: 15)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID N0:15所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列5，-TAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 6)或5，-TARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO :7)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二內(nèi)引物包含SEQ ID N0:13或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的5，末端的位置1至12中的1、 2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 13)或5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO: 14)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二內(nèi)引物在其3，末端包含SEQ ID N0:13或SEQ ID N0: 14所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二內(nèi)引物包含SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:17所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的5，末端的位置1至13中的1、 2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 16)或
5，-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO: 17)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二內(nèi)引物在其3，末端包含SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:17所示的核苷酸序列。在第一具體實(shí)施方式
中，第一外引物包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二外引物包含SEQ ID NO 10 或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 10和SEQ IDNO 11的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO=Il的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在第二具體實(shí)施方式
中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:13禾口 SEQ ID NO 14 的5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在第三具體實(shí)施方式
中，第一外引物包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO :9的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 10和SEQ IDNO 11的5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14 的5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13 和SEQ ID N0:14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，靶HCV核酸分子具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，靶HCV核酸分子是基因型Ia 或lb。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，靶HCV核酸分子是具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)的基因型 Ia 或 lb。在第四具體實(shí)施方式
中，第一外引物在其3’末端包含SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物在其3，末端包含SEQ ID N0:10或SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和 SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物在其3，末端包含SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ IDNO :12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物在其3，末端包含SEQ ID NO 13 或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，靶HCV核酸分子具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，靶HCV核酸分子是基因型Ia或lb。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，靶HCV核酸分子是具有大于8，000 個(gè)堿基對(duì)的基因型Ia或lb。在第五具體實(shí)施方式
中，靶HCV核酸分子是具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)的基因型la。 在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，外引物包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物包含SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:10的5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè)) 核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO :12的5，末端的位置1至14中的1、2或 3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 13的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，外引物在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物在其3，末端包含SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，第一外引物包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列；第二外引物包含SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列；第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，第一外引物在其3’末端包含SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列；第二外引物在其3’末端包含SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列；第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列；并且第二內(nèi)引物在其3，末端包含SEQ ID N0:13所示的核苷酸序列。在第六具體實(shí)施方式
中，靶HCV核酸分子是具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)的基因型Ib。 在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，第一外引物包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地， SEQ ID NO 9的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是 SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物包含SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:11的5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2 個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至14中的1、 2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO :14的 5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQID NO :14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，第一外引物在其3’末端包含 SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是 SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物在其3，末端包含SEQ ID NO=Il 所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，第一外引物包含SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列；第二外引物包含SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列；第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO 14所示的核苷酸序列。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，第一外引物在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列； 第二外引物在其3’末端包含SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列；第一內(nèi)引物在其3’末端包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列；并且第二內(nèi)引物在其3，末端包含SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列。在一些具體實(shí)施方式
