專利名稱：新穎的核重編程序物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的核重編程序物質(zhì)及其用途，更具體地，涉及可以替代Klf4的新穎的核重編程序物質(zhì)，和使用所述物質(zhì)建立誘導(dǎo)的多能干(在下文中稱作iPQ細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，小鼠和人iPS細(xì)胞已經(jīng)相繼建立。Yamanaka等人通過(guò)分析EST數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒別出了在多能細(xì)胞(諸如胚胎干細(xì)胞和生殖細(xì)胞)中特異性地表達(dá)基因，并使用敲除的小鼠技術(shù)等，進(jìn)行了功能分析?？紤]到其它研究組的一些報(bào)告，他們選擇了對(duì)個(gè)基因作為在體細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性(重編程序細(xì)胞核)的候選物[wo 2007/069666A1 ；Takahashi,K.和 Yamanaka, S. , Cell, 126 =663-676 (2006) ] 他們?nèi)缦抡T導(dǎo) iPS 細(xì)胞通過(guò)將這 24 個(gè)基因?qū)雭?lái)自報(bào)告小鼠的成纖維細(xì)胞(MEF)中，其中新霉素抗性基因被敲入(knock-in)1^x15基因座中，并借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒，使細(xì)胞表達(dá)這些基因。通過(guò)轉(zhuǎn)移M個(gè)基因中的23個(gè)，他們進(jìn)一步縮小了對(duì)于細(xì)胞核重編程序而言最重要的基因的范圍，并最終鑒別出了 4個(gè)基因0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc作為在體細(xì)胞中的細(xì)胞核重編程序的必需因子[TO2007/069666A1 ；Takahashi，K.和 Yamanaka, S.，Cell,126 :663-676(2006) ] 另外，Yamanaka等人成功地建立了 iPS細(xì)胞(Nanog iPS細(xì)胞)，所述細(xì)胞表現(xiàn)出與在胚胎干(EQ細(xì)胞中的那些幾乎相同的基因表達(dá)和后天修飾特性，并通過(guò)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，成功地制備出嵌合小鼠，其中綠熒光蛋白(GFP)和嘌呤霉素-抗性基因整合進(jìn)Nanog的基因座中，它們的表達(dá)與1^x15表達(dá)相比更集中在多能細(xì)胞中，使源自該小鼠的MEF表達(dá)上述的4個(gè)基因，并成功地選擇出嘌呤霉素-抗性的和GFP-陽(yáng)性細(xì)胞[Okita，K.等人，Nature, 448 :313-317 (2007)]。此后，據(jù)披露，使用除了 c-Myc基因之外的3個(gè)因子，也可以制備iPS細(xì)胞，這也構(gòu)成嵌合小鼠的種系[Nakagawa, M.等人，Nat. Biotethnol. ,26
101-106(2008)]ο此外，Yamanaka等人通過(guò)將與在小鼠中使用的那些相同的4個(gè)基因或3個(gè)基因?qū)肴似つw成纖維細(xì)胞中，成功地建立了 iPS細(xì)胞[W02007/069666A1 ；Takahashi, K.等人，Cell, 131 :861-8720007)]。因此，已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)將確定的因子導(dǎo)入體細(xì)胞中，可以在人和小鼠中制備在多能性方面與胚胎干細(xì)胞相當(dāng)?shù)膇PS細(xì)胞。在4個(gè)基因0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc中，據(jù)報(bào)道，0ct3/4和Sox2是維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性所必需的，且還已經(jīng)報(bào)道，c-Myc參與維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性。同時(shí)，Klf4屬于Krilppel-樣因子(Klf)家族，即控制不同的生物學(xué)過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子，包括增殖、分化、發(fā)育和細(xì)胞凋亡[McConnel 1, B. B.等人，Bioassays, 29 549-557 Q007)]，但是它的功能的細(xì)節(jié)仍然不明。不同于胚胎干細(xì)胞，從植入后胚胎的上胚層建立的上胚層干細(xì)胞(EpiSC)不能形成嵌合的胚胎，甚至當(dāng)注射進(jìn)宿主胚泡中時(shí)。但是，在EpiSC中，以與在胚胎干細(xì)胞中的那些類似的水平表達(dá)0ct3/4和Sox2，而在顯著更低的水平表達(dá)Klf4基因。最近，據(jù)報(bào)道，通過(guò)將單獨(dú)的Klf4基因轉(zhuǎn)入EpiSC中，可以獲得與胚胎干細(xì)胞的性質(zhì)類似的性質(zhì)[Guo, G.等人，Development, 136 1063-1069 (2009) ] 由于胚胎干細(xì)胞不表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)變化，甚至在通過(guò)RNAi抑制(knock down) Klf4 時(shí)[Nakatake, Y.等人，Mol. Cell. Biol. ,26 :7772-7782 (2006)]，但是，Klf4 可能不是維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)所必需的。