專利名稱：：具有酯酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
：植物細胞壁多糖約構(gòu)成植物細胞壁的90%，并且能分成三組纖維素，半纖維素和果膠。纖維素代表細胞壁多糖的主要成分。半纖維素是植物細胞壁第二豐富的成分。主要的半纖維素聚合物是木聚糖。木聚糖骨架的生物降解依賴于兩類酶內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶。內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)將木聚糖骨架切割成更小的寡糖，其可以進一步由β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。其它與木聚糖降解有關(guān)的酶包括，例如，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯糖酶，α-葡糖醛酸糖苷酶，酯酶，和對-香豆酸酯酶。W002/12472公開了能夠立體選擇性水解手性酯和水解阿魏酸酯的酯酶。Faulds和Williamson，1991，J.Gen.Microbiol.137:2339-2345描述了來自橄欖色鏈霉菌(Sti^ptomycesolivochromogenes)的4_羥基-3-甲氧基-肉桂(阿魏)酸酯酶的純化和表征。Faulds和Williamson，1994，Microbiology140:779_787，描述了來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶的純化和表征。Kroon等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23:255-262描述了由糖甜菜粕上黑曲霉生長而誘導(dǎo)的新酯酶的純化和表征。deVries等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:4638-4644公開了來自黑曲霉和塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)的酉旨酶基因。Castanares等，1992,EnzymeMicrobiol.Technol.14:875_884，描述了來自嗜松青霉(Penicillumpinophilu)的阿魏?；?對-香豆?；ッ傅募兓托再|(zhì)。本發(fā)明涉及具有酯酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明人分離了具有酯酶活性的來自漆斑菌屬菌種(Myrotheciumsp.)的酯酶。所述新酯酶與已知的氨基酸序列具有少于30%的非常低的同一性。本發(fā)明人還分離了編碼該新酯酶的基因，并將其克隆入大腸桿菌菌株。本發(fā)明涉及具有酯酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至4少45%同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或幾個氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及編碼具有酯酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自下組(a)編碼包含氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少45%同一性；(b)多核苷酸，其在至少中嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或()的互補鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)多核苷酸，其編碼SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或幾個氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達載體和重組宿主細胞，和產(chǎn)生具有酯酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及抑制多肽在細胞中表達的方法，其包括對細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及此種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地該dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發(fā)明還涉及降解包含木聚糖的材料的方法。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼此種具有酯酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生此種具有酯酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼具有阿魏酸酯酶的多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明進一步涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中將所述基因可操作地連接于編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至20或由SEQIDNO2的氨基酸1至20組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹?。附圖簡述酯酶活性術(shù)語“酯酶活性”定義為在稱作水解的與水進行的化學(xué)反應(yīng)中將酯分解為酸和醇的水解酶活性(EC3.1.1.)。就本發(fā)明而言，酯酶活性是根據(jù)實施例1中所述的在PNPB底物中確定酯酶活性的方法來確定的。在本領(lǐng)域公知(EC3.1.1.)包含的酯酶可選自例如阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)、乙酰木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)、蛋白質(zhì)-谷氨酸甲基酯酶(EC3.1.1.61)、羧基酯酶(EC3.1.1.1)、芳基酯酶(EC3.1.1.2)、乙?；ッ?EC3.1.1.6)、膽堿酯酶(EC3.1.1.8)、甾醇酯酶(EC3.1.1.13),α-氨基酸酯酶(EC3.1.1.43)等等。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的酯酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指由來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，多肽是如通過SDS-PAGE測定的，至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純的多肽?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為具有酯酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:2的氨基酸1至20是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸21至520。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDN0:1的核苷酸1至60編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO=I的核苷酸61至1560。同一性由參數(shù)“同一性”描述的兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277)的Needle程序，優(yōu)選3.0.0版或更高版本中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來確定。使用的任選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62取代矩陣(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle標記為“最高同一性(longestidentity)，，(使用-nobrief選項獲得)的輸出結(jié)果作為百分比同一性，并計算如下(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上文)的Needle程序，優(yōu)選3.0.0或更高版本中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和mmSCh，1970，見上文)來測定。