專利名稱：變體axmi-r1δ-內(nèi)毒素基因和使用它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。提供了編碼殺蟲蛋白的新基因。這些蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸序列在制備殺蟲制劑中并且在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗害蟲植物中有用。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis) (Bt)是形成孢子的革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌，其特征在于它產(chǎn)生晶狀包含體的能力，其中所述的晶狀包含體特異性毒害某些目和種的昆蟲，但是對(duì)植物和其他非靶向的生物無(wú)害。出于這個(gè)原因，包括蘇云金芽孢桿菌菌株或其殺蟲蛋白質(zhì)的組合物可以作為環(huán)境可接受的殺蟲劑用來(lái)控制農(nóng)業(yè)昆蟲害蟲或多種人或動(dòng)物疾病的昆蟲媒介。來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白(δ -內(nèi)毒素)具有主要針對(duì)鱗翅目、雙翅目和鞘翅目幼蟲的強(qiáng)力殺蟲活性。這些蛋白質(zhì)也顯示出針對(duì)膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨亞綱(Acari)害蟲目以及其他無(wú)脊椎動(dòng)物如線形動(dòng)物門(Nemathelminthes)、扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes) 禾口 Sarcomastigorphora 白勺 舌j"生(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree. 在 Advanced Engineered Pesticides 中，Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y.)。 這些蛋白質(zhì)起初主要基于它們的殺昆蟲活性分類為CryI至CryV。主要類型是鱗翅目特異性(I)、鱗翅目與雙翅目特異性(II)、鞘翅目特異性(III)、雙翅目特異性(IV)和線蟲特異性(V)與(VI)。所述蛋白質(zhì)進(jìn)一步劃分成亞家族；賦予每個(gè)家族內(nèi)部更高度相關(guān)的蛋白質(zhì)區(qū)分字母如CrylA、CrylB、CrylC等。每個(gè)部分內(nèi)部甚至更密切相關(guān)的蛋白質(zhì)給予名字，如 CrylCU Cry 1C2 等?；诎被嵝蛄型葱远抢ハx靶專一性，最近描述了 Cry基因的一種新命名法 (Crickmore 等人.(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813)。在這種新分類中，每種毒素賦予一個(gè)獨(dú)特名稱，包含初階(阿拉伯?dāng)?shù)字)、次階(大寫字母)、三階(小寫字母)和四階(另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)。在這個(gè)新分類法中，羅馬數(shù)字已經(jīng)更換為初階中的阿拉伯?dāng)?shù)字。序列同一性小于45%的蛋白質(zhì)具有不同的初階，并且次階和三界的標(biāo)準(zhǔn)分別是78%和 95%。晶體蛋白不顯示殺昆蟲活性直至它在昆蟲中腸中被攝取和溶解。攝取的前毒素由昆蟲消化道中的蛋白酶水解成活性有毒分子。(Hiifte和Whiteley (1989)Microbiol. Rev. 53 :242-255)。這種毒素與靶幼蟲中腸中的頂部刷狀緣受體結(jié)合并插入頂膜，產(chǎn)生離子通道或孔，從而導(dǎo)致幼蟲死亡。δ -內(nèi)毒素通常具有5個(gè)保守的序列結(jié)構(gòu)域和3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(見，例如，de Maagd等人Q001)Trends Genetics 17 193-199)。第一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域由7 個(gè)α螺旋組成并且參與膜插入和孔形成。結(jié)構(gòu)域II由以希臘鑰匙構(gòu)型排列的3個(gè)β-片層組成，并且結(jié)構(gòu)域III由“薄卷餅型”形式的2個(gè)反平行β-片層組成(de Maagd等人， 2001，上文)。結(jié)構(gòu)域II和III參與受體識(shí)別和結(jié)合，并且因此被視為毒素特異性的決定因
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最初在二十世紀(jì)八十年代早期鑒定Cry3型δ內(nèi)毒素。Cry3Aal δ內(nèi)毒素(以前也稱作cryC和cryIIIA)先前已經(jīng)從蘇云金芽孢桿菌圣迭戈變種菌株(Bacillus thuringiensis var san diego) (Herrnstadt 等人(1987)Gene. 57 :37-46)、蘇云金芽抱桿菌擬步甲亞種(Bacillus thuringiensis tenebrionis) (Hofte 等人(1987)Nucleic acids Res. 15 :7183 ；McPherson 等人(1988)Bio/technology 6 :61-66Sekar 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :7036-7040)和 EG2158 (Donovan 等人(1988)Mol Mol Gen Genet. 214(3) :365-72)分離。Cry3Aa常常在某種天然芽孢桿菌菌株中作為長(zhǎng)斜方形晶體的主要組分觀察到，并且作為72kDa蛋白質(zhì)產(chǎn)生，該蛋白質(zhì)隨后由孢子形成相關(guān)蛋白酶通過(guò)蛋白酶解加工過(guò)程加工成66kDa毒素。這種66kDA蛋白質(zhì)已知產(chǎn)生針對(duì)鞘翅目科羅拉多馬鈴薯甲蟲的活性。因?yàn)槔ハx可能造成的毀壞和通過(guò)控制害蟲改善產(chǎn)量，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新形式的殺蟲毒素存在持續(xù)需要。發(fā)明概述提供了用于賦予殺蟲活性至細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子的組合物和方法。 組合物包括編碼殺蟲多肽和殺昆蟲多肽的序列的核酸分子、包含這些核酸分子的載體和包含所述載體的宿主細(xì)胞。組合物也包括殺蟲多肽序列和針對(duì)那些多肽的抗體。所述核苷酸序列可以在用于生物(包括微生物和植物)中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中使用。所述核苷酸或氨基酸序列可以是已經(jīng)設(shè)計(jì)用于在生物中表達(dá)的合成序列，所述的生物包括，但不限于微生物或植物。組合物還包含轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。具體地，提供了編碼殺蟲蛋白的分離的核酸分子。另外，包括與該殺蟲蛋白相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。尤其，本發(fā)明提供了分離核酸分子，其包含編碼變體CRY3的核苷酸序列。也包括與本發(fā)明核苷酸序列互補(bǔ)或本發(fā)明序列雜交的核苷酸序列。提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽和用于使用這些多肽控制或殺死鱗翅目、鞘翅目、線蟲或雙翅目害蟲的方法。也包括用于檢測(cè)樣品中本發(fā)明核酸和多肽的方法和試劑盒。本發(fā)明的組合物和方法在產(chǎn)生具有增強(qiáng)的害蟲抵抗性或耐受性的生物中有用。這些生物和包含所述生物的組合物對(duì)于農(nóng)業(yè)目的而言是所希望的。本發(fā)明的組合物也用于產(chǎn)生具有殺蟲活性的經(jīng)改變或改良的蛋白質(zhì)，或用于檢測(cè)產(chǎn)品或生物中殺蟲蛋白或核酸的的存在。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示注釋的AXMI-Rl序列(SEQ ID NO 2)。加下劃線的區(qū)域代表環(huán)區(qū)域(Li、 L2和L3)。直條形代表結(jié)構(gòu)域I (DI)、結(jié)構(gòu)域II (DII)和結(jié)構(gòu)域III (DIII)之間的邊界。箭頭指示為產(chǎn)生變體所靶向的一些區(qū)域。圖 2 顯示 Axmi 164 (SEQ ID NO 13)、Axmi 161 (SEQ ID NO 44)、Axmi 152 (SEQ ID NO :45)、Axmi 151 (SEQ ID NO :26)、Axmi 146 (SEQ ID NO :27)、Axmi 141 (SEQ ID NO :28)、 Axmi129(SEQ ID NO 29),Axmi128(SEQ ID NO 30),Axmi127(SEQ ID NO 31),Axmi120(SEQ ID NO32)、Axmi116(SEQ ID NO33)、Axmi114(SEQ ID NO34)、AxmilOl(SEQ ID NO :35)、 Axmi091(SEQ ID NO :36)、Axmi087(SEQ ID NO :37)、Axmi037(SEQ ID NO :38)、Axmi029(SEQ ID NO :39)、Axmi028(SEQ ID NO :40)、Cry8Bbl(SEQ ID NO :41)、Cry8Bcl(SEQ ID NO :42)、 Cry7Aa (SEQ ID NO :43)、AxmiRlPermutP3c7 (evo21) (SEQ ID NO : 13)禾口 Axmi-Rl (SEQ IDNO:2)的比對(duì)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)生物中、尤其植物或植物細(xì)胞中害蟲抵抗性或耐受性的組合物和方法?！暗挚剐浴币庵负οx(例如，昆蟲)在攝取或接觸本發(fā)明多肽時(shí)被殺死?！澳褪苄浴币庵笓p害或減少害蟲的運(yùn)動(dòng)、采食、繁殖或其他功能。所述方法涉及用編碼本發(fā)明殺蟲蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化生物。尤其，本發(fā)明的核苷酸序列用于制備擁有殺蟲活性的植物和微生物。因而，提供轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。