專(zhuān)利名稱(chēng)：使用綴合的生物聚合物表面對(duì)抗原特異性記憶b細(xì)胞的分離的制作方法
使用綴合的生物聚合物表面對(duì)抗原特異性記憶B細(xì)胞的分
離
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背景技術(shù)：
病毒(例如痘病毒、絲狀病毒)作為生物武器的潛在應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注，特別是對(duì)于目前尚無(wú)有效對(duì)策的人類(lèi)疾病。治療性抗體的施用是對(duì)暴露于或感染對(duì)軍事和反生物恐怖工作具有意義的病毒疾病物質(zhì)的個(gè)體進(jìn)行治療和/或預(yù)防的合適策略。目前，痘苗病毒(vaccina virus, VACV)免疫球蛋白(vaccinia virus immune globulin，VIG)(人血液來(lái)源的多克隆Ig產(chǎn)品)是治療由不良天花接種事件引起的播散性VACV感染的“首選” 療法。另外，交叉反應(yīng)性mAb制劑可以用作由其它致病性正痘病毒(如猴痘病毒和天花病毒(天花的病原體))所引起感染的治療劑或預(yù)防劑，從而減輕使用這些病毒劑的生物恐怖的威脅。在VACV基因組中所含的約200個(gè)基因中，僅有少量基因編碼已知引起中和抗體應(yīng)答的蛋白質(zhì)，包括H3、A17、A27、D8、Ll和B51。第七基因A33R編碼引起非中和性抗體應(yīng)答但仍是保護(hù)性的蛋白質(zhì)?；跉v史和初步數(shù)據(jù)，在動(dòng)物模型中顯示出保護(hù)效力的VACV抗原特異性mAb的組合將有可能對(duì)人疾病的治療有效。用于鑒定針對(duì)A33R、B5R和LlR的Fab 的一個(gè)方法是PC0MB3噬菌體展示系統(tǒng)(Scripps Institute)。該方法可能存在問(wèn)題，例如， 由于低文庫(kù)大小/多樣性、低效率克隆以及與第一代PC0MB3系統(tǒng)有關(guān)的穩(wěn)定性問(wèn)題。隨著2003年對(duì)阿達(dá)木單抗(Humira)的批準(zhǔn)，工業(yè)界看到了從嵌合到人源化再到完全人序列的新型抗體治療的全面變化。工業(yè)界的目標(biāo)是生產(chǎn)與人體中所產(chǎn)生的抗體相同的藥物。目前可用的方法具有多種問(wèn)題，例如，發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)基于抗體之藥物的成本較高，以及在速度、穩(wěn)定性、保真度、法規(guī)順應(yīng)性和產(chǎn)品表達(dá)方面的困難。如單克隆抗體的免疫治療劑已證明是挽救生命的醫(yī)用產(chǎn)品并且是診斷和研究工具的重要試劑。在本領(lǐng)域中，仍需要用于鑒定和生產(chǎn)具有所需特異性的完全人源化單克隆抗體的改進(jìn)的方法和設(shè)備。由于將利用人B細(xì)胞，因此本發(fā)明特別適合于該任務(wù)。這些細(xì)胞獨(dú)特地被設(shè)計(jì)用于表達(dá)和分泌抗體。來(lái)源于人B細(xì)胞的細(xì)胞系的遺傳學(xué)、生物化學(xué)以及細(xì)胞器組成將精確地并且忠實(shí)地產(chǎn)生大多數(shù)可能的人治療性分子。本發(fā)明還提供了用于提取(isolation)抗原特異性記憶B細(xì)胞的設(shè)備。該設(shè)備可用于發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)新一代免疫治療齊U，以滿(mǎn)足如傳染病學(xué)、腫瘤學(xué)、公共衛(wèi)生和生物防御等領(lǐng)域中的重大需求。

發(fā)明內(nèi)容
可利用提取的抗原特異性克隆來(lái)鑒定和生產(chǎn)高效人治療性單克隆抗體，所述抗原特異性克隆通過(guò)使用在綴合了抗原的生物聚合物表面上差異性粘附介導(dǎo)的細(xì)胞分離來(lái)源于人供體的循環(huán)中記憶B細(xì)胞池。使用間接親合磁珠法，可以從接種疫苗的供體人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood m ononuclear cell, PBMC)中提取外源(病毒)抗原特異性記憶B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)免疫細(xì)胞的受體與配體之間的相互作用分離所述免疫細(xì)胞的設(shè)備。通常，所述配體固定于設(shè)備的功能化表面上，并且該設(shè)備適于使免疫細(xì)胞流動(dòng)通過(guò)功能化表面?？梢允褂萌魏晤?lèi)型的配體，例如，與免疫細(xì)胞上存在的受體結(jié)合的配體。適合的實(shí)例包括(但不限于)免疫細(xì)胞特異性的抗原。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的設(shè)備可以是流通池和/或微流體設(shè)備。