專利名稱：酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含核酸結(jié)合蛋白和表面的構(gòu)建體。從所述結(jié)合蛋白上除去至少一個(gè)天然的可及的半胱氨酸殘基。所述結(jié)合蛋白通過一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸連接在所述表面上。從所述蛋白質(zhì)上移除其他可及的半胱氨酸殘基使得可控制對(duì)所述表面的連接。所述構(gòu)建體可被用于形成跨膜孔，其連接有核酸結(jié)合蛋白。這樣的孔尤其可用于測序核酸。所述酶處理所述核酸的方式使得所述孔能通過隨機(jī)傳感來檢測所述核酸的每個(gè)組成核苷酸。
背景技術(shù)：
隨機(jī)檢測是一種依賴于對(duì)分析物分子與受體之間個(gè)體結(jié)合事件的觀察結(jié)果的傳感方法。隨機(jī)傳感器可通過如下方式形成將納米尺寸的單孔置入絕緣膜中，并且在存在分析物分子的情況下測量電壓驅(qū)動(dòng)的穿過所述孔的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。電流波動(dòng)的發(fā)生頻率可揭示在所述孔中結(jié)合的分析物的濃度。分析物的種類是通過其特征性電流特征，特別是電流阻斷的持續(xù)時(shí)間和程度而揭示(Braha，0. ,Walker,B.，Cheley，S. ,Kasianowicz, J. J.，Song，L.， Gouaux, J.Ε., and Bayley, H. (1997)Chem. Biol. 4,497-505 ；and Bayley, H. , and Cremer, P.S. (2001)Nature413,226-230) 形成細(xì)菌孔的毒素α-溶血素(α-HL)的基因工程改造形式已用于對(duì)許多類型的分子進(jìn)行的隨機(jī)傳感(Bayley，H.，and Cremer, P. S. (2001)Nature 413,226-230 ；Shin, S. -H. , Luchian, Τ. , Cheley, S. , Braha, 0. , andBayley, H. (2002)Angew. Chem. Int. Ed. 41, 3707-3709 ；Guan, Χ. , Gu,L. -Q. ,Cheley, S. ,Braha,0. ,and Bayley,H. (2005)ChemBioChem 6,1875-1881)。在這些研究的過程中，已發(fā)現(xiàn)，對(duì)α-HL進(jìn)行改造以直接結(jié)合小的有機(jī)分析物的嘗試是很費(fèi)力的，并且鮮有成功的實(shí)例(Guan, X.，Gu, L.-Q.，Cheley, S.，Braha, 0.，and Bayley, H. (2005)ChemBioChem 6，1875-1881)。幸運(yùn)地是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一種不同的策略，該策略利用了非共價(jià)連接的分子銜接體(adaptor)，特別是環(huán)糊精(Gu，L.-Q.， Braha, 0.，Conlan, S.，Cheley, S.，and Bayley, H. (1999) Nature398，686-690)，還有環(huán)形月太(Sanchez-Quesada, J. , Ghadiri, Μ. R. , Bayley, H. , and Braha, 0. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122,11758-11766)和葫蘆脲(cucurbituril) (Br aha, 0. ,Webb, J.，Gu，L.-Q. ,Kim, K.， andBayley, H. (2005) ChemPhysChem 6,889-892) 環(huán)糊精可短暫地進(jìn)入所述 α-HL 孔中，并產(chǎn)生很大程度但不完全的通道阻斷。有機(jī)分析物在環(huán)糊精的疏水內(nèi)部發(fā)生結(jié)合，加強(qiáng)這種阻斷可使得分析物可被檢測(Gu, L. -Q.，Braha, 0.，Conlan, S.，Cheley，S.，and Bayley, H. (1999)Nature 398,686-690)?，F(xiàn)在在大范圍的應(yīng)用中需要快速且廉價(jià)的DNA或RNA測序技術(shù)?，F(xiàn)有的技術(shù)速度較慢且價(jià)格昂貴，主要是因?yàn)樗鼈円蕾囉跀U(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生大量核酸并且需要大量專門的熒光化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行信號(hào)檢測。隨機(jī)傳感有可能通過減少所需核苷酸和試劑的量來提供快速且廉價(jià)的DNA測序
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人出乎意料地證明，通過置換除去核酸結(jié)合蛋白的所有天然可及的半胱氨酸殘基或者僅保留一個(gè)天然可及半胱氨酸殘基，所述核酸結(jié)合蛋白仍保持其功能。發(fā)明人還展示了生成僅有一個(gè)或多個(gè)可及半胱氨酸殘基的核酸結(jié)合蛋白使得所述蛋白質(zhì)對(duì)表面的連接可受到控制。所述一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸殘基可以是通過突變引入的非天然殘基?；蛘?，所述一個(gè)或多個(gè)可及的殘基可以是保留的天然殘基，條件是除去了其他天然可及的半胱氨酸。因此，本發(fā)明提供包含核酸結(jié)合蛋白質(zhì)和表面的構(gòu)建體，其中從所述結(jié)合蛋白質(zhì)上除去至少一個(gè)天然可及的半胱氨酸殘基，其中所述結(jié)合蛋白通過一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸殘基連接在所述表面上，并且其中所述結(jié)合蛋白保持其結(jié)合核酸的能力。所述核酸結(jié)合蛋白優(yōu)選地是核酸處理酶(nucleic acid handling enzyme)。所述表面優(yōu)選地是孔或孔亞基。發(fā)明人還出乎意料地證明本發(fā)明的構(gòu)建體可被用于產(chǎn)生既能夠結(jié)合核酸又能夠通過隨機(jī)傳感測序所述核酸的跨膜孔。所述核酸結(jié)合蛋白的固定特性和與所述孔的緊密接近意味著靶核酸中的一部分核苷酸會(huì)與所述孔相互作用并以獨(dú)特方式影響流經(jīng)所述孔的電流。因此，包含這樣的構(gòu)建體的跨膜孔可用于隨機(jī)傳感，特別是可用于測序核酸。因此，本發(fā)明還提供-用于測序核酸的修飾孔，其包含至少一種本發(fā)明的構(gòu)建體；-用于產(chǎn)生用于測序核酸的修飾孔的試劑盒，包括(a)至少一種本發(fā)明的構(gòu)建體，其中所述表面是孔亞基；和(b)形成孔所需要的其他亞基；-產(chǎn)生本發(fā)明的構(gòu)建體的方法，包括(a)使包含一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸殘基的核酸結(jié)合蛋白通過所述半胱氨酸殘基連接在表面上；并且(b)確定所得到的構(gòu)建體是否能夠結(jié)合核酸；-產(chǎn)生本發(fā)明的修飾孔的方法，包括(a)使得本發(fā)明的至少一種構(gòu)建體(其中所述表面是孔亞基)與其他合適的亞基形成孔；并且(b)確定所得到的孔是否能夠結(jié)合核酸并且檢測核苷酸；-測序靶核酸序列的方法，包括(a)使所述靶序列與本發(fā)明的孔接觸，所述孔包含核酸外切酶，從而使得所述核酸外切酶從所述靶序列的一端消化單個(gè)核苷酸；(b)使所述核苷酸與所述孔接觸從而使所述核苷酸與所述銜接體相互作用；(c)測量所述相互作用過程中通過所述孔的電流，從而確定所述核苷酸的種類； 并且(d)在所述靶序列的相同末端重復(fù)步驟(a)至(C)，從而確定所述靶序列的序列。-測序靶核酸序列的方法，包括(a)使所述靶序列與本發(fā)明的孔接觸，所述孔包含核酸處理酶，從而使得所述酶將所述靶序列推過或拉過所述孔并且所述靶序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；并且(b)檢測每個(gè)相互作用過程中通過所述孔的電流，從而確定所述靶序列的序列；-包含SEQ ID NO :8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48和50中任意一個(gè)所顯示的序列或其變體的核酸外切酶；和-編碼本發(fā)明的核酸外切酶的多核苷酸序列。


