專利名稱：利用適體的靶物質(zhì)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用適體的靶物質(zhì)檢測方法及檢測用試劑盒，具體地說，是涉及三種靶物質(zhì)檢測方法及檢測用試劑盒向固定于固相載體的第1適體添加試料及第2適體使第1適體、靶物質(zhì)及第2適體間形成夾層結(jié)合的靶物質(zhì)檢測方法及檢測用試劑盒；FET傳感器基礎(chǔ)靶材檢測方法及檢測用試劑盒；還有AAO傳感器基礎(chǔ)靶材檢測方法及檢測用試劑
品.ο
背景技術(shù)：
研發(fā)出一種能夠靈敏而特異地檢測溶液中較小分子的新型傳感器平臺對于監(jiān)測與疾病相關(guān)的代謝物、環(huán)境污染物及食品毒素等是非常重要的，目前為止，對代謝物、環(huán)境污染物及毒素等具有低分子量的分析物的分析一般都是通過GC/MS或者HPLC等復雜的實驗進行的，這即使是對于操作熟練的人員來說也需要很長的時間來進行檢查，而且它還不適用于臨場分析(on-site analysis) (Stales, C. A. et al, Environ. Toxicol. Chem., 20:2450,2001)。因此，為了能夠成功實施現(xiàn)場的(on-site)實時檢測，就需要較小刻度的裝置及特異結(jié)合的試劑。因此，作為檢測小物質(zhì)的便攜式平臺，雖然已有表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance)等檢測平臺，但是，從原理上來說，它很難檢測分子量低于400的極低分子量物質(zhì)。而且，對使用17 β-雌二醇(β-estradiol，MW: 272)結(jié)合特異適體的1 μ M (272ppb)濃度進行分析的結(jié)果如圖1所示，是不可能對上述低分子量物質(zhì)的濃度進行分析的(Kimei ai, Biosens. Bioelecrtron., 22:2525，2007)。所以，就迫切需要研發(fā)出一種能夠靈敏而特異地檢測出低分子量物質(zhì)新型平臺。另外，為了對分析物實施靈敏而特異的檢測，就需要抗體與分析物特異結(jié)合的試劑。但是，如果是低分子量的小物質(zhì)，通常使動物產(chǎn)生抗體而言，由于其太小或者毒性太強都不能生成抗體。因此，就需要能夠鎖定小分子的新型特異結(jié)合的試劑。另外，適體作為單一鏈條DNA或者RNA分子，具有很高的親和性，即能夠特異認知靶物質(zhì)的小單鏈寡核苷酸。適體可以用作檢測分析系統(tǒng)中能夠識別分子的生物傳感器的一個要素，因此，它一直被當作抗體的替代物質(zhì)。特別是，適體與抗體不同，它可以用作以毒素為主的多種有機物及無機物的靶分子，一旦將與特定物質(zhì)特異結(jié)合的適體分離，可以采用自動化的低聚物合成方法以較低的費用進行連續(xù)再生產(chǎn)，比較經(jīng)濟。自1996年首次開發(fā)出利用熒光標記的適體測定靶蛋白的適體基礎(chǔ)生物傳感器之后，以這種適體的優(yōu)點和結(jié)構(gòu)上的特性為基礎(chǔ)開發(fā)出了多種適體生物傳感器(金延錫&邱萬福，NICE，26(6): 690， 2008)。但是，利用現(xiàn)有適體的分析方法一直都是采用分離附著在特定物質(zhì)上的適體或者利用其它物質(zhì)結(jié)合等競爭分析方法，因此，就需要研發(fā)出通過更加直接而簡便的方法來利用適體檢測出物質(zhì)的方法。另外，以碳納米管(CNT)為基礎(chǔ)的傳感器作為檢測小物質(zhì)的便攜式裝置，是一個很有魅力的平臺，它與石英晶體微量天平(quarts-crystal microbalance)、電化學阻抗分析儀(electrochemical impedance spectrometry)、表面等離子共振技術(shù)(surface ρIasmon resonance)及光尋址電位傳感器(light-addressable potentiometric sensor: LAPS)等其它檢測平臺相比，單壁碳納米管(swCNT)-場效應(yīng)晶體管(FETs)作為小刻度裝置，適合用作非常靈敏地檢測化學物質(zhì)的傳感器(Kim，Τ. K. et al., Advanced Materials, 20:1， 2008 ； Kong, J. et al., Science, 287:622， 2000; Snow, E. S. & Perkins, F. K. , Nano. Lett. , 5:2414，200 。但是，最近用于檢測小分子的swCNT-FET存在含有大部分重要的生物學代謝物或毒素，呈非液體狀，僅限于氣體和蒸汽狀的問題。另外，由于溶液中的無極性小分子的檢測并不在FET基礎(chǔ)傳感器的檢測范圍內(nèi)，因此，溶液中小分子的檢測就非常困難(Heller，I. et al, Nano. Lett., 8:591， 2008)。另外，對分析物實施特異而靈敏的檢測還需要通過功能基獲得使swCNT-FET化學傳感器與抗體等特異結(jié)合的試劑，通常就小分子使動物產(chǎn)生抗體而言，由于其太小或者毒性太強都不能生成抗體。因此，本發(fā)明為了提供一種能夠檢測出小分子，特別是溶液中的小分子也能夠被檢測出來的新型檢測方法，經(jīng)過如實施例所述的一系列努力最終完成了本發(fā)明，即向固定于固相載體的第1適體添加試料及第2適體，使第1適體，靶物質(zhì)及第2適體間形成夾層結(jié)合之后，對于雙酚A等無極性低分子量的物質(zhì)也能夠被檢測出來。另外，本發(fā)明將第1適體作為探測器固定于FET傳感器上之后，再向其中添加試料及第2適體，然后，就可以測定電流變化，從而也可以檢測出pM標準的無極性低分子物質(zhì)。另外，本發(fā)明將適體作為探測器固定于AAO傳感器上之后，再向其中添加試料，然后，就可以測定靜電容量的變化，從而也可以檢測出無極性低分子物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種溶液中的低分子物質(zhì)也能夠被檢測出來的新型靶物質(zhì)檢測方法。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種溶液中的低分子物質(zhì)也能夠被檢測出來的靶物質(zhì)檢測用試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種利用適體的靶物質(zhì)檢測方法，其包括如下幾個步驟