使用的任選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL取代矩陣(NCBINUC4.4的EMBOSS版)。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為預(yù)測的蛋白質(zhì)，其在用SEQIDNO2的漆斑菌屬菌種酯酶或其成熟多肽進行的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols,S.Misener禾口S.A.Krawetz編，pp.185-219)中給出小于0.001的E值(或期望值)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有酯酶活性。在一個優(yōu)選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少250個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少300個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少450個氨基酸殘基。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有酯酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少750個核苷酸，更優(yōu)選至少900個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1350個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，多核苷酸是如通過瓊脂糖電泳測定的，至少純，優(yōu)選5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純的多核苷酸?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選在本文公開的多核苷酸是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成或重組核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段，或所述核酸是合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達。表達術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)0修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對由SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當用在本文時，術(shù)語“人工變體”的意思是具有酯酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention)，通過修飾SEQIDN0:1中公開的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發(fā)明詳述具有酯酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及包含氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有優(yōu)選至少45%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，甚至更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少85%，且甚至最優(yōu)選至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有酯酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸21至520，或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸21至520。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸21至520或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸21至520組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有酯酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選非常低嚴格條件下，更優(yōu)選低嚴格條件下，更優(yōu)選中嚴格條件下，更優(yōu)選中-高嚴格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴格條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴格條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iν)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有酯酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO=I的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有酯酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優(yōu)選至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少700個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應(yīng)的基因(例如，用％PJH、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針涵蓋于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有酯酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含于SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，其全長互補鏈；或它們的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸61至1560。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)DSM19428中的質(zhì)粒中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有酯酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌DSM19428中的質(zhì)粒中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍栏裥詾?0%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至M小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在450C(非常低嚴格性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴格性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴格性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴格性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴格性)，并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比牛艮據(jù)Bolton禾口McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二S1IffcI(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三方面，本發(fā)明涉及具有酸酯酶活性的分離的多肽，其由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少45%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，且甚至最優(yōu)選至少95%、96%,97^^98%或99%的同一性程度，其編碼活性多肽。