專利名稱：采用非編碼rna表達分析的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及采用非編碼RNA表達分析的方法。本發(fā)明的實施方案著手解決的問題包括但不限于確定在通過兩種或更多種干預影響生物系統(tǒng)的機制方面的相似性，鑒定測試劑的候選治療應用以及鑒定治療劑的新應用，它們以前已經(jīng)是關于一種或多種適應癥的臨床試驗的主題。
背景技術：
關于微小RNA(miRNA)表達分析的應用，現(xiàn)在將討論本發(fā)明涉及的問題，然而，本發(fā)明可以采用涉及其它非編碼RNA分子的表達分析。miRNA是具有大約21至23個核苷酸長度的單鏈RNA分子。miRNA是由Victor Ambros在1993年首先描述的并且從那時起已經(jīng)發(fā)表了 2000篇以上關于miRNA主題的論文。據(jù)預測在人類中存在有大約1000種miRNA，其中迄今為止已經(jīng)描述并且實驗確認了大約600種，雖然據(jù)估計這個數(shù)字在幾萬。然而，一篇最近的尋求產(chǎn)生一個不同的人類和嚙齒動物組織和細胞系中的miRNA的表達譜的報道，報道了大約300種miRNA，占所有已檢測的 miRNA 的 97%。miRNA并不被翻譯成蛋白質(zhì)而是代替地調(diào)控一種或多種其它基因的表達。已知的生物學目前顯示微小RNA靶向特定個體的信使RNA(mRNA)或mRNA群，由此阻止它們的翻譯或較少地加速mRNA的降解。成熟的單鏈miRNA分子與RNA誘導的沉默復合體(RISC)蛋白絡合并且結(jié)合到一個來自其靶基因的蛋白質(zhì)編碼mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’ -UTR)之內(nèi)的部分互補序列上。另外的蛋白質(zhì)被募集以形成一種沉默復合體并且通過阻止mRNA翻譯的機制而抑制靶基因產(chǎn)物的表達。雖然許多關于miRNA的生物學以及沉默復合體的組成和機制有待發(fā)現(xiàn)，很明顯 miRNA涉及許多基因的調(diào)控。miRNA被認為在翻譯水平上調(diào)控多達所有基因的30% (Xie et al，2005)。一種miRNA可以調(diào)控多種基因并且每種基因可以通過多種miRNA進行調(diào)控。 miRNA的組織特異性表達被認為引導細胞定型(commitment)以分化和/或積極維持組織的個性特征。這種不同miRNA之間的廣泛影響與互相作用表明，單個的miRNA或miRNA的一個小子集的解除管制的表達(deregulated expression)可能導致復雜疾病性狀(Lim et al, 2005,Nature) 0超過50%的已知人類miRNA駐留在在癌細胞中的易于改變的基因組區(qū)域(Calin et al，2004 PNAS, 101, 299-3004) 并不出人意料的是，miRNA的表達譜在癌癥和其它疾病狀態(tài)中在變化。通過允許癌癥干細胞中的特異性miRNA表達譜的定義，這個信息已經(jīng)開始被用于對癌癥進行分類和分期、揭示用于預后和反應的生物標記以及提供一種指導治療干預的關鍵決定因素、解釋化學敏感性、以及告知化學抗性的機制。對于可能的新的治療劑的研究和開發(fā)，miRNA的應用已經(jīng)典型地產(chǎn)生自對于繁瑣且耗時的機制的分析，這些機制是通過其調(diào)控miRNA的表達和加工的機制以及通過特異性 miRNA調(diào)控mRNA翻譯的機制。已經(jīng)鑒定了一些特異性藥物靶標并且與這些藥物靶標有關的研究正在進行中。然而，雖然是徹底的，這個研究范式是耗時的并且昂貴的。因此，本發(fā)明的目的是提供用于發(fā)現(xiàn)干預措施的實際應用(如一種治療劑的給藥)的可替代的方法，該方法不需要詳細理解該干預措施的作用機制或特異性藥物靶標的鑒定。本發(fā)明的一些實施方案著手解決的問題是，確定對于已知治療實體的新的適應癥或預測測試劑的藥理學性質(zhì)，如它們的毒理學特性(toxicological profile)的一些方面。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括以下步驟(1)進行多種表達分析，每種表達分析包括以下步驟在一種生物系統(tǒng)上進行一種干預，測量由該干預產(chǎn)生的在該生物系統(tǒng)中的非編碼RNA的一個表達譜，并且存儲源于該測量的表達譜的一個表達數(shù)據(jù)集，所述這些表達分析涉及多種不同的干預和多種不同的生物系統(tǒng)的兩者之一或兩者；(2)分析生成的表達數(shù)據(jù)集以確定在兩種或更多種表達分析組中對對應的干預的非編碼RNA表達譜的作用之間的相關，這些表達分析涉及不同的干預或不同的生物系統(tǒng)的兩者之一或兩者。通過分析表達數(shù)據(jù)集以確定在兩種或更多種表達分析的組中一種干預對非編碼 RNA表達譜的作用之間的相似性，這些相似性根據(jù)被進行的干預以及在其上進行該干預的生物系統(tǒng)的兩者之一或兩者而不同，在沒有必要確定機制(一種或多種干預通過該機制影響在一種或多種生物系統(tǒng)中的非編碼RNA的表達譜)的情況下可以確定這些相關。因此，其中發(fā)現(xiàn)一種第二干預對非編碼RNA的表達譜具有作用，該作用與一種具有已知的治療關聯(lián)性的第一干預的作用是相關的，該第二干預可以被視為用于相同或相似的治療應用的候選物。至少有一定的可能性，即該第一和第二干預將具有相同的、相似的或相關的作用機制。本方法與用于發(fā)現(xiàn)治療干預的已知策略形成了直接對比，在本方法中鑒定并且分析了一種特異性靶標(例如一種蛋白質(zhì)、核酸或液體分子)，深入研究了該靶標的生物學，并且通過合理的和/或組合的方法開發(fā)了適用于調(diào)節(jié)該靶標的一種或多種活性的治療干預。一種或多種(以及任選地所有)所述干預可以包括同時地或順序地將一種或多種測試劑應用到一種生物系統(tǒng)中。該一種或多種測試劑可以是一種化學實體，例如，具有分子量小于2000道爾頓、小于1000道爾頓或小于500道爾頓的一種分子。該化學實體可以是非聚合的。該一種或多種測試實體可以是一種生物實體，例如一種生物大分子，如脂類、寡核苷酸或蛋白質(zhì)(例如酶、抗體、或抗體片段、人源化抗體或抗體片段、或展示蛋白質(zhì)片段的噬菌體或核糖體、或朊病毒)。該生物實體可以是一種病毒或細菌。因此，一些或每種表達分析可以量度一種測試劑對一種生物系統(tǒng)中的非編碼RNA的表達譜的作用。一種或多種所述測試劑可以是一種治療劑。