專利名稱：新型除草劑抗性基因的制作方法
新型除草劑抗性基因
背景技術(shù)：
目前有許多類型用于控制雜草的除草劑。一種非常流行的除草劑是草甘膦。已經(jīng)開發(fā)了抗草甘膦的農(nóng)作物，例如玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、小麥、草皮(turf)和稻。所以，例如，可以對活躍生長有草甘膦抗性大豆的田地進行噴灑來控制雜草，而不會顯著破壞大豆植株。90年代中期，利用引入遺傳工程化的草甘膦耐受的農(nóng)作物(GTC)，農(nóng)業(yè)上種植者能夠利用簡單、便利、靈活、廉價的工具來前所未有地控制廣譜的闊葉雜草和草本雜草。隨后，生產(chǎn)者很快采用了 GTC，并在許多情況下放棄了許多已經(jīng)接受的最好的農(nóng)藝學(xué)實踐， 例如輪作、輪作操作的除草劑模式(herbicide mode of action rotation)、罐混(tank mixing)、機械控制雜草與化學(xué)和培養(yǎng)控制雜草的結(jié)合。目前在美國和其他地區(qū)可商購草甘膦耐受的大豆、棉花、玉米和油菜。紫花苜蓿是引入的第一個多年生GTC，增加了在數(shù)年時間內(nèi)對同樣的作物和土地重復(fù)使用草甘膦的機會。更多的GTC(例如小麥、稻、甜菜、草皮等)已準(zhǔn)備好介入未決的全球市場占有率。許多其他的草甘膦抗性物種在實驗至開發(fā)的階段(例如甘蔗、向日葵、 甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、西紅柿和煙草；像楊樹和楓香樹(sweetgum)這樣的林業(yè)物種；和像金盞花、矮牽牛和秋海棠這樣的園藝物種；參見“isb. vt. edu/cfdocs/ fieldtestsl.Cfm，2005”網(wǎng)站)。另外，最近這些年草甘膦的費用急劇降低，以至于常規(guī)的除草程序很少能有效地與草甘膦GTC系統(tǒng)在價格和性能上面競爭了。在栽培者面對草甘膦抗性的雜草或變化為更加難控制的雜草物種時，可以通過罐混或與可控制遺漏雜草的其他除草劑交替使用來彌補草甘膦的缺點。在許多情況下控制闊葉的其他雜草的一個慣用罐混物(tankmix)參與者是2，4-二氯苯氧基乙酸Q，4_D)。2， 4-D已經(jīng)在農(nóng)藝上應(yīng)用并在非作物情況下用于廣譜的闊葉雜草控制達60年。雖然已經(jīng)報道了許多的耐受物種的個別例子，但是2，4-D仍然是最廣泛使用的除草劑之一。2，4-D的進一步應(yīng)用的一個限制是其對于雙子葉作物例如大豆或棉花的選擇性非常差，所以2，4-D通常不用于(而且一般不靠近)敏感的雙子葉作物。此外，由于可能發(fā)生的對禾本科作物造成傷害的這種性質(zhì)，從某種程度上限制了 2，4-D的應(yīng)用。2，4-D聯(lián)合草甘膦已經(jīng)用于在種植免耕法大豆和棉花之前提供更加穩(wěn)健的除草處理；但是，由于這些雙子葉物種對2，4-D的敏感性，這些除草處理必須在種植之前至少14-30天進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供對諸如2，4_D等植物生長素類除草劑有抵抗力的新型植物。在本發(fā)明一些發(fā)明中，此處公開的植物還對其他除草劑有抵抗力。在本發(fā)明的這些方面，也可向植物引入異源的草甘膦_、ALS-(咪唑啉酮、磺酰脲)、芳氧基鏈烷酸酯_、HPPD-、PPO-和/或草銨膦抗性基因，以提供對多種除草劑的耐受性。本發(fā)明的多個其他方面提供編碼能夠用于失活植物生長素類除草劑的甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸和多肽序列。序列簡要說明
SEQ ID NO 1是編碼甲基轉(zhuǎn)移酶Pt JBMT3的核酸序列。SEQ ID NO :2是SEQ ID NO 1編碼的翻譯蛋白質(zhì)序列。表格簡要說明表1 示例性可商購植物生長素類除草劑。表2 用植物生長素類除草劑進行的PtJBMT和PtJBMTm3相對活性檢測。表3:氨基酸取代表。


圖1 :PtJBMTm3對底物的示例性甲基化。圖2 示例性植物生長素類除草劑和PtJBMTm3對除草劑底物的相對活性(相對于對底物2，4-D的ptJBMTm3活性)。圖3 :PtJBMTm3的序列(SEQ ID NO :1)?；钚晕稽c殘基用黑體并雙下劃線表示。圖4 :PtJBMTm3的其他可能除草劑底物。圖5 :W0/2009/046090中公開的示例性植物生長素類除草劑。該結(jié)構(gòu)包括的多種取代基和化合物如下A)A代表N或C ;R1代表C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C4烷硫烷基、C2-C4烯基、 C2-C4鹵代烯基、C2-C4烷氧基烯基、C2-C4烷硫基烯基(thioalkylalkenyl)、C2-C4炔基或C2-C4 鹵代炔基、甲?；2-C4烷基羰基、C2-C4鹵代烷基羰基；R2代表C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C2-C6烯基、C2-C6鹵代烯基或其中