(a)向固定于固相載體與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體中添加含有靶物質(zhì)的試料及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合且附著有標志物的第2適體，并使其反應(yīng)的步驟；
(b)分析上述標志物并檢測靶物質(zhì)的步驟。另外，本發(fā)明還提供一種利用適體的靶物質(zhì)檢測方法，其包括如下幾個步驟
(a)向固定于固相載體與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體中添加含有靶物質(zhì)的試料及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體，并使其發(fā)生反應(yīng)的步驟；
(b)使標志物與上述第2適體結(jié)合的步驟；
(c)分析上述標志物并檢測靶物質(zhì)的步驟。另外，本發(fā)明提供一種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其包括固定有與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體的固相載體；以及含有與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體檢測試劑。另外，本發(fā)明提供一種雙酚A檢測用試劑盒，其特征在于，包含固定有與雙酚A特異結(jié)合的第1適體的固相載體及含有與附著標志物的雙酚A特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑，上述第1適體或者第2適體從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。另外，本發(fā)明提供一種適體標記用核酸片段，其特征在于，附著標志物并能夠與適體末端互補結(jié)合。另外，本發(fā)明提供一種利用適體的場效應(yīng)晶體管(FET)傳感器基礎(chǔ)的靶物質(zhì)的檢測方法，其包括如下幾個步驟
(a)包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的源極及漏極、以及與上述源極及漏極接觸并在基板上形成的入口，向與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定于上述源極表面、入口表面及漏極表面中任意一個以上的FET傳感器中添加含有靶物質(zhì)的試料，并與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的步驟；
(b)測定當上述靶物質(zhì)和第2適體與固定在上述FET傳感器上的第1適體結(jié)合時產(chǎn)生的上述FET傳感器的源極及漏極之間流動的電流變化并檢測靶物質(zhì)的步驟。另外，本發(fā)明提供一種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其包括如下幾個步驟
包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的源極及漏極及，以及與上述源極及漏極接觸并在基板上形成入口的FET傳感器，與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定于上述源極表面、入口表面及漏極表面中任意一個以上為特征的FET傳感器；含有與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑。另外，本發(fā)明提供一種雙酚A檢測用試劑盒，其特征在于，其包括如下幾個步驟 作為包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的Au電極、含有與上述Au電極接觸并在上述基板上形成通道的單壁碳納米管通道區(qū)的FET傳感器，與雙酚A特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定于上述Au電極表面為特征的FET傳感器；含有與雙酚A特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑。在這里，上述第1適體或者第2適體從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。另外，本發(fā)明提供一種利用適體的陽極氧化鋁(AAO，Anodic aluminum oxide)傳感器基礎(chǔ)靶材檢測方法，其包括如下幾個步驟
(a)包含基板、在上述基板上形成具有納米大小的孔的陽極氧化鋁、對上述陽極氧化鋁的表面進行涂覆的金屬，向與靶物質(zhì)特異結(jié)合的適體作為探測器固定于上述金屬表面的 AAO傳感器中添加含有靶物質(zhì)的試料的步驟；
(b)領(lǐng)用AAO傳感器測定當上述靶物質(zhì)與適體結(jié)合時殘生的靜電通量的變化英檢測靶物質(zhì)的步驟。另外，本發(fā)明提供一種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其包括如下幾個步驟含有基板、在上述基板上形成并具有納米大小的孔的陽極氧化鋁、對上述陽極氧化鋁的表面進行涂覆的金屬的陽極氧化鋁(AAO)傳感器；與靶物質(zhì)特異結(jié)合的適體。本發(fā)明的另一個特征以及實施例將通過下面的詳細說明及所附權(quán)利要求書中作