本發(fā)明的設(shè)備可以用于提取任何類(lèi)型的免疫細(xì)胞，例如，中性粒細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、 嗜堿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和/或單核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明設(shè)備提取的細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞，例如B細(xì)胞、T細(xì)胞和/或自然殺傷細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，提取的細(xì)胞可以是B細(xì)胞。在免疫細(xì)胞表面上表達(dá)的任何受體可用于通過(guò)與功能化表面上的受體所結(jié)合的一種或多種配體相連接來(lái)提取細(xì)胞。適合的受體包括B細(xì)胞受體，其適合的配體包括(但不限于)具有B細(xì)胞表位的抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞受體可以是T細(xì)胞受體，其適合的配體包括(但不限于)具有T細(xì)胞表位的抗原。本領(lǐng)域已知的任何適合的方法可用于對(duì)在其上提取免疫細(xì)胞的設(shè)備表面進(jìn)行功能化。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)在表面上沉積聚合物使該表面功能化。在沉積前后，可以將一種或多種配體與聚合物綴合。本發(fā)明提供了通過(guò)將包含免疫細(xì)胞的溶液與本發(fā)明設(shè)備相接觸來(lái)提取免疫細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可包括在功能化表面上捕獲(即固定)免疫細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)活化來(lái)使得這些免疫細(xì)胞增殖。此活化可導(dǎo)致形成免疫細(xì)胞集落。在一些方法中，從設(shè)備中回收有活力的經(jīng)活化增殖中免疫細(xì)胞集落。可使用本領(lǐng)域已知的任何方法回收集落，例如，可以通過(guò)從聚合物上釋放配體回收集落和/或可以機(jī)械性移除(例如吸取)集落。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于通過(guò)間接親合磁珠法從來(lái)源于接種疫苗供體的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中分離病毒抗原特異性記憶B細(xì)胞。本發(fā)明的材料和方法可包括綴合了抗原的生物聚合物表面，其可用于通過(guò)差異性滾動(dòng)粘附介導(dǎo)抗原特異性B細(xì)胞分離。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抗原特異性B細(xì)胞分離的綴合了抗原的生物聚合物表面。在用B細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，使用綴合了抗體的微球進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)表面梯度、 剪切速率和流通池設(shè)計(jì)。在一些實(shí)施方案中，可以原位活化使用本發(fā)明提取的B細(xì)胞以用于克隆提取 (clone isolation)。例如，可以原位活化生物聚合物表面捕獲的抗原特異性B細(xì)胞以用于克隆提取。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于提取抗原特異性B細(xì)胞，然后可以在生物聚合物表面上將其活化，誘導(dǎo)分化為抗體分泌細(xì)胞(antibody secreting cell, ASC)并誘導(dǎo)擴(kuò)增和形成集落?？梢詮纳锞酆衔锉砻嫔咸崛』罨目乖禺愋杂洃汢細(xì)胞集落以產(chǎn)生 IgG分泌細(xì)胞系。因此，本發(fā)明提供了可以用于提取、擴(kuò)增和表征來(lái)源于經(jīng)活化抗原特異性 B細(xì)胞集落的IgG表達(dá)細(xì)胞系以及產(chǎn)生克隆抗體分泌細(xì)胞系的材料和方法。