本文中提供包含編碼變體Cry3氨基酸序列的核酸序列的組合物，其中該變體具有殺蟲活性，特別地是針對(duì)鞘翅目害蟲的殺蟲活性。“變體Cry3”氨基酸序列意指除天然存在的Cry3氨基酸序列之外的Cry3序列，其中該氨基酸序列具有與表16中所述的替換相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。對(duì)于Cry3序列表，見Crickmore等人(1998)，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813,并且對(duì)于定期更新，見在 www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_ Crickmore/Bt/index 處的 Crickmore 等人(2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (蘇云金芽孢桿菌毒素命名法)。在一些實(shí)施方案中，天然存在的或“野生型”Cry3序列是SEQ ID NO :1中所述的Axmi-Rl核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO 2中所述的氨基酸序列。AXMI-Rl序列對(duì)應(yīng)于 GENBANK 檢索號(hào)P0A379中描述的cry3Aa序列。然而，將會(huì)理解可以在任意Cry3蛋白如任意Cry3A、Cry3B或Cry3C蛋白的相應(yīng)位置處產(chǎn)生表16中描述的替換?！跋鄳?yīng)位置” 可以通過(guò)將靶序列與SEQ ID NO 2比對(duì)來(lái)確定。見，例如，圖2中所示的比對(duì)結(jié)果。cry3Aa蛋白的晶體結(jié)構(gòu)先前已經(jīng)測(cè)定(Li等人，1991，Nature353 :815-821)。該晶體結(jié)構(gòu)描述了多種環(huán)區(qū)域，并且相對(duì)于該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)顯示蛋白酶解加工的位點(diǎn)。該種結(jié)構(gòu)表明此毒素排列成與其他S-內(nèi)毒素序列的結(jié)構(gòu)相一致的3個(gè)結(jié)構(gòu)域(一般稱作結(jié)構(gòu)域I、II和III)。該毒素的每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有基于此晶體結(jié)構(gòu)定義的環(huán)區(qū)域。在該晶體結(jié)構(gòu)發(fā)表之前并且自此之后，已經(jīng)存在眾多嘗試以描述與Bt內(nèi)毒素并且尤其cry3-型內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)與毒性功能相關(guān)的廣泛簡(jiǎn)單規(guī)則和蛋白酶解在這種活性中的作用。例如，Van Rie等人，1997(美國(guó)專利5，659，123)提出通過(guò)鑒定不利影響毒性的位置，而后隨機(jī)替換這些環(huán)內(nèi)部某些位置處的氨基酸，在視為“環(huán)”的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域 II的修飾而鑒定導(dǎo)致毒性改善的氨基酸。類似地，Wu和DeanCJ. Mol. Biol.，1996，255 628-640)將丙氨酸隨機(jī)插入環(huán)II殘基減弱了蛋白質(zhì)功能。mi等人(Febs Letters, 2000, 473 :227-232)對(duì)環(huán)I殘基的隨機(jī)誘變?cè)诖蠖鄶?shù)情況下產(chǎn)生不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)和減弱的蛋白質(zhì)功能，并且在兩種情況下?lián)?bào)道產(chǎn)生具有增加的毒性和改變的結(jié)合特性的蛋白質(zhì)。對(duì)于 cry3Bb毒素(English等人，美國(guó)專利6，023，013，作為RE39，580再公布)，據(jù)報(bào)道在該毒素中的某些替換導(dǎo)致改善的玉米根蟲活性，但在大多數(shù)情況下，這些改變?cè)谂cVan Rie所提出或mi和Dean所研究的殘基不同的殘基中出現(xiàn)。此外，已經(jīng)在正常由胰蛋白酶樣或胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶切割的cry3A毒素區(qū)域中做出修飾，試圖改善對(duì)鞘翅目并且特別對(duì)西方玉米根蟲的cry3A活性。Chen等人(美國(guó)專利7，030, 295)報(bào)道在該蛋白質(zhì)中特定位置處插入被描述為“組織蛋白酶G切割位點(diǎn)”(或 “胰凝乳蛋白酶/組織蛋白酶G切割位點(diǎn)”;Walters等人，2008，Applied and Environ. Micro. 74 :367-374)的合成四肽AAPF (SEQ ID NO :20)可以導(dǎo)致改善的cry3A活性。
cry3A的胰蛋白酶切割是本領(lǐng)域熟知的，并且已經(jīng)顯示在天然cry3A肽中的大約 R158-N159 區(qū)域內(nèi)天然發(fā)生(Carroll 等人 1989Biochem J. 261 :99-105)。另外，還已知胰凝乳蛋白酶在這個(gè)區(qū)域中的Hisl6Herl62接頭處切割(Carroll等人1997J Invert. Biol. 70 :41-49)。Walters等人OOOS)顯示通過(guò)胰凝乳蛋白酶在該區(qū)域中其天然位置 (Hisl61-Serl62接頭處)切割修飾的Cry3A( “mCry3A”，其含有胰凝乳蛋白酶/組織蛋白酶G蛋白酶識(shí)別位點(diǎn))。沒(méi)有報(bào)道Cry 3A的這個(gè)區(qū)域中的天然存在氨基酸序列的誘變導(dǎo)致對(duì)鞘翅目害蟲改善的殺蟲活性。因而，本發(fā)明提供相對(duì)于相應(yīng)的野生型序列具有改善的殺蟲活性的變體Cry3序列。在多種實(shí)施方案中，與AXMI-Rl的殺蟲活性相比，變體Cry3殺蟲序列具有改善的殺蟲活性?！案纳频幕钚浴币庵赴泻οx的死亡率增加、采食減少或者生長(zhǎng)減少。活性的改善是相對(duì)于野生型序列(例如，AXMI-R1)的活性而言活性增加至少約5%、至少約10%、至少約 20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90%、至少約100%、至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍或更大。在一些實(shí)施方案中，靶害蟲是鞘翅目害蟲。在一些實(shí)施方案中，本文中所包括的殺蟲序列包含SEQ ID NO :1中所述axmi-Rl 序列的變體?！癮xmi-Rl的變體”意指與AXMI-Rl相對(duì)應(yīng)的核苷酸或氨基酸序列，其中已經(jīng)在AXMI-Rl序列的某些區(qū)域(即，“靶突變區(qū)域”)內(nèi)部導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)突變。除非另外說(shuō)明，在靶突變區(qū)域外部的氨基酸區(qū)域與AXMI-Rl序列相同。相同的區(qū)域是相同的氨基酸序列或是編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。將會(huì)理解，核苷酸序列可以與野生型核苷酸序列不同，但是因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性仍編碼野生型氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，Cry3的靶突變區(qū)域?qū)?yīng)于Li等人(1991，Nature353 815-821，通過(guò)引用的方式完整并入本文中，尤其就Cry3Aa蛋白的結(jié)構(gòu)描述方面)中描述的所提出的加工和孔形成區(qū)域。在多種實(shí)施方案中，靶突變區(qū)域?qū)?yīng)于SEQ ID NO :2的第480 至490位氨基酸位置和第510至530位。在一些實(shí)施方案中，變體Cry3序列含有表16中描述的一個(gè)或多個(gè)突變，包括表16中所列突變的任意組合，直至并且包括在表16中描述的每個(gè)位置處的突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體Cry3序列具有選自與SEQ ID NO :2的第158、 482,483和519位相對(duì)應(yīng)的氨基酸位置中的一個(gè)或多個(gè)替換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變體 Cry3 序列沒(méi)有以下替換:P154H、V155H、R315W、R315D、R315M、R315L、G316K、G316N、G316V 或G316A。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體Cry3序列沒(méi)有美國(guó)專利6，023，013的表2 中所列突變的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變體Cry3序列選自由SEQ ID NO :6、8、10、13、15、17、19和 21-43組成的組。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本文中所包括的的變體Cry3序列由加工和孔形成區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)突變和受體結(jié)合區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)突變組成。本文中所包括的變體具有相對(duì)于野生型Cry3的殺蟲活性而言改善的殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，改善的殺蟲活性針對(duì)鞘翅目害蟲，例如，根蟲害蟲。可以進(jìn)一步修飾本發(fā)明的變體Cry3序列以導(dǎo)入本領(lǐng)域描述的一個(gè)或多個(gè)Cry3 突變。例如，除美國(guó)專禾U 5，659，123 和 6，023，013 ；Wu 和 Dean (J. Mol. Biol.，1996，255 628-640)；或Wu等人(Febs Letters, 2000,473 :227-232)中描述的一個(gè)或多個(gè)突變之外，本文中所包括的變體AXMI-Rl序列可以包含表16中所列的一個(gè)或多個(gè)替換或其任意組合。 