參見本文的多核苷酸部分。在第四方面，本發(fā)明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸,如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn.Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?；蛘?，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells，1989，ScienceM4:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，酯酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255=306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如由Reidhaar-Olson禾口Sauer，1988，Science241:53-57；Bowie禾口Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413;或WO95/2洸25公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30:10832-10837；美國專利號5，223，409；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽，如SEQIDNO2的氨基酸21至520的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有酯酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有酯酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是具有酯酶活性的革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(!印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或具有酯酶活性的革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬O^seudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)^iIffliiM(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多妝。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)S"(Bacillusamyloliquefaciens)^M^^^fM(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulms)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿M(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明具有酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選具有酯酶活性的酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選具有酯酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremoniumm)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium.鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)λMSM(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假漂盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(fThielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬CTrichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevtsiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個優(yōu)選方面，所述多肽是具有酯酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniudmcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(Fusariumcerealis)、庫威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霄(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霄(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfunicidlosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、35PJji1(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica>Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa^^yifl^ifil^(Thielaviaaustraleinsis)>Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana^^^(Thielaviaspededonium)>^^(Thielaviasetosa)>Thielaviasubthermophila、^(Thielaviaterrestris)>(^^7^(Trichodermaharzianum)>^tJ27^β(Trichodermakoningii)、^枝7^(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霄(Trichodermareesei)或參錄色木霄(Trichodermaviride)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是漆斑菌屬多肽，在一個更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的漆斑菌屬菌種多肽，例如，包含SEQIDNO:2的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質(zhì)釋放具有酯酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-WiIson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.633488-3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498—503;禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-fcicie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln后通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發(fā)明具有酯酶活性的多肽的核苷酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO=I或由SEQIDNO=I組成。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌DSM19428中所含質(zhì)粒中含有的序列，或由大腸桿菌DSM19428中所含質(zhì)粒中含有的序列組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸61至1560或由SEQIDNO:1的核苷酸61至1560組成。