Yamanaka等人假設(shè)，用屬于相同的各個(gè)家族的其它基因可以替代這4個(gè)基因，并證實(shí)，甚至當(dāng)用Klfl、Klf2或Klf5替換Klf4時(shí)，可以建立 iPS 細(xì)胞[WO 2007/069666A1 ；Nakagawa, M.等人，Nat. Biotethnol. ,26 101-106 (2008) ] Thomson等人的研究組報(bào)道，使用Nanog和LiM8替代Klf4和c_Myc，可以制備人iPS細(xì)胞 [W0 2008/118820A2 ；Yu，J.等人，Science，318 1917-192(^2007)]；可以認(rèn)為，Klf4 的功能與Nanog相比具有許多共同的方面。當(dāng)用視黃酸處理胚胎干細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)它們的分化時(shí)，不僅Klf4的表達(dá)減少，而且 Klf2和Klf5的表達(dá)也減少。注意到該事實(shí)，Jiang等人同時(shí)抑制了 Klf2、Klf4和Klf5，并發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞中誘導(dǎo)了分化，表明Klf家族的至少某些成員(諸如Klf2和KlK)可以在胚胎干細(xì)胞中在功能上替代 Klf4 [Jiang，J.等人，Nat. Cell Biol.，10 :353-360 (2008)]。 他們繼續(xù)將Klf2或Klf5基因或其它轉(zhuǎn)錄因子和后生調(diào)節(jié)因子與3個(gè)基因0ct3/4、SoX2和 c-Myc —起轉(zhuǎn)入MEF中；他們證實(shí)，Klf2和Klf5可以替代Klf4，并發(fā)現(xiàn)，hrrb (—種與雌激素受體類似的孤兒細(xì)胞核受體)也能夠替代Klf4[Feng，B.等人，Nat. Cell Biol. ,11 197-203(2009)]ο

發(fā)明內(nèi)容
在發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用中，最重要的是闡明核重編程序機(jī)制的所有細(xì)節(jié)。鑒別可以替代公知知識(shí)中現(xiàn)有核重編程序物質(zhì)的未知核重編程序物質(zhì)不僅在幫助闡明核重編程序機(jī)制中，而且在開(kāi)發(fā)用于建立最適合臨床應(yīng)用的iPS細(xì)胞的方法中都是非常重要的。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒別新穎的核重編程序物質(zhì)，特別是可以替代Klf4的新穎的核重編程序物質(zhì)，并提供使用所述物質(zhì)建立iPS細(xì)胞的新穎的方法。為了實(shí)現(xiàn)該目的，發(fā)明人不僅對(duì)在多能細(xì)胞(諸如胚胎干細(xì)胞)中特異性地表達(dá)的基因的基因文庫(kù)，而且對(duì)更寬范圍的轉(zhuǎn)錄因子的基因文庫(kù)，進(jìn)行了廣泛的基因分析， 其可以用于建立iPS細(xì)胞作為Klf4的替代物。結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)屬于IRX家族的基因、屬于GLIS家族的基因、屬于PTX家族的基因或DMRT-樣家族B(具有富含脯氨酸的 C-端)1 (DMRTBl)基因與3個(gè)基因0ct3/4、SoX2和c-Myc —起轉(zhuǎn)入成年小鼠皮膚成纖維細(xì)胞或MEF中時(shí)，可以有效地建立iPS細(xì)胞，將這些轉(zhuǎn)錄因子鑒別為在功能上可以替代Klf4 的新穎的核重編程序物質(zhì)，并開(kāi)發(fā)了本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容[1] 一種生產(chǎn)iPS細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟向體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入下述的 ⑴和⑵(1) 一種或多種選自下述的物質(zhì)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、DMRTBl以及編碼它們的核酸，(2)當(dāng)與Klf4組合時(shí)，能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)。[2]根據(jù)上面[1]所述的方法，其中在上面(1)中提及的物質(zhì)包括至少一種選自下述的物質(zhì)droquois同源框蛋白6(IRX6)、GLIS家族鋅指1 (GLISl)、成對(duì)-樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子2亞型b (PITX2)、DMRTBl以及編碼它們的核酸。[3]根據(jù)上面[1]所述的方法，其中在上面(2)中提及的物質(zhì)選自0ct家族的成員、Sox家族的成員、Myc家族的成員、Nanog和Lin家族以及編碼它們的核酸。[4]根據(jù)上面[1]所述的方法，其中在上面O)中提及的物質(zhì)是0ct3/4。[5]根據(jù)上面[1]所述的方法，其中在上面O)中提及的物質(zhì)是0ct3/4和Sox2。[6]根據(jù)上面[1]所述的方法，其中在上面(2)中提及的物質(zhì)是0ct3/4和c-Myc。[7]根據(jù)上面[1]所述的方法，其中在上面O)中提及的物質(zhì)是0ct3/4、Sox2和 c-Mycο[8] 一種從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)物，其包含下述的(1)和O):(1) 一種或多種選自下述的物質(zhì)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、DMRTBl以及編碼它們的核酸，(2)當(dāng)與Klf4組合時(shí)，能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)。