中，第一和第二外引物是上文第一至第四具體實(shí)施方式
中每一個(gè)中所述；并且第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3 個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID N0:16或SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3 個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在一些更具體的實(shí)施方式中，任選地與SEQ ID NO :15的核苷酸不同的核苷酸獨(dú)立地在SEQ ID NO 15的5，末端的位置1至16中；并且任選地與SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的核苷酸不同的核苷酸獨(dú)立地在SEQ ID N0:16和SEQ ID N0:17的5，末端的位置1至13中。在一些更具體的實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17所示的核苷酸序列。在一些具體實(shí)施方式
中，靶HCV核酸分子是具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)的基因型Ia ； 第一和第二外引物如上文第五具體實(shí)施方式
中所述；并且第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO 15 所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在一些更具體的實(shí)施方式中，任選地與SEQ ID N0:15的核苷酸不同的核苷酸獨(dú)立地在SEQ ID NO 15的5，末端的位置1至16中；并且任選地與SEQ ID NO 16的核苷酸不同的核苷酸獨(dú)立地在SEQ ID NO 16的5’末端的位置1至13中。在一些更具體的實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO 16所示的核苷酸序列。在一些具體實(shí)施方式
中，靶HCV核酸分子是具有大于8，000個(gè)堿基對(duì)的基因型Ib ； 第一和第二外引物如上文第五具體實(shí)施方式
中所述；并且第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO 15所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:17的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在一些更具體的實(shí)施方式中，任選地與SEQ ID N0:15的核苷酸不同的核苷酸獨(dú)立地在SEQ ID NO 15的5，末端的位置1至16中；并且任選地與SEQ ID NO 17的核苷酸不同的核苷酸獨(dú)立地在SEQ ID NO 17的5’末端的位置1至13中。在一些更具體的實(shí)施方式中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列。本領(lǐng)域已知的任意合適的PCR條件都可用于本發(fā)明中。例如，可以在本領(lǐng)域找至1J多個(gè)指導(dǎo)，例如 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ；ffetmur,1991, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4) :227-259 ；Ausubel 等人(eds. ),1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley&Sons,Inc. , New York),見(jiàn) Unit 2. 10 ；和美國(guó)專利號(hào)5，789，550。另外，可以在PCR試劑生產(chǎn)商和/或銷售商例如Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut)出版的PCR程序中找到此類指導(dǎo)。具體地，可以根據(jù)本領(lǐng)域中提供的指導(dǎo)，考慮例如多個(gè)變量來(lái)確定適宜的PCR條件，所述變量包括寡核苷酸的長(zhǎng)度和堿基對(duì)濃度、離子強(qiáng)度、錯(cuò)配堿基對(duì)的發(fā)生率和所選的用于寡核苷酸退火的溫度。一般地，包含DNA模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物含有進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)必需的試劑。通常而言，混合物包含用于聚合的試劑，例如熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。更通常地，除了熱穩(wěn)定性 DNA聚合酶之外，混合物包含脫氧核苷5'三磷酸(dNTP)，以及在合適的緩沖液中的二價(jià)金屬陽(yáng)離子。可用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶的典型實(shí)例包括TaqDNA聚合酶、Klentaq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶和Tfl DNA 聚合酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在本發(fā)明中使用Klentaq和Pfu DNA聚合酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明中的Klentaq和Pfu DNA聚合酶的比例是=Klentaq DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶=1 1至3 1。注意本文描述的涉及兩個(gè)端點(diǎn)“之間”的范圍也包括端點(diǎn)值。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，第一步PCR的PCR反應(yīng)混合物包含2單位至3單位的Klentaq DNA聚合酶和1單位至1. 5單位的Pfu DNA聚合酶。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，第二步PCR的PCR反應(yīng)混合物包含2. 5單位至3. 5單位的Klentaq DNA 聚合酶和1單位至2單位的Pfu DNA聚合酶。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，第一步和第二步PCR中的每一個(gè)獨(dú)立地使用甜菜堿(betaine)。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，第一步和第二步PCR的每一個(gè)的 PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地包含數(shù)量為0. 75M至2M的甜菜堿。在一個(gè)實(shí)施方式中，在第一步和第二步PCR的每一個(gè)中，每個(gè)PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地在溫度Tl溫育時(shí)間段R1，然后進(jìn)行多個(gè)降落PCR循環(huán)。每個(gè)降落循環(huán)包括在溫度T2溫育PCR反應(yīng)混合物時(shí)間段R2;然后在溫度[T3-(V V χ m)]溫育時(shí)間段R3，mth循環(huán)；然后在溫度T4溫育時(shí)間段R4。通常而言，Tl和T2獨(dú)立地是90°C至100°C ；T3和T4獨(dú)立地是 65°C至70°C ；Rl是1分鐘至5分鐘；R2是5秒至45秒；R3是10秒至40秒；R4是5分鐘至 20分鐘；并且V是0. 2°C至0. 80C (e. g.，0. 5°C )。更通常而言，Rl是1分鐘至3分鐘；R2是10秒至20秒；R3是15秒至25秒；并且R4是8分鐘至15分鐘。在具體的實(shí)施方式中， Rl是1分鐘至3分鐘；R2是10秒至20秒；R3是15秒至25秒；R4是8分鐘至15分鐘；Tl 是 94°C ；T2 是 94°C ；T3 是 68°C ；T4 是 68°C ；V 是 0. 5°C。通常而言，降落PCR的循環(huán)數(shù)是20至50，例如20至40。在具體的實(shí)施方式中，降落PCR的循環(huán)數(shù)是30。如上所述，通常而言，可以在組合的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中進(jìn)行RT 和PCR步驟。在一些具體實(shí)施方式