進一步介紹。


圖1是依據(jù)現(xiàn)有SPR的方法利用適體執(zhí)行17 β雌二醇檢測的結(jié)果示意圖2是依據(jù)本發(fā)明的方法使雙酚A及標記的適體與固定的適體結(jié)合的過程的概略示意圖3是依據(jù)本發(fā)明的方法通過夾層結(jié)合執(zhí)行雙酚A檢測的結(jié)果示意圖； 圖4是swCNT-FET傳感器以及利用它適用依據(jù)本發(fā)明的方法檢測雙酚A (BPA)的過程概略示意圖5是將BPA溶液(圖5a)、BPA與抗-BPA適體混合溶液(圖恥)以及抗-BPA適體溶液(圖5c)分別添加到swCNT-FET傳感器中測定其電流變化的函數(shù)圖和將BPA、BPB、6F及 BP等各種溶液與抗-BPA適體溶液的混合溶液添加到swCNT-FET傳感器中測定電流變化的函數(shù)圖(圖5d)；
圖6是多通道AAO傳感器的概略示意圖7是分別把頻率從0到100赫茲變化的過程中適體與傳感器結(jié)合時與雙酚A流入時的靜電容量進行比較的結(jié)果示意圖8是利用AAO傳感器檢測雙酚A獲得結(jié)果的函數(shù)圖，(圖8a)是不使適體結(jié)合的AAO 傳感器的實驗結(jié)果示意圖，(圖8b)是使適體結(jié)合的AAO傳感器的靜電容量變化結(jié)果示意圖9是將雙酚A分別以lnm，IOnM及IOOnM的濃度流入與適體結(jié)合的AAO傳感器時靜電容量變化的函數(shù)圖。
具體實施例方式只要沒有以其它形式定義，在本說明書中使用的所有技術(shù)及科學術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的工作人員通常所理解的涵義相同。一般情況下，本說明書中使用的命名法以及下面所述實驗方法都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的常用方法。在對本發(fā)明進行詳細說明中所用的主要術(shù)語的定義如下。本發(fā)明中所謂的“適體”是指能夠以較高的親和性對靶物質(zhì)進行特異認知的小單鏈寡核苷酸。本發(fā)明中所謂的“試料”是指含有或者推定含有所關(guān)心的靶物質(zhì)而對其進行分析的組成物，其特征在于，它是從液體、土壤、空氣、食品、廢棄物、動植物臟器內(nèi)及動植物身體組織中任意一種中提取的試料中檢測出來的，但并非僅限定于此。在這種情況下，液體包括水、血液、小便、眼淚、汗、唾液、淋巴及腦脊液等，上述水包括江水、海水、湖水及雨水等，廢棄物包括污水、廢水等，上述動植物包括人體。另外，上述動植物組織包括粘膜、皮膚、表皮、 毛發(fā)、鱗、眼球、舌頭、面頰、蹄子、嘴、喙、腳、手、口、乳頭、耳朵、鼻子等組織。本發(fā)明中所謂的“場效應(yīng)晶體管(FET)傳感器”是指在基板兩側(cè)形成帶有與基板相反極性的源極及漏極，包括與源極及漏極接觸并在基板上形成的入口，在入口表面或者上述金屬電極的表面固定有探測器，當探測器與靶物質(zhì)結(jié)合時，通過電氣的方法測定結(jié)合時產(chǎn)生的電流變化，從而檢測出探測器與靶物質(zhì)間是否結(jié)合的傳感器。本發(fā)明中所謂的“碳納米管”是指一個碳元素與其它的碳原子構(gòu)成六角形蜂窩紋結(jié)合的管狀物質(zhì)，管的直徑是以納米為標準，是極其小的物質(zhì)，根據(jù)石墨片的結(jié)合數(shù)可以分為單壁碳納米管(single-walled nanotube)、多壁碳納米管(multi-walled nanotube)以
9及碳納米管束(rope nanotube)。本發(fā)明中所謂的“陽極氧化鋁(AAO，Anodic aluminum oxide)”是指利用將鋁通過電化學方式氧化的陽極氧化(anodization)方法生成表面帶有均勻規(guī)則性的納米大小的多孔性鋁。本發(fā)明從一種觀點出發(fā)，利用適體的靶物質(zhì)檢測方法，它包含如下幾個步驟
(a)固定于固相載體與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體中添加含有靶物質(zhì)的試料及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合并且附著標志物的第2適體，并使其反應(yīng)的步驟；
(b)分析上述標志物并檢測靶物質(zhì)的步驟。在本發(fā)明中，“固相載體”作為固定適體的固相載體支撐體，不限定于固定適體的形態(tài)或者物質(zhì)。為了便于實施分析方法，一般都采用多孔型微孔板。也可以采用由傳感器芯片、塑料、聚丙烯及凝膠或瓊脂糖等小珠填充形成的柱狀等其它的形狀。第1適體可以通過一般的方法與上述固相載體固定。雖然在本發(fā)明的一個實施例中是采用溶膠-凝膠分株法固定，但是，并不意味著僅限定于此。這對于具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)知識的工作人員來說是顯而易見的。對于本發(fā)明來說，上述(a)步驟作為向上述固定的第1適體中添加試料和第2適體，并使其反應(yīng)的步驟，在這里，所謂的“反應(yīng)”是指向第1適體中添加試料及第2適體，并進行培養(yǎng)后，使其與固定有存在于試料中靶物質(zhì)的第1適體結(jié)合，然后再通過反應(yīng)使第2適體與靶物質(zhì)結(jié)合。在這種情況下，首先將試料與第2適體混合，然后，再向上述第1適體中添加。即，將試料和第2適體混合后，使試料中靶物質(zhì)與第2適體間形成特異結(jié)合。然后， 再向固定有結(jié)合的靶物質(zhì)-第2適體的第1適體中添加，就可以使其與第1適體結(jié)合。另外，上述(a)步驟的特征在于，首先添加試料后，再添加第2適體。S卩，首先使試料中的靶物質(zhì)與固定在固相載體的第1適體結(jié)合，然后，再依次添加第2適體使其結(jié)合，從而就可以依次完成結(jié)合反應(yīng)。