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌DSM19428中所含質(zhì)粒中含有的成熟多肽編碼序列或由大腸桿菌DSM19428中所含質(zhì)粒中含有的成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還涵蓋編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:1的亞序列，所述亞序列編碼具有酯酶活性的SEQIDNO:2的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)。可以從漆斑菌屬菌株，或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少45%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其編碼具活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95一107。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上文)來鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的酯酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴格條件下，優(yōu)選低嚴格條件，更優(yōu)選中等嚴格條件，更優(yōu)選中-高嚴格條件，甚至更優(yōu)選高嚴格條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴格條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴格條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有酯酶活性的多肽。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈霉菌(Sti^ptomyces16coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican,1980,242:74-94中；禾口在Sambrook等，1989，見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(lihizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?；蛘?，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)、克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(Bacillusclausiialcalineprotease)(aprH)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。在一個優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至20，或者由SEQIDΝ0:2的氨基酸1至20組成。在另一個優(yōu)選方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至60，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至60組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、xyl和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列可與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。上述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘?，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的核酸序列或核酸構(gòu)建體來表達本發(fā)明的核酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)粒或兩個或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體穩(wěn)定整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點。用于酵母宿主細胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，和由此得到多核苷酸的額外拷貝。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，可有利地用于多肽的重組生產(chǎn)中。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細胞，使載體作為染色體整合體或如前所述的自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細胞”包括由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是天藍鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler禾口Thorne，1987，JournalofBacteriologyl69:5771-5278)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，R)liaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細胞，例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞，例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，hfect.Immun.321295_1四7)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68:189-2070)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細胞的方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞。“真菌”用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filikisidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Wianerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬/嗜熱霉屬(Thermoascus)、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFiffllif(Ceriponopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽角質(zhì)金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Wianer0Chaetechrysosporium),輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和^ltonφ,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474ψ描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,ppl82_187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriologyl53:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，則其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酯酶產(chǎn)物的形成或酯酶底物的消失。例如，酯酶測定法(esteraseassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因的植物、植物部分或植物細胞，其經(jīng)核酸序列轉(zhuǎn)化，所述核酸序列編碼本發(fā)明具有酯酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗營養(yǎng)因子。在一個具體實施方案中，所述多肽靶向種子中的胚乳儲藏液泡。