圖1顯示EcoExo I結(jié)構(gòu)的草圖，顯示天然存在的半胱氨酸的位置和殘基數(shù)目(從晶體結(jié)構(gòu)得到)。圖2顯示EcoExo I的表面圖，顯示可及的半胱氨酸的位置(從晶體結(jié)構(gòu)得到)。圖3顯示Exo I突變體與野生型比較的相對(duì)活性。圖4顯示EcoExo I的圖，顯示可引入單個(gè)半胱氨酸以與蛋白質(zhì)納米孔偶聯(lián)的位置。圖fe和釙顯示Exo I突變體與野生型比較的相對(duì)活性。圖6顯示核酸外切酶I測定法的圖示。圖7顯示來自核酸外切酶I測定法的數(shù)據(jù)的實(shí)例。圖8顯示連接體(linker)對(duì)Exo-ATTTT_A83C的連接不影響酶活性。Y-軸是相對(duì)活性。左邊的一對(duì)柱是0NLP1403，右邊的一對(duì)柱是0NLP1405。在每對(duì)柱中，左邊的柱(深色的柱)是帶有連接體的酶，右邊的柱(淡色的柱)是沒有連接體的酶。圖9顯示PNA對(duì)EXO-ATTTT-A83C的連接不影響酶活性。Y-軸是相對(duì)活性。左邊的柱是0NLP1498，右邊的柱是0NLP1499。圖10顯示PEG連接體對(duì)Exo-ATTTT或Exo-ATTTT_M184C的連接不影響酶活性。 Y-軸是相對(duì)活性。左邊的一對(duì)柱是Exo-ATTTT，右邊的一對(duì)柱是Exo-ATTTT-M184C。在每對(duì)柱中，左邊的柱(深色的柱)是帶有連接體的酶，右邊的柱(淡色的柱)是沒有連接體的酶。序列表說明SEQ ID NO=I顯示編碼野生型α -溶血素(α -HL)的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。SEQ ID NO 2顯示野生型α -HL的一個(gè)亞基的氨基酸序列。氨基酸2至6、73至 75,207至209、214至216和219至222形成α -螺旋。氨基酸22至30、；35至44、52至62、 67 至 71、76 至 91、98 至 103、112 至 123、137 至 148、154 至 159、165 至 172、229 至 235、243 至261、266至271、285至286和291至293形成β -鏈。所有其他非末端氨基酸，也就是 7 至 21,31 至 34,45 至 51,63 至 66、72、92 至 97,104 至 111,124 至 136,149 至 153,160 至 164,173 至 206,210 至 213、217、218、223 至 228,236 至 242,262 至 265,272 至 274 和 287 至290形成環(huán)區(qū)。氨基酸1和294是末端氨基酸。SEQ ID NO :3顯示編碼α-HL L135C/N139Q (HL-CQ)的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。SEQ ID NO :4顯示α-HL L135C/N139Q(HL-CQ)的一個(gè)亞基的氨基酸序列。在野生型α-HL中形成α-螺旋、β-鏈和環(huán)區(qū)的相同氨基酸在該亞基中形成相應(yīng)的區(qū)域。SEQ ID NO 5顯示衍生自大腸桿菌(E. coli) sbcB基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。它編碼大腸桿菌的核酸外切酶I (EcoExo I)。SEQ ID NO :6顯示大腸桿菌的核酸外切酶I酶(EcoExo I)的氨基酸序列。該酶從5，至3，方向從單鏈DNA(ssDNA)持續(xù)消化5，單磷酸核苷。氨基酸60至68、70至78、80 至 93、107 至 119,124 M 128,137 M 148,165 M 172、182 至 211、213 至 221、234 至 241、268至 286、313 至 324、3洸至；352、362 至 370、373 至 391、401 至妨4 和 457 至 475 形成 α -螺旋。氨基酸10至18J8至洸、47至50、97至101、133至136、2四至232、243至251、258至 263、298至302和308至311形成β-鏈。所有其他非末端氨基酸，19至27、37至46、51至 59、69、79、94 至 96,102 至 106,120 至 123,129 至 132,149 至 164,173 至 181、212、222 至 228233、242、252 至 257,264 至 267,287 至 297,303 至 307、312、325、353 至 361、371、372、 392至400、455和456形成環(huán)。氨基酸1至9是末端氨基酸。所述酶的整體折疊使得三個(gè)區(qū)域結(jié)合形成一個(gè)具有字母C外形的分子，但是無序分布在晶體結(jié)構(gòu)中的殘基355-358可有效地將該C形轉(zhuǎn)變?yōu)?樣形狀。氨基末端(1-206)形成核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，并與DnaQ超家族有同源性，以下殘基(202-354)形成SH3樣結(jié)構(gòu)域，并且羧基結(jié)構(gòu)域(359-475)伸出所述核酸外切酶結(jié)構(gòu)域以形成所述分子的C樣形狀。EcoExo I的4個(gè)酸性殘基與DnaQ超家族的活性位點(diǎn)殘基是保守的(對(duì)應(yīng)于D15、E17、D108和D186)。已經(jīng)提出，單個(gè)金屬離子被殘基D15和108所結(jié)合。DNA的水解可能是通過活化的水分子攻擊易被切斷的磷酸基來催化的，其中H181是催化殘基并對(duì)準(zhǔn)所述核苷酸底物。SEQ ID NO :7 顯示編碼 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C51A (0NLD0393)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :8 顯示 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C51A (0NLD0393)的氨基酸序列。SEQ ID NO :9 顯示編碼 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C144M(0NLD0403)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO 10 顯示 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C144M(0NLD0403)的氨基酸序列。SEQ ID NO 11 顯示編碼 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C144T (0NLD0404)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO 12 顯示 EcoExo I C98S/C306S/C330T/C144T (0NLD0404)的氨基酸序列。SEQ ID N0:13 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98S/C144M/C306S/C330T/ V42C (0NLD0415)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO 14 顯示 EcoExo IC51A/C98S/C144M/C306S/C330T/V42C (0NLD0415)的
氨基酸序列。SEQ ID N0:15 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98S/C144T/C306S/C330T/ V42C(0NLD0416)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO 16 顯示 EcoExo IC51A/C98S/C144T/C306S/C330T/V42C (0NLD0416)的
氨基酸序列。SEQ ID N0:17 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98S/C144M/C306S/C330T/ M184C (0NLD0417)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 18 EcoExo I C51A/C98S/C144M/C306S/C330T/M184C(0NLD0417)的氨
基酸序列。SEQ ID N0:19 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98S/C144T/C306S/C330T/ M184C (0NLD0418)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :20 顯示EcoExo IC51A/C98S/C144T/C306S/C330T/M184C (0NLD0418)的氨基酸序列。SEQ ID NO :21 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T (0NLD0411)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :22 顯示 EcoExo I C51A/C98S/C144T/C306S/C330T (0NLD0411)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :23 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306S/C330T (0NLD0432)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :24 顯示EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306S/C330T (0NLD0432)的氨基
酸序列。SEQ ID NO : 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306T/C330T (0NLD0433)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO 26 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306T/C330T (0NLD0433)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :27 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144M/C306S/C330T (0NLD0451)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :28 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144M/C306S/C330T (0NLD0451)的氨基