[9]根據(jù)上面[8]所述的誘導(dǎo)物，其中在上面⑴中提及的物質(zhì)包括至少一種選自下述的物質(zhì)IRX6、GLIS1、PITX2、DMRTBl以及編碼它們的核酸。[10] 一種iPS細(xì)胞，其含有編碼一種或多種選自下述的因子的外來(lái)核酸IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員和DMRTBl。[11]根據(jù)上面[10]所述的iPS細(xì)胞，其含有編碼一種或多種選自下述的因子的外來(lái)核酸IRX6、GLISl、PITX2 和 DMRTBl。[12]根據(jù)上面[10]所述的iPS細(xì)胞，其中所述至少一種外來(lái)核酸整合進(jìn)基因組中。[13] 一種生產(chǎn)體細(xì)胞的方法，所述方法包括處理根據(jù)上面[10]所述的iPS細(xì)胞，以誘導(dǎo)其分化成體細(xì)胞。[14] 一種從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)物，其包含一種或多種選自下述的物質(zhì) IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、DMRTBl以及編碼它們的核酸，其中所述誘導(dǎo)物與當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)一起，轉(zhuǎn)移進(jìn)體細(xì)胞中。[15] 一種或多種選自下述的物質(zhì)用于生產(chǎn)iPS細(xì)胞的用途IRX家族的成員、GLIS 家族的成員、PTX家族的成員、DMRTBl以及編碼它們的核酸，其中所述物質(zhì)與當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)一起，轉(zhuǎn)移進(jìn)體細(xì)胞中。[16] 一種選自下述的物質(zhì)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、 DMRTBl以及編碼它們的核酸，所述物質(zhì)作為從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)物，其中所述物質(zhì)與當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)一起，轉(zhuǎn)移進(jìn)體細(xì)胞中。[17]根據(jù)上面[10]所述的iPS細(xì)胞在生產(chǎn)體細(xì)胞中的用途。[18]根據(jù)上面[10]所述的iPS細(xì)胞，其作為生產(chǎn)體細(xì)胞的細(xì)胞來(lái)源。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)證實(shí)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員和 DMRTBl能夠在核重編程序中在功能上替代Klf4。預(yù)見(jiàn)到研究這些核重編程序物質(zhì)的作用機(jī)制會(huì)促進(jìn)核重編程序機(jī)制的闡明。本發(fā)明最近已經(jīng)將除了在胚胎干細(xì)胞中特異性地表達(dá)的那些以外的基因鑒別為核重編程序物質(zhì)的事實(shí)提示在將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在未知的其它的核重編程序物質(zhì)。


圖1是顯示了通過(guò)人(Gateway 進(jìn)入克隆的功能來(lái)選擇進(jìn)入克隆的步驟(N. Goshima 等人，Nature methods, 2008)的示意圖。圖2顯示了從轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)入克隆產(chǎn)生用于體細(xì)胞重編程序因子篩選的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)文庫(kù)的流程圖。圖3是借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒把共4種基因(即，3個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和G06(基因名GLIS1)、H08(基因名DMRTB1)或 HlO (基因名PITX2))轉(zhuǎn)入 Nanog-GFP 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中所得到的GFP-陽(yáng)性菌落的形態(tài)學(xué)的代表性照片?！癒lf-G6-1”指示與3個(gè)基因一起轉(zhuǎn)移G06(基因名GLIS1)得到的iPS細(xì)胞克??；“Klf-H8-2”指示與3個(gè)基因一起轉(zhuǎn)移H08(基因名=DMRTBl)得到的iPS細(xì)胞克?。弧癒lf-HlO-l”和“Klf-H10”指示與3個(gè)基因一起轉(zhuǎn)移HlO (基因名PITX》得到的iPS細(xì)胞克隆。PO顯示了在菌落建立時(shí)拍攝的圖像；Pl顯示了第1代的圖像( 孔)；P2顯示了第2代的圖像(6孔)。對(duì)于每組3個(gè)照片，左圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像，中圖顯示了相差圖像，右圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像和相差圖像的重疊照片。僅Klf-HlO-I通過(guò)Reseed方法建立，而其它通過(guò)MSTO方法建立。圖4是借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒把共4種基因(S卩，即，3個(gè)基因(0Ct3/4、SOX2、C-MyC)和F09(基因名IRX6)、G06(基因名GLIS1)、H08 (基因名DMRTB1)或 HlO (基因名PITX2))轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中所得到的GFP-陽(yáng)性菌落在菌落建立時(shí)的形態(tài)學(xué)的代表性照片。