這可通過將其合成為具有合適信號肽的前體來獲得，參見Horvath等，于PNASJeb.15,2000,vol.97，no.4，p.1914-1919。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)或其經(jīng)工程改造的變體。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱、黑小麥(小、麥(Triticum)和黑麥(Secale)的穩(wěn)定雜種)和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)如向日葵(Helianthus)、棉(Gossypium)、羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)禾口十字花禾斗的(cruciferous)植物(十字花禾斗(familyBrassicaceae)),如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。如例如美國專利5，689，054號和美國專利6，111，168號中所述的低肌醇六磷酸植物是經(jīng)工程改造的植物的實例。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口細胞質(zhì)(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細胞的后代。表達本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個表達構(gòu)建體并入植物宿主基因組，并且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。方便地，表達構(gòu)建體是包含編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該核酸序列所需的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構(gòu)建體可包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了24表達構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的細胞區(qū)室、組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如league等，1988,PlantPhysiology86:506所述。對于組成性表達，可以使用下述啟動子35S_CaMV啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294)、玉米泛素1(ChristensenAH,SharrockRA和Quail1992，.Maizepolyubiquitingenesstructure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation)或稻肌動蛋白1啟動子(PlantMo.Biol.18，675-689.；Zhang等，W,McElroyD.andWuR1991,AnalysisofriceActl5'regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)0器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi,1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiologyl02:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology洸85-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995,Molecularandgeneralgenetics248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)、赤霉酸(gibberellicacid)和/或重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)酶在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上文，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強表達。仍進一步，可對于所討論的植物物種優(yōu)化密碼子的使用以改善表達(參見上文引用的Horvath等)。選擇性標記基因和表達構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可得到的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990,Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和khilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法是更加常用的。目前，除了土壤桿菌屬方法外，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中白勺(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasil等，1992,Bio/Technology10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-4所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入其中的表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，所述核酸序列編碼本發(fā)明具有酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。組合物在仍進一步的方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本領(lǐng)域內(nèi)已知方法將包含于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明的多肽或多肽組合物的優(yōu)選用途的實例。動物飼料本發(fā)明還涉及在動物飼料中使用具有酯酶活性的多肽的方法，以及涉及包含本發(fā)明多肽的飼料組合物和飼料添加劑術(shù)語動物包括所有動物，包括人。動物的實例為非反芻動物和反芻動物。反芻動物包括，例如，動物如綿羊、山羊和牲畜(cattle)，例如牛(cow)如肉牛和奶牛。在一個具體實施方案中，動物是非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物，例如豬(Pigorswine)(包括但不限于，小豬、飼育豬(growingpig)和母豬)；家禽如火雞、鴨和雞(包括但不限于肉仔雞(broilerchick)、蛋雞)；魚(包括但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚和鯉魚)；和甲殼類動物(包括但不限于小蝦(shrimp)和對蝦(prawn))。術(shù)語飼料或飼料組合物意指任何適合或旨在由動物攝取的化合物、制備物、混合物或組合物。在本發(fā)明的用途中，酯酶可在飲食之前、之后或同時飼喂予動物。后者是優(yōu)選的。在一個具體實施方案中，所述酯酶在其添加至飼料或包含于飼料添加物時的形式是明確限定的。明確限定意指酯酶制備物如通過尺寸排阻色譜確定為至少50%純(參見W001/58275的實施例12)。在其他具體實施方案中，所述酯酶制備物如通過該方法確定為至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%純。明確限定的酯酶制備物是有利的。舉例而言，將基本上不含干擾或污染的其他酯酶的酯酶正確劑量添加于飼料中是容易得多的。術(shù)語正確劑量添加特別指獲得一致和恒定結(jié)果的目標，以及基于所需的效果優(yōu)化劑量的能力。然而，對于在動物飼料中的用途，所述酯酶無需如此之純；其可例如包含其他酶，在此情況下其稱為酯酶制備物。所述酯酶制備物可(a)直接添加至飼料(或直接用于蛋白質(zhì)的處理工藝)或(b)可用于產(chǎn)生一種或多種后續(xù)添加至飼料(或用于處理工藝)的中間組合物如飼料添加劑或預(yù)混物(premix)。上述的純度指原始酯酶制備物的純度，無論是根據(jù)上述(a)或(b)使用的。