一種或多種所述測試劑可以是一種治療劑，該治療劑具有針對一種已知病癥的治療或預防的已知應用。一種或多種所述測試劑可以是一種治療劑，該治療劑已經(jīng)是與一種或多種適應癥有關的臨床試驗(不管是否成功)的主題。然而，一種或多種(以及任選地所有)所述干預可以包括將一個或多個組應用到一種生物系統(tǒng)中，這個或這些組包括電離輻射、連續(xù)發(fā)射或脈沖電磁輻射(例如可見光、紫外光、紅外光)、聲能(通過空氣或通過一種液體介質(zhì)遞送的)、機械干預(例如施加壓力)、電、溫度的變化、滲透性以及一種生長介質(zhì)的滲透強度(tonicity)或pH值的變化、 磁場、流體動力學的變化、以及機械化學的信號轉(zhuǎn)導。因此，至少一些干預可以是已知對該生物系統(tǒng)是有害的干預。由這些有害的干預產(chǎn)生的表達譜可能對鑒定逆轉(zhuǎn)或防止這些有害作用的藥劑是有用的。一種或多種所述生物系統(tǒng)可以包括細胞，如哺乳動物細胞，例如人類細胞、兔細胞、或嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)細胞、或培養(yǎng)的昆蟲細胞、兩棲動物細胞或魚細胞系。一種或多種所述生物系統(tǒng)可以包括多種細胞類型的混合物。該干預典型地在培養(yǎng)的哺乳動物細胞上進行。這些哺乳動物細胞可以是干細胞或祖細胞。對于干細胞我們提及能夠自我更新并且分化成至少一種另外的專門的細胞類型的細胞。然而，一種或多種所述生物系統(tǒng)可以是一個完整的生物體、離體組織、一個合成系統(tǒng)或轉(zhuǎn)化的細胞。一種或多種所述生物系統(tǒng)可以是轉(zhuǎn)基因的。培養(yǎng)的細胞可以具有同步的或異步的細胞周期。一種或多種所述干預可以是這樣一種干預該干預改變干細胞或祖細胞的分化狀態(tài)或去分化狀態(tài)，或者引起干細胞或祖細胞專門化或復制，同時維持一個細胞譜系或分化狀態(tài)的特性。這些表達分析可以重復并且可以根據(jù)一些或所有的重復試驗編輯被分析的這些實驗數(shù)據(jù)集，這些實驗在等效的生物系統(tǒng)上使用等效的干預。在非編碼RNA的一個子集的表達之間典型地具有相關性，與之相關的表達數(shù)據(jù)存儲在該表達數(shù)據(jù)集中。在兩種或更多種表達分析之間的一個或一個小數(shù)目(例如兩個、三個、五個或少于五個、或十個或少于十個)的非編碼RNA的表達的變化中，在非編碼RNA表達譜的作用之間的相關典型地可以是正相關或負相關。正相關可以包括在兩種表達分析的每一種中一種或多種非編碼RNA的表達的增加。正相關可以包括在兩種表達分析中的每一種中的一種或多種非編碼RNA的表達的減少。負相關可以包括在一個第一表達分析中的一種或多種非編碼RNA的表達的增加以及在一個第二表達分析中相同的一種或多種非編碼 RNA的表達的減少。為了確定對一個對應的干預的非編碼RNA表達譜的作用之間的相關，該方法可以進一步包括在一個適合的對照分析中測量非編碼RNA的表達譜，該對照分析例如是在其中不進行對應的干預的一個對照分析或包括在進行對應的干預之前測量一種生物系統(tǒng)中的非編碼RNA表達譜的對照分析?？梢源_定表達分析以及相應的對照分析中的非編碼RNA表達譜之間的差異?？梢詮囊粋€測量的表達譜以及一個相應的對照分析的表達譜得到該存儲的表達數(shù)據(jù)集。分析生成的表達數(shù)據(jù)的步驟可以包括考慮來自對照分析的表達譜。然而， 在一些應用中進行對照分析將是沒有必要的。例如，如果在等效的生物系統(tǒng)上進行了多種干預，只分析單獨地由每種表達分析產(chǎn)生的表達譜得到的數(shù)據(jù)集可能是有必要的，以確定對對應的干預的非編碼RNA的表達譜的作用之間的相關。有可能的是至少一些所述相關是正相關，例如在兩種或更多種表達分析的組中對對應的干預的非編碼RNA的表達的作用之間的相似性。分析生成的表達數(shù)據(jù)集以確定相關的步驟可以包括基于由表達分析產(chǎn)生的表達數(shù)據(jù)集之間的相似性對表達分析進行分類 (例如聚類或分組)的步驟。有利的是，這可以允許在機制方面的相似性，兩種或更多種不同的干預通過該機制對有待鑒定的非編碼RNA(典型地在相同的或等效的生物系統(tǒng)上)的表達譜直接或間接具有作用，而不要求有待了解的共享機制的性質(zhì)。因此，該方法可以是確定兩種或更多種干預對一種或多種非編碼RNA的表達具有相似作用的一種方法。一種第一干預可以是一個第一治療實體的應用，具有至少一個已知的第一治療應用，并且該方法可以是確定對一種第二干預的非編碼RNA表達的作用之間存在正相關的一種方法，包括一個第二治療實體的應用。因此，該方法可以是確定用于一個已知治療實體(第二治療實體)的一種可能的新治療應用(第一治療應用)的一種方法。該方法可以進一步包括測試一種第二干預是否可應用于一種所述已知的第一治療應用的治療的試驗。該第一干預可以是一個實體(沒有一種已知的第一治療應用)的應用，但是已知具有適合于部署為一種療法的藥理學以及毒理學特性。因此，該方法可以是確定用于一種治療實體的可能的新治療應用的一種方法，該治療實體已經(jīng)通過了毒理學試驗但是未能在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)是有效的或者比一個對照治療實體是更有效的。有可能的是至少一些所述的相關是負相關，例如可以確定的是在兩種或更多種干預對一種或多種非編碼RNA的表達具有相反的作用。有利的是，對一種第一干預和一種第二干預的非編碼RNA表達譜的作用之間的負相關可能表明在治療中該第二干預可能對逆轉(zhuǎn)一種或多種該第二干預的作用是有用的。因此，該第一干預可以是已知的對該生物系統(tǒng)具有有害作用的一種干預，例如該第一干預可以是一種毒素的應用。在這種情況下，該方法可以包括鑒定該第二干預，作為用于已知將由該第一干預引起的病癥的治療或預防的一種候選物。因此，多種干預可以包括給予對生物系統(tǒng)有害的一種毒素或一種處理。因此，該方法可以是確定候選干預(例如候選治療實體)的一種方法的一部分，這些候選干預可以治療或預防已知可由一種或多種其他的干預引起的病癥。該方法可以是確定候選物以治療或預防已知治療干預的副作用(例如一種治療實體或一種放射療法的應用)的一種方法的一部分。該方法可以是預測一種測試劑的毒性的一個或多個方面的一種方法，例如通過檢測由一種第一干預產(chǎn)生的非編碼RNA的表達譜與已知對該生物系統(tǒng)具有有害作用的一種干預的表達譜是正相關的，或者與包括給予一種其毒理學的一個或多個方面是已知的藥劑的一種干預的表達譜是正相關的。