額外地，變體AXMI-Rl序列可以包含如上文討論的一個(gè)或多個(gè)組織蛋白酶G切割位點(diǎn)的插入(例如，在天然胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶切割位點(diǎn)處或其附近)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以將表16中描述的突變導(dǎo)入與AXMI-Rl具有同源性的任意氨基酸序列的相應(yīng)位置以導(dǎo)入或改善針對(duì)目的害蟲、尤其鞘翅目害蟲如根蟲害蟲的毒性。見，例如，圖2中與AXMi-Ri比對(duì)的氨基酸序列，或例如GENBANK 檢索號(hào) P0A379. 1、AAA22336. 1、AAA22542. 1、AAS79487. 1、AAU29411. 1、AAW82872. 1、AAA73184. 1、 CAA51996. 1、1DLC_A、Q45744. UQ06117. UAAA74198. UP17969. It 中所述的同源氨基酸序列。可以使用本文中所述的比對(duì)程序之一比對(duì)同源氨基酸序列以鑒定用于突變的相應(yīng)位置。備選地，同源氨基酸序列的晶體結(jié)構(gòu)或其另外的三維表示可以疊加到(在Li等人1991， Nature 353 =815-821中描述的)Cry3A的晶體結(jié)構(gòu)上并且比對(duì)相應(yīng)位置。CryiBB蛋白的晶體結(jié)構(gòu)在美國(guó)專利6，023，013中描述。所述序列用于構(gòu)建隨后轉(zhuǎn)化至目的生物中的表達(dá)載體，作為探針用于分離其他同源(或部分同源的)基因，并且用于通過(guò)本領(lǐng)域已知方法(如結(jié)構(gòu)域互換或DNA改組法) 產(chǎn)生改變的殺蟲蛋白。所述蛋白質(zhì)用于控制或殺死鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和線蟲害蟲種群并且用于產(chǎn)生具有殺蟲活性的組合物?！皻⑾x毒素”或“殺蟲蛋白”意指針對(duì)一種或多種害蟲具有毒害活性的毒素，其中所述的害蟲包括，但不限于鱗翅目、雙翅目和鞘翅目或線蟲綱的成員，或者與這種蛋白質(zhì)具有同源性的蛋白質(zhì)。殺蟲蛋白已經(jīng)從包括例如芽孢桿菌屬物種、雙酶梭狀芽孢桿菌 (Clostridium bifermentans)禾口 Paenibacillus popilliae 的生物分離。殺蟲蛋白包括從本文中公開的全長(zhǎng)核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列和因使用下游可變起始位點(diǎn)或因產(chǎn)生具有殺蟲活性的更短蛋白質(zhì)的加工作用而短于全長(zhǎng)序列的氨基酸序列。加工可以在表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物中或在攝取該蛋白質(zhì)后的害蟲中發(fā)生。分離的核酸分子及其變體和片段本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離或重組的核酸分子，其包含編碼殺蟲蛋白和多肽或其生物學(xué)活性部分的核苷酸序列，以及這樣的核酸分子，其足以用作雜交探針來(lái)鑒定編碼具有序列同源性區(qū)域的蛋白質(zhì)的核酸分子。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”意圖包括DNA分子(例如，重組DNA、cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?！胺蛛x的”或“重組的”核酸序列(或DNA)在本文中用來(lái)指不再處于其天然環(huán)境 (例如處于體外或處于重組細(xì)菌宿主或植物宿主細(xì)胞)中的核酸序列(或DNA)。在一些實(shí)施方案中，分離或重組的核酸不含在衍生該核酸的生物的基因組DNA中天然分布于該核酸側(cè)翼的序列(即，位于該核酸的5'端和3'端處的序列)(優(yōu)選地是蛋白質(zhì)編碼序列)。出于本發(fā)明的目的，用來(lái)指核酸分子時(shí)，“分離”排除分離的染色體。例如，在多種實(shí)施方案中， 分離的編碼δ -內(nèi)毒素的核酸分子可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb 的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在衍生該核酸分子的細(xì)胞的基因組DNA中天然分布于該核酸分子側(cè)翼。在多種實(shí)施方案中，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的S-內(nèi)毒素蛋白包括具有少于約30^^20^^10%或5% (以干重計(jì))的非δ-內(nèi)毒素蛋白(本文中也稱作“雜質(zhì)蛋白”) 的制備物。
編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括編碼Cry3變體的核苷酸序列以及其片段和互補(bǔ)序列?！盎パa(bǔ)序列”意指與給定核苷酸序列充分互補(bǔ)，從而它可以與給定核苷酸序列雜交以因而形成穩(wěn)定雙鏈體的核苷酸序列。本發(fā)明也包括作為編碼殺蟲蛋白的這些核苷酸序列的片段的核酸分子?！捌巍币庵妇幋a殺蟲蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以編碼殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分，或它可以是使用下文公開的方法時(shí)可以作為雜交探針或PCR引物使用的片段。取決于預(yù)期用途，作為編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約50、100、200、 300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400 個(gè)連續(xù)核苷酸，或者直至本文中公開的編碼殺蟲蛋白的全長(zhǎng)核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目?！斑B續(xù)”核苷酸意指彼此緊密相鄰的核苷酸殘基。本發(fā)明核苷酸序列的片段將會(huì)編碼保留殺蟲蛋白的生物學(xué)活性并且因而保留殺蟲活性的蛋白質(zhì)片段?！氨Ａ艋钚浴币庵冈撈螌⒕哂袇⒖?xì)⑾x蛋白(即，本文中公開的殺蟲性變體Cry3序列)的至少約30%、至少約50%、至少約70%、 80^^90^^95%或更高的殺蟲活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺鞘翅目活性。用于測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomo 1. 83 2480-2485 ；Andrews ^ 人(1988)Biochem. J. 252:199-206 ；Marrone ^ 人(1985)J. of Economic Entomology78 :290-293 ；和美國(guó)專利號(hào)5，743，477，所述全部文獻(xiàn)均通過(guò)引用方式完整地并入本文。編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的片段(其編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分) 將編碼至少約 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450 個(gè)連續(xù)氨基酸，或者直至本發(fā)明的全長(zhǎng)殺蟲蛋白中存在的氨基酸總數(shù)。在一些實(shí)施方案中，該片段是蛋白酶解切割片段。例如，該蛋白酶解切割片段可以相對(duì)于SEQ ID NO :2具有至少約100個(gè)氨基酸、約120個(gè)、約130個(gè)、約140個(gè)、約150個(gè)或約160個(gè)氨基酸的N端截短。在多種實(shí)施方案中，該蛋白酶解切割片段可以對(duì)應(yīng)于分別與SEQ ID NO :2的氨基酸位置158-159或位置160-161相對(duì)應(yīng)的天然胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶切割位點(diǎn)，或可以對(duì)應(yīng)于任意人工插入的切割位點(diǎn)，如 Walters 等人，2008，Applied and Environ. Micro. 74 :367-374 中所述的組織蛋白酶G切割位點(diǎn)。本發(fā)明的優(yōu)選殺蟲蛋白由與本文所包括的變體Cry3序列充分相同的核苷酸序列編碼?！俺浞窒嗤币庵甘褂脴?biāo)準(zhǔn)參數(shù)，使用本文中所述的比對(duì)程序之一，與參考序列(例如，天然或變體Cry3序列，包括天然或變體Cry3A、Cry3B或Cry3C序列，或者選自SEQ ID NO :2、6、8、10、13、15、17、19和21-43的序列，或者編碼這些天然或變體Cry3蛋白序列任一者的核苷酸序列)相比，具有至少約60 %或65 %序列同一性、約70 %或75 %序列同一性、 約 80%或 85%序列同一性、約 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 更多序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、可讀框定位等，可以適當(dāng)調(diào)整這些值以確定兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。為確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的同一性百分?jǐn)?shù)，所述序列為最佳比較目的進(jìn)行比對(duì)。這兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)是所述序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，同一性百分?jǐn)?shù)=相同位置數(shù)/總位置數(shù)(例如，重疊位置)x 100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這兩個(gè)序列具有相同的長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，貫穿整個(gè)參考序列(即，本文中所包括的變體