具體而言，具有該數(shù)量級的純度的酯酶制備物可使用重組產(chǎn)生方法獲得，而當通過傳統(tǒng)發(fā)酵方法產(chǎn)生該酯酶時，其并不那么容易獲得，且其批次間(batch-to-batch)差異要高得多。當然，此種酯酶制備物可與其他酶混合。可以任何形式將酯酶添加至飼料，無論其為相對純的酯酶或與其他旨在添加至動物飼料的組分一同混合，即以動物飼料添加劑的形式，如所謂用于動物飼料的預(yù)混物。在一個進一步的方面，本發(fā)明涉及用于動物飼料的組合物，如動物飼料和動物飼料添加劑，例如預(yù)混物。除了本發(fā)明的酯酶，本發(fā)明的動物飼料添加劑包含至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量元素和/或至少一種常量礦物質(zhì)(macromineral)0此外，可選的飼料添加劑成分為著色劑，例如類胡蘿卜素如胡蘿卜素、蝦青素和葉黃素；香料化合物；穩(wěn)定劑；抗微生物肽；多不飽和脂肪酸；產(chǎn)活性氧類物質(zhì)；和/或至少一種其他選自下組的酶肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.)；磷脂酶Al(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(EC3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；淀粉酶如例如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)和/或阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)。在一個具體實施方案中，這些其他酶是明確限定的(如上述對于酯酶制備物所定義的)?？刮⑸镫?AMP)的例子有CAP18、LeucocinA(明串珠菌素A)、Tritrpticin,Protegrin-I、Thanatin(死亡素)、防衛(wèi)素(Defensin)、Lactoferrin(乳鐵蛋白)、Lactoferricin(乳鐵素)禾口Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer，2000)、Plectasins(菌絲霉素)、和Statins(他汀類)，包括WO03/044049和WO03/048148中公開的化合物和多肽，以及上述各項的保留抗微生物活性的變體或片段。多不飽和脂肪酸的例子有C18、C20和C22多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoicacid)、二十碳五烯酸和Y-亞油酸。產(chǎn)活性氧類物質(zhì)的例子是化學(xué)品如過硼酸鹽(perborate)、過硫酸鹽(persulphate)或過碳酸鹽(percarbonate)；和酶如氧化酶、加氧酶或合成酶。通常，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質(zhì)形成旨在加入飼料中的所謂預(yù)混物的部分，而常量礦物質(zhì)通常分開地添加到飼料中。這些組合物類型之任一，當富含本發(fā)明的酯酶時，為本發(fā)明的動物飼料添加劑。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑旨在以0.005至10%，具體而言0.01至5%，更具體而言0.02至2%，且甚至更具體而言0.2至1%的水平包含于(或被規(guī)定為必須包含于)動物飲食或飼料中(％表示每IOOg飼料的g添加劑)。對于預(yù)混物而言尤其如此。下面是這些組分的實例的非排他性列表脂溶性維生素的例子有維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子有維生素B12、生物素和膽堿、維生素Bi、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸(鹽)、例如Ca-D-泛酸。痕量礦物質(zhì)的例子有錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。常量礦物質(zhì)的例子有鈣、磷和鈉。這些組分的營養(yǎng)需要量(以家禽和小豬/豬為例)在WO01/58275的表A中列出。營養(yǎng)需要量是指這些組分應(yīng)以指明的濃度在飲食中提供?；蛘?，本發(fā)明的飼料添加劑包含WO01/58275的表A中指定的各單獨組分中的至少一種。至少一種意指任一種，一種或多種，一種，或兩種，或三種，或四種，依此類推多至全部13種，或多至全部15種單獨組分。更具體地說，該至少一種單獨組分以這樣的量包含在本發(fā)明的添加劑中，從而提供如表A的第4欄、或第5欄或第6欄所示范圍內(nèi)的飼料中濃度(in-feed-concentration)0本發(fā)明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或飲食具有相對高含量的蛋白質(zhì)。家禽和豬用飲食可以如WO01/58275的表B中所示來表征。魚用飲食可以如該表B的第4欄所示來表征。此外，此類魚用飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275對應(yīng)于美國專利第6，960，462號，在此通過提述將其并入本文。根據(jù)本發(fā)明的動物飼料組合物的粗蛋白含量為50_800g/kg，并且還包含至少一種如本文中要求保護的酯酶。此外，或者(作為上述粗蛋白含量的替代)，本發(fā)明的動物飼料組合物的可代謝能量含量為10-30MJ/kg；和/或鈣含量為0.l-200g/kg；和/或有效磷含量為0.l_200g/kg；和/或甲硫氨酸含量為0.l-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸含量為0.l-150g/kg；和/或賴氨酸含量為0.5-50g/kg。在具體的實施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或賴氨酸的含量為WO01/58275的表B中范圍2、3、4或5(第2_5行)之任一者之內(nèi)。粗蛋白如下計算氮(N)乘以因數(shù)6.25，即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25。氮含量用凱氏定氮法(A.0.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis第14版，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)來測定。可代謝能量可基于下列文獻來計算NRCpublicationNutrientrequirementsinswine,修訂的第9版，subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress，Washington，D.C.，pp.2—6，禾口EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,ffageningen.ISBN90-71463-12-5。鈣、可用磷、和氨基酸在完全動物飲食中的飲食含量基于如Veevoedertabe11997,gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6,8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7等的飼料表來計算。動物飲食可以作為例如碎飼料(mashfeed)(未制粒的)或制粒的飼料來制備。通常，將經(jīng)過粉碎的飼料物料混合，并根據(jù)所述物種的具體規(guī)格加入足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。酶可以作為固體或液體酶配制物加入。例如，固體酶配制物通常在混合步驟之前或過程中加入，而液體酶制備物通常在制粒步驟之后加入。酶也可以摻入飼料添加劑或預(yù)混物中。飲食中的最終酶濃度是在每kg飲食0.01-200mg酶蛋白的范圍內(nèi)，例如在0.2-30mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選每kg動物飲食0.5至1.5mg酶蛋白。對于包含木聚糖酶和酯酶的酶組合物，最終酶濃度通常為每kg動物飲食0.5至lmg。毫無疑問，酯酶可以以有效量施用，即以足以改善飼料溶解和/或改善飼料營養(yǎng)價值的量施用。目前涵蓋了酶以一種或多種下述量(劑量范圍)施用0.01-200;0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10-所有范圍為每kg飼料的mg酯酶蛋白(ppm)。為了確定每kg飼料的mg酯酶蛋白，將酯酶從飼料組合物純化，并使用相關(guān)測定法(參見下述酯酶測定部分)確定所述純化的酯酶的比活性。