酸序列。SEQ ID NO 29 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98T/C144M/C306T/C330T (0NLD0452)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :30 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144M/C306T/C330T (0NLD0452)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :31 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98G/C144T/C306S/C330T (0NLD0453)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :32 顯示 EcoExo I C51A/C98G/C144T/C306S/C330T (0NLD0453)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :33 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98D/C144T/C306S/C330T (0NLD0491)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :34 顯示 EcoExo I C51A/C98D/C144T/C306S/C330T (0NLD0491)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :35 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98K/C144T/C306S/C330T (0NLD0454)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :36 顯示 EcoExo I C51A/C98K/C144T/C306S/C330T (0NLD0454)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :37 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98L/C144T/C306S/C330T (0NLD0455)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :38 顯示 EcoExo I C51A/C98L/C144T/C306S/C330T (0NLD0455)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :39 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98V/C144T/C306S/C330T (0NLD0456)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。
9
SEQ ID NO :40 顯示 EcoExo I C51A/C98V/C144T/C306S/C330T (0NLD0456)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :41 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98V/C144T/C306T/C330T (0NLD0476)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :42 顯示 EcoExo I C51A/C98V/C144T/C306T/C330T (0NLD0476)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :43 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98T/C144T/C306M/C330T (0NLD0477)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :44 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306M/C330T (0NLD0477)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :45 顯示編碼 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306N/C330T (0NLD0478)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :46 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306N/C330T (0NLD0478)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :47 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98T/C144T/C306D/C330T (0NLD0479)的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。SEQ ID NO :48 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306D/C330T (0NLD0479)的氨基
酸序列。SEQ ID NO :49 顯示編碼 EcoExo IC51A/C98T/C144T/C306A/C330T (0NLD04S0)的
密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。。SEQ ID NO 顯示 EcoExo I C51A/C98T/C144T/C306A/C330T (0NLD0480)的氨基
酸序列。在SEQ ID NO :7至50所描述的全部突變體中，在野生型EcoExo I中形成α -螺旋、β-鏈和環(huán)區(qū)的相同氨基酸在該突變體中形成相應(yīng)區(qū)域。SEQ ID NO :51顯示衍生自大腸桿菌的XthA基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。 它編碼大腸桿菌的核酸外切酶III。SEQ ID NO :52顯示大腸桿菌的核酸外切酶III的氨基酸序列。該酶從3，_5，方向從雙鏈DNA(dsDNA)的一條鏈上逐個(gè)消化5’單磷酸核苷。鏈上的酶啟動(dòng)需要大約4個(gè)核苷酸的 5，突出。氨基酸 11 至 13、15至25、39至41、44至49、85至89、121 至 139、158 至 160、165 至174、181至194、198至202、219至222、2；35至240和248至252形成α -螺旋。氨基酸 2 至 7、四至 33、53 至 57、65 至 70、75 至 78、91 至 98、101 至 109、146 至 151、195 至 197、229 至234和241至246形成β -鏈。所有其他非末端氨基酸，8至10 J6至觀、34至38、42、 43、50 至 52、58 至 64、71 至 74、79 至 84、90、99、100、110 至 120,140 M 145,152 M 157,161 至164、175至180、203至218、223至228、247和253至261形成環(huán)。氨基酸1、267和洸8 是末端氨基酸。酶活性位點(diǎn)是由連接β I-α 1、β 3-β 4、β 5-β 6、β III-α I、β IV-α II 禾口 β V-β VI 的環(huán)區(qū)(分別由氨基酸 8-10、58-64、90、110-120、152-164、175-180、223-228 和253-261構(gòu)成)形成的。單個(gè)二價(jià)金屬離子結(jié)合在殘基E34上，幫助和H259組氨酸-天冬氨酸催化對(duì)對(duì)磷酸二酯鍵的親核攻擊。SEQ ID NO 53顯示衍生自嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)的recj基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。它編碼嗜熱棲熱菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)。SEQ ID NO力4顯示嗜熱棲熱菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。該酶從 5’_3’方向從ssDNA持續(xù)消化5’單磷酸核苷。鏈上的酶啟動(dòng)需要至少4個(gè)核苷酸。氨基酸 19 至 33、44 至 61、80 至 89、103 至 111、136 至 140、148 至 163、169 至 183、189 至 202、207 至 217、223 至 240、242 至 252、2M 至洲7、302 至 318、338 至 350 和 365 至 382 形成 α -螺旋。氨基酸 36 至 40、64 至 68、93 至 96、116 至 120、133 至 135J94 至四7、321 至 325、328 至332、352至355和359至363形成β -鏈。所有其他非末端氨基酸，34,35,41至43、 62、63、69 至 79,90 至 92,97 至 102,112 至 115,121 至 132,141 至 147,164 至 168,184 至 188203 至 206,218 至 222、241、253、288 至 293,298 至 301、319、320、326、327、333 至 337、 351至358和364形成環(huán)。氨基酸1至18和383至425是末端氨基酸。僅對(duì)嗜熱棲熱菌 (Thermus thermophilus)的RecJ的核心結(jié)構(gòu)域(殘基40-463)解析了晶體結(jié)構(gòu)。為了確保RecJ核心結(jié)構(gòu)域的翻譯起始和體內(nèi)表達(dá)，在其氨基末端加入了甲硫氨酸殘基，而這在所述晶體結(jié)構(gòu)信息中不存在。