上述第2適體中附著的標志物可以通過間接或者直接的方式附著，標志物可以使用熒光物質(zhì)、放射性同位素等，但并不意味著僅限定于此。在這種情況下，熒光物質(zhì)的種類沒有特別的限定，例如可以使用與Cy3或Cy5等相類似的熒光色素或者熒光素酶 (Iuciferase)、GFP等熒光蛋白質(zhì)類公認的熒光物質(zhì)。在本發(fā)明中，上述(b)步驟作為分析上述標志物并檢測靶物質(zhì)的步驟，分析靶物質(zhì)和第2適體與固定于固相載體的第1適體結(jié)合時產(chǎn)生的標志物的變化并檢測靶物質(zhì)。在這種情況下，標志物的分析可以通過公知的標志物分析法完成。例如如果將熒光物質(zhì)用作標志物，當靶物質(zhì)存在時就會發(fā)光或者顏色發(fā)生變化，通過對其進行測定，就可以檢測靶物質(zhì)。作為一個示例，通過能夠探測熒光染料的圖像掃描儀等掃描引起反應(yīng)的小孔就可以確認是否檢測到靶物質(zhì)。同時，利用軟件對圖像進行深度測定就可以測定檢測量。另外，除了在上述第2適體附著標志物使用之外，在上述(a)步驟中，使試料和第2 適體與第1適體結(jié)合之后，再使標志物與第2適體結(jié)合，從而就可以檢測出靶物質(zhì)。因此， 本發(fā)明從另一種觀點出發(fā)，利用適體的靶物質(zhì)檢測方法，它包含如下幾個步驟
(a)固定于固相載體與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體中添加含有靶物質(zhì)的試料及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體，并使其反應(yīng)的步驟；
(b)使標志物與上述第2適體結(jié)合的步驟；(C)分析上述標志物并檢測靶物質(zhì)的步驟。對于本發(fā)明來說，與上述(b)步驟中標志物的結(jié)合，其特征在于，通過與上述第2 適體互補結(jié)合的核酸片段和上述第2適體進行互補結(jié)合而完成。在這種情況下，所謂的“互補結(jié)合”是指合成核酸片段的序列相對于上述第2適體來說大約在80 90%以上，更加優(yōu)選地，大約在90 95%以上，進一步優(yōu)選地，大約在95 99%以上的序列可以彼此互補或者完全互補雜交。優(yōu)選地，上述核酸片斷的特征在于，它可以與第2適體的末端互補結(jié)合。在這種情況下，第2適體為了實現(xiàn)上述結(jié)合，其末端可以包含附加的序列。在本發(fā)明的一個實施例中，為了確認依據(jù)本發(fā)明的檢測方法是否能夠檢測出溶液中低分子量的物質(zhì)，利用環(huán)境荷爾蒙做實驗，看是否能夠檢測出大家熟知但檢測極其困難的雙酚A，其結(jié)果表明，低分子量的雙酚A也能夠通過特異的方法檢測出來。這意味著，與依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)檢測溶液中代謝物、毒素等非常困難的情況不同，利用本發(fā)明的方法能夠?qū)⑷芤褐械拇x物、毒素等檢測出來。優(yōu)選地，為檢測上述實施例中的雙酚A而使用的適體可以從序列號2至28的核酸序列中所示的適體中選擇。在這種情況下，核酸適體可以用單鏈DNA或RNA，當上述核酸為 RNA時，上述核酸序列中T用U表示，這種序列包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這一點對于具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)知識的工作人員來說是顯而易見的。本發(fā)明從另一種觀點出發(fā)，利用適體的場效應(yīng)晶體管(FET)傳感器基礎(chǔ)靶物質(zhì)的檢測方法，它包含如下幾個步驟
(a)包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的源極及漏極、與上述源極及漏極接觸并在基板上形成的入口，與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定在上述源極表面、 入口表面及漏極表面中任意一個以上的FET傳感器中添加含有靶物質(zhì)的試料及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的步驟；
(b)通過測定上述靶物質(zhì)和第2適體與固定在上述FET傳感器上的第1適體結(jié)合時產(chǎn)生的上述FET傳感器的源極及漏極之間流動的電流變化而檢測靶物質(zhì)的步驟。依據(jù)本發(fā)明的方法基于場效應(yīng)晶體管(FET)原理，其特征在于，將適合作為探測器固定于源極表面、入口表面及漏極表面中任意一個以上進行使用。作為實施本發(fā)明而采用的FET傳感器也可以使用現(xiàn)有任何形態(tài)的FET傳感器。另外，包含在基板兩側(cè)與基板相反的極性添加的源極及漏極、與上述源極及漏極接觸并在基板上形成的入口，通過電氣方法測定靶物質(zhì)與入口表面或者固定于源極及漏極上的探測器結(jié)合時產(chǎn)生的電流變化，利用這種原理的傳感器可以用于執(zhí)行實施本發(fā)明的方法，這一點對于具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)知識的工作人員來說是顯而易見的。另外，對于本發(fā)明來說，其特征在于，上述金屬電極可以由金、鉬、鉻、銅、鋁、鎳、鈀以及鈦構(gòu)成的組中選擇任意一種或以上形成。優(yōu)選地，在這種情況下，為了提高檢測活性，上述FET傳感器的特征在于，它是碳納米管沉積于基板上并與上述源極及漏極接觸構(gòu)成通道區(qū)的FET傳感器。碳納米管的沉積可以通過化學氣相沉積法、激光消融法、弧光放電法、等離子體增強化學氣相沉積法、熱化學氣相沉積法、氣相合成法、電解法、火焰燃燒合成法等通常的方法完成。優(yōu)選地，對于這種碳納米管FET傳感器來說，其特征在于，上述第1適體固定于上述金屬電極表面。同時，對于本發(fā)明來說，上述(a)步驟作為向FET傳感器中添加試料和第2適體的