9Cry3序列)計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)?？梢允褂门c下文所述那些技術(shù)相似的技術(shù)，在容許或不容許空位的情況下確定兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。在計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)中，一般計(jì)數(shù)精確匹配。使用數(shù)學(xué)算法，可以完成兩個(gè)序列之間同一性百分?jǐn)?shù)的確定。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul, (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264 的算法，該算法如 Karlin 和 Altschul, (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 5873-5877中那樣修改。這種算法被并入Altschul等人，(1990) J. Mol. Biol. 215 :403的 BLASTN和BLASTX程序。BLAST核苷酸搜索可以在采用BLASTN程序，評(píng)分=100、字長(zhǎng)度= 12的情況下執(zhí)行以獲得與本發(fā)明的殺蟲樣核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以在采用BLASTX程序，評(píng)分=5，字長(zhǎng)度=3的情況下執(zhí)行以獲得與本發(fā)明的殺蟲蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的空位比對(duì)結(jié)果，空位BLAST(在BLAST 2.0 中)可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中所述那樣使用。備選地，PSI-Blast可以用來(lái)執(zhí)行迭代搜索，其檢測(cè)分子之間遠(yuǎn)緣關(guān)系。見上文Altschul等人， (1997)。當(dāng)使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序(例如，BLASTX 和BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。比對(duì)可以通過(guò)目測(cè)法手工地進(jìn)行。用來(lái)比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是ClustalW算法(Higgins等人 (1994) Nucleic acids Res. 22 :4673-4680)。ClustalW 比較序列和比對(duì)氨基酸或 DNA 序列的完整性，并且因而可以提供關(guān)于完整氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法在一些市售DNA/氨基酸分析軟件包中使用，如Vector NTI軟件包的ALIGNX模塊Qnvitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。在用ClustalW比對(duì)氨基酸序列后，可以評(píng)估氨基酸同一性百分?jǐn)?shù)。用于分析ClustalW比對(duì)結(jié)果的軟件程序的非限制實(shí)例是GENED0C 。GENED0C (Karl Nicholas)允許評(píng)估多種蛋白質(zhì)之間的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用來(lái)比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是是Myers和Miller，(1988) CABIOS 4 :11-17的算法。 此種算法被并入了 ALIGN程序(版本2.0)，所述的ALIGN程序是GCG Wisconsin Genetics 軟件包，第 10 版(從 Accelrys，Inc. ,9685 Scranton Rd.，San Diego, CA, USA 可獲得)的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序以比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表、空位長(zhǎng)度罰分12和空位罰分4。除非另外說(shuō)明，使用 Needleman 和 Wunsch 算法(1970) J. Mol. Biol. 48(3) 443-453的GAP第10版將會(huì)用來(lái)確定序列同一性或相似性，使用以下參數(shù)對(duì)于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3及nwsgapdna. cmp評(píng)分矩陣；對(duì)于氨基酸序列的％同一性或％相似性，使用GAP權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2及BL0SUM62評(píng)分程序。 也可以使用等同程序?！暗韧绦颉币庵溉魏涡蛄斜容^程序，其中對(duì)于所討論的任意兩個(gè)序列而言，與GAP第10版所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)結(jié)果比較時(shí)，所述的序列比較程序產(chǎn)生具有相同核苷酸或殘基匹配和相同序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對(duì)結(jié)果。本發(fā)明也包括變體核酸分子。編碼殺蟲性變體Cry3蛋白的核苷酸序列的“變體” 包括編碼本文公開的變體殺蟲蛋白，但是因?yàn)檫z傳密碼簡(jiǎn)并性而保守地相異的那些序列， 以及如上文所討論那樣充分相同的那些序列。變體核苷酸序列也包括合成方式衍生的核苷酸序列，所述核苷酸序列例如通過(guò)使用位點(diǎn)定向誘變法產(chǎn)生，但如下文所討論仍編碼本發(fā)明中所公開的殺蟲蛋白。由本發(fā)明包括的變體蛋白是有生物活性的，即，它們繼續(xù)擁有
10參考蛋白(即，本文中所包括的變體Cry3序列)的想要的生物學(xué)活性，即，殺蟲活性?！氨Ａ艋钚浴币庵冈撟凅w將具有該參考蛋白的至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約 80%的殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，本文中所述的變體殺蟲蛋白相對(duì)于SEQ ID N0:2中所述的AXMI-Rl蛋白顯示改善的活性。用于測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Czapla 禾口 Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等人(1985) J. of Economic Entomology78 :290-293 ；和美國(guó)專利號(hào)5，743，477，所述全部文獻(xiàn)均通過(guò)引用方式完整地并入本文。技術(shù)人員將會(huì)進(jìn)一步理解，可以通過(guò)突變本發(fā)明的核苷酸序列引入變化，從而導(dǎo)致編碼的殺蟲蛋白的氨基酸序列變化，而不改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的生物學(xué)活性。因而，分離的變體核酸分子可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、添加或缺失導(dǎo)入本文公開的相應(yīng)核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生，從而將一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、添加或缺失導(dǎo)入所編碼蛋白質(zhì)的靶突變區(qū)域中。突變可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如位點(diǎn)定向誘變法和PCR介導(dǎo)誘變法導(dǎo)入。此類變體核苷酸序列也由本發(fā)明包括。例如，可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的、非必需氨基酸殘基處產(chǎn)生保守性氨基酸替換。 “非必需”氨基酸殘基是可以從殺蟲蛋白的參考序列改變，但是不實(shí)質(zhì)地改變生物學(xué)活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基為生物學(xué)活性所需要的?！氨Ｊ匦园被崽鎿Q”是其中氨基酸殘基以具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β -分支的側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。Δ-內(nèi)毒素通常具有5個(gè)保守的序列結(jié)構(gòu)域和3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(見，例如，de Maagd等人.Q001)Trends Genetics 17:193-199)。第一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成并且參與膜插入和孔形成。結(jié)構(gòu)域II由以希臘鑰匙構(gòu)型排列的3個(gè) β-片層組成，并且結(jié)構(gòu)域III由“薄卷餅型”形式的2個(gè)反平行β-片層組成(de Maagd 等人，2001，上文)。結(jié)構(gòu)域II和III參與受體識(shí)別和結(jié)合，并且因此被視為毒素特異性的決定因素?？梢栽诒Ａ艄δ艿姆潜Ｊ貐^(qū)域做出氨基酸替換。通常，不對(duì)保守氨基酸殘基或不對(duì)位于保守基序內(nèi)部的氨基酸殘基做出此類替換，其中此類殘基對(duì)蛋白質(zhì)活性是必需的。 保守并且可能對(duì)蛋白質(zhì)活性是必需的殘基的實(shí)例包括例如，在相似或相關(guān)毒素與本發(fā)明序列的比對(duì)結(jié)果中所含的全部蛋白質(zhì)之間相同的殘基(例如，在同源蛋白的比對(duì)結(jié)果中相同的殘基)。保守并且可以允許保守性氨基酸替換并仍保持活性的殘基的實(shí)例例如包括，在相似或相關(guān)毒素與本發(fā)明序列的比對(duì)結(jié)果中所含的全部蛋白質(zhì)之間僅具有保守性替換的殘基(例如，在同源蛋白比對(duì)結(jié)果中所含的全部蛋白質(zhì)之間僅具有保守性替換的殘基)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，功能性變體可以在保守殘基中具有少量保守或非保守的改變。