專利名稱：在氮限制條件下具有改變的農學特性的植物和涉及編碼包含snf2結構域多肽的基因的相 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明領域涉及植物育種和遺傳學，具體地講涉及植物中可用的賦予氮利用效率和/或氮限制條件耐受性的重組DNA構建體。
背景技術：
世界范圍內非生物脅迫顯著地限制了作物產量。據(jù)評估，這些因素累積地造成平均70%的農業(yè)產量減少。植物是固著的，必須適應它們周邊的主要環(huán)境條件。這已經導致它們發(fā)展出基因調控、形態(tài)發(fā)生和代謝的高可塑性。適應和防御機制策略涉及激活編碼對適應或防御不同脅迫具有重要作用的蛋白。植物氮吸收在它們的生長中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) ^5-306(2004))。植物從環(huán)境中的無機氮合成氨基酸。因此，氮肥已經成為提高栽培植物如玉米和大豆的產量有力工具。為了避免硝酸鹽污染并保持足夠的利潤率，如今農民期望減少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生長和產量的提高。概括地說，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品種是所期望的?？衫眉せ顦擞泚龛b定能影響性狀的基因。已經在模型植物擬南芥屬中使用該方法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入轉錄增強子元件能夠顯著激活和/或提高附近內源基因的表達。這種方法可以用于鑒定特定性狀(例如植物的氮利用效率)的受關注的基因，當所述基因經轉基因進入生物中時可改變該性狀。發(fā)明概述本發(fā)明包括在一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、25、27、 29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。 在另一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、25、 27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進行比較時具有至少50%的序列同一性， 并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。任選地，在氮限制條件下與未包含所述重組DNA構建體的所述對照植物比較時，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種農學特性的所述改變。所述至少一種農學特性可以是產量、生物量、或它們二者，并且所述改變可以是提高。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽(canola)、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗和柳枝稷。。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、 48、或49進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述種子產生的植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性或至少一種農學特性的改變，或者兩者皆有。所述至少一種農學特性可以是產量、生物量、或二者，并且所述改變可以是提高。在另一個實施方案中，提高植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、 42、44、46、48、或49進行比較時，具有至少50 %的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA構建體；以及(c)獲取來源于步驟(b)的轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體并且在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，評價植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)獲取轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、25、27、四、 30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進行比較時具有至少50 %的序列同一性；(b)獲取來源于所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)評價所述子代植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，測定植物農學特性的改變的方法，所述方法包括(a)獲取轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19、21、23、25、27、四、 30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進行比較時，具有至少50%的序列同一性，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；(b)獲取來源于所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。任選地，所述測定步驟(c)包括測定所述轉基因植物在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。所述至少一種農學特性可以是產量、生物量、或二者，并且所述改變可以是提高。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何方法，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗和柳枝稷。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含 (a)編碼包含SNF2結構域的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、36、38、或46進行比較時，具有至少50%，55%，60%， 65%，70%，75%，80%，85%，90%，或95%的序列同一性，或者(b)所述核苷酸序列的全長互補序列，其中所述全長互補序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是 100%互補的。所述多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO :19、21、23、36、38、或46。所述核苷酸序列可包含核苷酸序列SEQ ID NO :18、20、22、35、37、或45。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何分離的多核苷酸的重組DNA構建體，所述分離的多核苷酸可操作地連接到至少一種調控序列，并且本發(fā)明涉及包含所述重組DNA構建體的細胞、植物和種子。所述細胞可以是真核細胞，例如酵母、昆蟲或植物細胞，或者是原核細胞，例如細菌細胞。附圖簡沭和序列表根據(jù)以下的詳細描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。

圖1示出pHSbarENDs2激活標記構建體的圖譜，該構建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO 1)ο圖 2 示出載體 PDONR11^eo (SEQ ID NO 2), GATEWAY· 供體載體的圖譜。attPl 位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸27M-2985 (互補鏈)。圖3示出載體pD0NR 221 (SEQ ID NO :3) ,GATEWAY 供體載體的圖譜。attPl位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸27M-2985 (互補鏈)。圖4示出載體pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的圖譜，該載體是用于構建擬南芥屬表達載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸11276-11399(互補鏈)；attR2位點位于核苷酸9695-9819(互補鏈)。圖5示出載體PHP27840 (SEQ ID NO 5)的圖譜，該載體是用于構建大豆表達載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸7310-7434 ；attR2位點位于核苷酸8890-9014。圖6示出載體PHP23236(SEQ ID NO 6)的圖譜，它是用于構建feispe Flint來源的玉米品系的表達載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸2006-2130 ；attR2位點位于核苷酸沘99-3023。