中，在逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中組合RT和 PCR步驟，優(yōu)選在巢式RT-PCR中。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定HCV感染的樣品中的HCV核酸分子的方法。在測(cè)定方法中，通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意合適的方法對(duì)通過(guò)如上所述的擴(kuò)增方法制備的擴(kuò)增的 HCV核酸分子進(jìn)行測(cè)序。HCV核酸分子的確定的序列可用于例如開發(fā)用于診斷和/或治療患者中的HCV感染的新的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增和/或測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的HCV核酸分子的試劑盒。通常而言，本發(fā)明的試劑盒包含如上所述的RT弓丨物；如上所述的PCR外引物對(duì)(第一外引物和第二外引物)；和如上所述的PCR內(nèi)引物對(duì)(第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶。此類RT和PCR 引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的具體實(shí)例如上文所描述。試劑盒還可以包含描述如何使用該試劑盒的書面說(shuō)明書(例如，描述用于HCV擴(kuò)增和/或測(cè)定方法的說(shuō)明書)和方法所需的化學(xué)試劑，以及任何其它成分。這些試劑盒還可以包含，例如，用于樣品收集(例如收集血液樣品)的試劑和用于從HCV感染的樣品收集和純化HCVRNA的試劑。本發(fā)明還提供了 PCR引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物包括SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5’末端的位置1至14中的1、2或3個(gè) (或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:10的5，末端的位置1至12中的1、2或 3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO :11的5，末端的位置1至12中的1、2 或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸； SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 13的5，末端的位置1 至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 3的那些核苷酸之外的其它核苷酸；SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:14的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸；SEQ ID NO 15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 15的5， 末端的位置1至16中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 16 的5’末端的位置1至13中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16 的那些核苷酸之外的其它核苷酸；或SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:17的5’末端的位置1至13中的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ IDNO 17的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；在其3，末端包含SEQ ID NO 10 所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；在其3’末端包含SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列， 其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO=Il的那些核苷酸之外的其它核苷酸；在其3’末端包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3 個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；在其 3’末端包含SEQ ID NO :13所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè)) 核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13的那些核苷酸之外的其它核苷酸；或，在其3’末端包含SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是 SEQ ID NO :14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物包含 SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列；SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列；SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列；SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列；SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列；SEQ ID NO 14所示的核苷酸序列；SEQ ID NO 15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:15的 1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO :16的1、2或3個(gè)(或者1 或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16的那些核苷酸之外的其它核苷酸；或，SEQ ID NO 17所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID N0:17的1、2或3個(gè)(或者1或2個(gè))核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :17的那些核苷酸之外的其它核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物在其3，末端包含SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列；在其3，末端包含SEQ ID NO 10 所示的核苷酸序列；在其3’末端包含SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列；在其3’末端包含 SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列；在其3，末端包含SEQ ID NO 13所示的核苷酸序列；在其3’末端包含SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物在其3，末端包含SEQ ID NO 15所示的核苷酸序列；在其3，末端包含SEQ ID NO 16所示的核苷酸序列；或在其3’末端包含SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列。這些引物的任意組合也包括在本發(fā)明內(nèi)。用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法本發(fā)明的引物的具體長(zhǎng)度如上文所描述。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定HCV核酸的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒包含如上所述的本發(fā)明的PCR引物。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，試劑盒包含如上所述的PCR 外引物對(duì)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，試劑盒包含PCR內(nèi)引物對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒包含本發(fā)明的PCR引物和如上所述的RT引物。包含于試劑盒中的RT和PCR 引物的具體實(shí)例如上文所述。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和試劑盒中使用的每個(gè)PCR引物包含分別與 SEQ ID而2-7和9-17至少80%、85%、89%或90%同一的核苷酸序列。通過(guò)如上所述的RT-PCR方法獲得的PCR擴(kuò)增子的群體的序列可以直接被測(cè)序。 或者，可以將來(lái)自擴(kuò)增的DNA的群體的PCR擴(kuò)增子進(jìn)行分子克隆(或亞克隆)，然后克隆的 (或亞克隆的)產(chǎn)物可用于核苷酸序列測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)通過(guò)如上所述的RT-PCR方法制備的擴(kuò)增子進(jìn)行克隆(或亞克隆)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任意合適方法進(jìn)行此類克隆?？梢孕揎桺CR內(nèi)引物以允許與限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的互補(bǔ)，從而允許產(chǎn)物被連接進(jìn)入經(jīng)合適的限制性核酸內(nèi)切酶消化的載體?；蛘撸梢允褂闷侥┒丝寺CR擴(kuò)增子直接插入至非產(chǎn)物特異性載體序列。由于 PCR中通常使用的DNA聚合酶可能使PCR擴(kuò)增子的3’末端的另外的脫氧腺苷發(fā)生聚合，所以也可以使用TA克隆來(lái)亞克隆擴(kuò)增子?？梢酝ㄟ^(guò)修飾PCR引物的5’末端的序列(從而5’ 末端脫氧腺苷殘基增加具有3’脫氧腺苷懸突的PCR擴(kuò)增子的分?jǐn)?shù))來(lái)調(diào)節(jié)向PCR擴(kuò)增子的 3’末端非特異性添加脫氧腺苷的效率，從而改善TA克隆的效率(見(jiàn)Peng等人，Adenosine added on the primer 5' end improved TA cloning efficiency of polymerase chain reaction products, Analytical Biochemistry,第 363 卷，第 1 其月，2007 年 4 月 1 日，第 163-165 頁(yè))。