“Klf-F9”指示與3個(gè)基因一起轉(zhuǎn)移F09(基因名IRX6)得到的iPS細(xì)胞克??；“Klf-G6-1”和“Klf-G6-2”指示與3個(gè)基因一起轉(zhuǎn)移G06(基因名=GLISl)得到的iPS細(xì)胞克隆；“Klf-H8-1和“Klf-H8-2”指示與3個(gè)基因一起轉(zhuǎn)移H08(基因名DMRTB1)得到的iPS細(xì)胞克隆；“Klf-ΗΙΟ”指示與3個(gè)基因一起轉(zhuǎn)移HlO (基因名PITX2)得到的iPS細(xì)胞克隆?！癛eseed”顯示了通過(guò)Reseed方法得到的結(jié)果；“MST0”顯示了通過(guò)MSTO方法得到的結(jié)果。圖 5 是在 G6-1 (Klf-G6-1)、H8_2 (Klf_H8_2)和 HlO (Klf-HlO) iPS 細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)PMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖6是在圖5中的那些以外的另一個(gè)HlO (Klf-HlO) iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)PMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖 7 是在 G6-1 (Klf-G6-1)、H8_2 (Klf_H8_2)和 HlO (Klf-HlO) iPS 細(xì)胞克隆上進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果的代表性照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞；“ES”和“iPS”指示小鼠胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞；“Sox2RT- “是陰性對(duì)照。圖8是在圖7中的那些以外的另一個(gè)HlO (Klf-HlO) iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞；“ES”和“iPS”指示小鼠胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞；“Sox2RT-”是陰性對(duì)照。圖 9 是通過(guò)把 3 種因子(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和 G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或H10(PITX2)的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中建立的iPS細(xì)胞(GFP-陽(yáng)性細(xì)胞)的菌落的數(shù)目的計(jì)數(shù)結(jié)果的圖形表示?？偨Y(jié)了6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖 10 是通過(guò)把 2 種因子(0ct3/4、Sox2)和 G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或 H10(PITX2) 的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中建立的iPS細(xì)胞(GFP-陽(yáng)性細(xì)胞)的菌落的數(shù)目的計(jì)數(shù)結(jié)果的圖形表示?？偨Y(jié)了2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖11是代表性照片，其顯示了通過(guò)把3種因子(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和 G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或HlO (PITX2)的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中建立的iPS細(xì)胞的菌落，和通過(guò)把2種因子(0ct3/4、Sox2)和G6(GLIS1)或H8 (DMRTBl)的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中建立的iPS細(xì)胞的菌落。PO顯示了在菌落建立時(shí)拍攝的圖像；Pl顯示了第1代的圖像；P2顯示了第2代的圖像。對(duì)于每組3張照片，左圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像，中圖顯示了相差圖像，右圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像和相差圖像的重疊照片。圖12是在圖11所示的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)PMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖13是在圖11所示的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片。 在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“ES”和“iPS”指示使用4種因子 (0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的小鼠胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞。圖14是通過(guò)把2種因子(0ct3/4、c-Myc)和HlO (PITX2)的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中建立的iPS細(xì)胞的菌落的代表性照片。PO顯示了在菌落建立時(shí)拍攝的圖像；Pl顯示了第1代的圖像；P2顯示了第2代的圖像。對(duì)于每組3張照片，左圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像，中圖顯示了相差圖像，右圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像和相差圖像的重疊照片。圖15是在圖14所示的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)PMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖16是在圖14所示的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片。 在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“ES”和“iPS”指示使用4種因子 (0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的小鼠胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞。圖 17 是通過(guò)把 3 種因子(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和 G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或 HlO (PITX2)的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS細(xì)胞(GFP-陽(yáng)性細(xì)胞)的菌落的數(shù)目的計(jì)數(shù)結(jié)果的圖形表示。總結(jié)了4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖 18 是通過(guò)把 2 種因子(0ct3/4、Sox2)和 G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或 H10(PITX2) 的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS細(xì)胞(GFP-陽(yáng)性細(xì)胞)的菌落的數(shù)目的計(jì)數(shù)結(jié)果的圖形表示。在2 (OS)+HlO中建立的菌落的數(shù)目是1 (對(duì)于MSTO方法)和1 (對(duì)于 Reseed 方法)。圖19的代表性照片顯示了通過(guò)把3種因子(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和G6 (GLISl)、 H8 (DMRTBl)或HlO (PITX2)的組合轉(zhuǎn)入Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS細(xì)胞的菌落，和通過(guò)把 2 種因子(0ct3/4、Sox2)和 G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或 H10(PITX2)的組合轉(zhuǎn)入 Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS細(xì)胞的菌落。PO顯示了在菌落建立時(shí)拍攝的圖像；Pl顯示了第1代的圖像；P2顯示了第2代的圖像。0S+G6、0S+H8和0S+H10是在PO時(shí)的照片。對(duì)于每組3張照片，左圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像，中圖顯示了相差圖像，右圖顯示了 GFP-陽(yáng)性菌落圖像和相差圖像的重疊照片。圖20是在圖19所示的iPS細(xì)胞克隆(3種因子+G6、H8或H10)上進(jìn)行基因組-PCR 的結(jié)果的照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)PMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖21是在圖19所示的iPS細(xì)胞克隆(3種因子+G6、H8或H10)上進(jìn)行基因組-PCR 的結(jié)果的照片。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“ES”和“ iPS”指示使用4種因子(0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的小鼠胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞。圖22是在畸胎瘤上進(jìn)行基因組-PCR的結(jié)果的照片，所述畸胎瘤通過(guò)將從成年小鼠(Nanog-GFP小鼠)皮膚成纖維細(xì)胞建立的iPS克隆(G6-1克隆、G6-6克隆、H8-2克隆、 HlO克隆)皮下注射進(jìn)免疫缺陷的小鼠中來(lái)制備。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)pMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖23顯示了通過(guò)將G6-1克隆或G6_6克隆皮下注射進(jìn)免疫缺陷的小鼠中制備的畸胎瘤的組織學(xué)染色的圖像(蘇木素-曙紅染色)。圖M顯示了通過(guò)將H8-2克隆或HlO克隆皮下注射進(jìn)免疫缺陷的小鼠中制備的畸胎瘤的組織學(xué)染色的圖像(蘇木素-曙紅染色)。圖25的散點(diǎn)圖顯示了為了測(cè)定在K-G6和MEF之間、或在K-G6和4F基因之間是否存在基因表達(dá)模式差異而進(jìn)行的DNA微陣列分析的結(jié)果(變化倍數(shù)線2-倍)。