通過確定對對應地在第一測試劑和第二測試劑(或是一種已知的該靶標分子的拮抗劑或拮抗劑的測試劑)的非編碼RNA表達譜的作用之間的相關，該方法可以是確定一種第一測試劑是一種第二測試劑或一種特異性目標大分子的候選激動劑或拮抗劑的一種方法。該方法可以包括將對非編碼RNA的表達具有相似作用的干預進行分組的步驟。這些生成的表達譜是對于進一步的研究是有用的出發(fā)點，以鑒定進一步的治療實體。該方法可以是確定在與一組干預(例如，一組治療實體)相關的非編碼RNA表達譜的變化方面的一種方法。因此，該方法可以是確定一個化學或生物實體具有對一種生物系統(tǒng)的作用機制的一種方法，該作用機制與生物系統(tǒng)上的另一個化學或生物實體的作用機制是有關的?？梢园磳哟螌@些組進行排序。其中一種干預是將一種第二測試劑應用到該生物系統(tǒng)上，并且發(fā)現(xiàn)就非編碼RNA 表達譜而言應用該第二測試劑的作用與在該生物系統(tǒng)上應用另一種第一測試劑的作用是相關的(正相關或負相關)，該第一測試劑已知對于一個第一病癥的治療或預防是有用的， 可以測試該第二測試劑或通過修飾該第二測試劑獲得的測試劑在該第一病癥(或與該第一病癥相關的病癥)的治療或預防中的效能?？梢愿鶕?jù)有關病癥的治療或預防對被發(fā)現(xiàn)對該第一病癥(或與該第一病癥相關的病癥)的治療或預防是有效的測試劑進行部署。
在一些實施方案中，進行了在其中同一干預或一組干預在多種不同的生物系統(tǒng)上進行的表達分析。因此，該方法可以使得能夠發(fā)現(xiàn)僅僅在一些多種不同的生物系統(tǒng)中出現(xiàn)的干預作用之間的相關。在某些實施方案中，該多種不同的生物系統(tǒng)是處于不同的分化或去分化狀態(tài)(例如不同的發(fā)育階段)的干細胞。因此該方法可以使得能夠發(fā)現(xiàn)對處于特異性分化或去分化狀態(tài)的干細胞的干預的作用之間的相關。這個信息對研究發(fā)育機制以及干細胞或祖細胞的分化和去分化的機制是有用的。該多種不同的生物系統(tǒng)可以包括處于不同疾病狀態(tài)的哺乳動物細胞。一種干預可以是引起干細胞或祖細胞分化和去分化、或驅(qū)動達到一個特異分化狀態(tài)或維持處于一個特定的分化狀態(tài)的干細胞或祖細胞的穩(wěn)定性的一種干預。該表達譜是與至少一種以及典型地多種非編碼RNA (優(yōu)選地是至少10種，或者更優(yōu)選地是至少100種非編碼RNA)的表達有關的。該表達譜可以是與一種或多種作為標記物起作用的轉(zhuǎn)基因非編碼RNA的表達有關的。一個表達譜可以包括一種或多種非編碼RNA 的表達水平的定量或定性測量。通過測量一種報道構(gòu)建體的激活量或激活水平，可以間接確定一種或多種所述非編碼RNA的表達水平，該構(gòu)建體例如是，參入到該生物系統(tǒng)的基因組中或一種特殊的生物系統(tǒng)中以游離基因方式保持(maintenance episomally)的一種轉(zhuǎn)基因報道構(gòu)建體。該表達譜典型地是與在該生物系統(tǒng)中的在至少一些情況下(例如一種或多種非編碼RNA的穩(wěn)定狀態(tài)或高峰量)所表達的一種或多種非編碼RNA的量有關的。然而， 該表達譜可以，例如與一種或多種非編碼RNA的表達的變化率有關。在一些實施方案中，這些表達譜是使用微陣列芯片而獲得的。這些非編碼RNA典型地包括微小RNA(miRNA)并且可以包括miRNA前體和成熟 miRNA的兩者之一或兩者。這些非編碼RNA可以包括一種或多種小干擾RNA(siRNA)、piwi 蛋白相互作用RNA(piRNA)、核RNA(snRNA)、以及短發(fā)夾RNA(shRNA)。這些非編碼RNA可以是轉(zhuǎn)基因的。這些RNA的一些或全部可以，例如是轉(zhuǎn)基因RNA，這些RNA作為非編碼RNA表達的報道基因而起作用。這些非編碼RNA可以是游離基因的，并且該方法可以包括將游離基因的DNA引入該生物系統(tǒng)中的步驟(例如通過用一種病毒感染一種生物系統(tǒng))，其中可以轉(zhuǎn)錄該游離基因的DNA以產(chǎn)生構(gòu)成繪制圖譜的(profiled)非編碼RNA的全部或一部分的非編碼RNA?？梢詫σ唤M非編碼RNA中的每種非編碼RNA測量表達譜，并且該方法可以包括鑒定單獨的非編碼RNA或該非編碼RNA組的一個亞組，這些非編碼RNA具有在其上多種干預具有相關作用的表達圖譜?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法鑒定具有相關作用的多種干預，因此使得在一個非編碼 RNA組和單獨的非編碼RNA或在該組之內(nèi)的非編碼RNA亞組的表達譜上具有相關作用的干預兩者成為可能，該組具有受多種有待鑒定的干預影響的表達水平。具有相關作用的多種干預可以是以前已知具有相關作用機制的干預，例如多種干預可以包括已知或被認為具有相同的或相似的作用機制的藥劑(例如一類藥物)的給予。 因此，本發(fā)明提供了鑒定具有受多種干預影響的表達水平的單獨的非編碼RNA或一個非編碼RNA亞組的一種方法。然后可以選擇該生成的鑒定的單獨的非編碼RNA或鑒定的非編碼RNA亞組，用于在進一步的表達分析中使用，在這些分析中測量了一個減少的非編碼RNA組的表達譜，該減少的非編碼RNA組包括僅僅一些非編碼RNA組、包括或任選地其組成為至少該鑒定的單獨的非編碼RNA或鑒定的非編碼RNA亞組。由此，可以確定進一步的干預對該減少的非編碼 RNA組的表達譜的作用、以及進一步的干預對該減少的非編碼RNA組的表達譜的作用與所述多種干預對該減少的非編碼RNA組的表達譜的作用之間的相關。因此，隨后的分析以及試驗可以采用較少的非編碼RNA，這樣減少了成本并且增加了生產(chǎn)量。例如，具有在其上一類治療劑具有相關作用的表達水平的一個減少的非編碼RNA組可以被用于篩選候選藥劑、 或者用于發(fā)現(xiàn)新穎的在治療上有用的藥劑、抑或用于針對已知的治療劑鑒定新的適應癥?？梢源_定一個非編碼RNA組或一個非編碼RNA亞組的表達水平與生物干預的作用之間的區(qū)分的關聯(lián)性。該方法可以包括對該組或該亞組之內(nèi)的非編碼RNA進行分級的步驟 (依賴于它們與生物干預的作用之間的區(qū)分的關聯(lián)性)。該方法可以包括對一種生物干預 (或?qū)Ψ蔷幋aRNA的表達具有相關作用的一組生物干預)的非編碼RNA組或亞組中的非編碼RNA的表達的作用進行分級的步驟。由此產(chǎn)生的等級可以用來鑒定生物干預的作用之間的相關可以通過統(tǒng)計數(shù)學方法(例如主成分分析)來鑒定相關。可以將一組編碼的一個指定給一種生物干預對多種特異性非編碼RNA的每一種的表達的作用，這些編碼指示該生物干預對對應的非編碼RNA的表達的作用的特性。可以分析這些生成的編碼來鑒定相關。本發(fā)明還擴展到具有非編碼RNA的分析裝置(例如一種試劑盒或一種具有固定在其中的非編碼RNA的固相載體)，這些非編碼RNA由通過本發(fā)明的方法所獲得的所述減少的非編碼RNA組組成。