所解析的結(jié)構(gòu)顯示通過長α-螺旋(254487)連接的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，氨基(2-253)和羧基(288-463)區(qū)。催化殘基(D46、D98、Η122和D183)與單個(gè)金屬離子配位以親核攻擊所述磷酸二酯鍵。D46和Η120被認(rèn)為是所述催化對(duì)；但是，對(duì)大腸桿菌 RecJ中這些保守殘基任意一個(gè)的突變都顯示可消除活性。SEQ ID NO :55顯示衍生自噬菌體λ (redX)基因的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。 它編碼噬菌體λ核酸外切酶。SEQ ID NO :56顯示噬菌體λ核酸外切酶的氨基酸序列。所述序列是組裝成三聚體的三個(gè)相同亞基之一的序列。所述酶高度持續(xù)地從dsDNA的一條鏈上消化核苷酸，方向是 5，_3，(http://www. neb. com/nebecomm/products/productM0262. asp)。在一條鏈上的酶啟動(dòng)優(yōu)選地需要大約4個(gè)核苷酸的具有5’磷酸的5’突出端。氨基酸3至10、14至16、 22 至洸、；34 至 40、52 至 67、75 至 95、1；35 至 149、152 至 165 和 193 至 216 形成 α -螺旋。 氨基酸 100 至 101,106 至 107,114 至 116,120 至 122,127 至 131,169 至 175 和 184 至 190 形成β-鏈。所有其他非末端氨基酸，11至13、17至21、27至33、41至51、68至74、96至 99,102 M 105,108 M 113,117 M 119,123 M 126,132 M 134,150 M 151,166 M 168,176 M 183、191至192、217至222形成環(huán)。氨基酸1、2和2 是末端氨基酸。λ核酸外切酶是同三聚體，所述同三聚體形成具有穿過中間的錐形通道的圓環(huán)結(jié)構(gòu)(toroid)，所述通道在一端顯然大到足以使dsDNA進(jìn)入，而在另一端僅能使ssDNA離去。未確定催化殘基，但是單個(gè)二價(jià)金屬離子似乎通過殘基D119、E129和L130與每個(gè)亞基結(jié)合。SEQ ID NO 57顯示核酸序列，由其可產(chǎn)生優(yōu)選的核酸連接體。SEQ ID NO :58顯示優(yōu)選的核酸連接體。MAL是馬來酰亞胺。該連接體與SEQ ID N0:61結(jié)合使用。SEQ ID NO :59顯示優(yōu)選的核酸連接體。MAL是馬來酰亞胺。該連接體與SEQ ID N0:62結(jié)合使用。SEQ ID NO :60顯示優(yōu)選的核酸連接體。MAL是馬來酰亞胺。該連接體與SEQ ID N0:63結(jié)合使用。SEQ ID NO :61顯示優(yōu)選的核酸連接體。MAL是馬來酰亞胺。該連接體與SEQ ID NO 58互補(bǔ)并且與SEQ ID NO 58結(jié)合使用。
SEQ ID NO :62顯示優(yōu)選的核酸連接體。MAL是馬來酰亞胺。該連接體與SEQ ID NO 59互補(bǔ)的并與SEQ ID NO 59結(jié)合使用。SEQ ID NO :63顯示優(yōu)選的核酸連接體。MAL是馬來酰亞胺。該連接體與SEQ ID NO 60互補(bǔ)并與SEQ ID NO 60結(jié)合使用。SEQ ID NO :64顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID N0:65結(jié)合使用。SEQ ID NO 65顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 64結(jié)合使用。SEQ ID NO 66顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 68結(jié)合使用。SEQ ID NO 67顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 69結(jié)合使用。SEQ ID NO 68顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 66互補(bǔ)并與SEQ ID NO 66結(jié)合使用。SEQ ID NO 69顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 67互補(bǔ)并與SEQ ID NO 67結(jié)合使用。SEQ ID NO 70顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 73互補(bǔ)并與SEQ ID NO 73結(jié)合使用。SEQ ID NO 71顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 74互補(bǔ)并與SEQ ID NO: 74結(jié)合使用。SEQ ID NO 72顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 75結(jié)合使用。SEQ ID NO 73顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 70結(jié)合使用。SEQ ID NO 74顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO 71結(jié)合使用。SEQ ID NO 75顯示優(yōu)選的核酸連接體。該連接體與SEQ ID NO -J2互補(bǔ)并與SEQ ID NO 72結(jié)合使用。
具體實(shí)施例方式應(yīng)理解所公開的產(chǎn)物和方法的不同應(yīng)用可根據(jù)本領(lǐng)域具體需要而調(diào)整。還應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅用于描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的目的，并且無意限制。此外，如本說明書和所附權(quán)利要求書所使用的，除非上下文明確說明相反，單數(shù)形式“一種”、“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及“一種構(gòu)建體”包括“各種構(gòu)建體”，提及“一種跨膜蛋白質(zhì)孔”包括兩種或多種這樣的孔，提及“一種分子銜接體”包括兩種或多種這樣的銜接體，等等。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)，無論是在上文還是在下文中，都以引用的方式全文納入本說明書。構(gòu)建體本發(fā)明提供用于結(jié)合核酸的構(gòu)建體。具體地，本發(fā)明提供用于處理核酸的構(gòu)建體， 例如當(dāng)測序核酸時(shí)用于處理核酸的構(gòu)建體。所述構(gòu)建體包含核酸結(jié)合蛋白和表面。從所述核酸結(jié)合蛋白上除去至少一個(gè)天然可及的半胱氨酸殘基。但是，所述核酸結(jié)合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸殘基并且通過這些殘基連接于所述表面。有限數(shù)量的可及半胱氨酸的存在使得可以控制對(duì)所述表面的連接。半胱氨酸殘基的可電離側(cè)鏈?zhǔn)怯糜趨⑴c加成反應(yīng)的強(qiáng)效親核試劑，因此廣泛地被選用于生物綴合(bioconjugation)技術(shù)。但是，對(duì)于這些技術(shù)的有效使用的一個(gè)常見障礙是存在于野生型蛋白質(zhì)中的天然半胱氨酸殘基。對(duì)一個(gè)或多個(gè)所述天然半胱氨酸殘基的修飾可導(dǎo)致不確定的酶活性和不受控制的連接。本發(fā)明涉及核酸結(jié)合蛋白的天然半胱氨酸殘基的定點(diǎn)誘變?？杀Ａ粢粋€(gè)或多個(gè)可及的天然半胱氨酸，除去其他可及的天然半胱氨酸?；蛘?，可除去全部可及的半胱氨酸殘基，并向所述蛋白質(zhì)中引入一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基。特定的可及的半胱氨酸的存在有利于所述結(jié)合蛋白與表面的連接，所述表面例如另一個(gè)蛋白質(zhì)、固體支持物或化學(xué)試劑。天然半胱氨酸殘基的去除和單個(gè)或多個(gè)半胱氨酸的定點(diǎn)加入改進(jìn)了之前的方法， 因?yàn)樗x予了控制連接的能力，同時(shí)還使得所述核酸結(jié)合蛋白通過不想要的表面巰基相互之間形成二聚體、三聚體等的可能相互作用最小化。如果所述蛋白質(zhì)僅在其結(jié)構(gòu)中的設(shè)計(jì)位點(diǎn)含有單個(gè)半胱氨酸殘基，那么該殘基的巰基基團(tuán)可用于與其他巰基形成直接的二硫鍵或者可通過反應(yīng)活性連接體介導(dǎo)偶聯(lián)。這些定點(diǎn)半胱氨酸殘基確保只有需要數(shù)量的酶分子與需要數(shù)量的靶分子交聯(lián)，同時(shí)還賦予一定程度的有利構(gòu)象，從而使得例如活性位點(diǎn)可以最優(yōu)地取向。存在于野生型酶中的天然半胱氨酸殘基使得不容易使用包含巰基反應(yīng)活性基團(tuán)的特定連接體，所述連接體例如馬來酰亞胺、碘乙酰胺或鄰二硫吡啶(ortho-pyridyl disulphide (OPSS))。與任何在結(jié)構(gòu)和催化方面重要的半胱氨酸殘基反應(yīng)的可能性會(huì)影響所述結(jié)合蛋白的活性，這對(duì)于在單個(gè)分子應(yīng)用中應(yīng)用很重要。優(yōu)選使用用于生物綴合的連接體以確保一定的空間分離，從而使得結(jié)合蛋白的活性不因與另一蛋白質(zhì)或表面(例如固體載體)緊密接近而受到影響。所述表面優(yōu)選地為孔或孔亞基。因此本發(fā)明的構(gòu)建體是用于形成能夠通過隨機(jī)傳感測序核酸的孔的有用工具。