備選地，變體核苷酸序列可以通過(guò)沿著全部或部分的靶突變區(qū)域隨機(jī)導(dǎo)入突變(如通過(guò)排列或飽和誘變法)產(chǎn)生，并且可以對(duì)得到的突變體篩選賦予殺蟲活性的能力以鑒定保留活性或顯示改善的活性的突變體。誘變后，可以重組地表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)，并且可以使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法技術(shù)測(cè)定該蛋白質(zhì)的活性。使用如PCR、雜交等方法，可以鑒定相應(yīng)的殺蟲序列，此類序列與本發(fā)明的序列具有實(shí)質(zhì)同一'性。見，例如，Sambrook 禾口 Russell (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY),禾口 Innis 等人(1990)PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications(Academic Press,NY)。在雜交方法中，全部或部分的殺蟲性核苷酸序列可以用來(lái)篩選cDNA或基因組文庫(kù)。用于構(gòu)建cDNA和基因組文庫(kù)的方法通常是本領(lǐng)域已知的并且在上文Sambrook等人， 2001中公開。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可檢測(cè)基團(tuán)如32p或任何其他可檢測(cè)性標(biāo)記物(如其他放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)標(biāo)記?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)記基于本文中公開的已知的編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的合成寡核苷酸產(chǎn)生用于雜交的探針?？梢灶~外地使用基于核苷酸序列或編碼的氨基酸序列中保守的核苷酸或氨基酸殘基設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。探針一般包含核苷酸序列的區(qū)域，所述的區(qū)域在嚴(yán)格條件下與編碼本發(fā)明殺蟲蛋白的核苷酸序列或其片段或變體的至少約12個(gè)、至少約25個(gè)、至少約50個(gè)、75個(gè)、100個(gè)、125個(gè)、150個(gè)、175個(gè)或200個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。用于制備雜交用探針的方法通常是本領(lǐng)域已知的并且在通過(guò)引用方式并入本文的上文Sambrook等人，2001中公開。例如，本文中公開的完整殺蟲蛋白序列或其一個(gè)或多個(gè)部分可以作為能夠與相應(yīng)的殺蟲蛋白樣序列和信使RNA特異性雜交的探針使用。為在多種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交，此類探針包括下述序列，所述序列是獨(dú)特的并且優(yōu)選地具有至少約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度或至少約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。此類探針可以用來(lái)通過(guò)PCR從所選的生物擴(kuò)增相應(yīng)的殺蟲性序列。該項(xiàng)技術(shù)可以用來(lái)從想要的生物中分離額外的編碼序列或作為診斷性測(cè)定法用來(lái)確定生物中編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括鋪板DNA文庫(kù)的雜交篩選法(蝕斑或菌落；見，例如，Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)0此類序列的雜交可以在嚴(yán)格性條件下實(shí)施。“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指這樣的條件，在所述條件下探針將會(huì)與其靶序列雜交至比其與其他序列雜交可檢測(cè)性更大的程度(例如，高于背景至少2倍)。嚴(yán)格條件具有序列依賴性并且會(huì)在不同的環(huán)境中不同。 通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源性探測(cè))。備選地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針是小于約1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，優(yōu)選地小于500個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。一般而言，嚴(yán)格性條件將會(huì)是這些條件，其中鹽濃度在pH 7. O至8. 3上小于約 1. 5M Na離子，一般約0. 01至1. OM Na離子濃度(或其他鹽)并且對(duì)于短探針(例如10至 50個(gè)核苷酸)，溫度是至少約30°C，并且對(duì)于長(zhǎng)探針(例如多于50個(gè)核苷酸)，是至少約 60°C。也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。示例性低嚴(yán)格性條件包括在37°C 用30至35%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并且在50至 55°C于IX至2XSSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性中等嚴(yán)格性條件包括在37°C于40至45%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS中雜交，并且在55至60°C于0. 5X
12至IXSC中洗滌。示例性高嚴(yán)格性條件包括在37°C于50%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS中雜交， 并且在60至65°C于0. IXSSC中洗滌。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0. 至約SDS0 雜交的持續(xù)時(shí)間一般是小于約M小時(shí)，通常約4至約12小時(shí)。特異性一般是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是終末洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。 對(duì)于 DNA-DNA 雜合體，Tm 可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267-284 的等式=Tm = 81. 50C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -0. 61(% form)-500/L 近似；其中 M 是單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分?jǐn)?shù)，％ form是雜交溶液中甲酰胺的百分?jǐn)?shù)，并且L是該雜合體的長(zhǎng)度(堿基對(duì))。Tm是50%互補(bǔ)性靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。Tm因每錯(cuò)配下降約1°C;因此，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以雜交至具有想要的同一性的序列。例如，如果尋求具有 ^ 90%同一性的序列，則1可以降低10°C。通常，選擇嚴(yán)格性條件比在確定的離子強(qiáng)度和 PH下特定序列及其互補(bǔ)序列的解鏈溫度低約5°C。然而，極嚴(yán)格性條件可以利用比解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格性條件可以利用比解鏈溫度(Tm)低 6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格性條件可以利用比解鏈溫度(Tm)低11、12、13、 14、15或20°C的雜交和/或洗滌。使用該等式、雜交與洗滌組合物和想要的Tm，普通技術(shù)人員將會(huì)理解雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化被內(nèi)在地描述。如果想要的錯(cuò)配程度產(chǎn)生小于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，則優(yōu)選增加SSC濃度，從而可以使用更 1 白勺￠: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, I 部分，第 2 章(Elsevier, New York)；禾口 Ausubel 等人編輯(1995)Current Protocols in Molecular Biology, % 2 章(Greene Publishing 禾口 Wiley-Interscience, New York)。見 Sambrook 等人(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual(2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)中存在對(duì)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)。分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段殺蟲蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)?！皻⑾x蛋白”意指本文中所包括的殺蟲性變體Cry3 序列。也提供其片段、生物學(xué)活性部分和變體，并且可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。“分離的蛋白質(zhì)”或“重組蛋白”用來(lái)指不再處于其天然環(huán)境(例如在體外或處于重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞)中的蛋白質(zhì)?！捌巍被颉吧飳W(xué)活性部分”包括本文中所包括變體Cry3序列并且顯示殺蟲活性的多肽片段。殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分可以是例如10、25、50、100、150、200、250個(gè)或更多氨基酸長(zhǎng)度的多肽。此類生物學(xué)活性部分可以通過(guò)重組技術(shù)制備并評(píng)價(jià)殺蟲活性。用于測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等人 (1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ；和美國(guó)專利號(hào) 5，743，477，所述全部文獻(xiàn)均通過(guò)引用方式完整地并入本文。如此處所用，片段包含參考蛋白的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。 然而，本發(fā)明包括其他片段，如蛋白質(zhì)中多于約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、 400、450、500、550、600、650個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任意片段?！白凅w”意指具有與SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少約60%、65%、約70%、75%、 約 80%、85%、約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。變體也包括由下述核酸分子編碼的多肽，其中所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與編碼本文中所包括的變體Cry3序列的核酸分子或其互補(bǔ)序列雜交。變體包括因誘變而在氨基酸序列上相異的多肽。由本發(fā)明包括的變體蛋白質(zhì)是有生物活性的，即它們繼續(xù)擁有變體Cry3蛋白的想要的生物學(xué)活性，即保留殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，該變體相對(duì)于參考蛋白(例如，相對(duì)于SEQ ID N0:2或相對(duì)于特定的變體Cry3蛋白)具有改善的活性。用于測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ.Entomol. 83 :2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等人(1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ；和美國(guó)專利號(hào) 5，743，477，所述全部文獻(xiàn)均通過(guò)引用方式完整地并入本文。細(xì)菌基因，如本發(fā)明的axmi基因，相當(dāng)經(jīng)常地?fù)碛锌拷勺x框起點(diǎn)的多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。常常，在這些起始密碼子中一個(gè)或多個(gè)密碼子處的翻譯起始將會(huì)導(dǎo)致功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。然而，細(xì)菌(如芽孢桿菌屬物種) 也將密碼子GTG識(shí)別為起始密碼，并且在GTG密碼子處啟動(dòng)翻譯的蛋白質(zhì)含有在第一氨基酸處的甲硫氨酸。在罕見情況下，細(xì)菌系統(tǒng)中的翻譯可以在TTG密碼子處起始，然而在這種情況下TTG編碼甲硫氨酸。另外，常常不先驗(yàn)地確定在細(xì)菌中天然地使用這些密碼子中的哪些。因而，可以理解備選甲硫氨酸密碼子之一的使用可以也導(dǎo)致殺蟲蛋白的產(chǎn)生。這些殺蟲蛋白包含于本發(fā)明中并且可以在本發(fā)明的方法中使用。將會(huì)理解在植物中表達(dá)時(shí)，需要更改備選起始密碼子至ATG以正確翻譯。本發(fā)明也包括針對(duì)本發(fā)明多肽或針對(duì)其變體或片段的抗體。用于產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的(見，例如，Harlow 禾口 Lane(1988) Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；美國(guó)專利號(hào) 4, 196, 265)。改變或改善的變體認(rèn)識(shí)到可以通過(guò)多種方法進(jìn)一步改變殺蟲蛋白的DNA序列，并且這些改變可以產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，其中所述的蛋白質(zhì)具有與本發(fā)明殺蟲蛋白所編碼的氨基酸序列不同的氨基酸序列。這個(gè)蛋白質(zhì)可以以多種方式改變，所述方式包括本文中所包括的變體 Cry3序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸替換、缺失、截短和插入，包括在一個(gè)或多個(gè)靶突變區(qū)域內(nèi)多達(dá)約2個(gè)、約3個(gè)、約4個(gè)、約5個(gè)、約6個(gè)、約7個(gè)、約8個(gè)、約9個(gè)、約10個(gè)、約15 個(gè)、約20個(gè)、約25個(gè)、約30個(gè)、約35個(gè)、約40個(gè)、約45個(gè)、約50個(gè)、約55個(gè)、約60個(gè)、約 65個(gè)、約70個(gè)、約75個(gè)、約80個(gè)、約85個(gè)、約90個(gè)、約100個(gè)、約105個(gè)、約110個(gè)、約115 個(gè)、約120個(gè)、約125個(gè)、約130個(gè)、約135個(gè)、約140個(gè)、約145個(gè)、約150個(gè)、約155個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入。用于此類操作的方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過(guò)在DNA中突變來(lái)制備殺蟲蛋白的氨基酸序列變體。這也可以通過(guò)幾種形式的誘變法之一和 /或在定向進(jìn)化中完成。在一些方面中，氨基酸序列中所編碼的變化將不會(huì)實(shí)質(zhì)地影響蛋白質(zhì)的功能。此類變體會(huì)擁有想要(或改善)的殺蟲活性。然而，可以理解，殺蟲蛋白賦予殺蟲活性的能力可以將此類技術(shù)用于本發(fā)明的組合物而得到改善。例如，可以在DNA復(fù)制期間顯示高堿基錯(cuò)誤摻入率的宿主細(xì)胞如XL-IRed(Mratagene，La Jolla, CA)中表達(dá)殺蟲蛋白。在此類菌株中增殖后，可以分離DNA(例如通過(guò)制備質(zhì)粒DNA或通過(guò)PCR擴(kuò)增并將所得的PCR片段克隆至載體中)，在非誘變性菌株中培養(yǎng)殺蟲蛋白突變體，并且鑒定具有殺蟲活性的突變基因，例如通過(guò)開展檢測(cè)殺蟲活性的測(cè)定法。一般而言，將所述蛋白質(zhì)混合并用于飼喂測(cè)定法中。見,例如 Marrone 等人(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293。 此類測(cè)定法可以包括使植物與一種或多種害蟲接觸并測(cè)定植物存活和/或造成害蟲死亡的能力。導(dǎo)致毒性增加的突變的實(shí)例Ikhnepf等人(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 775-806。備選地，可以在氨基或羧基端對(duì)許多蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列做出改變，而不明顯影響活性。這可以包括通過(guò)現(xiàn)代分子方法(如PCR)導(dǎo)入的插入、缺失或改變，所述的PCR包括通過(guò)在PCR擴(kuò)增中所用的寡核苷酸中包括氨基酸編碼序列而改變或延伸蛋白質(zhì)編碼序列的PCR擴(kuò)增。備選地，添加的蛋白質(zhì)序列可以包括完整的蛋白質(zhì)編碼序列，如本領(lǐng)域常見用來(lái)產(chǎn)生蛋白質(zhì)融合物的那些序列。此類融合蛋白常常用來(lái)(1)增加目的蛋白的表達(dá)， (2)導(dǎo)入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶活性或表位以促進(jìn)蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)檢測(cè)或本領(lǐng)域已知的其他實(shí)驗(yàn)用途，(3)將蛋白質(zhì)定向分泌或翻譯至亞細(xì)胞細(xì)胞器，如革蘭陰性細(xì)菌的周質(zhì)空間或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的糖基化。本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列也包括從誘變性和重組生產(chǎn)方法如DNA改組法衍生的序列。采用這種方法，一種或多種不同的殺蟲蛋白編碼區(qū)可以用來(lái)產(chǎn)生擁有想要的特性的新殺蟲蛋白。以這種方式，從包含具有實(shí)質(zhì)序列同一性并且可以在體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)的相關(guān)序列多核苷酸群中產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫(kù)。例如，使用這種方法，可以在本發(fā)明的殺蟲性基因和其他已知的殺蟲性基因之間改組編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序以獲得編碼蛋白質(zhì)的新基因，其中所述蛋白質(zhì)具有改善的目的特性，如增加的殺昆蟲活性。用于此類DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。見，例如Stemmer (1994) Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ；Stemmer (1994) Nature 370 :389-391 ；Crameri 等人 (1997) Nature Biotech. 15 :436-438 ；Moore 等人(1997) J. Mol. Biol. 272 :336-347 ；Zhang 等人(1997)Proc. Natl. Acad. ki. USA 94 :4504-4509 ；Crameri 等人(1998) Nature391 288-291 ；和美國(guó)專利號(hào) 5，605，793 和 5，837，458。結(jié)構(gòu)域互換或改組是用于產(chǎn)生改變的殺蟲蛋白的另一種機(jī)制。