參照以下圖形，現(xiàn)在將展示本發(fā)明一個示例實施方案，其中圖1是一個根據(jù)本發(fā)明的一種方法的流程圖；圖2是來自針對一種生物干預(a)以及針對一個變量(b)的主成分分析的結(jié)果的繪圖；圖3是給出了 11個miRNA就它們的ρ值以及q值而言的統(tǒng)計等級的一個表格；以及圖4是來自顯示(a)標記的辨別性miRNA亞組的主成分分析的數(shù)據(jù)、以及(b)來自顯示來自不同干預類型的表達數(shù)據(jù)如何聚類的四個干預類型的數(shù)據(jù)的繪圖。一個示例實施方案的詳細說明在本發(fā)明的一個實例應用中，準備了一個miRNA表達數(shù)據(jù)集(是源于一個測量的非編碼RNA表達譜的一個表達數(shù)據(jù)集的一個實例)的數(shù)據(jù)庫。參見圖1，通過已知的方法培養(yǎng)了適合的人類細胞2并且對這些培養(yǎng)的細胞給予一種測試劑4。然后使用處理過的細胞的樣品在做出干預之后的一個或多個時期測量了一個miRNA表達譜6，以確定在處理過的細胞中許多miRNA的每一種的表達水平。下面展示了用于測量這些miRNA表達譜的兩種可替代的方法，微陣列芯片分析和定性實時PCR分析。(l)miRNA微陣列芯片和數(shù)據(jù)分析使用一種來自丹麥Exiqon A/S of Vedbaek的基于柱的試劑盒分離了藥物處理(η=3)與對照處理細胞(n = 3)的總RNA。通過miRNA微陣列芯片分析了兩微克的來自每個樣品的總RNA。包括標記、雜交、掃描、歸一化以及數(shù)據(jù)分析的miRNA微陣列芯片分析從許多來源(例如從Exiqon A/S)是可商購的。簡言之，使用Bioanalyser 2100微流體平臺進行了 RNA質(zhì)量控制(Bioanalyser是Agilent科技公司的一個商標)。遵照所提供的說明，使用來自Agilent的完整標記Hyb試劑盒(Complete Labelling Hyb Kit)來標記樣品。(2)定量實時PCR正如以上選項(1)，使用來自Exiqon的一種基于柱的試劑盒并且遵照制造商的說明提取了所有細胞RNA。如由制造商(美國加利福尼亞州福斯特市的Applied Biosystems) 所描述，通過iTaqMan實時PCR進行了 miRNA的定量。(TaqMan是羅氏分子系統(tǒng)公司的一個商標)。簡言之，使用了 10微克的RNA作為用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)的模板，該逆轉(zhuǎn)錄使用TaqMan 微小RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及miRNA特異性莖環(huán)引物(Applied Biosystems)。將RT產(chǎn)物的一個等分部分(1. 5微升)引入到20微升的PCR反應混合物中，在96孔板內(nèi)在ABI 7900HT 熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)上在95°C下孵育10分鐘，然后在95°C下進行40個循環(huán)， 每個循環(huán)進行15秒，并且在60°C下進行1分鐘。基于U48 RNA(—種小的、非編碼RNA)表達(或GAPDH，如果發(fā)現(xiàn)U48隨藥物處理而變化)的值在不同樣品之間將靶基因表達歸一化。在每種情況下，將該生成的miRNA表達水平存儲為表達數(shù)據(jù)集8。優(yōu)選地進行了大量的表達分析。典型地，以這種方式將許多(例如數(shù)百或數(shù)千)測試劑引入到細胞培養(yǎng)物中并且進行了分析，以創(chuàng)建一個miRNA表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。一旦可以獲得miRNA表達數(shù)據(jù)集的一個適當大的數(shù)據(jù)庫，就分析這些表達數(shù)據(jù)集 10來確定每一測試劑對miRNA表達的作用之間的相關并且產(chǎn)生測試劑的分層聚類，這些測試劑對miRNA表達譜具有相似的作用。用于確定核酸表達數(shù)據(jù)集之間的相關的方法對本領域的普通技術人員來說是熟知的。例如，一種方法是將從Exiqon A/S獲得的GI5R格式的微陣列芯片數(shù)據(jù)輸入到一個電子表格中。(GI^R是Gen印ix6軟件使用的數(shù)據(jù)格式，可以從美國加利福尼亞州尤寧城的Molecular Devices公司獲得。Gen印ix是Molecular Devices公司的一個商標)。對照miRNA芯片(由Gem5Pixe軟件指示為陰性標志)上提供的質(zhì)量控制以及校準點對每一 miRNA的斑點強度進行了分析。信號強度50以下的值被提出為0。對用于每一 miRNA捕獲探針種類的四個重復點的每個，計算了背景校正斑點強度的中位值并且將其輸入到TMeV 微陣列芯片分析軟件中，該軟件進行分層聚類和/或本領域的普通技術人員熟悉的其它統(tǒng)計分析。(TMeV由Dana-Farber癌癥研究所在www. tm4. org提供)?？商娲?，可以將GPR格式的表達數(shù)據(jù)輸入到Genespring GX軟件(從Agilent Technologies 公司可獲得)中。(Genespring GX 是 Agilent Technologies 公司的一個商標)，可以將GI^R格式的表達數(shù)據(jù)歸一化到第75個百分位數(shù)進而使用分層聚類以及內(nèi)置于 Genespring GX中的其它統(tǒng)計工具進行處理。其中在兩種或更多種測試劑對一種或多種miRNA的表達的作用之間發(fā)現(xiàn)了正相關，這可能指示這些測試劑共享相同的、或有關聯(lián)的作用機制。因此，發(fā)現(xiàn)了對miRNA表達譜具有相似作用的這些測試劑(已知作為用于一種病癥的治療的藥劑)可以被鑒定12，作為用于治療相同的、或有關聯(lián)的病癥的候選物。這可能對促進已經(jīng)被鑒定為對一種治療應用是潛在有用的藥物的重新定位是有用的?？梢詫@些候選測試劑進行測試以確定它們對于相同的或有關聯(lián)的病癥的治療是否可能是有用的、或者是否可以被用作進一步研究的出發(fā)點。例如，可能使用理性的或組合的設計方法學對它們進行修改，可能制備并且測試一種模擬化合物等等?？