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，從通過(guò)如上所述的RT-PCR方法制備的擴(kuò)增子制備克隆的產(chǎn)物，其中第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列，并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:17所示的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，第一內(nèi)引物包含SEQ IDNO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 15的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :15的核苷酸之外的那些核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID N0:16或SEQ ID N0 17所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:16和SEQ ID NO 17的核苷酸之外的那些核苷酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，第一內(nèi)引物包含SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO :15的 5’末端的位置1至16中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的核苷酸之外的那些核苷酸；并且第二內(nèi)引物包含SEQ ID N0:16或SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的5，末端的位置1至13中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的核苷酸之外的那些核苷酸。然后，克隆的(或亞克隆的)產(chǎn)物可用于多個(gè)下游應(yīng)用，包括核苷酸序列測(cè)定。例如，克隆的產(chǎn)物可用于轉(zhuǎn)染宿主生物，可以在體內(nèi)擴(kuò)增來(lái)自宿主生物的質(zhì)粒，從而允許進(jìn)行單個(gè)病毒變體的序列分析。還可以將克隆的擴(kuò)增子或其片段克隆進(jìn)入其它載體。有多種方法可用于將擴(kuò)增子導(dǎo)入合適的載體(見(jiàn)，例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.； ffetmur, 1991, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley&Sons, Inc. , New York)。引物可以是天然的或合成的。對(duì)于PCR，引物優(yōu)選是單鏈寡脫氧核糖核苷酸。 通常而言，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意合適方法來(lái)合成本文公開的引物，例如Ozaki et al, Nuc. Acids Res. 20 :5205-5214(1992) ；Agrawal et al, Nuc. Acids Res. 18 5419-5423(1990)等。方便地，在自動(dòng)化 DNA 合成器例如 Applied Biosystems, Inc, Foster City, Calif, model 392，394或3900DNA/RNA合成器上使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)法例如亞磷酰胺化學(xué)法合成寡核苷酸引物(Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48 :2223-2311 (1992)，美國(guó)專利號(hào) 4，980，460，4，725，677，4，415，732，4，458，066 和 4，973，679)，或者從商業(yè)上的銷售商 (Invitrogen, Carlsbad, CA USA)獲得。引用的所有文獻(xiàn)通過(guò)引用方式并入本文。為了更完整地理解本發(fā)明，給出了以下制備和測(cè)試實(shí)施例。這些實(shí)施例僅是為了解釋的目的，不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.方法和材料從血漿提取RNA使用QIAamp Virus BioRobot 9604 Kit(Qiagen, Valencia, CAUSA)從血菜中提取RNA，包括HCV病毒RNA，只不過(guò)將生產(chǎn)商的說(shuō)明書修改為用于人工分離。簡(jiǎn)而言之，將血菜(220 660 μ 1)與蛋白酶(40 120 μ 1)和QIAamp AL緩沖液Q40 720 μ 1)(補(bǔ)充了 20 μ g載體RNA/柱)混合。將混合物在56°C溫育15分鐘。向每個(gè)孔中加入無(wú)水乙醇 093 875 μ 1)并混合均勻。將混合物載入QIAamp柱并通過(guò)蠕動(dòng)微泵(IPS-16 ；Ismatec, Zurich, Switzerland)抽吸使其通過(guò)該柱。如上所述通過(guò)施加真空，分別以1000 μ 1 Affl緩沖液和1000 μ 1 AW2緩沖液(Qiagen)洗滌柱子。通過(guò)在6，000 Xg旋轉(zhuǎn)10分鐘以1000 μ 1 AW2緩沖液洗滌柱子，然后通過(guò)在6，OOOXg旋轉(zhuǎn)15分鐘使其干燥。向每個(gè)柱中加入40 μ 1 RNA貯液(Ambion)，并在室溫溫育5分鐘。通過(guò)在6，000 X g離心10分鐘洗脫RNA。然后重復(fù)洗脫一次以增大產(chǎn)率。優(yōu)選立即使用所分離的RNA，或儲(chǔ)存于-80°C。可以從IfQIAamp 96孔板處理多達(dá)96個(gè)樣品，可以使用多個(gè)板以增大處理量。從患者血漿擴(kuò)增和測(cè)序HCV多聚蛋白的編碼區(qū)通過(guò)以巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增跨越HCV多聚蛋白編碼區(qū)的大約8991個(gè)核苷酸的HCV RNA片段(殘基286至9277，HCV參考序列H77，NCBI登記號(hào)NC_0041(^)來(lái)進(jìn)行HCV的序列分析。從病毒RNA合成跨越HCV多聚蛋白編碼區(qū)的互補(bǔ)性DNA(cDNA)片段其中使用2. 5mM oligo_dA20引發(fā)，使用經(jīng)修改的Superscript III RNase Η-Reverse Transcriptase 1 ^: (Invitrogen, CA) ； jf ^h 1 : RT 中使用 400 單位的 Superscript III，40 單位的 RNAseOUTanvitrogen)，PC2 反應(yīng)緩沖液 (50mM Tris-HCl pH 9. 1，16mM硫酸銨，3. 5mM 氯化鎂，和 150mg/ml BSA ；AB Peptides,MO), 并使用階梯式延伸溫度(25°C 10分鐘，42°C 60分鐘，50°C 30分鐘，和55°C 30分鐘)。將完成的RT反應(yīng)1 1稀釋進(jìn)入第一 PCR反應(yīng)(40μ1)，其中含有PC2反應(yīng)緩沖液，200mM dNTP (Clontech, CA)，1. 5M 甜菜堿(Sigma Aldrich, M0)、2· 56 單位的 Klentaq DNA 聚合酶 (AB Peptides, M0) U. 28 單位的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene，CA)和 400mM 每種引物表1.用于擴(kuò)增HCV編碼區(qū)的引物的列表
權(quán)利要求
1.從HCV感染的樣品擴(kuò)增丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法，包括通過(guò)兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCVRNA的基因組的DNA模板的區(qū)段，其中第一步PCR使用第一外引物和第二外引物，并且第二步PCR使用第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物，其中i)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO 2 5’ -GAGTAGTGTTGGGTCG-3’ (SEQ ID NO 2),ii)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID NO 3或SEQ ID NO 4 5，-CACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 3)或5’ -CAVGCTGTGATATATG-3‘ (SEQ ID NO 4), 其中V是A、C或G;iii)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO 5 5，-GGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO: 5)，并且iv)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO 6或SEQ ID NO 7 5，-TAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 6)或5，-TARCCAGCRACGAACC-3‘ (SEQ ID NO 7), 其中R是A或G。