結(jié)構(gòu)域可以在殺蟲蛋白之間互換，從而產(chǎn)生具有改善的殺蟲活性或靶譜的雜合或嵌合毒素。用于產(chǎn)生重組蛋白和測(cè)試其殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的(見，例如，Naimov等人Q001)Appl. Environ. Microbiol. 67 :5328-5330 ；de Maagd 等人(1996)Appl. Environ. Microbiol. 62 1537-1543 ；Ge 等人(1991) J. Biol. Chem. 266 :17954-17958 ；Schn印f 等人(1990) J. Biol. Chem. 265 :20923-20930 ；Rang 等人 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65 :2918-2925)?？梢栽谟糜谀康闹参镏斜磉_(dá)的表達(dá)盒中提供本發(fā)明的殺蟲序列?！爸参锉磉_(dá)盒”意指能夠在植物細(xì)胞中導(dǎo)致蛋白質(zhì)從可讀框中表達(dá)的DNA構(gòu)建體。一般，這些植物表達(dá)盒含有啟動(dòng)子和編碼序列。常常地，此類構(gòu)建體也會(huì)含有3'非翻譯區(qū)。此類構(gòu)建體可以含有促進(jìn)該肽共翻譯或翻譯后運(yùn)輸至某些胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如葉綠體(或其他質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的“信號(hào)序列”或“前導(dǎo)序列”?！靶盘?hào)序列”意指已知或懷疑導(dǎo)致跨細(xì)胞膜共翻譯或翻譯后肽運(yùn)輸?shù)男蛄小Ｔ谡婧松镏?，這一般涉及分泌至高爾基體中，伴有一定所得的糖基化。細(xì)菌的殺昆蟲性毒素常常合成為前毒素，所述前毒素在靶害蟲的腸中蛋白酶解地活化(Chang(1987)Methods Enzymo 1. 153 :507-516)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，信號(hào)序列位于天然序列中或可以從
15本發(fā)明的序列衍生?！扒皩?dǎo)序列”意指任意序列，其中所述的序列在翻譯時(shí)產(chǎn)生足以觸發(fā)肽鏈共翻譯性運(yùn)輸至亞細(xì)胞細(xì)胞器的氨基酸序列。因而，這包括通過(guò)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中、進(jìn)抵至液泡、質(zhì)體(包括葉綠體)、線粒體等的前導(dǎo)序列靶向運(yùn)輸和/或糖基化?！爸参镛D(zhuǎn)化載體”意指為高效轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞必需的DNA分子。這種分子可以由一個(gè)或多個(gè)植物表達(dá)盒組成，并且可以組織成多于一個(gè)“載體"DNA分子。例如，雙元載體是使用兩個(gè)非連續(xù)DNA載體來(lái)編碼用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的全部必要順式和反式作用功能的植物轉(zhuǎn)化載體(Hellens 和 MullineauxQOOO) Trends in Plant Science 5:446-451)。“載體，，指設(shè)計(jì)用于不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體。“表達(dá)載體”指具有在外來(lái)細(xì)胞中摻入、整合和表達(dá)異源DNA序列或片段的能力的載體。該盒將會(huì)包括與本發(fā)明序列有效連接的5' 和3'調(diào)節(jié)序列?！坝行нB接”意指啟動(dòng)子與第二序列之間的功能性連接，其中所述啟動(dòng)子序列啟動(dòng)并且介導(dǎo)與第二序列相對(duì)應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常，有效連接意指連接的核酸序列是連續(xù)的，并且在需要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的情況下，是連續(xù)且處于相同的可讀框中。 該表達(dá)盒可以額外地含有至少一個(gè)待共轉(zhuǎn)化入生物的額外基因。備選地，可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供額外的基因?！皢?dòng)子”指發(fā)揮指導(dǎo)下游編碼序列轉(zhuǎn)錄的功能的核酸序列。啟動(dòng)子，連同其他轉(zhuǎn)錄性和翻譯性調(diào)節(jié)核酸序列(又稱作“調(diào)控序列”)，對(duì)于目的DNA序列的表達(dá)是必需的。這種表達(dá)盒提供有用于插入處在調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)錄性調(diào)控下的殺蟲性序列的多個(gè)限制性位點(diǎn)。所述表達(dá)盒將會(huì)在5’ -3’轉(zhuǎn)錄方向包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄與翻譯起始區(qū) (即，啟動(dòng)子)、本發(fā)明的DNA序列和轉(zhuǎn)錄與翻譯終止區(qū)(即，終止區(qū))。啟動(dòng)子可以是天然的或類似的，或?qū)χ参锼拗骱?或?qū)Ρ景l(fā)明的DNA序列是外來(lái)或異源的。另外，啟動(dòng)子可以是天然序列或備選地是合成性序列。在啟動(dòng)子相對(duì)于植物宿主是“天然”或“同源”的情況下，意指該啟動(dòng)子存在于導(dǎo)入該啟動(dòng)子的天然植物中。在啟動(dòng)子相對(duì)于本發(fā)明的DNA序列是“外來(lái)”或“異源”的情況下，意指該啟動(dòng)子對(duì)于有效連接的本發(fā)明DNA序列而言不是天然的或天然存在的啟動(dòng)子。終止區(qū)可以相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是原有的，可以相對(duì)于有效連接的目的DNA序列是原有的，可以相對(duì)于植物宿主是原有的，或可以來(lái)自另一來(lái)源(即，相對(duì)于啟動(dòng)子、目的DNA序列、植物宿主或其任意組合是外來(lái)或異源的)。方便的終止區(qū)是從根瘤農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)的Ti質(zhì)?？傻玫降?，如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。也見Guerineau 等人(1991)Mol.Gen. Genet. 262 :141-144 ；Proudfoot(1991)Cell 64 :671-674 ；Sanfacon 等人(1991)Genes Dev. 5 :141-149 ；Mogen 等人(1990)Plant Cell 2 :1261-1272 ；Munroe 等人(1990)Gene 91 :151-158 ；Ballas 等人(1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891-7903 ；禾口 Joshi 等人(1987)Nucleic Acid Res. 15 :9627_9639。根據(jù)需要，基因可以為轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中增加的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。即，基因可以為改善的表達(dá)而使用宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子合成，或可以按宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子選擇頻率使用密碼子進(jìn)行合成。通常，基因的GC含量將會(huì)增加。見，例如，Campbell和Gowri (1990) Plant Physiol. 92 :1-11對(duì)宿主優(yōu)選密碼子選擇的討論。用于合成植物優(yōu)選基因的方法是本領(lǐng)域可獲得的。見，例如，通過(guò)引用的方式并入本文的美國(guó)專利號(hào)5，380，831和 5，436，391 以及 Murray 等人，1989，Nucleic Acids Res. 17 :477_498。
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在一個(gè)實(shí)施方案中，將殺蟲蛋白靶向葉綠體用于表達(dá)。以這種方式，在不直接將殺蟲蛋白插入葉綠體的情況下，表達(dá)盒將會(huì)額外地含有核酸，所述核酸編碼引導(dǎo)殺蟲蛋白至葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。此類轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域已知的。見，例如，Von Heijne等人(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9 :104-126 ；Clark ^ 人(1989)J. Biol. Chem. 264 :17544-17550 ； Della-Cioppa 等人(1987)Plant Physiol. 84 :965-968 ；Romer ^ 人(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 :1414-1421 ；和 Shah 等人(1986) Science 233 :478-481。待靶向至葉綠體的殺蟲基因可以為葉綠體中的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化以引起植物細(xì)胞核和這種細(xì)胞器之間密碼子選擇的差異。以這種方式，目的核酸可以使用葉綠體優(yōu)選的密碼子合成。見，例如，通過(guò)引用方式并入本文的美國(guó)專利號(hào)5，380，831。棺物轉(zhuǎn)化本發(fā)明的方法涉及導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體至植物中。術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”意指如此方式向植物呈遞核苷酸構(gòu)建體，從而該構(gòu)建體進(jìn)入該植物的細(xì)胞的內(nèi)部。