圖 1 是 pcdna3. lzeo:VACV_B5R、pcdna3. lzeo:VACV_A33R 和 pcdna3. lzeo:VACV_ LlR的質(zhì)粒圖。圖2A和2B是循環(huán) 中VACV特異性抗體和B細(xì)胞的抗體效價(jià)圖。圖3顯示了來(lái)自Dryvax (LB, DS)或ACAM2000 (AM)接種供體的人血清樣品對(duì)于具有免疫相關(guān)性的重組表達(dá)VACV蛋白的ELISA測(cè)定結(jié)果。圖4顯示了以1 1(上圖)或1 5 (下圖)的載體插入物比例的IOXL-Iblue/ pC0MB:HC+LCK文庫(kù)克隆中克隆的人LC KcDNA插入物存在性的PCR集落分析結(jié)果。圖5顯示了對(duì)Ll和MBP不同輪次淘選的噬菌體ELISA結(jié)果。圖6是顯示輕鏈和重鏈盒的兩種可能取向的瓊脂糖凝膠圖照片以及 pcDNA Δ dhfr VL VH 質(zhì)粒圖。圖7顯示了放射性標(biāo)記的VACV蛋白與VACV免疫人血清或與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的全長(zhǎng)人HlAb的免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。圖8顯示了單克隆抗體對(duì)BALB/c小鼠的保護(hù)。圖9顯示了用2 X IO6或2 X IO5PFU痘苗病毒IHD-J株進(jìn)行i/n攻擊后的體重變化。顯示了每個(gè)處理組的平均體重(η = 5)。圖10顯示了 12個(gè)區(qū)的微流體表面設(shè)計(jì)。每個(gè)區(qū)可包含矩形金電極以允許對(duì)功能化綴合的殼聚糖混合物進(jìn)行位點(diǎn)特異性尋址。圖11顯示了微流體流動(dòng)室的設(shè)計(jì)，其詳細(xì)地示出了用于生物功能化表面電沉積的電極位置以及流路。圖12顯示了綴合抗原介導(dǎo)的記憶B細(xì)胞分離和可溶性配體活化策略的示意圖。圖13顯示了來(lái)自PBMC解凍物的FACS數(shù)據(jù)(左圖為僅PBS而右圖為PBS加PI)。圖14顯示了具有多個(gè)N和C末端標(biāo)簽的VACV Ll變體。圖15顯示了下列項(xiàng)的瓊脂糖凝膠(A) LlR胞外域的PCR產(chǎn)物和(B) LlR的六個(gè)末端標(biāo)簽變體的PCR產(chǎn)物。圖16顯示了 Hind III和Not I限制性酶切哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒 pcdna3. 1+zeo: intA:VACVsLlR+His#l 的瓊脂糖凝膠。圖17顯示了含六個(gè)Ll末端標(biāo)簽變體的Hind III和Not I限制性酶切哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠。圖18顯示了瞬時(shí)表達(dá)的純化的Ll變體的SDS-PAGE凝膠。圖19顯示了瞬時(shí)表達(dá)的純化的Ll變體的ELISA分析結(jié)果。
具體實(shí)施方案本發(fā)明人已開(kāi)發(fā)出了用于預(yù)防性和治療性治療人病原性正痘病毒感染的單克隆抗體混合物。這些感染可來(lái)源于不良疫苗接種事件(例如痘苗病毒(VACV)感染)或暴露于其它正痘病毒(如作為天花病原體的天花病毒(variola virus, VARV)或猴痘病毒 (monkeypox virus, MPXV)。在生物恐怖和生物戰(zhàn)威脅以及公共衛(wèi)生問(wèn)題的背景下，這些適應(yīng)癥的有效治療劑的開(kāi)發(fā)滿(mǎn)足了重大而未獲滿(mǎn)足的醫(yī)學(xué)和國(guó)家安全的需求。工作集中在發(fā)現(xiàn)對(duì)VACV B5R、A33R和LlR蛋白(其已知能夠引起中和應(yīng)答)具有特異性的mAb克隆上。在pcdna3. Izeo質(zhì)粒背景中改造得到具有這些VACV基因的質(zhì)粒以用于產(chǎn)生表達(dá)這些錨定在細(xì)胞表面上的蛋白的NSO和293T/17細(xì)胞系(圖1)。另外，構(gòu)建了編碼下列VACV蛋白的帶HIS標(biāo)簽的可溶性版本的表達(dá)載體A27L、D8L、A33R、B5L、A17L、 A4L、A10L、H3L、F13L和L1R。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用其它抗原，例如中和抗體所識(shí)別的抗原。制備了 VACV株WR感染的Vero細(xì)胞的TRIzol提取物，以用于總RNA提取和cDNA合成。 這些cDNA用于擴(kuò)增如上所述的所有10個(gè)病毒基因。改造得到每個(gè)基因的可溶性版本，以?xún)H包含帶有聚組氨酸標(biāo)簽的胞外域并且由VACV B5信號(hào)肽序列所驅(qū)動(dòng)。在 CHO-S 和 293-F FreeStyle 細(xì)胞(Invitrogen)中嘗試了 VACV 蛋白 A33、B5 和Ll的帶HIS標(biāo)簽可溶性版本的表達(dá)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且使之在生長(zhǎng)條件下繼續(xù)生長(zhǎng)96小時(shí)。對(duì)于初始純化來(lái)說(shuō)，將上清液上樣到平衡過(guò)的HIS Spin柱(Sigma) 上，清洗，然后用IOOmL含有咪唑的緩沖鹽水緩沖液洗脫。