11步驟，在這種情況下，其特征在于，首先使試料和第2適體混合后，再向上述FET傳感器中添加。即，試料與第2適體混合后使試料中靶物質(zhì)與第2適體間特異結(jié)合，然后，再把結(jié)合的靶物質(zhì)-第2適體向FET傳感器中添加并使其與作為探測器的第1適體結(jié)合。
另外，上述(a)步驟的特征在于首先添加試料后，再添加第2適體。即，使試料中靶物質(zhì)首先與FET傳感器的第1適體結(jié)合，然后，再依次添加第2適體并使其結(jié)合，從而就可以使其依次結(jié)合反應(yīng)。 在本發(fā)明中，上述試料的特征在于，推定含有或者正在溶入所關(guān)心的靶物質(zhì)后，作為對其進行分析的組成物，可以通過對從土壤、液體、空氣、食品、廢棄物、動植物臟器內(nèi)及動植物組織中任意一種或以上中提取的試料進行檢測，但并不意味著僅限定于此。在這種情況下，液體可以是水、血液、小便、眼淚、汗、唾液、淋巴及腦脊液等，上述水包含江水、海水、湖水及雨水等，廢棄物包含污水、廢水等，上述動植物包含人體。另外，上述動植物組織包括粘膜、皮膚、表皮、毛發(fā)、鱗、眼球、舌頭、面頰、蹄子、嘴、喙、腳、手、口、乳頭、耳朵、鼻子等組織。在本發(fā)明的一個實施例中，為了確認依據(jù)本發(fā)明的檢測方法是否也能夠檢測出溶液中低分子量的無極性物質(zhì)，利用環(huán)境荷爾蒙做實驗，看是否能夠檢測出大家熟知但檢測卻極其困難的雙酚A，其結(jié)果表明，即使溶液中的雙酚A達到pM標準也能夠檢測出來，而且對具有與雙酚A極其相似構(gòu)造的BPB、6F等其它雙酚類不會引起反應(yīng)，而只對雙酚A進行特異檢測。這意味著，依據(jù)本發(fā)明的檢測方法與現(xiàn)有技術(shù)檢測溶液中代謝物、毒素等非常困難的情況不同，利用依據(jù)本發(fā)明的方法能夠?qū)⑷芤褐械拇x物、毒素等檢測出來。優(yōu)選地，為了檢測上述實施例的雙酚A而用于FET傳感器的適體可以從序列號2 至28的核酸序列中所示的適體中選擇。在這種情況下，核酸適體可以用單鏈DNA或RNA，當上述核酸為RNA時，上述核酸序列中T用U表示，這種序列包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這一點對于具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)知識的工作人員來說是顯而易見的。本發(fā)明從另一種觀點出發(fā)，利用適體的陽極氧化鋁(AAO，Anodic aluminum oxide)傳感器基礎(chǔ)靶材的檢測方法，它包含如下幾個步驟
(a)包含基板、在上述基板上形成并具有納米大小的孔的陽極氧化鋁、對上述陽極氧化鋁的表面進行涂覆的金屬，向與靶物質(zhì)特異結(jié)合的適體作為探測器固定于上述金屬表面的 AAO傳感器中添加含有靶物質(zhì)的試料的步驟；
(b)測定靶物質(zhì)與適體結(jié)合時產(chǎn)生的上述AAO傳感器的靜電容量的變化并檢測靶物質(zhì)的步驟。所謂的“陽極氧化鋁(AAO，Anodic aluminum oxide)”是指利用電氣方法氧化的鋁。鋁具有沿垂直方向規(guī)則排列的細小納米氣孔，它在電氧化過程中可以對其大小進行調(diào)節(jié)。當金屬粒子溶入這種陽極氧化鋁表面后就與適體結(jié)合。在這里，如果有選擇性地使雙酚 A等靶物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，就會導致電壓與電流發(fā)生變化，并最終引起靜電容量發(fā)生變化，從而就可以實現(xiàn)對微量的物質(zhì)也能夠檢測出的納米生物傳感器。作為實施本發(fā)明而采用的AAO 傳感器也可以使用現(xiàn)有任何形態(tài)的AAO傳感器。在這種情況下，在上述陽極氧化鋁表面涂覆的金屬可以用金，但并非僅限定于此。另外，上述AAO傳感器上適體的固定可以發(fā)揮與適體的一個末端結(jié)合的功能基的作用，在本發(fā)明的一個實施例中，與適體的3’末端結(jié)合的硫氫基構(gòu)成陽極氧化鋁表面的金和共價鍵，并結(jié)合到AAO傳感器的表面。在這種情況下，如圖6所示，上述AAO傳感器的特征在于，優(yōu)選地，能夠同時執(zhí)行多種物質(zhì)的檢測，可以作多通道利用。即，將互不相同的適體分別固定于各個通道，就可以同時對多種物質(zhì)進行檢測。另外，使互不相同的試料流入各個通道，從而就可以同時對多種試料進行調(diào)查。在本發(fā)明的一個實施例中，為了確認依據(jù)本發(fā)明基于AAO傳感器的檢測方法是否也能夠檢測出溶液中低分子量的無極性物質(zhì)，利用環(huán)境荷爾蒙做實驗，看是否能夠檢測出大家熟知但檢測極其困難的雙酚A，其結(jié)果表明，確認能夠檢測出溶液中的雙酚A。這意味著，依據(jù)本發(fā)明的檢測方法與依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)檢測溶液中代謝物、毒素等非常困難的情況不同，利用依據(jù)本發(fā)明的方法能夠?qū)⑷芤褐械拇x物、毒素等檢測出來。優(yōu)選地，為了檢測上述實施例的雙酚A而用于AAO傳感器的適體可以從序列號2 至28的核酸序列中所示的適體中選擇。在這種情況下，核酸適體可以用單鏈DNA或RNA，當上述核酸為RNA時，上述核酸序列中T用U表示，這種序列包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這一點對于具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)知識的工作人員來說是顯而易見的。另外，依據(jù)本發(fā)明的方法為了提高便攜性，可以按試劑盒的形態(tài)提供。