本發(fā)明的構(gòu)建體尤其可用于形成跨膜孔，所述跨膜孔既能夠結(jié)合靶核酸序列又能夠區(qū)分所述靶序列上的不同核苷酸。如下文所詳細(xì)描述的，所述核酸結(jié)合蛋白優(yōu)選地以這樣的方式處理靶核酸，即所述孔能夠鑒別所述靶序列中的核苷酸，從而測序所述靶序列。尤其是，一旦催化發(fā)生，本發(fā)明的構(gòu)建體不僅可將核酸結(jié)合蛋白(例如核酸處理酶)共定位至納米孔，而且可將所述酶活性位點(diǎn)取向以優(yōu)化堿基移位。所述表面不必須是孔或孔亞基。其他測序技術(shù)一般依賴于這樣的核酸，即所述核酸被固定在固體載體(例如，小珠)上，之后酶從溶液中結(jié)合并加入金屬離子來觸發(fā)催化活性。然后可在下游以多種方式檢測釋放的堿基。但是，該方法的障礙在于費(fèi)時(shí)、擴(kuò)增費(fèi)用昂貴并且需要后續(xù)的化學(xué)修飾以使所述模板核酸偶聯(lián)于所述小珠的表面。將核酸結(jié)合蛋白預(yù)先連接在小珠上可使得對(duì)任意核酸修飾的需要最少?，F(xiàn)有的酶連接方法不合適，因?yàn)樗鼈円蕾囉诤怂峤Y(jié)合蛋白的無向大量連接，并由于未知的取向或距離所述表面的空間分離而在結(jié)合蛋白質(zhì)的量以及結(jié)合蛋白質(zhì)的活性方面變化很大。本發(fā)明的構(gòu)建體使得可以受控地將單個(gè)核酸結(jié)合蛋白加至表面，因此極大地改進(jìn)了該測序方法。一類重要的核酸結(jié)合蛋白是核酸外切酶。核酸外切酶在分子生物學(xué)中的常見用途是從PCR反應(yīng)中除去擴(kuò)增引物以使得可通過加入特異測序引物來直接使用所述產(chǎn)物進(jìn)行測序。然而仍需要將所述核酸外切酶變性或者去除以防止所述測序引物的降解。因此需要在該階段中迅速而方便地將所述核酸外切酶去除的方法，以幫助該過程自動(dòng)化并且減少昂貴的DNA純化步驟。包含連接于表面的核酸外切酶的本發(fā)明的構(gòu)建體對(duì)于這樣的應(yīng)用是很理想的。上文已經(jīng)敘述了使核酸外切酶連接于表面(例如載玻片、孔的底部或者小珠)的現(xiàn)有方法的相關(guān)問題。使核酸外切酶通過單個(gè)半胱氨酸殘基與表面(例如瓊脂糖小珠)的共價(jià)偶聯(lián)將極大地改進(jìn)已知的方法，并且能夠幫助任何可能的酶溶解性問題。此外，從實(shí)施例中可得知，去除天然半胱氨酸能夠產(chǎn)生具有改變的活性和穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)?；钚愿叩€(wěn)定性降低的核酸外切酶也可以幫助從所述PCR反應(yīng)中去除酶活性。還應(yīng)考慮很多其他商業(yè)上重要的酶的類似可能應(yīng)用?？蓪⒈景l(fā)明的構(gòu)建體分離、基本上分離、純化或基本上純化。如果構(gòu)建體完全沒有任何其他組分(例如脂質(zhì)或其他孔單體)則其是分離的或純化的。如果構(gòu)建體與不會(huì)干擾其預(yù)期用途的載體或稀釋劑混合在一起則其是基本上分離的。例如，如果構(gòu)建體以包含少于10 %、少于5%、少于2%或少于的其他組分(例如脂質(zhì)或其他孔單體)的形式存在則其是基本上分離的或基本上純化的。本發(fā)明的構(gòu)建體可存在于脂雙層中。半胱氨酸殘基的誘變本發(fā)明的構(gòu)建體包含核酸結(jié)合蛋白，所述核酸結(jié)合蛋白中至少一個(gè)可及的半胱氨酸被去除。所述蛋白質(zhì)還具有一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸殘基。可及的半胱氨酸是可與巰基特定基團(tuán)反應(yīng)的殘基。確定半胱氨酸殘基是否可與巰基特定基團(tuán)反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域中熟知的。可及的半胱氨酸殘基一般存在于所述蛋白質(zhì)的可及表面上?？杉暗陌腚装彼釟埢俏幢宦駴]在所述結(jié)合蛋白內(nèi)部并且/或者沒有形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基。埋沒在所述結(jié)合蛋白內(nèi)部并且/或者形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基不需要從所述結(jié)合蛋白中去除，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)干擾對(duì)所述表面的連接。半胱氨酸殘基當(dāng)然能夠與所述蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵或者與其他含有反應(yīng)活性巰基基團(tuán)的化學(xué)綴合物形成二硫鍵?？衫眯蛄行畔⒑头肿幽Ｐ投ㄎ豢杉暗陌腚装彼釟埢＿@樣的建模方法是本領(lǐng)域中已知的。在實(shí)施例中還描述了一種方法。一旦所述可及的半胱氨酸被定位，就能夠如下文所述除去至少其中之一?？蓮乃鼋Y(jié)合蛋白上除去任意數(shù)量的天然可及的半胱氨酸殘基，例如2個(gè)、5個(gè)、 10個(gè)或更多。在一些實(shí)施方案中，從所述核酸結(jié)合蛋白除去全部天然可及的半胱氨酸殘基。 這將在下文中進(jìn)一步描述?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法除去天然可及的半胱氨酸殘基。天然殘基是存在于天然或野生型蛋白質(zhì)中的殘基?？赏ㄟ^缺失來除去天然半胱氨酸殘基。優(yōu)選通過置換來除去天然半胱氨酸殘基。可用天然存在的殘基或非天然存在的殘基置換天然半胱氨酸殘基?？捎萌鄙俜磻?yīng)活性巰基基團(tuán)的殘基置換天然半胱氨酸殘基。優(yōu)選用具有類似結(jié)構(gòu)的殘基置換天然半胱氨酸殘基。用于代替半胱氨酸殘基的合適殘基包括但不局限于，丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸。最優(yōu)選用蘇氨酸置換半胱氨酸殘基。從所述核酸結(jié)合蛋白上去除的可及半胱氨酸殘基的數(shù)目當(dāng)然依賴于存在于天然蛋白質(zhì)上的數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施方案中，從所述結(jié)合蛋白上除去全部天然可及的半胱氨酸，并且向所述結(jié)合蛋白中引入一個(gè)或多個(gè)，例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)非天然可及的半胱氨酸殘基。非天然殘基是不存在于天然或野生型蛋白質(zhì)中的殘基?？赏ㄟ^添加來引入非天然半胱氨酸殘基。優(yōu)選通過置換來引入非天然半胱氨酸殘基。一般引入非天然半胱氨酸來代替缺少反應(yīng)活性巰基基團(tuán)的殘基。可用半胱氨酸代替任意殘基，例如甲硫氨酸、纈氨酸、絲氨酸或丙氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除保留一個(gè)或多個(gè)所述天然可及的半胱氨酸外，從所述結(jié)
14合蛋白除去所有天然可及的半胱氨酸殘基。在該實(shí)施方案中，所述核酸結(jié)合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)，例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)天然可及的半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，除1個(gè)或2個(gè)所述天然可及的半胱氨酸殘基外，從所述結(jié)合蛋白上除去所有所述天然可及的半胱氨酸殘基。所保留的天然可及半胱氨酸殘基被用于使所述結(jié)合蛋白以特定方式連接至所述表面。 在該實(shí)施方案中，所述核酸結(jié)合蛋白還可包含如上文所述引入的一個(gè)或多個(gè)，例如2個(gè)、3 個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)非天然可及半胱氨酸殘基。所述核酸結(jié)合蛋白可通過所述天然殘基、 所述非天然殘基或者所述天然和非天然殘基兩者連接至所述表面。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸結(jié)合蛋白僅包含一個(gè)或兩個(gè)可及的半胱氨酸殘基。所述半胱氨酸殘基可以是如上文所述的天然的、非天然的半胱氨酸殘基或兩者的組合。 所述核酸蛋白通過這些半胱氨酸殘基連接至所述表面?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法來確定僅一個(gè)或僅兩個(gè)可及半胱氨酸殘基的存在。例如，所述核酸結(jié)合蛋白能夠與包含反應(yīng)活性巰基基團(tuán)的綴合物反應(yīng)，可確定與所述蛋白質(zhì)連接的綴合物的數(shù)目。下文更詳細(xì)地描述了進(jìn)行此類反應(yīng)的方法。如果僅有一個(gè)綴合物在該反應(yīng)后連接至核酸結(jié)合蛋白，則所述蛋白僅包含一個(gè)可及的半胱氨酸殘基。如果僅有2個(gè)綴合物在該反應(yīng)后連接至核酸結(jié)合蛋白，則所述蛋白僅包含2個(gè)可及的半胱氨酸殘基。所述核酸結(jié)合蛋白保持其結(jié)合核酸的能力。這使得所述構(gòu)建體可結(jié)合核酸并且優(yōu)選如下文所描述的測序核酸?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法來測定構(gòu)建體結(jié)合核酸的能力。例如，可對(duì)所述構(gòu)建體或從所述構(gòu)建體形成的孔測試它們結(jié)合核酸特定序列的能力。一般如實(shí)施例中所描述的測定構(gòu)建體或孔結(jié)合核酸的能力。所述核酸結(jié)合蛋白還保持其使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)表達(dá)的能力。