2.權(quán)利要求1的方法，其中內(nèi)引物和外引物中的每一個(gè)獨(dú)立地是15-50mer。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；并且b)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID N0:10或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或 5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO: 11)， 其中Y是C、T或U ；并且V是A、C或G。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中a)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；并且b)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:13或SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸 5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 13)或 5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3‘ (SEQ ID NO: 14)， 其中R是A或G。
5.權(quán)利要求4的方法，其中a)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 15的5，末端的位置1至16中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 15)；并且b)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:16或SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的5，末端的位置1至13中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 16)或 5’ -ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3’ (SEQ ID NO: 17)， 其中R是A或G。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸5’ -CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3’ (SEQ ID NO 9)；b)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID N0:10或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或 5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO: 11)， 其中Y是C、T或U;并且V是A、C或G;c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:13或SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 13)或 5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3‘ (SEQ ID NO: 14)， 其中R是A或G。
7.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸5’ -CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3’ (SEQ ID NO 9)；b)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID N0:10或SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或·5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO: 11)，其中Y是C、T或U;并且V是A、C或G;c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 15的5，末端的位置1至16中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 15)；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:16或SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列， 其中任選地，SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的5，末端的位置1至13中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 16)或·5’ -ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3’ (SEQ ID NO: 17)，其中R是A或G。
8.權(quán)利要求1-7的方法，其中HCV核酸是基因型Ia或lb。
9.權(quán)利要求8的方法，其中HCV核酸是基因型la。
10.權(quán)利要求9的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :10所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 10的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :13所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 13的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
11.權(quán)利要求9的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :10所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 10的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至16中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :16所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQID NO 13的5，末端的位置1至13中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
12.權(quán)利要求8的方法，其中HCV核酸是基因型lb。
13.權(quán)利要求12的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :14所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 14的5，末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
14.權(quán)利要求12的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 9的5，末端的位置1至14中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，5’末端的位置1至12中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO :11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 12的5，末端的位置1至16中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO :17所示的核苷酸序列，其中任選地，SEQ ID NO 14的5，末端的位置1至13中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增的HCV核酸包含編碼C，El,E2，NS2, NS3， NS4A, NS4B, NS5A 和 NS5B 蛋白的基因。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，還包括使用RT引物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT)形成互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板的步驟，其中所述RT引物的核苷酸序列在其3’末端包含 SEQ ID NO 1 5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO 1),其中η是1- 的整數(shù)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中對(duì)于RT引物，η是10-20的整數(shù)。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述RT引物在其3，末端包含SEQID NO 8的核苷酸序列、5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(SEQ ID NO :8)。
19.權(quán)利要求16-18的方法，其中形成DNA模板的步驟包括在擴(kuò)增步驟之前，使用選自多聚-A RNA和細(xì)菌的tRNA的載體RNA從HCV感染的樣品中分離HCV RNA。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中第一步PCR之后是第二步PCR，并且在第一步和第二步PCR的每一個(gè)中，每個(gè)PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地a)在溫度Tl溫育時(shí)間段Rl，和b)然后進(jìn)行多個(gè)降落PCR循環(huán)，每個(gè)降落循環(huán)包括 i)在溫度T2溫育PCR反應(yīng)混合物時(shí)間段R2 ； )然后在溫度[T3-(V°C xm)]溫育PCR反應(yīng)混合物時(shí)間段R3，mth循環(huán)；和iii)然后在溫度T4溫育PCR反應(yīng)混合物時(shí)間段R4，其中Tl禾Π T2獨(dú)立地是90°C至100°C ；T3和T4獨(dú)立地是65°C至70°C ；Rl是1分鐘至5分鐘；R2是5秒至45秒；R3是10秒至40秒；R4是5分鐘至20分鐘；并且V 是 0. 2°C至 0. 8°C。