Z1 W1代表H或鹵素；
Y
W1
X1
X1代表H、鹵素、硝基、氰基、甲酰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C6烷基羰基、C1-C6烷基硫、C1-C6烷基亞磺酰基、C1-C6烷基磺?；2-C4烯氧基、C2-C4炔氧基、C2-C4烯硫基、C2-C4炔硫基、C1-C6商代烷基、C2-C6商代烯基、 C2-C6鹵代炔基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C4鹵代烷氧基烷基、C2-C6鹵代烷基羰基、C1-C6鹵代烷硫基、C1-C6鹵代烷基亞磺?；1-C6鹵代烷基磺?；3-C6三烷基甲硅烷基、C2-C4鹵代烯氧基、C2-C4鹵代炔氧基、C2-C4鹵代烯硫基、C2-C4鹵代炔硫基、-C (O)OR7、-C (O)M6R7、-C&N0 R7、-NR6R7、-NR6OR7、-NR6SO2R7, -NR6C (0) R7、-NR6C (0) OR7、-NR6C (0) NR6R7 或-NCIi6M6R7 ；
Y1代表H、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6 烯基或C2-C6鹵代烯基，或者，當(dāng)&和Y1 —起時代表-O(CH2)nCH2-或-O(CH2)nO-其中η = 1 或2 ；且
6
乙代表H或鹵素；R3和R4獨立地表示Hj1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、羥基、C1-C6烷氧基、氨基-C1-C6酰基、C1-C6烷氧羰基(carboalkoxy)、C1-C6烷基氨甲?；1-C6烷基磺?；?、C1-C6三烷基甲硅烷基或C1-C6 二烷基膦?；蛘呙窈蚏4與N —起表示5-或6-元飽和環(huán)；且&代表H或鹵素； 胺；D)如A或B或C所述的化合物，其中隊為C1-C2烷基、C1-C2鹵代烷基、C2-C3烯基或C2-C3鹵代烯基；
E)如D所述的化合物，其中R1為乙烯基；
F)如A、B、C、D或E中任一個所述的化合物，其中&為環(huán)丙基；
G)如A、B、C、D或E中任一個所述的化合物，其中&為
R6表示H、C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基；且 R7表示C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基； 和羧酸基團的可農(nóng)用衍生物；
B)如A)所述的化合物，其中民和R4獨立地代表H或C1-C6烷基；
C)如A或B所述的化合物，其中所述羧酸基團的可農(nóng)用衍生物為可農(nóng)用鹽、酯和酰
其中
W1代表H或鹵素
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物細胞，包括編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼所述蛋白質(zhì)，而且所述多核苷酸在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1或其完全互補物雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述多核苷酸的表達誘導(dǎo)所述細胞對植物生長素類除草劑抵抗或耐受。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述多核苷酸編碼SEQIDNO :2。
4.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述植物細胞進一步包括第二個異源基因， 以使得所述植物細胞對第二種除草劑耐受。
5.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述植物細胞為雙子葉細胞。
6.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述植物細胞為單子葉細胞。
7.—種轉(zhuǎn)基因植物，包括多個如權(quán)利要求1、2、3或4所述的細胞，其中所述多核苷酸的表達賦予所述植物對植物生長素類除草劑的耐受性。
8.—種控制雜草的方法，所述方法包括向包含植物和雜草的區(qū)域過度噴灑/施用包括植物生長素類除草劑的組合物，所述植物包括多個如權(quán)利要求1所述的植物細胞。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述植物為大豆、玉米、擬南芥、煙草、棉花、油菜、 稻、小麥、草皮、紫花苜蓿、三葉草、牧場草、水果植物、蔬菜或觀賞性植物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述植物進一步包括草甘膦抗性基因，而且所述方法進一步包括向所述植物和所述雜草施用草甘膦。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，所述植物進一步包括第三種除草劑抗性基因，而且所述方法進一步包括向所述植物和所述雜草施用第三種除草劑。