梢詫蜻x測試劑進行測試14以確定它們是否適合于用作治療實體，并且如果是適合的，則將它們部署為治療實體16。對一種或多種miRNA的表達具有相似作用的一些測試劑進行分組是特別有用的， 因為根據(jù)對miRNA表達的作用的這種分類可以被反映在相似或相關的作用機制中，不論在 miRNA的表達水平上是直接的或間接的。在其中鑒定出負相關的一種測試劑可以被鑒定為一種候選物，用于防止、減輕或避免一種另外的測試劑或其他干預的一種或多種不希望的影響。因此，相對于具有不希望的作用的另一種測試劑，已知對一種或多種miRNA的表達具有相反作用的一種測試劑可以被考慮為用于治療或預防這種不希望的作用的一種候選實體。有利的是，進行了 miRNA表達分析以評定一系列干預(包括除了給予化學或生物實體之外的干預)的作用。例如，可以用對細胞有害的紫外光、電離輻射、聲波以及其他干預處理細胞。當能夠鑒定出一種測試劑對一種或多種miRNA的表達具有與這樣的干預的作用是負相關的作用時，該測試劑可能是用于治療或預防由相應的體內(nèi)干預導致的不希望的作用的一種候選物。這可能對于鑒定用于預防由紫外光或來自放射療法的副作用引起的損害的藥劑是有用的。該方法可以應用于許多測試劑(例如，小化學實體、肽、模擬肽或聚核苷酸的組合文庫)的高通量篩選。隨著進行新的表達分析，可以將生成的表達數(shù)據(jù)集與以前存儲的表達數(shù)據(jù)集進行比較，以尋找篩選的測試劑以及以前已經(jīng)分析的藥劑的作用之間的相關。通過使用miRNA表達數(shù)據(jù)集的一個大型數(shù)據(jù)庫，典型地最好地使用了該方法然而，對于一些特殊的應用，可能僅僅必需具有少量的miRNA表達數(shù)據(jù)集或甚至一個miRNA表達數(shù)據(jù)集，可用于與新的分析產(chǎn)生的miRNA表達數(shù)據(jù)集進行比較。這在發(fā)現(xiàn)對miRNA的表達具有作用的藥劑的高通量篩選中可以是有關聯(lián)的，該作用與一個特定的鑒定的作用正相關或負相關，例如是已知或被懷疑為對miRNA表達具有顯著作用的一種藥劑的作用。因而，本發(fā)明是基于在作用機制方面的相似性的原理，因此可以通過它們對 miRNA(以及可能地其它非編碼RNA)表達的作用的比較分析而發(fā)現(xiàn)測試劑(如化學實體以及生物制品)的實際應用，而不必了解這些測試劑影響miRNA表達譜的機制。這與傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)以及藥物重新定位策略形成直接對比，在這些策略中深入研究了一種作用機制來鑒定用于篩選分析的藥物靶標以發(fā)現(xiàn)與該藥物靶標具有所希望的相互作用的藥劑。實驗發(fā)現(xiàn)以及它們的含義采用描述的這些方法，基于miRNA表達數(shù)據(jù)的分組，我們已經(jīng)確定的是，有可能確定干預的治療應用的潛在模式。此外，可以采用該方法來鑒定某些miRNA，這些miRNA具有指示被篩選的干預的某些治療應用的表達水平。這些指示性miRNA將使得將來的干預篩選能夠分析較小組的miRNA表達水平，以鑒定被篩選的這些干預的潛在治療應用，而不是整個miRNA文庫。下面給出了使用選擇的一個miRNA小組來確定對于一種干預的潛在治療用途的一個實例。
在此描述的實驗過程中，作為對照，用一種包括二甲基亞砜(或DMS0)以及磷酸鹽緩沖鹽水的藥物溶劑混合物對一群細胞進行處理。假定該藥物溶劑混合物對miRNA的表達將不會有作用，而如果它確實有作用，則它與被測試的藥物相關的表達譜中的任何一個將不會是一致的。然而，發(fā)現(xiàn)了該藥物溶劑混合物具有與HDAC抑制劑一致的miRNA表達譜。 隨后，從一篇文獻綜述發(fā)現(xiàn)DMSO已經(jīng)顯示為一種HDAC抑制劑，證實了使用本發(fā)明的這些方法可以確定藥物的未知的潛在治療特性。材料與方法使用標準方法培養(yǎng)了 HeLa細胞。將這些細胞分散到DMEM培養(yǎng)基中。對培養(yǎng)基進行抽吸并且用適當量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，溶解在800毫升蒸餾水中的8克NaCUO. 2克KCl、1· 44克Na2HPO4以及0. 24克KH2PO4)洗滌細胞單層。對PBS進行抽吸。將所討論的測試劑施用到這些細胞上并且孵育48小時。RNA 提取在以下的步驟中使用來自Exiqon的基于柱的試劑盒分離和純化了來自這些細胞的 RNA。對這些細胞在其上生長的培養(yǎng)基進行抽吸并且用一個適當量的PBS洗滌該細胞單層。進一步抽吸PBS。將350 μ L的溶解液直接添加到一個培養(yǎng)皿上。通過輕拍該培養(yǎng)皿并且使緩沖液在該培養(yǎng)皿的表面渦旋五分鐘而使這些細胞溶解。然后將該溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一個微型離心管中。將200 μ L的95% -100%的乙醇添加到該溶解產(chǎn)物中并且通過渦旋混合10秒。使用該試劑盒中所提供的這些離心管之一組裝了一個柱子。將600 μ L的溶解產(chǎn)物/乙醇施加到該柱子上并且在14000Xg下離心1分鐘。丟棄流動物(flow-through)并且用它的收集管重新組裝旋轉(zhuǎn)柱。將所提供的400 μ L的洗液施加到該柱子上并且在14000 Xg下離心1分鐘。丟棄流動物并且用它的收集管重新組裝旋轉(zhuǎn)柱。通過添加另一個400 μ L的洗液對該柱子洗滌兩次并且在14000 Xg下離心1分
鐘。丟棄流動物并且用它的收集管重新組裝旋轉(zhuǎn)柱。使該柱子在14000 Xg下旋轉(zhuǎn)兩分鐘以徹底對樹脂進行干燥并且丟棄該采集管。將該柱子組裝在由試劑盒提供的一個1. 7毫升的洗脫管中。將50 μ L的洗脫緩沖劑添加到該柱子中并且在200 Xg下離心兩分鐘，之后在14000Xg下離心一分鐘。該生成的純化RNA樣品可以在-20°C下儲存幾天。為了樣品的長期儲存，將樣品儲存在_70°C。(l)miRNA微陣列芯片和數(shù)據(jù)分析標記使用來自Agilent的一種標記試劑盒對純化的RNA樣品進行標記。在Ix TE (PH 7. 5)中將總RNA樣品稀釋到50ng/ μ L。將2 μ L的稀釋的總RNA添加到一個1.5mL的微型離心管中并且置于冰上。剛好在使用之前，將0.4yL IOX小牛腸磷酸酶緩沖液、1. 1 μ L無核酸酶水以及0. 5 μ L小牛腸磷酸酶輕輕混合以制備一種小牛腸堿性磷酸酶母料混合物。將2微升的該小牛腸堿性磷酸酶母料混合物添加到每一個樣品管中，達到4 μ L的總反應體積，并且通過移液管輕輕混合。