飼料組合物本身的酯酶活性也使用相同測定法確定，并基于此兩種確定，計算了以每kg飼料的mg酯酶蛋白計的劑量。相同原則適用于確定飼料添加劑中的mg酯酶蛋白。毫無疑問，如果可獲得用于制備所述飼料添加劑或所述飼料的酯酶的樣品，則從該樣品確定所述比活性(無需從飼料組合物或添加劑純化酯酶)。實施例試劑、培養(yǎng)基和設(shè)備mi除非另行指明，所用的化學(xué)品為至少試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。pNP-底物pNPB丁酸對硝基苯酯(p-NitrophenylButyrate)(SigmaN9876),pNPA:乙酸對硝基苯酯(p-NitrophenylAcetate)(SigmaN8130)，pNPP棕櫚酸對硝基苯酯(p-Nitrophenylpalmitate)(SigmaN2752)，pNNAG對硝基苯基N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷(p-NitrophenylN-Acetyl-β-D-Glucosaminide)(SigmaN9376)。EDTA(GibcoBRL目錄號15576-028)IPTG(Promega,目錄號V3951)X-gal(Promega,目錄號V3941)氨芐青霉素鈉鹽(GIBC0L目錄號11593-019)LMP瓊脂糖(!Iomega，目錄號V2111)BETEB對苯二甲酸二O-羥乙基)酯二苯甲酸酯(Tei^phthalicacidbis(2-hydroxyethyl)esterdibenzoate)在本文中縮寫為BETEB(苯甲酰-亞乙基-對苯三甲酸_亞乙基一苯甲酸酉旨(benzoyl-ethylene-terephthalic-ethelene-benzoate))。其從對苯二甲酸二(2-羥乙基)酯和苯甲酸制備。培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基向950ml的去離子H2O添加IOg細菌蛋白胨，5g細菌酵母提取物，IOgNaCl。振蕩直至溶質(zhì)溶解。用5NNaOH(0.^il)將pH調(diào)整至7.0。用去離子H2O將溶液體積調(diào)整至1升。以液體循環(huán)在151b/sq.in.進行高壓滅菌20分鐘。含氨芐青霉素/IPTG/X-Gal的LB平板將15g瓊脂糖添加至1升的LB培養(yǎng)基。添加氨芐青霉素至終濃度100μg/ml，然后補充0.5mMIPTG和80μg/mlX-gal并鋪板。SOC液體培養(yǎng)基2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，IOmMNaCl,2.5mMKCl,10mMMgCl2,IOmMMgSO4,20mM葡萄糖TAE緩沖液0.04MTris-乙酸，0.001MEDTA1%LMP瓊脂糖凝膠將IgLMP瓊脂糖添加入100ml1XTAE緩沖液。YS培養(yǎng)基向1升水添加10g蛋白胨，IOg酵母提取物，5g葡萄糖，5gK2HPO4,IgMgSO4.7H20,20ml橄欖油。MD培養(yǎng)基1.34%YNB，4X10_5%生物素，2%右旋糖BMGY(緩沖的甘油復(fù)合培養(yǎng)基，BufferedGlycerol-complexMedium)；酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀(pH6.0),1.34%YNB，4xl(T5%生物素，1%甘油BMMY(緩沖的甲醇復(fù)合培養(yǎng)基，BufferedMethanol-complexMedium)酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀(pH6.0)，1.34%YNB，4xl(T5%生物素，0.5%甲醇。設(shè)備，包括各種試劑盒5Κ膜(MilliporeΒΙ0ΜΑΧ-5,13442ΑΜ)0.45μm過濾器(Nalgene190-2545)0.45μm聚碳酸酯過濾器(Sartorius)QSepharoseFF柱(AmershamPharmacia17-0510-01)Superdex75柱(AmershamPharmacia17-1047-01)SuperdexPeptidePE(7.5x300mm)凝膠過濾柱(Global)IEF-凝膠(AmershamPharmacia80-1124—80)ThermomixerComfort(Eppendorf)SpectrophotometerDU7500(Beckman)GeneAmpPCRSystem9700(PE)Vac-ManJr.LaboratoryVacuumManifold(Promega,目錄號A7660)BioRadGenePulserIIRNeasyPlantMiniKit(50)(QIAGEN,目錄號74904)DNeasyPlantMiniKit(50)(QIAGEN,目錄號69104)3，RACEKit(GIBC0,目錄號18373-019)，包含Adapter引物和AUAPdNTP混合物(lOOmM，Promega,目錄號U1330)TaqDNA聚合酶系統(tǒng)(Promega，目錄號M1661)，包含PCR緩沖液QOOmOTris-HCl(pH8.4),500mMKCl)PCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega,目錄號A7170)pGEM-TVectorSystem(Promega,目錄號A3600)，包含T4DNALigase2XBufferJM109高感受態(tài)細胞(!Iomega，目錄號L1001)ElectroMaxDH10B感受態(tài)細胞(Invitrogen,目錄號18290-015)MiniprepsDNAPurificationSystem(Promega,A7100)BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(PEAppliedBiosystems,目錄號4303149)DNAWalkingSpeedUpKit(SeeGene,目錄號#K1502)ABIPrism377DNA測序儀(PE)pfuDNA聚合酶系統(tǒng)(!Iomega，目錄號M7741)SnaBI(PromegaR6791)NotI(PromegaR6431)BglII(PromegaR6071)實施例1酯酶測定法瓊脂糖平板測定法含有磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液pH8.5中的瓊脂糖，0.1%BETEB的瓊脂糖平板；將20μ1樣品施于含BETEB底物的瓊脂糖平板中的d=4mm的孔，在45°C溫育12-16小時，通過清晰的暈圖(halo)鑒定酶活性。BETEBfopendorf管測定法將0.08%BETEB底物的溶液在攪拌下懸于Tri-HCl緩沖液pH8.5中(對于實施例4中的pH分布部分，使用pH3至pH11的緩沖液系統(tǒng)代替)。將溶液在攪拌下分配于Eppendorf管中(每孔100μ1)，添加30μ1酶樣品，并在EppendorfThermomixer中在50°C以1200rpm溫育平板30分鐘。使用變性的酶樣品(在100°C煮沸20分鐘)作為空白。在溫育之后，通過將管轉(zhuǎn)移至冰上來終止反應(yīng)，然后在4°C以IOOOOrpm離心10分鐘。將60μ1的上清轉(zhuǎn)移至微滴定板，并使用BioRadMicroplateReader測量230nm處的吸光度。等電聚焦等電聚焦是在預(yù)制的AmpholinePAG平板pH3.5-9.5(Pharmacia,Sweden)中根據(jù)生產(chǎn)商的指示進行的。將樣品以一式三份施用，并在電泳之后，將凝膠一分為三。將含有瓊脂糖和緩沖液PH8.5中的0.BETEB的覆蓋物(overlay)傾至每部分凝膠之上。在45°C溫育12-16小時。通過清晰區(qū)鑒定酶活性和酶蛋白的pi。在pNPB底物中確定酯酶活性使用丁酸對硝基苯酯作為底物確定酯酶活性。將酶制備物稀釋以提供丁酸對硝基苯酯少于15%的轉(zhuǎn)化，即在1.5ml微離心管中用50mM乙酸鈉pH5.0進行起始稀釋，接著用50mM乙酸鈉pH5.0進行2倍系列稀釋。然后將稀釋酶的100μ1等分試樣轉(zhuǎn)移至96孔板的孔。丁酸對硝基苯酯儲液是通過將丁酸對硝基苯酯溶解于二甲亞砜(DMSO)以構(gòu)成0.IM溶液而制成的。在測定之前，將儲液樣品在50mM乙酸鈉pH5.0中稀釋100倍以制成ImM溶液。將100μ1體積的ImM丁酸對硝基苯酯與每個酶稀釋物混合，然后在25°C溫育10分鐘。將底物本身、酶本身和緩沖液本身作為對照運行。將0.25,0.2,0.1,0.05和0.02mM的對硝基苯酚標準溶液通過將IOmM儲液稀釋于50mM乙酸鈉pH5.0來制備。