如圖3所示，CHO-S和293-F細(xì)胞均表達(dá)SB5-HIS和s-Ll-HIS，但兩個(gè)細(xì)胞系表達(dá)的sA33_HIS的水平均不顯著。sB5_HIS 和s-Ll-HIS的產(chǎn)量在0. 5至34μ g/mL上清液的范圍內(nèi)。因此，我們使用CHO-S和/或 293-F細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生SB5-HIS和sLl_HIS，使用在含血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的293T/17細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生 sA33-HIS。圖 1 顯示了 pcdna3. lzeo:VACV_B5R、pcdna3. lzeo:VACV_A33R 禾口 pcdna3. lzeo:VACV_LlR的質(zhì)粒圖。將包含大部分pCMV啟動(dòng)子的NheI-NotI片段(包含內(nèi)含子A)和VACV A33R、B5R或LlR的完整開(kāi)放讀碼框克隆到由相同核酸內(nèi)切酶酶切的 pcdna3. Izeo質(zhì)粒片段中。將所得構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)染293T/17細(xì)胞以確認(rèn)表達(dá)，隨后產(chǎn)生在細(xì)胞表面上表達(dá)這些病毒基因的穩(wěn)定系。用由VACV免疫的人供體的外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocate，PBL) 所產(chǎn)生的cDNA構(gòu)建人Fab噬菌體文庫(kù)。在與體液免疫應(yīng)答峰值有關(guān)的疫苗接種后的第18 天從經(jīng)過(guò)加強(qiáng)免疫的供體中提取PBL(參見(jiàn)圖2)。用經(jīng)許可的紐約衛(wèi)生局(New York Board of Health) VACV疫苗對(duì)VACV免疫志愿者進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在接種疫苗后的多個(gè)時(shí)間，通過(guò) ELISA測(cè)量循環(huán)抗VACV IgG。用埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrn virus)轉(zhuǎn)化B細(xì)胞并將有限稀釋液加入到96孔板中。通過(guò)對(duì)含有細(xì)胞克隆的孔進(jìn)行ELISA，評(píng)價(jià)了循環(huán)中B細(xì)胞分泌抗VACV抗體的頻率。在從供體DS構(gòu)建第一人Fab噬菌體展示文庫(kù)期間，平行地進(jìn)行了重組VACV蛋白靶標(biāo)的表達(dá)和純化。對(duì)于這些試劑的可用性，確定了來(lái)自供體DS的血清對(duì)VACV Ll的反應(yīng)性(重要的特異性)較差。用ACAM2000 (Acambis)對(duì)第二供體AM進(jìn)行疫苗接種，并提取了 PBL0通過(guò)ELISA分析了來(lái)自?xún)蓚€(gè)供體的血清對(duì)一系列重組VACV蛋白靶標(biāo)的反應(yīng)性。如下圖3所示，所有血清和陽(yáng)性對(duì)照(抗HIS mAb)對(duì)sH3-HIS蛋白的反應(yīng)性均較差。目前，尚不了解缺少顯著反應(yīng)性的原因。有一種可能是盡管純化并定量了蛋白，但是該蛋白是錯(cuò)誤折疊的并且是非反應(yīng)性的。相反，用抗HIS陽(yáng)性對(duì)照mAb明確地建立了對(duì)所有其它蛋白的反應(yīng)性。另外，如所預(yù)期的，7D11僅與sLl-HIS反應(yīng)，而10F10僅與sA33_HIS反應(yīng)。來(lái)自供體AM的血清對(duì)所有抗原均表現(xiàn)出最佳反應(yīng)性，隨后從該供體PBL提取的RNA用于人Fab文庫(kù)的構(gòu)建。由于在之前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以1 100的稀釋度使用時(shí)DS供體血清的反應(yīng)性較差，因此在VACVsLlR-HIS板上，以1 10的稀釋度使用來(lái)自供體“DS sera post”的血清。使用來(lái)源于供體AM的PBMC，用pC0MB3系統(tǒng)(Scripps Institute)產(chǎn)生了 κ和XFab噬菌體展示文庫(kù)2。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行TRIzol (Invitrogen)處理以提取總RNA。使用 RT-PCR(Invitrogen，superscript III)將 TRIzol 制備物用于產(chǎn)生來(lái)源于 mRNA 的 cDNA 文庫(kù)。