如果一旦除去一個(gè)或多個(gè)天然半胱氨酸殘基就不能表達(dá)所述蛋白質(zhì)，則當(dāng)然意味著所述蛋白質(zhì)不能連接至所述表面。很容易確定某種特定突變體是否能夠表達(dá)。核酸結(jié)合蛋白表達(dá)的能力一般如實(shí)施例中所描述的來測定。核酸結(jié)合蛋白本發(fā)明的構(gòu)建體包含核酸結(jié)合蛋白。這類蛋白的實(shí)例包括但不局限于核酸處理酶，例如核酸酶、聚合酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、連接酶和解旋酶；和非催化的結(jié)合蛋白，例如由 SCOP(蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分類)分類在核酸結(jié)合蛋白超家族(50M9)下的那些。如上所述，所述核酸結(jié)合蛋白被修飾以除去并且/或者代替半胱氨酸殘基。核酸是包含兩個(gè)或多個(gè)核苷酸的大分子。由蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸可包含任意核苷酸的任意組合。所述核苷酸可以是天然存在的或者是人造的。所述核苷酸可被氧化或者甲基化的。核苷酸一般包含核堿基、糖和至少一個(gè)磷酸基團(tuán)。所述核堿基一般是雜環(huán)的。核堿基包括但不局限于嘌呤和嘧啶，更具體地是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖一般是戊糖。核苷酸糖包括但不局限于核糖和脫氧核糖。所述核苷酸一般是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。所述核苷酸一般包含單磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可連接在核苷酸的5’或3’側(cè)。核苷酸包括但不限于單磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、 單磷酸鳥苷酸(GMP)、二磷酸鳥苷(GDP)、三磷酸鳥苷(GTP)、單磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、單磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、單磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)單磷酸鳥苷(cGMP)、單磷酸脫氧腺苷(dAMP)、二磷酸脫氧腺苷(dADP)、三磷酸脫氧腺苷(dATP)、 單磷酸脫氧鳥苷(dGMP)、二磷酸脫氧鳥苷(dGDP)、三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)、單磷酸脫氧胸苷(dTMP)、二磷酸脫氧胸苷(dTDP)、三磷酸脫氧胸苷(dTTP)、單磷酸脫氧尿苷(dUMP)、二磷酸脫氧尿苷(dUDP)、三磷酸脫氧尿苷(dUTP)、單磷酸脫氧胞苷(dCMP)、二磷酸脫氧胞苷 (dCDP)和三磷酸脫氧胞苷(dCTP)。所述核苷酸優(yōu)選地選自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、 dTMP、dGMP 或 dCMP。所述核酸可以是脫氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。所述核酸可以是本領(lǐng)域中已知的任意合成的核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)、鎖核酸(LNA)或具有核苷酸側(cè)鏈的其他合成的聚合物。由蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸優(yōu)選地為單鏈的， 例如(^嫩、1 離、6離、1嫩或1^離。由蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸優(yōu)選地是雙鏈的，例如DNA。結(jié)合單鏈核酸的蛋白質(zhì)可被用于測序雙鏈DNA，條件是所述雙鏈DNA在其被所述蛋白質(zhì)結(jié)合之前解離為單鏈優(yōu)選地，所述核酸結(jié)合蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)是已知的。所述結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)的知識(shí)使得可對(duì)所述蛋白質(zhì)做出修飾以促進(jìn)其在本發(fā)明的構(gòu)建體或孔中的功能。所述蛋白質(zhì)可具有任意大小和任意結(jié)構(gòu)。例如，所述蛋白質(zhì)可以是低聚體，例如二聚體或三聚體。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選地是從一個(gè)單體形成的小的球狀多肽。這樣的蛋白質(zhì)容易處理并且干擾所述表面的可能性較小。例如，這樣的蛋白質(zhì)干擾孔亞基的孔形成能力的可能性較小。還優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)的位置和功能是已知的。這可以防止對(duì)所述活性位點(diǎn)做出可消除所述蛋白質(zhì)的活性的修飾。還允許所述蛋白質(zhì)連接至所述表面，從而使得所述蛋白質(zhì)以特定的方式連接至所述靶核酸序列。例如，如果所述蛋白質(zhì)被連接于用于測序的跨膜蛋白質(zhì)孔，那么它使得靶序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用，如下所述。 在這樣的實(shí)施方案中，使所述蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)的位置盡可能靠近所述孔通道的桶狀體的開口并且使得所述蛋白質(zhì)本身不會(huì)阻斷電流是有益的。關(guān)于其中蛋白質(zhì)使核酸取向的方式的知識(shí)也使得可設(shè)計(jì)有效的構(gòu)建體。如將在下文所更詳細(xì)描述的，可能必須純化本發(fā)明的構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述核酸結(jié)合蛋白能夠承受用于純化所述構(gòu)建體的條件。本發(fā)明構(gòu)建體中的表面可包含孔。這樣的孔可被用于測序核酸。為了使所述靶核酸中的大部分核苷酸可通過隨機(jī)傳感被正確地鑒定，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選地在緩沖液背景下結(jié)合所述核酸，所述緩沖液背景適于所述核苷酸的辨別。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選地在遠(yuǎn)高于正常生理水平的鹽濃度(例如IOOmM至2000mM)下至少具有殘余活性。更優(yōu)選地，將所述蛋白質(zhì)修飾以增加其在高鹽濃度下的活性。還可對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾以提高其持續(xù)處理能力、 穩(wěn)定性和保存期限。合適的修飾可通過對(duì)嗜極微生物(extremphile)(例如嗜鹽和中度嗜鹽細(xì)菌、嗜熱和中度嗜熱生物)的核酸處理酶進(jìn)行表征來確定，以及通過改變嗜溫或嗜熱核酸外切酶的耐鹽性、穩(wěn)定性和溫度依賴性的定向進(jìn)化方法來確定。所述酶還優(yōu)選地在10°C至60°C的溫度下(例如室溫下)保持至少部分活性。這使得所述構(gòu)建體可在多種溫度下(包括在室溫下)測序核酸。所述核酸結(jié)合蛋白優(yōu)選地是核酸處理酶。核酸處理酶是能夠與核酸相互作用并且改變核酸的至少一種性質(zhì)的多肽。所述酶可通過切割所述核酸以形成單個(gè)核苷酸或較短的核苷酸鏈(例如二核苷酸或三核苷酸)來修飾所述核酸。所述酶可通過對(duì)所述核酸取向或?qū)⑵湟苿?dòng)至特定位置來修飾所述核酸。所述核酸處理酶優(yōu)選來地自溶核酶。所述酶的構(gòu)建體中使用的所述核酸處理酶更優(yōu)選地來自酶分類(EC)組 3. 1. 11,3. 1. 13,3. 1. 14,3. 1. 15,3. 1. 16,3. 1. 21,3. 1. 22、 3. 1. 25,3. 1. 26,3. 1. 27,3. 1. 30和3. 1. 31中任一組的成員。所述核酸處理酶更優(yōu)選地基于以下酶中的任一種#3.1.11,- 產(chǎn)生5'-磷酸單酯的脫氧核糖核酸外切酶。O 3. 1. 11. 1 脫氧核糖核酸外切酶I。O 3. 1. 11.2 脫氧核糖核酸外切酶III。〇3. 1. 11. 3 脫氧核糖核酸外切酶(λ誘導(dǎo)的)。O 3. 1. 11.4 脫氧核糖核酸外切酶(噬菌體SP3誘導(dǎo)的)。O 3. 1. 11.5 脫氧核糖核酸外切酶V。O 3. 1. 11.6 脫氧核糖核酸外切酶VII。· 3. 1. 13.-產(chǎn)生5'-磷酸單酯的核糖核酸外切酶。O 3. 1. 13. 1 核糖核酸外切酶II。〇3. 1. 13. 2 核糖核酸外切酶H。O 3. 1. 13.3 寡核苷酸酶。O 3. 1. 13.4 Poly (A)-特異的核糖核酸酶。〇3. 1. 13. 5 核糖核酸酶D?！?3. 1. 14.-產(chǎn)生3'-磷酸單酯的核糖核酸外切酶。O 3. 1. 14. 1 酵母核糖核酸酶。#3. 1. 15.-產(chǎn)生5'-磷酸單酯的可作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的核酸外切酶。〇 3. 1. 15. 1 毒液核酸外切酶(Venom exonuclease)。#3. 1. 16.-產(chǎn)生3'-磷酸單酯的可作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的核酸外切酶。〇 3. 1. 16. 1 脾臟核酸外切酶(Spleen exonuclease)?！?3. 1.21.-產(chǎn)生5'-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。〇3.1.21.1 脫氧核糖核酸酶I.〇3. 1. 21. 2 脫氧核糖核酸酶IV (噬菌體-TG)-誘導(dǎo)的)。〇3. 1. 21. 3 I型位點(diǎn)特異的脫氧核糖核酸酶。〇3. 1. 21. 4 II型位點(diǎn)特異的脫氧核糖核酸酶。〇3. 1. 21. 5 III型位點(diǎn)特異的脫氧核糖核酸酶。〇3.1.21.6 CC-嗜性脫氧核糖核酸內(nèi)切酶(CC-preferring endodeoxyribonuclease)。O 3. 1.21.7 脫氧核糖核酸酶V?！?3. 1. 22.-不產(chǎn)生5'-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。〇3.1.22.1 脫氧核糖核酸酶II。