21.權(quán)利要求20的方法，其中 Rl是1分鐘至3分鐘；R2是10秒至20秒； R3是15秒至25秒； R4是8分鐘至15分鐘；并且降落PCR的循環(huán)數(shù)是20至50。
22.權(quán)利要求21的方法，其中Tl是94°C；T2是94°C ；T2是68°C ；T3是68°C ；并且V 是0. 5 °C，并且其中降落PCR的循環(huán)數(shù)是30。
23.權(quán)利要求20的方法，其中第一步和第二步PCR的每個(gè)PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地包含 Klentaq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶，二者的比例是Klentaq DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶=1 1至3 1。
24.權(quán)利要求23的方法，其中第一步PCR的PCR反應(yīng)混合物包含2單位至3單位的 Klentaq DNA聚合酶和1單位至1. 5單位的Pfu DNA聚合酶。
25.權(quán)利要求23的方法，其中第二步PCR的PCR反應(yīng)混合物包含2.5單位至3. 5單位的Klentaq DNA聚合酶和1單位至2單位的Pfu DNA聚合酶。
26.權(quán)利要求23的方法，其中第一步和第二步PCR的每一個(gè)的PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地包含數(shù)量為0. 75M至2M的甜菜堿。
27.從HCV感染的樣品擴(kuò)增丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法，包括通過(guò)兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCVRNA的基因組的DNA模板的區(qū)段，其中第一步PCR 使用第一外引物和第二外引物，并且第二步PCR使用第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物，其中i)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸5’ -CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3’ (SEQ ID NO 9)；ii)第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID N0:10或SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:10和SEQ ID NO 11 的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO: 11)，其中Y是C、T或U;并且V是A、C或G;iii)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；并且iv)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID N0:13或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14 的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO: 13)或5’ -TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3‘ (SEQ ID NO: 14)，其中R是A或G。
28.權(quán)利要求27的方法，其中內(nèi)引物和外引物中的每一個(gè)獨(dú)立地是15-50mer。
29.權(quán)利要求27或28的方法，其中HCV核酸是基因型Ia或lb。
30.權(quán)利要求四的方法，其中HCV核酸是基因型la。
31.權(quán)利要求30的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :10所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :13所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 13的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
32.權(quán)利要求30的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :10所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 10的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :16所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 16的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
33.權(quán)利要求四的方法，其中HCV核酸是基因型lb。
34.權(quán)利要求33的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :14所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
35.權(quán)利要求33的方法，其中a)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；b)第二外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；c)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :15所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 15的那些核苷酸之外的其它核苷酸；并且d)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :17所示的核苷酸序列，其中任選地，其1至13中的1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 17的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
36.權(quán)利要求27-35任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增的HCV核酸分子包含編碼C，El，E2，NS2， NS3, NS4A, NS4B, NS5A 和 NS5B 蛋白的基因。
37.權(quán)利要求27-36任一項(xiàng)的方法，還包括使用RT引物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT)形成互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板的步驟，其中所述RT引物的核苷酸序列在其3’末端包含 SEQ ID NO 1 5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO 1),其中η是1- 的整數(shù)。
38.權(quán)利要求37的方法，其中對(duì)于RT引物，η是10-20的整數(shù)。
39.權(quán)利要求37的方法，其中RT引物在其3，末端包含SEQID NO 8的核苷酸序列5，-ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ-3，(SEQ ID NO :8)。
40.權(quán)利要求37-39的方法，其中形成DNA模板的步驟包括在擴(kuò)增步驟之前，使用選自多聚-A RNA和細(xì)菌的tRNA的載體RNA從HCV感染的樣品中分離HCV RNA。
41.權(quán)利要求40的方法，其中使用RT引物在HCV基因組的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)引發(fā) HCV RNA0
42.權(quán)利要求41的方法，其中第一內(nèi)引物和第一外引物獨(dú)立地在HCV基因組的5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)引發(fā)，并且第二內(nèi)引物和第二外引物獨(dú)立地在HCV基因組的NS5B區(qū)引發(fā)。
43.權(quán)利要求27-42任一項(xiàng)的方法，其中第一步PCR之后是第二步PCR，并且在第一步和第二步PCR的每一個(gè)中，每個(gè)PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地a)在溫度Tl溫育時(shí)間段Rl，和b)然后進(jìn)行多個(gè)降落PCR循環(huán)，每個(gè)降落循環(huán)包括 i)在溫度T2溫育PCR反應(yīng)混合物時(shí)間段R2 ； )然后在溫度[T3-(V °C χ m)]溫育PCR反應(yīng)混合物時(shí)間段R3，mth循環(huán)；和iii)然后在溫度T4溫育PCR反應(yīng)混合物時(shí)間段R4，其中Tl禾Π T2獨(dú)立地是90°C至100°C ；T3和T4獨(dú)立地是65°C至70°C ；Rl是1分鐘至5分鐘；R2是5秒至45秒；R3是10秒至40秒；R4是5分鐘至20分鐘；并且V 是 0. 2°C至 0. 8°C。
44.權(quán)利要求43的方法，其中 Rl是1分鐘至3分鐘；R2是10秒至20秒； R3是15秒至25秒； R4是8分鐘至15分鐘；并且降落PCR的循環(huán)數(shù)是20至50。
45.權(quán)利要求44的方法，其中Tl是94°C；T2是94°C ；T2是68°C ；T3是68°C ；并且V 是0. 5 °C，并且其中降落PCR的循環(huán)數(shù)是30。