將該反應體積在一個循環(huán)水浴中在37°C下孵育30 分鐘。將2. 8μ L的100% DMSO添加到每一個樣品中。將樣品在一個循環(huán)水浴中在100°C 下孵育5-10分鐘并且然后立即轉(zhuǎn)移到一個冰浴中。將10XT4 RNA連接酶緩沖液加熱到37°C并且旋轉(zhuǎn)直到所有沉淀物已經(jīng)溶解。剛好在使用之前，將1 μ L的10 X "Γ4 RNA連接酶緩沖液、3 μ L的菁藍3_pCp以及0. 5 μ L的"Γ4 RNA連接酶輕輕混合以制成一種連接母料混合物并且置于冰上。將4. 5μ L的該連接母料混合物添加到每個樣品管中，達到11. 3μ L的總反應體積。通過移液管輕輕地混合樣品并且旋轉(zhuǎn)減慢。然后在一個循環(huán)水浴中16°C下孵育這些樣品兩小時。然后在45°C _55°C使用一個真空濃縮器干燥這些樣品，并且如果當輕拍該管這些沉淀物沒有移動或擴散時則確定這些樣品是干燥的。^將125 μ L的無核酸酶水添加到含有冷凍干燥的由Agilent Kit提供的10XGE阻斷劑的管形瓶中并且進行混合。該干燥的樣品被再懸浮在18 μ L的無核酸酶水中將4. 5 μ L的該10XGE阻斷劑添加到每一個樣品中。將22. 5μ L的2XHi-RPM雜交緩沖液添加到每一個樣品中并且混合均勻。將這些生成的樣品在100°C孵育5分鐘，并且然后立即轉(zhuǎn)移到一個冰水浴中保持另外的 5分鐘。將一個干凈的滑動墊圈(gasket slide)裝載到Agilent SureHyb室底部并確保該滑動墊圈與該室底部平齊。將該雜交樣品適當?shù)胤峙涞皆搲|圈上以確保沒有氣泡存在。將一個芯片的活性面朝下放置到SureHyb滑動墊圈上并且與SureHyb室的蓋進行組裝以形成一個組裝的室。將該組裝的室放入設置在的一個雜交箱中并且在該溫度以及20rpm下旋轉(zhuǎn)20小時。隨后使用提供的GE洗滌緩沖液在掃描之前沖洗這些芯片。(2)定量實時PCR制備RT反應物母料混合物將這些組分從冰上的凍結(jié)狀態(tài)解凍。通過混合0. 15 μ L的dNIPs (IOOmM)、1 μ L的 MultiScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶(MultiScribe 是 Applera 公司的一個商標)(50U/μ L)、1. 5 μ L 的 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 19 μ L的RNA酶抑制劑(20U/ μ L)、4. 16 μ L的無核酸酶水制備了 RT 反應物母料混合物，并且然后在冰上儲存。值得注意的是上面舉例的這些體積是基于15 μ L 的RT反應物的并且按照有待進行的RT反應的量而成比例地增加。制備RT反應物對于每15 μ L的RT反應物，將7 μ L的RT母料混合物與5 μ L的總RNA合并。將 RT引物在冰上解凍并且將3 μ L的RT引物添加到在一個96孔板的孔中的12 μ L的RT母料混合物/總RNA中。將該板保持在冰上直到被加滿進而將其放入熱循環(huán)儀中。熱循環(huán)儀中的步驟在16 °C下持續(xù)30分鐘
在42°C下持續(xù)30分鐘在85 °C下持續(xù)5分鐘只要方便，可維持在4°CPCR 擴增對于每個孔，將10 μ L的Taqman 2Χ通用PCR母料混合物與7. 67 μ L的無核酸酶水、1 μ L的20 X Taqman微小RNA分析混合物以及1. 33 μ L的來自前面步驟的RT產(chǎn)物進行混合。當所有的孔被加滿時，將該板用一個光學粘性罩密封并且進行離心以除去任何氣泡。然后將該板載入一個能夠?qū)崟r的熱循環(huán)儀/PCR儀中并且然后進行以下程序在95°C下持續(xù) 10 分鐘(AmpliTaq Gold Enzyme 的活化)40 X (95 °C 持續(xù) 15 秒，60 "C 持續(xù) 6O 秒)。數(shù)據(jù)分析對于每個板，對照摻加miRNA斑點將來自這兩種技術的數(shù)據(jù)歸一化，允許比較來自分開的芯片的數(shù)據(jù)。使用主成分分析(一種本領域的普通技術人員十分理解的標準技術)對歸一化的數(shù)據(jù)進行了分析以鑒定miRNA表達譜之間的相關，并且任何觀察到的數(shù)據(jù)的分組被確定是施用于原始細胞上的特定測試劑的作用的結(jié)果(根據(jù)單獨的miRNA的表達)。圖1是一個用于獲得微小RNA的表達譜的一種方法的流程圖。圖2顯示了在主成分分析之后的一個表達譜的實例。部分(a)顯示了 miRNA表達的總的多維表達數(shù)據(jù)集的三個主要組分的三維投影圖并且展示了對于一個處理類型的 miRNA表達數(shù)據(jù)的聚類。部分(b)顯示了用于單一 miRNA表達的數(shù)據(jù)散布(data spread) 0圖3顯示了用從hsa-miR-1到hsa-miR-11標記的有差別的miRNA的統(tǒng)計分級11。 P值是一個結(jié)果是否是統(tǒng)計學顯著的或可能性的結(jié)果的標準統(tǒng)計測試值(通常給定的一個 P值為< 0. 05)，并且q值是針對多重測試進行校正的ρ值并提供了錯誤發(fā)現(xiàn)率的一種度量。所有顯示的P值都遠遠小于0.05。圖4(a)顯示了對于多種miRNA的miRNA表達的多維數(shù)據(jù)集的三個主要組分的一個投影圖并且miRNA的聚類指示了潛在的治療應用。(b)顯示了對于多種miRNA的miRNA 表達的多維數(shù)據(jù)集的三個主要組分的一個投影圖，其中這些單獨的miRNA被涂暗色調(diào)以指示使用了在它們的表達中施加了生物干預的治療應用?？梢钥闯觯@些結(jié)果被清晰地分組并且這種分組的根據(jù)是施加到在其中表達這些 miRNA的細胞的生物干預的治療用途。換句話說，有可能確定的是，這些分組的生物干預對于它們被施加到其上的細胞具有相似的作用機制，并且該共享的機制導致了對miRNA表達水平的相似作用。具有相似作用機制的生物干預可能還具有相似的治療特性并且因此它們可能具有相似的治療應用。圖3以及圖4中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明，對于這些測試的生物干預，用于相似治療應用的生物干預(例如抗代謝劑)的miRNA表達的三維數(shù)據(jù)集的三個主要組分的投影圖確實在一起分組，并且證明具有不同治療用途的生物干預(例如表觀遺傳學修飾劑)的分組是分開地進行分組的通過進行許多生物干預以及分析miRNA表達譜中的這些作為結(jié)果的變化可以建立一個miRNA表達譜的數(shù)據(jù)庫。