也就是說， 本發(fā)明從另一種觀點出發(fā)，涉及一種靶物質(zhì)檢測試劑盒，它包含如下幾個步驟與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體固定于固體上的固相載體、含有與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑。在這種情況下，含有上述第2適體的檢測試劑既可以裝入其它的容器中，也可以裝入執(zhí)行夾層結(jié)合的反應(yīng)部。另外，上述檢測試劑盒可以包含檢測用緩沖溶液等。同時，優(yōu)選地，還可以包含能夠使上述檢測試劑與需要檢測的試料液混合的工具。本發(fā)明從另一種觀點出發(fā)，涉及一種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，包括如下幾個步驟作為包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的源極及漏極、與上述源極及漏極接觸并在基板上形成入口的FET傳感器，與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定于上述源極表面、入口表面及漏極表面中任意一種上的FET傳感器；含有與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑。在這種情況下，含有上述第2適體的檢測試劑既可以裝入其它的容器中，也可以裝入執(zhí)行使靶物質(zhì)與適體間結(jié)合的反應(yīng)部。另外，上述檢測試劑盒可以包含檢測用緩沖溶液等。同時，優(yōu)選地，還可以包含能夠使上述檢測試劑與需要檢測的試料液混合的工具。本發(fā)明從另一種觀點出發(fā)，涉及一種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其包括如下幾個步驟 包含基板、在上述基板上形成并具有納米大小孔的陽極氧化鋁、對上述陽極氧化鋁的表面進行涂覆的金屬的陽極氧化鋁(AAO)傳感器；與靶物質(zhì)特異結(jié)合的適體。優(yōu)選地，在這種情況下，上述金屬可以用金，但并非僅局限于此。在此后的執(zhí)行步驟中，上述適體利用與適體末端結(jié)合的功能基固定于AAO傳感器上，在這種情況下，上述功能基可以為硫氫基，它既可以通過吸附結(jié)合，也可以通過連接器(linker)結(jié)合。同時，上述試劑盒還可以包含流動系統(tǒng)。這里所謂的流動系統(tǒng)是指能夠?qū)嚵匣蛘哌m體的結(jié)合緩沖器送入上述AAO傳感器的系統(tǒng)。上述靶物質(zhì)檢測用試劑盒可以采用瓶、桶(tub)、小袋(sachet)、封套 (envelope)、軟管、細頸瓶(ampoule)等形態(tài)，它們可以部分或者全部采用塑料、玻璃、紙、 鋁箔、石蠟等形成。容器可以裝配能夠通過機械方式、粘著方式或者其它方式附著在容器上并能夠完全或者部分分離的蓋子。另外，容器還可以設(shè)置能夠通過注射針接觸內(nèi)容物的塞子。上述試劑盒可以包含外包裝。同時，外包裝還可以包含有關(guān)構(gòu)成要素的使用說明書。
具體實施例下面，將通過實施例對本發(fā)明進行更加詳細的說明。這些實施例僅限于對本發(fā)明進行示例說明，本發(fā)明的范圍并不僅僅局限于這些實施例，這一點對于具有本行業(yè)相關(guān)知識的工作人員來說是顯而易見的。特別是，在以下實施例中，雖然利用與雙酚A特異結(jié)合的適體確認雙酚A的檢測效果。但是，也可以利用與其它靶物質(zhì)特異結(jié)合的適體將依據(jù)本發(fā)明的方法運用于其它靶物質(zhì)的檢測，這一點對于具有本行業(yè)相關(guān)知識的工作人員來說是顯而易見的。實施例1 與雙酚A特異結(jié)合的適體的分離及對其進行固定的溶膠-凝膠芯片的制造
1-1 與雙酚A特異結(jié)合的適體的分離
首先，將具有以下序列的隨機ssDNA庫化學合成之后再分離為PAGE(Gen0tech Inc., Korea)。5' -GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-N60-GGACAGTACTCAGGTCATCCTAGG-3'(序列號 1) 對于上述ssDNA庫，利用雙酚A -瓊脂糖的親和性，執(zhí)行12次SELEX的篩選及放大過
程之后，再篩選出以下總共27個雙酚A特異適體。#31 5' -CGGCCCTAGG ATGACCTGAG TACTGTCCCT CACCCCTACT TCCGCCACTG GCCCAACAGC-3，(序列號 2)
#23 5'-TGCCTAGGAT CACTCTCCCA-3，(序列號 3) #47 5'-GCGGACGGGC CTAATTCGGG-3，(序列號 4) #50 5'-CGGCCCGCCC AGACAGGTGC-3，(序列號 5) #41 5'-CGGCAGCCCT CCGGTGCTTA-3，(序列號 6)
#27 5'-GGGGGCGTCG NCCTAGGATG ACCTGAGTAC TGTCCGCACN CAGGGAGGAT GCATTGAC-3' (序列號7)
#45 5'-GTGTCCCCAC GTCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAATG CCGCTCCTCC CGATGCAGAC-3，(序列號 8)
#11 5'-CTCTTCNCTC CAATTCGTAA GATGACCTGA GGTCTGCCCA ACGGTGTTTA GAACCCCTTG-3，(序列號 9)
#12-3 5' -CGCAGCGCGC CCCTGAGTAC TGTCCGCCCA ACGGTGTGAC GGCCCTGCGA TCAACGATTG-3，(序列號 10)
#12-4 5'-GGGCCGTCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCCCAACGG TGTGACGGCC CTGCGATCAA-3，(序列號 11)