圖沈的散點(diǎn)圖顯示了為了測(cè)定在K-H8和MEF之間、或在K_H8和4F之間是否存在基因表達(dá)模式差異而進(jìn)行的DNA微陣列分析的結(jié)果(變化倍數(shù)線2-倍)。圖27的散點(diǎn)圖顯示了為了測(cè)定在K-HlO和MEF之間、或在K-HlO和4F基因之間是否存在基因表達(dá)模式差異而進(jìn)行的DNA微陣列分析的結(jié)果(變化倍數(shù)線2-倍)。圖觀顯示了基于各個(gè)細(xì)胞之間的相關(guān)系數(shù)而進(jìn)行的聚簇的結(jié)果。圖四的代表性照片是通過(guò)把3個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c_Myc)和G6 (GLISl)轉(zhuǎn)入 HDF中所建立的iPS細(xì)胞的菌落圖像和堿性磷酸酶染色圖像。為了對(duì)照，也顯示了用4個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的iPS細(xì)胞的菌落圖像。圖30是通過(guò)把3個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c_Myc)和G6 (GLISl)轉(zhuǎn)入HDF中所建立的iPS細(xì)胞的第2代菌落的代表性照片。為了對(duì)照，也顯示了用4個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、 c-Myc、Klf4)建立的iPS細(xì)胞的菌落圖像。圖31是基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片，所述基因組-PCR是在通過(guò)把3個(gè)基因 (0ct3/4、Sox2、c-Myc)和G6 (GLISl)轉(zhuǎn)入HDF中所建立的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行。在該圖中， “4種因子”指示用4個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的iPS細(xì)胞，“AHDF”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成年皮膚成纖維細(xì)胞，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)PMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖32是RT-PCR的結(jié)果的代表性照片，所述RT-PCR是在通過(guò)把3個(gè)基因(0ct3/4、 Sox2, c-Myc)和G6(GLIS1)轉(zhuǎn)入HDF中所建立的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行。在該圖中，“4種因子”和“AHDF”與在圖31中的那些相同，“KhESl”指示人胚胎干細(xì)胞，“201B7”指示在過(guò)去建立的 iPS 細(xì)胞[Cell, 131 =861-872 (2007) ] 圖33的代表性照片是通過(guò)把2個(gè)基因(0ct3/4、Sox2)和H8 (DMRTBl)、或3個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和H10(PITX2)轉(zhuǎn)入DP31中所建立的iPS細(xì)胞的菌落圖像和堿性磷酸酶染色圖像。為了對(duì)照，也顯示了用4個(gè)基因(0Ct3/4、SOX2、C-MyC、Klf4)建立的iPS 細(xì)胞的菌落圖像。圖；34是通過(guò)把2個(gè)基因(0ct3/4、Sox2)和H8 (DMRTBl)轉(zhuǎn)入DP31中所建立的iPS 細(xì)胞的第1代菌落的代表性照片。圖35是基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片，所述基因組-PCR是在通過(guò)把2個(gè)基因(0ct3/4、Sox2)和H8 (DMRTBl)轉(zhuǎn)入DP31中所建立的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行。在該圖中， “DP31”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的牙髓干細(xì)胞克隆，“質(zhì)粒”指示通過(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)pMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖36是RT-PCR的結(jié)果的代表性照片，所述RT-PCR是在通過(guò)把2個(gè)基因(0ct3/4、 Sox2)和H8 (DMRTBl)轉(zhuǎn)入DP31中所建立的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行。在該圖中，“DP31”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的牙髓干細(xì)胞克隆，“hES”指示人胚胎干細(xì)胞，“201B7”指示在過(guò)去建立的 iPS 細(xì)胞[Cell, 131 :861-872 (2007) ] 圖37是通過(guò)把3個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c_Myc)和HlO (PITX2)轉(zhuǎn)入DP31中所建立的iPS細(xì)胞的第1代菌落的代表性照片。圖38是基因組-PCR的結(jié)果的代表性照片，所述基因組-PCR是在通過(guò)把3個(gè)基因 (0ct3/4、Sox2、c-Myc)和H10(PITX2)轉(zhuǎn)入DP31中所建立的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行。