本發(fā)明的方法不要求使用用于導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體至植物的特定方法，只要該核苷酸構(gòu)建體進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。用于導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體至植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)的方法。“植物”意指完整植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚及其子代。植物細(xì)胞可以是分化或未分化的(例如愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)?！稗D(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)化的植物”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”植物或細(xì)胞或組織指已經(jīng)使外源核酸序列或DNA片段摻入或整合入植物細(xì)胞中的植物。這些核酸序列包括為外源或在未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中不存在的那些核酸序列以及可以為內(nèi)源或在未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中存在的那些核酸序列?！爱愒础蓖ǔＶ高@些核酸序列，所述核酸序列相對(duì)于它們存在其中的細(xì)胞或天然基因組的部分而言不為內(nèi)源并且已經(jīng)通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射法、電穿孔法、微量投射法添加至細(xì)胞。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)本文中公開的一種或多種變體Cry3序列。在多種實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物還包含一個(gè)或多個(gè)用于昆蟲抵抗性的額外基因，例如，一個(gè)或多個(gè)用于控制鞘翅目害蟲的額外基因(例如，CryljB Cry 1A、CrylB, CrylC, CrylD, CrylE和CrylF 家族的成員；Cry2，如 Cry2A 家族的成員；Cry9,如 Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E 和 Cry9F家族的成員；Cry34/35 ；VIP，如VIP3 ；或本領(lǐng)域已知針對(duì)鞘翅目害蟲具有毒性的任何修飾的Cry3A或CryIBB序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解該轉(zhuǎn)基因植物可以包含賦予目的農(nóng)學(xué)性狀的任意基因。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾項(xiàng)技術(shù)之一完成。可以修飾本發(fā)明的殺蟲基因以獲得或增強(qiáng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。一般，表達(dá)這種蛋白質(zhì)的構(gòu)建體會(huì)含有驅(qū)動(dòng)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子以及允許轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化的3'非翻譯區(qū)。此類構(gòu)建體的組織是本領(lǐng)域熟知的。在一些情況下，可能有用的是使該基因工程化，從而所得的肽被分泌，或靶向在植物細(xì)胞內(nèi)部。例如，該基因可以工程化以含有促進(jìn)肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽。也可以優(yōu)選使植物表達(dá)盒工程化以含有內(nèi)含子，從而要求內(nèi)含子的mRNA加工用于表達(dá)。一般，這種“植物表達(dá)盒”將會(huì)插入“植物轉(zhuǎn)化載體”中。該植物轉(zhuǎn)化載體可以由實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需要的一個(gè)或多個(gè)DNA載體組成。例如，本領(lǐng)域中的常規(guī)實(shí)踐是使用由多于一個(gè)連續(xù)DNA區(qū)段組成的植物轉(zhuǎn)化載體。這些載體常常在本領(lǐng)域中稱作“雙元載體”。雙元載體以及帶有輔助質(zhì)粒的載體最經(jīng)常地用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中為實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化所需要的DNA區(qū)段的大小和復(fù)雜度是相當(dāng)大的，并且有利的是將多項(xiàng)功能分離至單獨(dú)的DNA分子上。雙元載體一般含有這樣的質(zhì)粒載體，其含有為T-DNA轉(zhuǎn)移所需的順式作用序列(如左邊界和右邊界)、被工程化以能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記和“目的基因”(被工程化以能夠在對(duì)于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物所需要的植物細(xì)胞中表達(dá)的基因)。這種質(zhì)粒載體上也存在為細(xì)菌復(fù)制所需要的序列。順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞并且在其中表達(dá)的的方式排列。例如，選擇標(biāo)記基因和殺蟲基因位于左邊界與右邊界之間。第二種質(zhì)粒載體常常含有介導(dǎo)T-DNA從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的反式作用因子。如本領(lǐng)域理解，這種質(zhì)粒常常含有允許農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞和通過(guò)在邊界序列處切割來(lái)轉(zhuǎn)移DNA和vir-介導(dǎo)的DNA 轉(zhuǎn)移的毒力功能(Vir 基因)(Hellens 和 MullineauxQOOO) Trends in Plant Science 5 446-451)。一些類型的農(nóng)桿菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAlOl、EHA105等)可以用于植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體對(duì)于通過(guò)其他方法如微量投射法、顯微注射法、電穿孔法、聚乙二醇法等轉(zhuǎn)化植物不是必需的。通常，植物轉(zhuǎn)化方法涉及轉(zhuǎn)移異源DNA至靶植物細(xì)胞中(例如不成熟或成熟的胚、 懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)，隨后施加最大閾水平的適宜選擇(取決于選擇標(biāo)記基因)以從未轉(zhuǎn)化細(xì)胞物質(zhì)的群體中回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。外植體一般轉(zhuǎn)移至相同培養(yǎng)基的新鮮補(bǔ)給物并例行地培養(yǎng)。隨后，在補(bǔ)充有最大閾水平選擇劑的再生培養(yǎng)基上放置后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化成苗。苗隨后轉(zhuǎn)移至選擇性生根培養(yǎng)基用于回收生根的苗或小植物。轉(zhuǎn)基因小植物隨后生長(zhǎng)成成熟的植物并且產(chǎn)生能育性種子(例如Hiei等人(1994) The Plant Journal 6 :271-282 ;Ishida 等人(1996)Nature Biotechnology 14:745—750)。夕卜植體一般轉(zhuǎn)移至相同培養(yǎng)基的新鮮補(bǔ)給物并例行地培養(yǎng)。對(duì)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般描述見 Ayres 禾口 Park (1994) Critical Critical Reviews in Plant Science 13 :219-239 和 Bommineni 和 Jauhar (1997)Maydica 42 :107_120。由于轉(zhuǎn)化的材料含有許多細(xì)胞；轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均存在任意一塊的經(jīng)處理的靶愈傷組織或組織或細(xì)胞群體中。殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并且允許轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖的能力產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。除去未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力常常是快速回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的限制條件。轉(zhuǎn)化方案以及用于導(dǎo)入核苷酸序列至植物中的方案可以根據(jù)為轉(zhuǎn)化所靶向的植物或植物細(xì)胞的類型即單子葉植物或雙子葉植物而變化?？梢酝ㄟ^(guò)幾種方法之一進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生，所述的方法包括，但不限于顯微注射法、電穿孔法、直接基因轉(zhuǎn)移法、通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入異源DNA至植物細(xì)胞中(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法)、用粘附至粒子的異源外來(lái)DNA轟擊植物細(xì)胞、射彈粒子加速法、氣溶膠束轉(zhuǎn)化法(美國(guó)公開申請(qǐng)?zhí)?0010(^6941 ；美國(guó)專利號(hào)4，945，050 ；國(guó)際
發(fā)明者V·海因里希斯 申請(qǐng)人:阿森尼克斯公司