12.—種轉(zhuǎn)基因植物，包括編碼包括SEQ ID NO :2的甲基轉(zhuǎn)移酶的異源多核苷酸，所述轉(zhuǎn)基因植物對植物生長素類除草劑有抵抗力。
13.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進一步包括至少一種另外的除草劑抗性基因。
14.如權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物進一步包括昆蟲抗性基因，所述昆蟲抗性基因來自選自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、光桿狀菌屬 (Photorhabdus)禾口致病桿菌屬(Xenorhabdus)的有機體。
15.如權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物進一步包括農(nóng)藝學(xué)特征基因，所述農(nóng)藝學(xué)特征選自真菌抗性、脅迫耐受性、提高的產(chǎn)量、改善的油屬性、改善的纖維質(zhì)量、病毒抗性、延遲成熟、耐寒性和耐鹽性。
16.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物包括源自選自下組來源的生物殺蟲劑日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae)、球形芽孢桿菌(B. sphaericus)、 蘇云金芽孢桿菌aizawai亞禾中(B. thuringiensis subsp. Aizawai)、蘇云金芽孢桿菌 Kurstaki 亞禾中(B. thuringiensis subsp. Kurstaki)、蘇云金芽抱桿菌 Tenebrionis 亞禾中 (B. thuringiensis subsp. Tenebrionis)、 求 包白iBlif (Beauveria bassiana)、蘋果産娥顆粒體病毒(Cydia pomonella granulosis virus)、道格拉斯冷杉草叢蛾 NPV(Douglas fir tussock moth NPV)、舞毒蛾 NPV(gypsy moth NPV)、谷實夜蛾 NPV(Helicoverpa zea NPV)立(Indian meal moth granulosis virus) M^SM (Metarhizium anisopliae)、幢蟲微抱子蟲(Nosema locustae)、擬青霉(Paecilomyces. fumosoroseus) >淡紫擬青霉菌(p. Iilacinus)、發(fā)光桿菌(Photorhabdus luminescens)、甜菜夜蛾 NPV(Spodoptera exigua NPV)、胰蛋白酶調(diào)節(jié)抑制因子(trypsin modulating oostatic factor)、嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophilus)禾口伯氏致病桿菌(X. bovienii)。
17.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物包含整合有選自CrylAb、CrylAc、 CrylF、Cry ΙΑ. 105、Cry2Ab2、Cry3A、mir Cry3A、Cry3BbU Cry34, Cry35 和 VIP3A 的保護性殺蟲劑的植物。
18.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
19.包括權(quán)利要求1-6所述的植物細胞的種子。
20.從權(quán)利要求19的種子生長的植物。
21.如權(quán)利要求12所述的植物的可再生部分、后代或無性繁殖體。
22.一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞的方法，包括將多個植物細胞用編碼包含SEQ ID NO 2 的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化，將所述細胞在包含一定濃度的植物生長素類除草劑的組合物中生長，所述濃度的植物生長素類除草劑允許表達所述多核苷酸的轉(zhuǎn)化細胞生長，而殺死或抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述方法用于選擇轉(zhuǎn)化的植物。
24.一種控制場地中雜草的方法，包括在場地中種植至少一種轉(zhuǎn)基因植物的種子，所述種子包含編碼包含SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸，并向所述場地的至少部分施加包含植物生長素類除草劑的組合物。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物對第二除草劑具有抵抗力，所述第二除草劑選自草甘膦、草銨膦、咪草煙、氯磺隆、麥草畏、甲基磺草酮、異噁氟草和氟丙嘧草酯。