在該圖中，“DP31”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的牙髓干細(xì)胞克隆，“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合進(jìn)pMXs中的每個(gè)基因而制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖39是RT-PCR的結(jié)果的代表性照片，所述RT-PCR是在通過(guò)把3個(gè)基因(0ct3/4、 Sox2、c-Myc)和H10(PITX2)轉(zhuǎn)入DP31中所建立的iPS細(xì)胞克隆上進(jìn)行。在該圖中，“DP31” 指示用作體細(xì)胞來(lái)源的牙髓干細(xì)胞克隆，“hES”指示人胚胎干細(xì)胞，“201B7”指示在過(guò)去建立的 iPS 細(xì)胞[Cell, 131 :861-872 (2007) ] 圖40顯示了畸胎瘤的組織學(xué)染色的圖像(蘇木素-曙紅染色)，所述畸胎瘤通過(guò)將用3個(gè)基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和G6 (GLISl)建立的iPS細(xì)胞克隆注射進(jìn)kid小鼠睪丸中來(lái)制備。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了可以替代Klf4的新穎的核重編程序物質(zhì)，以及通過(guò)將所述物質(zhì)和當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程序物質(zhì)轉(zhuǎn)入體細(xì)胞中來(lái)生產(chǎn)iPS 細(xì)胞的方法。(a)新穎的核重編程序物質(zhì)(替代Klf4)在本發(fā)明中，“核重編程序物質(zhì)”表示能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的任意物質(zhì)，其可以由任意物質(zhì)組成，諸如蛋白因子或編碼它們的核酸(包括整合進(jìn)載體中的形式)或低分子化合物。通過(guò)本發(fā)明鑒別出的可以替代Klf4的核重編程序物質(zhì)是蛋白，所述蛋白屬于IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族和DMRT-樣家族B (具有富含脯氨酸的C-端 1 (DMRTBl))的成員，或編碼它們的核酸。IRX(iroquois同源框)家族具有一個(gè)同源框結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是在脊椎動(dòng)物胚胎的模式形成過(guò)程中起多種作用。該基因家族的成員的實(shí)例包括、但不限于droquois同源框蛋白1 (IRXl)、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、IRX6等，優(yōu)選IRX6。IRX6是在人和小鼠胚胎干細(xì)胞中不表達(dá)的基因。GLIS家族包含這樣的轉(zhuǎn)錄因子，其具有5個(gè)C2H2型鋅指區(qū)，并在胚胎發(fā)生過(guò)程中正或負(fù)控制不同基因的表達(dá)。該基因家族的成員的實(shí)例包括、但不限于GLIS家族鋅指1 (GLISl)、GLIS2、GLIS3等，優(yōu)選GLISl。GLISl是在小鼠胚胎干細(xì)胞中不表達(dá)的基因。PTX家族具有一個(gè)同源框結(jié)構(gòu)域，且參與側(cè)不對(duì)稱的器官發(fā)生和決定。該基因家族的成員的實(shí)例包括、但不限于成對(duì)-樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1 (PITXl)、PITX2、PITX3等，優(yōu)選PITX2。已知PITX2存在3種亞型(亞型a、b和C)。盡管可以使用任意的亞型，例如，優(yōu)選地使用亞型b。DMRT-樣家族B (具有富含脯氨酸的C-端1 (DMRTBl))是未知功能的轉(zhuǎn)錄因子，其具有兩性DNA結(jié)合基序。DMRTBl是在人和小鼠胚胎干細(xì)胞中不表達(dá)的基因。盡管在本發(fā)明中使用的IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員和DMRTBl可以是源自任選地選擇的哺乳動(dòng)物(例如，人、小鼠、大鼠、猴、牛、馬、豬、狗等)的蛋白或編碼它們的核酸，但是人或小鼠起源的蛋白或核酸是優(yōu)選的。參考在表1中顯示的NCBI登錄號(hào)，可以獲得關(guān)于上述的人或小鼠起源的核重編程序物質(zhì)的氨基酸序列和cDNA序列的信息；本領(lǐng)域技術(shù)人員基于cDNA序列信息能夠容易地分離編碼各種蛋白的核酸，并根據(jù)需要生產(chǎn)重組蛋白。表 權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)iPS細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟向體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入下述的(1)和⑵(1)一種或多種選自下述的物質(zhì)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、 DMRTBl以及編碼它們的核酸，(2)當(dāng)與Klf4組合時(shí)，能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在上面(1)中提及的物質(zhì)包括至少一種選自下述的物質(zhì)droquois同源框蛋白6 (IRX6) ,GLIS家族鋅指1 (GLISl)、成對(duì)-樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子2亞型b (PITX2)、DMRTBl以及編碼它們的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在上面(2)中提及的物質(zhì)選自0ct家族的成員、 Sox家族的成員、Myc家族的成員、Nanog和Lin家族以及編碼它們的核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在上面中提及的物質(zhì)是0ct3/4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在上面中提及的物質(zhì)是0ct3/4和Sox2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在上面中提及的物質(zhì)是0ct3/4和c-Myc。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在上面中提及的物質(zhì)是0ct3/4、SoX2和C-MyC0