這樣一個數(shù)據(jù)庫將使一種未檢驗的生物干預的治療用途或潛在的將來的治療用途的鑒定成為可能(通過對所述的未檢驗的生物干預的一個miRNA表達譜與該數(shù)據(jù)庫中的未檢驗的生物干預的一個miRNA表達譜進行比較并且確定所述表達譜是否落入這些治療應用分組之一)。如果出現(xiàn)這樣一種相關，則對于該特異性治療應用可以考慮該未檢驗的生物干預。 此外，建立一個miRNA表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫可以揭示一個指示某一治療應用的某些 miRNA的子集。一旦鑒定了所述指示性miRNA的子集，可以通過看該指示性miRNA表達譜的子集的表達圖譜而不是這些細胞產(chǎn)生的全范圍的miRNA來進行測試，包括用來發(fā)現(xiàn)潛在治療應用的新的生物干預的將來的測試、或者用于新的治療應用的已知的生物干預的測試。還可以采用miRNA表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫來確定某些miRNA的子集，這些miRNA的表達水平用于在這些生物干預之間或這些生物干預的組之間進行區(qū)分是最有用的，這些生物干預是已知的或被假設具有相似的作用模式?？梢詫iRNA進行分級(按照用于在這些生物干預之間或這些生物干預的組之間進行區(qū)分的它們的表達水平的關聯(lián)性的順序)，這些生物干預是已知的或被假設具有相似的作用模式?？梢詫@些miRNA指定一個數(shù)值，該數(shù)值指示了用于在這些生物干預之間或生物干預的組之間進行區(qū)分的它們的表達水平的關聯(lián)性，這些生物干預是已知的或被假設具有相似的作用模式。例如，該數(shù)值可以與一種 miRNA的表達水平對主要成分的變化的貢獻有關。作為一個替代方案，或除此之外，使用統(tǒng)計方法(如主成分分析)的miRNA表達譜的比較、一種生物干預對一個有限的miRNA(例如10-50)的組的每種miRNA的表達的作用可以被鑒定并且被用于將一個編碼(選自一組編碼)指定給該生物干預對每個對應的 miRNA的表達的作用?？梢詫@些生成的編碼進行比較以鑒定在作用方面的相似性。例如，對于每種生物干預(例如對于每種篩選的化合物)可以指定一個3位二進制數(shù)，作為對每種分級的miRNA的一個編碼，這是基于1.如果該miRNA的表達響應于該生物干預而沒有變化(在實驗性變異性的正常范圍之內(nèi))，則將第一個位設為0。如果表達已經(jīng)顯著變化，則將第一個位設為1。2.如果鑒定出一個在表達水平方面的變化并且該變化是增加，則將第二位設為 1。如果由該生物干預導致的變化是減少，則將第二位設為0。3.如果在表達水平方面的變化大于4倍，則將第三位設為1，否則將其設為0。因此，一種生物干預水平對miRNA表達的作用被指定了一個具有五個可能值之一的編碼1.在表達方面沒有變化-0002.在表達方面有大的增加-1113.在表達方面有小的增加-1104.在表達方面有大的減少-1015.在表達方面有小的減少-100一種生物干預(例如一種特定化合物的給予)對一組miRNA的表達水平的作用可以通過有關編碼進行表征，允許不是立即從主成分分析中看出表達水平方面的變化的鑒定，允許對這些生物干預的相似性進行評分并且使生成的表達數(shù)據(jù)通過目測可理解的替代方法。對一種生物干預的作用進行表征并且確定對不同生物干預的miRNA表達的作用之間的相關的另一種方法是進行一種表達分析以確定一種生物干預對一組miRNA(典型地是10到50)中的每一種的表達的作用并且按照在這個組中的作用的順序?qū)@些miRNA 進行分級，例如，按照從在該組中在表達方面具有最大增加的miRNA到在該組中在表達方面具有最大減少的miRNA的順序，或反之亦然。這些生成的等級指示了這些特定的生物干預的作用。因此，可以測量其他的生物干預對該組miRNA的作用并且按該作用的順序?qū)υ摻M中的這些miRNA進行分級?？梢詫ι傻牡燃夁M行比較以使有待鑒定的生物干預的作用之間的相關成為可能?？梢蕴峁┌▽y試這些指示性miRNA的子集可操作的板的一種試劑盒，以顯著地增加效率和速度，用這樣的效率和速度可以篩選生物干預(針對潛在的新穎的治療應用)。在此處揭露的本發(fā)明的范圍之內(nèi)可以做進一步的變更以及修改。參考文獻1. Xie, X. , et al. , Systematic discovery of regulatoty motifs in human promoters and 3' -UTRs by comparison of several mammals. Nature,2005. 434(7031) p.338-452. Lim, L. P. , et al. , Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature,2005. 433 (7072) :p. 769-733. Calin, G. A. , et al. , MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Aci USA,2004. 101 (32) p. 11755-60。
權(quán)利要求
1.一種包括以下步驟的方法(1)進行多種表達分析，每種表達分析包括以下步驟在一種生物系統(tǒng)上進行一種干預，測量由該干預產(chǎn)生的在該生物系統(tǒng)中的非編碼RNA的一個表達譜，并且存儲源于該測量的表達譜的一個表達數(shù)據(jù)集，所述這些表達分析涉及多種不同的干預和多種不同的生物系統(tǒng)的兩者之一或兩者；以及(2)分析生成的表達數(shù)據(jù)集以確定在兩種或更多種表達分析的組中對對應的干預的非編碼RNA表達譜的作用之間的相關，這些表達分析涉及不同的干預或不同的生物系統(tǒng)的兩者之一或兩者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種方法，其中一種或多種所述干預包括將一種測試劑施用到一種生物系統(tǒng)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的一種方法，其中一種干預包括將多種測試劑施用到一種生物系統(tǒng)中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至權(quán)利要求3任一項所述的一種方法，其中一種或多種所述生物系統(tǒng)包括培養(yǎng)的細胞。