O 3. 1.22.2 曲霉屬(Aspergillus)脫氧核糖核酸酶 K(1)。O 3. 1. 22. 3 轉(zhuǎn)向條目3. 1. 21. 7。O 3. 1.22.4 交換型連接脫氧核糖核酸內(nèi)切酶(Crossover junction endodeoxyribonuclease)。〇3. 1. 22. 5 脫氧核糖核酸酶X.· 3. 1. 25.-特異性用于改變的堿基的位點(diǎn)特異的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。〇3. 1. 25. 1 脫氧核糖核酸酶(嘧啶二聚體)。O 3. 1. 25. 2 轉(zhuǎn)向條目4. 2. 99. 18。^3.1. .-產(chǎn)生5'-磷酸單酯的核糖核酸內(nèi)切酶。O 3. 1. 26. 1 絨胞菌多聚腦磷脂核糖核酸酶(Wiysarum polycephalum ribonuclease)。〇3. 1. 26. 2 核糖核酸酶α。O 3. 1. 26. 3 核糖核酸酶 III。〇3. 1. 26. 4 核糖核酸酶H。〇3. 1. 26. 5 核糖核酸酶P。O 3. 1. 26. 6 核糖核酸酶 IV。〇3. 1. 26. 7 核糖核酸酶Ρ4。〇3. 1. 26. 8 核糖核酸酶Μ5。〇3. 1. 26. 9 核糖核酸酶(poly- (U)-特異的)。O 3. 1. 26. 10 核糖核酸酶 IX。〇3. 1. 26. 11 核糖核酸酶Z。· 3. 1. 27.-不產(chǎn)生5'-磷酸單酯的核糖核酸內(nèi)切酶。〇3.1.27.1 核糖核酸酶W2)。〇3. 1. 27. 2 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)核糖核酸酶。〇3. 1. 27. 3 核糖核酸酶 T (1)。〇3. 1. 27. 4 核糖核酸酶 U (2)。O 3. 1.27.5 胰核糖核酸酶。O 3. 1. 27. 6 腸桿菌屬核糖核酸酶(Enterobacterribonuclease)。〇3. 1. 27. 7 核糖核酸酶F。〇3. 1. 27. 8 核糖核酸酶V。〇3. 1. 27. 9 tRNA-內(nèi)含子核酸內(nèi)切酶。〇3. 1. 27. 10 rRNA 核酸內(nèi)切酶。#3. 1.30.-產(chǎn)生5'-磷酸單酯的可作用于核糖核酸或脫氧核糖核酸的核糖核酸內(nèi)切酶。〇3.1.30.1 曲霉屬核酸酶S(I)。〇 3. 1. 30. 2 粘質(zhì)沙雷氏菌核酸酶(Serratia marcescensnuclease)?！?3. 1. 31.-產(chǎn)生3'-磷酸單酯的可作用于核糖或脫氧核糖的核糖核酸內(nèi)切酶。3. 1. 31. 1 微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease)。所述酶最優(yōu)選地衍生自核酸外切酶，例如脫氧核糖核酸酶，其切斷核酸以形成個(gè)
18體核苷酸。脫氧核酸核酸外切酶的優(yōu)點(diǎn)在于它們可作用于單鏈和雙鏈DNA并且可從5’-3’ 或3’ -5’方向水解堿基。個(gè)體核苷酸是單個(gè)核苷酸。個(gè)體核苷酸是不與另一個(gè)核苷酸或核酸以任何鍵(例如磷酸二酯鍵)結(jié)合的核苷酸。磷酸二酯鍵包含結(jié)合在另一個(gè)核苷酸糖基團(tuán)上的核苷酸磷酸基團(tuán)之一。個(gè)體核苷酸一般是不與另一個(gè)核酸序列以任何方式結(jié)合的核苷酸，所述另一個(gè)核酸序列具有至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少200個(gè)、至少500個(gè)、至少1000個(gè)或至少5000個(gè)核苷酸。用于本發(fā)明的優(yōu)選的酶包括來自大腸桿菌的核酸外切酶I (SEQ IDNO :6)，來自大腸桿菌的核酸外切酶III (SEQ ID N0:52)。來自嗜熱棲熱菌的RecJ(SEQ ID NO :54)和噬菌體λ核酸外切酶(SEQ ID NO 56)以及它們的變體。SEQ ID NO :56的三個(gè)相同亞基相互作用以形成三聚體核酸外切酶。所述酶最優(yōu)選地基于來自大腸桿菌的核酸外切酶I (SEQ ID NO 6)。所述核酸處理酶優(yōu)選地衍生自包含SEQ ID NO =6,52,54和56所示序列中任一個(gè)或其變體的核酸外切酶。換言之，所述酶優(yōu)選地在如上文所述修飾其半胱氨酸前包含SEQ ID NO =6,52,54和56所示序列中任一個(gè)或其變體。SEQ ID NO =6,52,54或56的變體是具有與SEQ ID NO =6,52,54或56的氨基酸序列不同的氨基酸序列但是保持核酸處理能力的酶。所述變體處理核酸的能力可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來分析。例如，可如實(shí)施例中所描述的來測定變體處理核酸的能力。如實(shí)施例中所述，所述變體還必須保持其被表達(dá)的能力。 所述變體可包括有助于處理所述核酸并且/或者促進(jìn)其在高鹽濃度和/或室溫下的活性的修飾。所述酶可以是由生物體(例如由大腸桿菌)表達(dá)的天然存在的變體。變體還包括由重組技術(shù)產(chǎn)生的非天然存在的變體。在SEQ ID而6、52、討或56的氨基酸序列全長中， 基于氨基酸同一性，變體優(yōu)選地與所述序列有至少50%的同源性。更優(yōu)選地，基于氨基酸同一性，所述變體多肽與SEQ ID NO :6、52、討或56的氨基酸序列在全長上具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%的同源性。在200或更多(例如230、250、270、280或者更多)個(gè)連續(xù)氨基酸的片段上有至少80% (例如至少85%、90(%或95(%)的氨基酸同一性(“硬同源性 (hardhomology)，，)?？梢杂帽绢I(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定同源性。例如，UWGCG軟件包提供的BESTFIT 程序可以用于計(jì)算同源性(例如使用它的默認(rèn)設(shè)置)(Devereux et al (1984)Nucleic Acids Research 12,387-395) 例如，如 Altschul S. Ε. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) JMol Biol 215 :403-10 中所述，可以使用 PILEUP 和 BLAST 算法計(jì)算同源性或者對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)(例如鑒定等價(jià)殘基或?qū)?yīng)序列(一般使用它們的默認(rèn)設(shè)置))。進(jìn)行BLAST分析的軟件可以從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)公開獲得。所述算法涉及到首先鑒別高打分序列對(duì)(HSP)，所述鑒別步驟通過如下方式實(shí)現(xiàn)鑒別查詢序列中長度為W的短字，所述短字就是在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字做比較時(shí)，能匹配或者滿足一些正值閾值分值T的字。T是指鄰近字分值閾值(Altschul et al，見上文)。將這些初始鄰近字匹配作為種子啟動(dòng)檢索，以發(fā)現(xiàn)包含它們的HSP。在沿每條序列的兩個(gè)方向上進(jìn)行字匹配延伸，到達(dá)累積比對(duì)分值能夠增加的極限。在每個(gè)方向上的字匹配延伸停止的條件是 所述累積比對(duì)分值從其所達(dá)到的最大值下降X量；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)打分值殘基比對(duì)的累積，所述累積分值降到0或小于0 ；或者達(dá)到任何一個(gè)序列的端點(diǎn)。所述BLAST算法的參數(shù) W、T和X決定了比對(duì)的敏感度和速度。所述BLAST程序使用的默認(rèn)字長(W)為11，BL0SUM62 打分矩陣(見 Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) 比對(duì)⑶為50，期望(E)為10，M = 5，N = 4，并且是進(jìn)行雙鏈比較。所述BLAST算法可進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)分析；參見例如Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。所述 BLAST 算法提供的一種相似性的量度是最小和概率(P(N))，所述最小和概率表示兩個(gè)氨基酸序列之間隨機(jī)出現(xiàn)匹配的概率。例如，如果第一序列與第二序列比較中的最小和概率小于約1，優(yōu)選小于約0. 1，更優(yōu)選小于約0. 01，并且最優(yōu)選小于約0. 001，那么第一序列被認(rèn)為與第二序列相似。除了上文所描述的那些之外，還可以對(duì)SEQ ID NO :6、52、M或56的氨基酸序列做出氨基酸置換，例如，最多達(dá)1、2、3、4、5、10、20或30個(gè)置換?？筛鶕?jù)下表1做出保守性置換。表1-保守性置換在第二列同一格，優(yōu)選在第三列同一行中的氨基酸可相互置換。