在10分鐘時，將50μ1的1.OMTris-HClpH8.0緩沖液添加至每個孔(包括樣品、底物對照、酶對照、試劑對照和標準)，混合，并在微滴定板讀數(shù)器(BioRad)上立即測量405nm處的吸光度。一個單位的酯酶活性定義為在PH5，25°C每分鐘能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚鹽陰離子的酶量。實施例2漆斑菌屬菌種菌株的培養(yǎng)對于接種，將真菌菌種漆斑菌屬菌種菌株在YS瓊脂糖平板(10g/L蛋白胨，IOg/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，5g/LK2HPO4,lg/LMgSO4.7H20，20g/L瓊脂，pH6.5)上在25°C生長7日并儲藏于4°C，然后用于接種搖瓶。對于粗酶產(chǎn)生，將菌株接種于含50mlYS培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，5g/LK2HPO4,lg/LMgSO4.7H20，橄欖油，PH6.5)的500ml搖瓶，并在25°C和160rpm下溫育7日。通過離心收獲發(fā)酵液(在4°C以4000rpm進行20分鐘)。實施例3來自漆斑菌屬菌種菌株的酯酶的純化將來自實施例2的1200ml上清用硫酸銨(80%飽和)沉淀，并重新溶解于40ml25mMTris-HCl,pH7.4緩沖液。將所得的溶液對25mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)透析以去除鹽。最終體積為50ml。將濃縮的酶溶液加載于用25mMTris-HCl緩沖液，pH8.0平衡的MonoQ陰離子交換柱，然后用O-IMNaCl的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。就^Onm處的吸收檢查來自柱的流出物，并通過BETEB平板測定法在pH8.5測定級分的酶活性。將具活性的級分匯集并濃縮，然后將上述經(jīng)濃縮的級分上樣于之前用25mMTris-HCl緩沖液，pH8.0平衡的Superdex75凝膠過濾柱，并用相同緩沖液洗脫蛋白。在酶測定之后，匯集具活性的級分，將其再次濃縮并對20mM乙酸鈉緩沖液，pH5.0進行透析。將經(jīng)透析的樣品施于第三個柱，用20mM乙酸鈉緩沖液，pH5.0平衡的MonoQ0用0_1MNaCl的線性梯度洗脫蛋白。最終，匯集具活性的級分并將其用于表征。在上述純化步驟之后，收集樣品，并對其就兩種活性(瓊脂糖平板測定法和用BETEB的覆蓋物技術(shù))還有純度(SDSPAGE和IEF凝膠)進行檢查，然后用于表征。在SDSPAGE上，發(fā)現(xiàn)了4個大約在分子量60kDa左右的蛋白條帶，并假定其為對應(yīng)的酶蛋白。對這些酶條帶進行電印跡，并確定其N端序列。發(fā)現(xiàn)這4個蛋白條帶具有相同的N端序列SCSPEVFSSVGIPKGEVL。在運行IEF凝膠之后的BETEB底物的覆蓋物顯示有單個具有約pH3.5的pi的活性級分。根據(jù)相同的N端序列和相同的pi推出結(jié)論其為相同的蛋白。實施例4漆斑菌屬菌種菌株的酯酶的表征溫度分布溫度和酶活性之間的關(guān)系是使用P-NPB和BETEB兩種測定來評價的。酶在20至70°C的廣泛溫度范圍內(nèi)具活性，并表現(xiàn)為在50_60°C左右具有其最優(yōu)溫度。pH分布pH和酶活性之間的關(guān)系是使用實施例1的p-NPB和BETEB兩種測定用pH3至pHll的緩沖系統(tǒng)來進行評價的。酶表現(xiàn)為在pH4至10的廣泛pH范圍內(nèi)具活性。最優(yōu)pH是約8_9。溫度穩(wěn)定件對于溫度穩(wěn)定性測量，將酶在60度溫育不同時間(0、1、3、4、6、7、14和24小時)，然后使用PNPB作為底物在pH8.5測定酶活性。酶表現(xiàn)為穩(wěn)定的。甚至在60度溫育7小時之后仍具有大約30%的殘留活性。DNP底物特異件所述酶的底物特異性是使用不同底物包括幾種pNP底物(丁酸對硝基苯酯(SigmaN9876)，乙酸對硝基苯酯(SigmaN8130)，棕櫚酸對硝基苯酯(SigmaN275》，對硝基苯基N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷(SigmaN9376)，鞣質(zhì)，BETEB)來進行評價的。結(jié)果示于下述表1。表1本發(fā)明的酶的底物特異性的比較權(quán)利要求1.一種具有酯酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少45%同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或幾個氨基酸的變體。2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其具有與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少50%，或55%，或60%，或65%，或70%，或75%，或80%，或85%，或90%，或95%，或98%同一性的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1的分離的多肽，包含SEQIDNO2的氨基酸序列，或由SEQIDNO2的氨基酸序列組成。4.權(quán)利要求1的分離的多肽，包含SEQIDNO2的成熟多肽，或由SEQIDNO2的成熟多肽組成。5.一種分離的多核苷酸，包含編碼權(quán)利要求1的多肽的核酸序列。6.權(quán)利要求5的分離的多核苷酸，包含編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的核酸序列。7.權(quán)利要求5的分離的多核苷酸，包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。8.—種核酸構(gòu)建體，其包含與一種或多種調(diào)控序列可操作地連接的權(quán)利要求5-7任一項的多核苷酸，所述調(diào)控序列在合適的表達宿主中指導(dǎo)所述多肽的產(chǎn)生。9.一種重組表達載體，其包含權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體。10.一種重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求9的載體。11.一種轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，能夠表達權(quán)利要求1至4中任一項的多肽。12.—種轉(zhuǎn)基因非人動物，或其產(chǎn)物或元件，能夠表達權(quán)利要求1至4中任一項的多肽。13.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1至4中任一項的多肽的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求10的重組宿主細胞以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；(b)回收所述多肽。14.權(quán)利要求1至4中任一項的多肽在動物飼料中的用途。15.權(quán)利要求1至4中任一項的多肽在制備用于動物飼料的組合物中的用途。16.一種用于改善動物飼料營養(yǎng)價值的方法，其中將至少一種權(quán)利要求1至4中任一項的多肽添加至所述動物飼料。17.一種組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1至4中任一項的多肽，和(a)至少一種脂溶性維生素，和/或(b)至少一種水溶性維生素，和/或(c)至少一種痕量礦物質(zhì)。18.權(quán)利要求17的組合物，其進一步包含淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。19.權(quán)利要求17或18的組合物，其為動物飼料添加劑。20.一種動物飼料組合物，其包含權(quán)利要求1至4中任一項的多肽或權(quán)利要求17至19中任一項的組合物。21.一種用于改善動物飼料營養(yǎng)價值的方法，其中將權(quán)利要求1至4中任一項的多肽或權(quán)利要求17至19中任一項的組合物添加至所述飼料。全文摘要本發(fā)明涉及具有酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N9/16GK102361973SQ201080012864公開日2012年2月22日申請日期2010年1月15日優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日發(fā)明者D.彼得森,劉曄,吳文平,湯嵐申請人:諾維信公司