5.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的一種方法，其中至少一些所述相關是正相關。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種方法，進一步包括基于由表達分析生成的表達數(shù)據(jù)集之間的相似性對表達分析進行分類的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種方法，進一步包括確定兩種或更多種不同干預通過一種相似的機制對非編碼RNA的表達譜具有直接或間接作用的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至權(quán)利要求7的任一項所述的一種方法，其中一種第一干預是將一個第一治療實體施用到一種生物系統(tǒng)中，該治療實體具有至少一種已知的第一治療應用， 并且該方法包括確定對一種第二干預的非編碼RNA表達的作用之間存在正相關的步驟，包括一個第二治療實體的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種方法，進一步包括測試該第二治療實體是否可應用于所述第一治療應用。
10.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的一種方法，其中至少一些所述相關是負相關。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種方法，其中一種第一干預可以是對該生物系統(tǒng)具有有害作用的一種干預，并且一種第二干預被確定為對非編碼RNA的表達譜具有與該第一干預的作用是負相關的作用，該第二干預被鑒定為一種用于治療或預防已知由該第一干預引起的一種病癥的候選物。
12.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的一種方法，該方法包括確定一組非編碼RNA的表達水平與在生物干預的作用之間的區(qū)分的關聯(lián)性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種方法，該方法包括，對于多種生物干預的每一種，根據(jù)對應的生物干預對對應的非編碼RNA的表達的作用將一組非編碼RNA內(nèi)的這些非編碼RNA 進行分級，并且比較這些生成的等級以鑒定生物干預對非編碼RNA的表達的作用之間的相關。
14.一種確定用于治療或預防已知的治療干預的副作用的候選治療實體的方法，包括以上權(quán)利要求的任一項所述的方法。
15.一種預測一種測試劑的毒理學的一個或多個方面的方法，包括權(quán)利要求1至14的任一項所述的方法。
16.一種確定第一測試劑是第二測試劑或特異性靶標大分子的一種候選激動劑或拮抗劑的方法，包括權(quán)利要求1至14的任一項所述的方法。
17.一種根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的方法，其中進行了多種表達分析，在這些表達分析中在多種不同的生物系統(tǒng)上進行了相同的干預或一組干預
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的一種方法，其中這些不同的生物系統(tǒng)包括處于分化或去分化的不同階段的哺乳動物干細胞。
19.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的一種方法，其中表達譜與多種非編碼RNA的表達是相關的。
20.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的一種方法，其中這些非編碼RNA是miRNA。
21.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的一種方法，其中這些所述的表達譜是針對一組非編碼RNA中的每種非編碼RNA進行測量的，并且該方法包括鑒定單獨的非編碼RNA或該非編碼RNA組的一個亞組，這些非編碼RNA具有在其上多種干預具有相關作用的表達圖譜。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種方法，其中對在一個非編碼RNA組和單獨的非編碼 RNA或在該組之內(nèi)的非編碼RNA亞組的表達譜上具有相關作用的干預兩者都進行了鑒定， 該非編碼RNA組具有受所述多種干預影響的表達水平。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的一種方法，其中具有相關作用的多種干預是以前已知具有一種有關的作用機制的干預，并且該方法是鑒定具有受所述多種干預影響的表達水平的單獨的非編碼RNA或一個非編碼RNA亞組的一種方法。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23的任一項所述的一種方法，其中該生成的鑒定的單獨的非編碼RNA或鑒定的非編碼RNA亞組被選擇用于在進一步的表達分析中使用，在這些進一步的表達分析中測量了一個減少的非編碼RNA組的表達譜，該減少的非編碼RNA組僅僅包括該非編碼RNA組的一些，至少包括這些鑒定的單獨的非編碼RNA或鑒定的非編碼RNA亞組。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的一種方法，其中所選擇的減少的非編碼RNA組被采用來進行篩選候選實體，以發(fā)現(xiàn)新穎的在治療上有用的實體或針對已知的治療實體鑒定新的適應癥。
26.具有非編碼RNA的分析裝置，包括一個通過權(quán)利要求25所述的方法而獲得的所述的減少的非編碼RNA組。
全文摘要
在此披露了一種方法，該方法包括以下步驟進行多種表達分析，每種表達分析包括以下步驟在一種生物系統(tǒng)上進行一種干預，測量由該干預產(chǎn)生的在該生物系統(tǒng)中的非編碼RNA的一個表達譜，并且存儲源于該測量的表達譜的一個表達數(shù)據(jù)集，所述這些表達分析涉及多種不同的干預和多種不同的生物系統(tǒng)的兩者之一或兩者；以及分析生成的表達數(shù)據(jù)集以確定在兩種或更多種表達分析的組中對對應的干預的非編碼RNA表達譜的作用之間的相關，這些表達分析涉及不同的干預或不同的生物系統(tǒng)的兩者之一或兩者。
文檔編號C12Q1/68GK102356163SQ201080012901
公開日2012年2月15日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者C·R·希利爾, J·F·戈登, J·P·埃斯蒂貝羅, V·奧布賴恩 申請人:西斯特米克蘇格蘭有限公司