權(quán)利要求
1.一種包含核酸結(jié)合蛋白和表面的構(gòu)建體，其中從所述結(jié)合蛋白質(zhì)上除去至少一個(gè)天然可及的半胱氨酸殘基，其中所述結(jié)合蛋白通過一個(gè)或多個(gè)可及半胱氨酸殘基連接在所述表面上，并且其中所述結(jié)合蛋白保持其結(jié)合核酸的能力。
2.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其中從所述結(jié)合蛋白上除去所有天然可及的半胱氨酸，并且將一個(gè)或多個(gè)非天然可及半胱氨酸殘基弓I入所述結(jié)合蛋白。
3.權(quán)利要求2的構(gòu)建體，其中通過置換引入所述非天然可及半胱氨酸殘基。
4.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其中所述結(jié)合蛋白保留一個(gè)或多個(gè)可及半的胱氨酸殘基，除去其他可及的半胱氨酸殘基。
5.權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中通過置換除去所述天然半胱氨酸殘基。
6.權(quán)利要求5的構(gòu)建體，其中所述天然半胱氨酸殘基被蘇氨酸置換。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述可及的半胱氨酸能夠與巰基特定基團(tuán)反應(yīng)。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述核酸結(jié)合蛋白是核酸處理酶并且保持其處理核酸的能力。
9.權(quán)利要求8的構(gòu)建體，其中所述核酸處理酶衍生自核酸酶。
10.權(quán)利要求9的構(gòu)建體，其中所述核酸酶是以下酶分類(EC)組中任一組的成員 3. 1. 11,3. 1. 13,3. 1. 14,3. 1. 15,3. 1. 16,3. 1. 21,3. 1. 22,3. 1. 25,3. 1. 26,3. 1. 27,3. 1. 30 和 3. 1. 31。
11.權(quán)利要求10的構(gòu)建體，其中所述核酸處理酶衍生自核酸外切酶。
12.權(quán)利要求11的構(gòu)建體，其中所述核酸外切酶包含SEQID NO =6,52,54和56中任一個(gè)所顯示的序列或者其變體。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述核酸結(jié)合蛋白包含SEQID NO :8,10, 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48 和 50 中任一個(gè)所顯示的序列或其變體。
14.權(quán)利要求8的構(gòu)建體，其中所述核酸處理酶衍生自聚合酶、解旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶。
15.權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中(a)所述聚合酶是酶分類(EC)組2. 7. 7. 6,2. 7. 7. 7,2. 7. 7. 19,2. 7. 7. 48 和 2. 7. 7. 49 中任一組的成員；(b)所述解旋酶是酶分類(EC)組3.6. 1.-和2. 7. 7.-中任一組的成員；或者(c)所述拓?fù)洚悩?gòu)酶是酶分類(EC)組5.99. 1. 2和5. 99. 1. 3中任一組的成員。
16.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述聚合酶是DNA依賴的DNA聚合酶、RNA依賴的DNA 聚合酶、DNA依賴的RNA聚合酶或RNA依賴的RNA聚合酶。
17.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述解旋酶是ATP依賴的DNA解旋酶、ATP依賴的RNA 解旋酶或不依賴ATP的RNA解旋酶。
18.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述拓?fù)洚悩?gòu)酶是促旋酶。
19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述表面是跨膜蛋白質(zhì)孔或其亞基。
20.權(quán)利要求19的構(gòu)建體，其中所述跨膜蛋白質(zhì)孔是α-溶血素(a-HL)。
21.權(quán)利要求20的構(gòu)建體，其中所述表面包含SEQID NO :2所示的序列或其變體。
22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述酶通過一個(gè)或多個(gè)連接體連接于所述表面。
23.權(quán)利要求22的構(gòu)建體，其中所述一個(gè)或多個(gè)連接體是核酸雜交連接體。
24.—種用于測序核酸的修飾孔，包含至少一個(gè)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)的構(gòu)建體。
25.權(quán)利要求M的孔，其中所述孔包含權(quán)利要求21的構(gòu)建體和6個(gè)亞基，所述亞基包含SEQ ID NO 2所示的序列或其變體。
26.權(quán)利要求25的孔，其中所有7個(gè)亞基都在SEQID NO 2的位置139處具有谷氨酰胺，并且所述亞基之一在SEQ ID NO 2的位置135處具有半胱氨酸。
27.權(quán)利要求沈的孔，其中所有7個(gè)亞基都在SEQID NO :2的位置113處具有精氨酸。
28.權(quán)利要求M至27中任一項(xiàng)的孔，其中所述孔包含分子銜接體，其有利于所述孔與一個(gè)或多個(gè)核苷酸之間的相互作用。
29.權(quán)利要求觀的孔，其中所述分子銜接體是環(huán)糊精或其衍生物。
30.權(quán)利要求四的孔，其中所述環(huán)糊精是七-6-氨基-β-環(huán)糊精(3!117-0^)、6-單脫氧-6-單氨基-β -環(huán)糊精(_廠β⑶)或七-(6-脫氧-6-胍基)-環(huán)糊精(gu7- β⑶)。
31.一種用于生產(chǎn)用于測序核酸的修飾孔的試劑盒，包括(a)至少一種權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)的構(gòu)建體；和(b)形成孔所需的其他亞基。
32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述試劑盒包含(a)權(quán)利要求20的構(gòu)建體；和(b)各自均包含SEQID NO 2所示的序列或其變體的6個(gè)亞基。
33.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的構(gòu)建體的方法，包括(a)使包含一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸殘基的核酸結(jié)合蛋白通過所述半胱氨酸殘基連接于表面；并且(b)確定所得到的構(gòu)建體是否能夠結(jié)合核酸。
34.權(quán)利要求33的方法，還包括在步驟(a)前(i)從所述結(jié)合蛋白上除去所有天然可及的半胱氨酸殘基并且向所述結(jié)合蛋白中引入一個(gè)或多個(gè)非天然可及半胱氨酸殘基；或者( )使所述結(jié)合蛋白上保留一個(gè)或多個(gè)天然可及的半胱氨酸殘基，除去其他天然可及的半胱氨酸殘基。
35.一種生產(chǎn)權(quán)利要求M的修飾孔的方法，包括(a)使得至少一種權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)的構(gòu)建體與其他合適的亞基形成孔；并且(b)檢測所得到的孔是否能夠結(jié)合核酸并且檢測核苷酸。
36.一種測序靶核酸序列的方法，包括(a)使所述靶序列與權(quán)利要求M的孔接觸，所述孔包含核酸外切酶，從而使得所述核酸外切酶從所述靶序列的一端消化單個(gè)核苷酸；(b)使所述核苷酸與所述孔接觸以使得所述核苷酸與所述銜接體相互作用；(c)測量所述相互作用過程中通過所述孔的電流，并從而確定所述核苷酸的種類；并且(d)在所述靶序列的相同末端重復(fù)步驟(a)至(c)，并從而確定所述靶序列的序列。
37.一種測序靶核酸序列的方法，包括(a)使所述靶序列與權(quán)利要求M的孔接觸，從而使得所述酶將所述靶序列推過或拉過所述孔，并且所述靶序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；并且(b)檢測每次所述相互作用過程中通過所述孔的電流，并從而確定所述靶序列的序列；
38.一種包含 SEQ ID NO :8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、 42、44、46、48和50中任一個(gè)所顯示的序列或其變體的核酸外切酶。
39.一種編碼權(quán)利要求38的核酸外切酶的多核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含核酸結(jié)合蛋白和表面的構(gòu)建體。將至少一個(gè)天然可及的半胱氨酸從所述結(jié)合蛋白質(zhì)上去除。所述結(jié)合蛋白通過一個(gè)或多個(gè)可及的半胱氨酸連接于所述表面。從所述蛋白質(zhì)上去除其他可及的半胱氨酸使得可控制對(duì)所述表面的連接。所述構(gòu)建體可被用于生成其上連接有核酸結(jié)合蛋白的跨膜孔。這樣的孔尤其可用于測序核酸。所述酶以這樣的方式操作核酸，所述方式即使得所述孔能夠通過隨機(jī)傳感檢測所述核酸的每個(gè)組成核苷酸。
文檔編號(hào)C12N9/12GK102482330SQ201080014556
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月30日
發(fā)明者B·麥克基翁, J·懷特, J·米爾頓, L·賈雅辛格, R·莫伊希, 邁克爾·納格斯 申請(qǐng)人:牛津納米孔技術(shù)有限公司