8.一種從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)物，其包含下述的(1)和:(1)一種或多種選自下述的物質(zhì)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、 DMRTBl以及編碼它們的核酸，(2)當(dāng)與Klf4組合時(shí)，能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)物，其中在上面(1)中提及的物質(zhì)包括至少一種選自下述的物質(zhì)IRX6、GLIS1、PITX2、DMRTBl以及編碼它們的核酸。
10.一種iPS細(xì)胞，其含有編碼一種或多種選自下述的因子的外來(lái)核酸IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員和DMRTBl。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的iPS細(xì)胞，其含有編碼一種或多種選自下述的因子的外來(lái)核酸IRX6、GLISl、PITX2 和 DMRTBl。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的iPS細(xì)胞，其中所述至少一種外來(lái)核酸整合進(jìn)基因組中。
13.—種生產(chǎn)體細(xì)胞的方法，所述方法包括處理根據(jù)權(quán)利要求10所述的iPS細(xì)胞，以誘導(dǎo)其分化成體細(xì)胞。
14.一種從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)物，其包含一種或多種選自下述的物質(zhì)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、DMRTBl以及編碼它們的核酸，其中所述誘導(dǎo)物與當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)一起，轉(zhuǎn)移進(jìn)體細(xì)胞中。
15.一種或多種選自下述的物質(zhì)用于生產(chǎn)iPS細(xì)胞的用途IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、DMRTBl以及編碼它們的核酸，其中所述物質(zhì)與當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)一起，轉(zhuǎn)移進(jìn)體細(xì)胞中。
16.一種選自下述的物質(zhì)IRX家族的成員、GLIS家族的成員、PTX家族的成員、DMRTBl 以及編碼它們的核酸，所述物質(zhì)作為從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)物，其中所述物質(zhì)與當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)一起，轉(zhuǎn)移進(jìn)體細(xì)胞中。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的iPS細(xì)胞在生產(chǎn)體細(xì)胞中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的iPS細(xì)胞，其作為生產(chǎn)體細(xì)胞的細(xì)胞來(lái)源。
全文摘要
提供了能夠替代Klf4的重編程序物質(zhì)，其選自IRX家族的成員(例如，IRX6)、GLIS家族的成員(例如，GLIS1)、PTX家族的成員(例如，PITX2)、DMRTB1以及編碼它們的核酸。也提供了一種生產(chǎn)iPS細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟向體細(xì)胞中導(dǎo)入一種或多種上述的細(xì)胞核重編程序物質(zhì)和當(dāng)與Klf4組合時(shí)能夠從體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的物質(zhì)。也提供了通過(guò)所述方法可以得到的包含外來(lái)核酸的iPS細(xì)胞，所述外來(lái)核酸編碼任一種上述細(xì)胞核重編程序物質(zhì)，以及通過(guò)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化來(lái)生產(chǎn)體細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N15/00GK102388136SQ20108001140
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者五島直樹(shù), 前川桃子, 山中伸彌, 望月宏美, 河村義史 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué), 日本生物信息協(xié)會(huì), 獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所