26.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述單子葉植物選自玉米、稻、小麥、大麥、黑麥、 暖季和冷季型草坪草、燕麥、高粱和牧場草。
28.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述第一除草劑為植物生長素類除草劑，而且所述植物為雙子葉植物。
29.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物為選自棉花、煙草、油菜和大豆的雙子葉植物。
30.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述方法包括施加第二除草劑，而且所述植物對所述第二除草劑具有抵抗力。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述植物生長素類除草劑和第二除草劑被依次施用。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述植物生長素類除草劑和第二除草劑被同時施用。
33.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物對草甘膦具有抵抗力。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述草甘膦抗性是由編碼EPSPS(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)或GAT的多核苷酸所賦予的。
35.一種物質(zhì)組合物，包括a)編碼包含SEQ ID NO 2的多肽或編碼SEQ ID NO 2的多肽片段的多核苷酸序列，所述多肽或片段具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性和/或能夠賦予植物對植物生長素類除草劑抗性；b)與SEQID NO 1有至少70%同一性而且編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性和/或能夠賦予植物對植物生長素類除草劑抗性的多肽的多核苷酸序列；c)多核苷酸序列，包括(a)或(b)中所述的多核苷酸序列的至少8個連續(xù)核苷酸；d)與(a)、(b)或(c)中所述的多核苷酸互補的多核苷酸；e)在低、中或高嚴(yán)緊條件下與(a)、(b)、(c)或(d)中所述的多核苷酸序列雜交的多核苷酸；f)包括(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中所述的多核苷酸序列的基因構(gòu)建體；g)包括(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中所述的多核苷酸或基因構(gòu)建體的載體；h)包括如(g)中所述的載體、(f)中所述的基因構(gòu)建體或(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中任一個所述的多核苷酸的宿主細胞；i)分離的多肽，所述多肽包括SEQID NO :2或具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性和/或能夠賦予植物對植物生長素類除草劑抗性的SEQ ID NO 2的片段。
36.一種分離的載體，包括有效連接到編碼SEQ ID NO :2或具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SEQ ID NO :2片段的多核苷酸的啟動子。
37.如權(quán)利要求36所述的載體，其中所述啟動子為植物啟動子。
38.如權(quán)利要求36所述的載體，包括選自木薯脈花葉病毒啟動子、CaMV35S啟動子、玄參花葉病毒啟動子、稻肌動蛋白啟動子、菜豆球蛋白啟動子、擬南芥泛素10啟動子、玉米泛素啟動子、擬南芥Act2啟動子、擬南芥泛素11啟動子和擬南芥泛素3啟動子的啟動子。
39.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、植物、可再生植物部分、后代、無性繁殖體、植物細胞或多肽，其中所述植物生長素類除草劑如表1或表2或圖2或圖4或圖5或圖6中所述。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的新型多核苷酸和多肽。本發(fā)明提供了表達此處公開的甲基轉(zhuǎn)移酶并對植物生長素類除草劑有抵抗力的新型植物。本發(fā)明還提供了已經(jīng)轉(zhuǎn)化了一種或多種其他除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物，從而使得該植物能夠耐受植物生長素類除草劑和一種或多種其他除草劑的施用。
文檔編號C12N15/82GK102365016SQ201080015508
公開日2012年2月29日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者G·R·阿梅爾, 趙楠, 陳 峰 申請人:田納西大學(xué)研究基金會