#22 5'-CCCTCGCCCT GAGTACTGTC CCCCGTCCGT CCGGTGAGGG CCACTATCGC
GACCTGAGTA TCGGCTCACC CTAGGATGAC AGGATGACCT
CTGTCCAGGC TAGGATGACC CTGAGTACTG GAGTACTGTC
TCCGACCTTG TGAGTACTGT TCCGCGGGAC CGCGAAAGAC
TCCCTGCCGC CCCCGTGGCG GGTATCGCTG TCCATGGTACTAACTGATCA-3’(序列號 12)
#4 5’-AGGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3’ (序列號13)
#12-5 5' -CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3'(序列號 14)
#6 5' -CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC-3' (序列號15)
#12-7 5'-CCGCCGTTGG CGCCTCCAGC-3，(序列號 16) #12-2 5'-TGACGGTGGC ACCGTTGGAG-3，(序列號 17) #12-9 5'-TGACGGTGGC ACCGTTGGGGG-3，(序列號 18) #12-6 5'-TGACGGTGGC ACCGGTCGGG-3，(序列號 19)
#2 5' -GCCGACAGGG CATGGGACGC TATCAGCGGT GTCAATCGAA TTCCCGCGGC CGCCATGCGG-3' (序列號20)
#14 5' -GGTCCCCGCA GCTCATACGG CGCTCCAGCG TAATCGAATT CCCGCGGCCG CCATGCGGCC-3，(序列號 21)
#46 5'-GCGAGTGGCC CATCAGCAGA GCGTAATCCC CACGCACATC GAGTGCCCCC GGCCGGTGCT-3，(序列號 22)
#12 5'-GTATTGTCAT TCATATCCTC GTGCTTGCTG TCCTCACCCC ACCCACCAGA ATGGAAA-3' (序列號23)
#13 5'-CCTGGTATTG TCTTGCCAAT CCTCGCCCTG GCTGTCTTAC CCCTCCCCAC CCGCCTGAAG-3，(序列號 24)
#48 5'-GTCGACTCGC GGGTACCGTG CTCAATGTCC CAATCCGGGG AAGCGTTTAG ACCCGCAGCC CAC-3'(序列號 25)
#40 5' -GTCGCCACTG CGGGTACCGT GCTTGGGCNA CCGATGNACC NTGNNACCGT GTTTNGCC-3' (序列號26)
#3 5' -CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3，(序列號 27)
#32 5'-GGGCGGTGGG TGGCGAGTTG TGAGACGCTG GAGGAGGTTG CTGCCCCCGG CACATTGGGA-3，(序列號 28) 1-2:溶膠-凝膠芯片的制造
按照下述方法制造能夠固定第1適體的傳感器芯片。即，將溶膠-凝膠點與陰性對照菌、適體(適體#3及#12-5)、陽性對照菌一起按照如圖3所示的順序即陽性對照菌(P)、 #12-5適體、#3適體及陰性對照菌(N)順序利用OmniGrid Accent Microarrayer (DIGI LAB, USA)固定于PMMA涂層的96-孔上制造出溶膠-凝膠芯片。 上述溶膠-凝膠點的溶膠組成物按照下述方法制造。首先，將硅酸甲酯
TGTGGTGGGCCCAGGGCCGG
GTGGAGGGCGCGTATCAATC
GTGGAGGGCGCGTATCAATC
GTGGAGGGCGCGTATCAATC
CGGCGCACAGCTGTTATAGA
GTTGATCGCAGGGCCGTCAT
GTTGATCGCAGGGCCGTCAT
GTTGATCGCAGGGCCGTCAT(tetramethyl orthosilicate, TM0S)與甲基三甲氧基娃燒(methyltrimethoxysilicate, MTMS)混合制造溶膠組成物。然后，準備溶液I即IOOmM的HCl。另外，將IOOmM 的 SP 緩沖溶液(pH 5. 8)及 2 次蒸餾水(double distilled water, DDff) 20 混合后，分別向陽性對照菌、陰性對照菌、實驗菌等上述混合物中添加10 Cy3 抗體(Santa Cruz, USA)、為陰性對照菌時，將PBS緩沖溶液、篩選的適體(適體#3及 #12-5)，經(jīng)5秒渦流后自旋減慢制造出溶液II。然后，依次將上述溶膠組成物、溶液I及溶液II分株后，將溶膠-凝膠點經(jīng)13 15 小時的凝膠化處理，從而制造出溶膠-凝膠芯片。實施例2 利用溶膠-凝膠芯片的雙酚A的檢測
首先，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase ； Fermentas, Canada)和 Cy3_dUTP (GeneChem, Korea)對適體 #3 及 #12-5 進行標記后用于本實驗中。不過，標記也可以按照以下方式完成分別將5’ -GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-3’ (序列號29)等片斷與用作第2適體的適體#3及#12-5的末端連接后，將Cy3附著于能與之互補結(jié)合的序列即5’-CATGCTCGTGTTCGAACGGCCC-3'(序列號30)等核酸片斷上，從而使 Cy3標記的上述核酸片斷與上述第2適體的上述末端片斷互補結(jié)合。然后，向在上述實施例1-2中制造的溶膠-凝膠芯片的各個孔中添加50 μ M的雙酚A和2 μ M的cy3-標記的適體(第2適體)。S卩，向各個孔中添加的情況如圖3所示，向上端右側(cè)孔中添加雙酚A (BPA)和適體#12-5，向下端左側(cè)孔中僅添加緩沖溶液和適體#3， 向下端右側(cè)孔中添加BPA和適體#3，并分別進行處理和培養(yǎng)。然后，經(jīng)過清洗過程，再通過 Multi-Image 分析儀(FUJIFILM，Japan)進行觀察。其結(jié)果如圖3所示，只有當雙酚A存在的情況下，固定#12-5適體及#3適體的位置才會出現(xiàn)信號(用紅色圓表示)，即利用依據(jù)本發(fā)明的溶膠-凝膠芯片可以特異地檢測出雙酚A。即，依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)檢測及其困難的無極性低分子量的雙酚A也可以通過依據(jù)本發(fā)明的方法特異地檢測出來。實施例3 雙酚A檢測用FET CNT傳感器的制造