將所得的cDNA文庫(kù)用作模板以使用廣泛覆蓋的引物組來(lái)通過(guò)PCR擴(kuò)增可變重鏈(VH) 和輕鏈(VLk和VLX)區(qū)。為了在開(kāi)始大規(guī)模轉(zhuǎn)化前優(yōu)化VL κ小規(guī)模連接進(jìn)pC0MB3:VH的效率，匯集來(lái)自9個(gè)獨(dú)立VL κ cDNA特異性物質(zhì)的PCR產(chǎn)物，然后用SacI和XbaI酶切。將所得片段克隆到含有人VH的類(lèi)似酶切的噬粒載體pC0MB3(表示為pC0MB3:VH)中。為了確定文庫(kù)大小和小規(guī)模轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)行了測(cè)試連接，然后電穿孔到電感受態(tài)大腸桿菌(E. coli) XL-IBlue細(xì)胞(Stratagene)中。為了確定pC0MB3 VH載體與VL κ插入物之間的最優(yōu)比值， 使用250ng載體以下列載體插入物比例(1)1 1、⑵1 5、(3)1 10和(4)1 15 進(jìn)行了四次轉(zhuǎn)化。表1列出了每次轉(zhuǎn)化的效價(jià)計(jì)算和所得的文庫(kù)大小。表1.PC0MB3:VH+VLk小規(guī)模文庫(kù)效價(jià)計(jì)算
權(quán)利要求
1.用于通過(guò)免疫細(xì)胞受體與配體的相互作用分離所述免疫細(xì)胞的設(shè)備，其中所述配體固定在所述設(shè)備的功能化表面上并且所述設(shè)備適于使所述免疫細(xì)胞流動(dòng)通過(guò)所述功能化表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述設(shè)備是流通池或微流體設(shè)備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述免疫細(xì)胞是B細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述免疫細(xì)胞受體是B細(xì)胞受體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述配體是具有B細(xì)胞表位的抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述免疫細(xì)胞是T細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述免疫細(xì)胞受體是T細(xì)胞受體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述配體是具有T細(xì)胞表位的抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述功能化表面是與所述配體綴合的聚合物。
10.用于提取免疫細(xì)胞的方法，其包括將包含所述免疫細(xì)胞的溶液與根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備相接觸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫細(xì)胞被捕獲在所述功能化表面上，并且通過(guò)誘導(dǎo)活化使其增殖。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中從所述設(shè)備回收有活力的經(jīng)活化且增殖中的免疫細(xì)胞集落。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)從所述聚合物上釋放所述配體來(lái)回收集落。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中機(jī)械性移除所述集落。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于提取免疫細(xì)胞的材料和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于提取和分離抗原特異性記憶B細(xì)胞的設(shè)備。通過(guò)使細(xì)胞沿綴合了配體的生物聚合物表面流過(guò)來(lái)分離免疫細(xì)胞。配體可沿生物聚合物表面的z軸以濃度梯度分布。展示出對(duì)生物聚合物上配體具有特異性的受體的細(xì)胞將與所述配體相互作用并且以白細(xì)胞滾動(dòng)的方式沿所述表面滾動(dòng)。附加的粘附相互作用將導(dǎo)致差異性細(xì)胞分離以及最終固定化。
文檔編號(hào)C12M1/00GK102439127SQ201080015280
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日
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