46.權(quán)利要求45的方法，其中第一步和第二步PCR的每個(gè)PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地包含 Klentaq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶，二者的比例是Klentaq DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶=1 1至3 1。
47.權(quán)利要求46的方法，其中第一步PCR的PCR反應(yīng)混合物包含2單位至3單位的 Klentaq DNA聚合酶和1單位至1. 5單位的Pfu DNA聚合酶。
48.權(quán)利要求46的方法，其中第二步PCR的PCR反應(yīng)混合物包含2.5單位至3. 5單位的Klentaq DNA聚合酶和1單位至2單位的PfuDNA聚合酶。
49.權(quán)利要求48的方法，其中第一步和第二步PCR的每一個(gè)的PCR反應(yīng)混合物獨(dú)立地包含數(shù)量為0. 75M至2M的甜菜堿。
50.權(quán)利要求1-49任一項(xiàng)的方法，其中DNA模板擴(kuò)增步驟包括i)通過(guò)第一PCR擴(kuò)增 DNA模板的區(qū)段以產(chǎn)生第一擴(kuò)增子；和ii)通過(guò)第二 PCR擴(kuò)增第一擴(kuò)增子的至少一部分以產(chǎn)生包括擴(kuò)增的HCV核酸的第二擴(kuò)增子。
51.測(cè)定HCV感染的樣品中的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法，包括a)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-50任一項(xiàng)的兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)于樣品中的 HCV RNA的基因組的DNA模板，以產(chǎn)生擴(kuò)增的HCV核酸；和b)對(duì)擴(kuò)增的HCV核酸進(jìn)行測(cè)序。
52.測(cè)定HCV感染的樣品中的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法，包括a)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-50任一項(xiàng)的兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)于樣品中的HCV RNA的基因組的DNA模板，以產(chǎn)生擴(kuò)增子；b)克隆所述擴(kuò)增子；和c)對(duì)克隆的擴(kuò)增子的HCV核酸進(jìn)行測(cè)序。
53.監(jiān)視感染了HCV的患者的抗性譜的方法，包括a)從患者獲得HCV感染的樣品；b)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-50任一項(xiàng)的兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板；和b)對(duì)擴(kuò)增的HCV核酸進(jìn)行測(cè)序。
54.用于測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的試劑盒，其包含含有第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)，其中i)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO 2 5，-GAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID N0:2)，并且ii)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID NO 3或SEQ ID NO 4 5，-CACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 3)或5’ -CAVGCTGTGATATATG-3‘ (SEQ ID NO 4), 其中V是A、C或G。
55.權(quán)利要求討的試劑盒，其中i)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸 5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；并且 b)第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:10或SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或 5’-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO: 11)， 其中Y是C、T或U ；并且V是A、C或G。
56.用于測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的試劑盒，其包含含有第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO 5 5，-GGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO: 5)，并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID NO 6或SEQ ID NO 7 5，-TAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 6)或·5，-TARCCAGCRACGAACC-3‘ (SEQ ID NO 7), 其中R是A或G。
57.權(quán)利要求56的試劑盒，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸·5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID N0:13或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14 的那些核苷酸之外的其它核苷酸、5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO: 13)或 5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3‘ (SEQ ID NO: 14)， 其中R是A或G。
58.權(quán)利要求57的試劑盒，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:15:、5，-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 15)；并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:16或SEQ ID NO 17 5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO: 16)或、5’ -ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3’ (SEQ ID NO: 17)， 其中R是A或G。
59.權(quán)利要求M-58任一項(xiàng)的試劑盒，還包含RT引物，其中RT引物的核苷酸序列包含 SEQ ID NO 1 、、5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中 η 是 1-26 的整數(shù)。
60.用于測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的試劑盒，包含a)包含第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)，其中i)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸、5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；并且ii)第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID N0:10或SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:10和SEQ ID NO 11 的那些核苷酸之外的其它核苷酸、5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID N0:10)，或 5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID N0:11)， 其中Y是C、T或U ；并且V是A、C或G ；和b)包含第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸、5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID N0:13或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14 的那些核苷酸之外的其它核苷酸、5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO :13)或 5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO :14)， 其中R是A或G。
61.權(quán)利要求60的試劑盒，還包含RT引物，其中RT引物的核苷酸序列包含SEQID N0:、1 、5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中 η 是 1-26 的整數(shù)。
62.權(quán)利要求61的試劑盒，其中RT引物的核苷酸序列包含SEQID NO 8 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(SEQ ID NO :8)。