圖7示出載體PHP10523 (SEQ ID NO :7)的圖譜，該載體是存在于農桿菌菌株 LBA4404 中的質粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 :165-174(1996) ；NCBI 通用標識號 59797027)。圖8示出載體PHP23235 (SEQ ID NO 8)的圖譜，它是用于構建目的載體PHP23236 的載體。圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO 9)的圖譜。圖10示出目的載體PHP22655(SEQ ID NO :10)的圖譜。圖11示出目的載體PHP^634(SEQ ID NO :15)的圖譜，該載體用于構建用于feispeFlint來源的玉米品系的表達載體。圖12示出用于篩選的五個品系(標記為1至5-每個品系有十一個個體)，加上野生型對照品系Cl (九個個體)的典型網(wǎng)格圖案。圖13示出通過圖像分析測定的若干個不同硝酸鉀濃度對植物顏色的效應。綠色區(qū)(色調50至66)對氮劑量的響應證明該區(qū)可被用于指示氮同化作用。圖14顯示實施例18中用于半水耕玉米生長的生長培養(yǎng)基。圖15是列出不同硝酸鹽濃度對實施例18中Gaspe Flint衍生的玉米系生長和發(fā)育的影響相關的數(shù)據(jù)的圖表。圖 16A-AM示出擬南芥(Arabidopsis thaliana)包含 SNF2 結構域的多肽(SEQ ID NO :25、27、和 29)以及它們的同源物(SEQ ID NO :19、21、23、30、31、32、36、38、40、42、44、 46、48、和49)的全長氨基酸序列的多重比對。圖17示出圖16A-AM中顯示的每對氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的圖表。序列描述以及所附序列表遵循如37C. F. R. § 1. 821-1. 825所列出的關于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical J. 219(2) 345-373(1984)中，它們引入本文以供參考。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。表1列出了本文所述的某些多肽、包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的對應標識符(SEQ ID NO:)。^ 1包含SNF2結構域的多肽
權利要求
1.在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、 38、40、42、44、46、48、或49進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。
2.在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、 38、40、42、44、46、48、或49進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出產量或生物量的提高或二者皆提尚。
3.權利要求2的植物，其中在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構建體的所述對照植物進行比較時，所述植物表現(xiàn)出所述產量或生物量的提高或二者皆提高。
4.權利要求1至3中任一項的植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗、和柳枝稷。
5.權利要求1至4中任一項的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA 構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或 49 進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中從所述種子產生的植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種性狀的提高，所述性狀選自氮脅迫耐受性、產量和生物量。
6.增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構建體導入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽， 所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、2U3、25、27、29、30、31、32、 36、38、40、42、44、46、48、或49進行比較時具有至少50 %的序列同一性；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)獲得源自所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體并且在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。
7.評價植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)獲取轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19, 21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或 49 進行比較時具有至少 50% 的序列同一性；(b)獲得源自所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)評價所述子代植物與不包含所述重組DNA構建體的對照植物相比的氮脅迫耐受性。
8.測定植物中產量、生物量或二者的改變的方法，所述方法包括(a)獲取轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19, 21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或 49 進行比較時具有至少 50% 的序列同一性；(b)獲得源自所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(c)測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出產量或生物量或二者的改變。
9.權利要求8的方法，其中所述測定步驟(c)包括測定所述轉基因植物在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構建體的對照植物相比是否表現(xiàn)出產量或生物量或二者的改變。
10.權利要求8或9的方法，其中所述改變?yōu)樘岣摺?br> 11.權利要求6至10中任一項的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、 低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗和柳枝稷。
12.分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)編碼包含SNF2結構域的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19、21、23、36、38、或46進行比較時，具有至少50%的序列同一性，其中所述Clustal V比對方法采用以下逐對比對默認參數(shù)=KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5，和 DIAGONALS SAVED = 5，或(b)(a)的核苷酸序列的全長互補序列。
13.權利要求12的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQID N0:19、21、23、 36,38 或 46。
14.權利要求12的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQID NO 18、20、22、35、37或45。
15.包含重組DNA構建體的植物或種子，其中所述重組DNA構建體包含權利要求12至 14中任一項的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了尤其可用于在氮限制條件下改變植物農學特性的分離的多核苷酸和多肽以及重組DNA構建體、包含這些重組DNA構建體的組合物(如植物或種子)、以及利用這些重組DNA構建體的方法。所述重組DNA構建體包含可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含SNF2結構域的多肽。
文檔編號C12N15/82GK102365365SQ201080013984
公開日2012年2月29日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權日2009年3月27日
發(fā)明者C·R·西蒙斯, D·盧塞爾, H·薩凱, M·奧克曼, S·M·艾倫, S·V·廷蓋, S·拉克 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司