63.用于測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的試劑盒，包含a)RT引物，其中RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 8 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(SEQ ID NO :8)；b)包含第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)，其中i)第一外引物的核苷酸序列包含SEQID NO 9 .5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；并且ii)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID N0:10或SEQ ID NO 11 5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或.5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO: 11)， 其中Y是C、T或U ；并且V是A、C或G ；和c)包含第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:15:.5，-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 15)；并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:16或SEQ ID NO 17 5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 16)或.5’ -ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3’ (SEQ ID NO: 17)， 其中R是A或G。
64.用于測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的試劑盒，包含a)RT引物，其中RT引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID NO 1 5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中η是1- 的整數(shù)；b)包含第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)，其中i)第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :9所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 9的那些核苷酸之外的其它核苷酸.5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；并且ii)第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID N0:10或SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:10和SEQ ID NO=Il 的那些核苷酸之外的其它核苷酸.5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或 5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO :11)， 其中Y是C、T或U ；并且V是A、C或G ；和c)包含第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQID NO :12所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸.5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQID N0:13或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任選地，其1、2或3個(gè)核苷酸獨(dú)立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 13)或 5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3‘ (SEQ ID NO: 14)， 其中R是A或G。
65.用于測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的試劑盒，包含a)RT引物，其中RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 8 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(SEQ ID NO 8)；b)包含第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)，其中i)第一外引物的核苷酸序列在包含SEQID NO 9 5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；并且ii)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID N0:10或SEQ ID NO 11 5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO: 11)， 其中Y是C、T或U ；并且V是A、C或G ；和c)包含第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:12:5，-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:13或SEQ ID NO 14 5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO :13)或5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO :14)， 其中R是A或G。
66.用于測(cè)定來(lái)自HCV感染的樣品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的試劑盒，包含a)RT引物，其中RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 8 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(SEQ ID NO :8)；b)包含第一外引物和第二外引物的PCR外引物對(duì)，其中i)第一外引物的核苷酸序列在包含SEQID NO 9 5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；并且ii)第二外引物的核苷酸序列包含SEQID N0:10或SEQ ID NO 11 5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO: 10)，或5’ -TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3’ (SEQ ID NO :11)， 其中Y是C、T或U ；并且V是A、C或G ；和c)包含第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物的PCR內(nèi)引物對(duì)，其中i)第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:15:5，-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 15)；并且ii)第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQID N0:16或SEQ ID NO 17 5，-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 16)或5’ -ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3’ (SEQ ID N0:17)， 其中R是A或G。
全文摘要
從HCV感染的樣品擴(kuò)增HCV核酸的方法，包括通過(guò)兩步PCR擴(kuò)增互補(bǔ)于來(lái)自樣品的HCV RNA的基因組的DNA模板的區(qū)段，其中第一步PCR使用第一外引物和第二外引物，并且第二步PCR使用第一內(nèi)引物和第二內(nèi)引物。第一外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)核苷酸是SEQ ID NO9的那些核苷酸之外的其它核苷酸。第二外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO10或SEQ ID NO11所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)核苷酸是SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的那些核苷酸之外的其它核苷酸。第一內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO12所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)核苷酸是SEQ ID NO12的那些核苷酸之外的其它核苷酸。第二內(nèi)引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO6或SEQ ID NO7所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO13或SEQ ID NO14所示的核苷酸序列，其中任選地，1、2或3個(gè)核苷酸是SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102341506SQ201080009852
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日
發(fā)明者A·D·孔, B·施姆斯, D·J·巴陀思, E·Z·張, J·A·利普克, J·C·蘇利萬(wàn), J·D·弗朗茲, S·瑟普索德, T·L·基弗爾, Y·周, 林超 申請(qǐng)人:沃泰克斯藥物股份有限公司