利用上述實施例1中分離的適體，并根據(jù)現(xiàn)有的方法(Lee，Μ. et al., Nat. Nano technol., 1:66，2006)制造單壁碳納米管(swCNT) -FET傳感器芯片。為了制造以甲基終結(jié)的十八烷基三氯硅烷(octadecyltrichlorosilane: 0TS) 自組裝單層(self-assembled monolayer)無極性鈍化(passivating)分子模式，利用現(xiàn)有的光刻法在SW2基板上進行模式化處理。在這種情況下，將基板浸漬于單壁碳納米管 (swCNTs)的溶液(ο-二氯苯0.05mg/ml)中，然后，將swCNTs直接組裝于SiO2部位并進行排列。另外，電極通過光刻法進行模式化處理后，再通過剝離工藝(lift-off process)將 Pd及Au (IOnm Pd上30nm Au)進行熱沉積。然后，為了制造swCNT為基礎(chǔ)雙酚A檢測用傳感器，將上述獲得的與27個雙酚A 特異結(jié)合的適體中#3適體(序列號27)固定于上述swCNT-FET傳感器芯片的Au電極上。 為了對其進行固定，首先，將芯片在IOnM MCH (mercaptohexanol)溶液(中性化的水)中浸泡一夜，并利用MCH對其進行預處理。然后，將芯片放入緩沖溶液(IOnM Tris-HCl)中置于ΙμΜ適體上浸漬10小時，然后，利用與5’末端帶有硫氫基(thiol group)的雙酚A特異結(jié)合的ssDNA適體對金電極進行涂層，從而制造出雙酚A檢測用FET傳感器。
實施例4 利用FET CNT傳感器的雙酚A的檢測
雙酚A (BPA)的電氣檢測可以將因BPA或者其它分子的導入而誘發(fā)的源極(source) 與漏極(drain)之間的電流變化(源極_漏極偏壓、.IV)通過吉時利4200半導體特性分析裝置(Keithley 4200 Semiconductor analyser, USA)進行監(jiān)測。首先，作為對照菌監(jiān)測源極-漏極間的電流變化(source-drain current change)，同時，將BPA溶液結(jié)合緩沖溶液(IOOmM Tris-HCl, 200mM NaCl, 25mM KCl, IOmM MgC12, 2. 5ppm DMS0)按多種濃度(1ρΜ 100ηΜ)向上述實施例3中制造的傳感器中添加。 然后，作為實驗菌將與雙酚A特異結(jié)合的適體#3 (序列號5)，即與第2適體結(jié)合的BPA也按照與上述相同的多種濃度(lpMlOOnM)向上述實施例3中制造的傳感器中添加(圖4)。這時，按照下述方法準備與適體#3結(jié)合的BPA將其作為第2適體。即，首先將BPA與適體溶液按相同的濃度混合后，再將混合的溶液在95°C條件下加熱5分鐘直至達到室溫時為止， 然后，冷卻廣2小時。另外補充一點，在沒有BPA的情況下，作為對照菌僅將含有適體#3的適體溶液按照與上述相同的條件向上述實施例3中制造的傳感器中添加。另外，為了確認制造的BPA檢測用FET傳感器是否只特異地檢測BPA，就將具有與 BPA類似結(jié)構(gòu)的其它分子即雙酚B (BPB)、4，4’ -雙酚(BP)及6F雙酚A (6F)導入InM。其結(jié)果如圖fe所示，在只加入雙酚A溶液的情況下，即使是按照IOOnM的濃度添加，F(xiàn)ET傳感器芯片也不能夠檢測出溶液中的無極性分子即雙酚A。這是因為BPA自身不攜帶任何的電荷或者偶極子。與此相反，如圖恥所示，依據(jù)本發(fā)明的方法在將包含雙酚A 的試料與第2適體一起添加的情況下，可以確認其與背景信號有明確的差異。因此，可以將無極性分子即雙酚A從IpM中檢測出來。另外，如圖5c所示，在沒有雙酚A的情況下，即使只將第2適體添加到傳感器中，如圖fe所示，也不會引起有意義的變化。另外，如圖5d所示，在導入具有與雙酚A (BPA)類似結(jié)構(gòu)的雙酚類即雙酚B(BPB)、 4，4’-雙酚(BP)及6F雙酚A (6F)的情況下，也不會引起有意義的電流變化。上述實驗結(jié)果表明，依據(jù)本發(fā)明的檢測方法對于因現(xiàn)有FET傳感器傳輸較低的電荷而不能檢測的溶液中的含有低分子量無極性分子也能夠特異地檢測出來。實施例5 利用適體的多通道AAO (anodic aluminum oxide)傳感器基礎(chǔ)靶材檢測。5-1 =AAO傳感器的制造
在本實施例中使用的AAO (陽極氧化鋁)傳感器按下述方法制作。(1)利用電子束蒸發(fā)器沉積的由1.3厚的鋁、5厚的金與10厚的鈦構(gòu)成的金屬模式可以在具有200 厚二氧化硅層的硅基板上通過普通的光刻(photolithography) 及l(fā)ift-off方法制作。(2)陽極氧化鋁的納米大小多孔的直徑約75 ，可通過2步驟陽極氧化過程制作 (Masuda, H. , Fukuda, K. , 1995. Science 268 (5216)，1466 - 1468)。將陽極氧化的 1 步驟中沉積的鋁膜在常溫條件下浸入0. 3 M的草酸中施加40V的恒定電壓經(jīng)過5分鐘從而完成對陽極的處理。將這種陽極氧化鋁膜在70 C條件下浸入1.8 % (wt)的鉻酸中溶解后再進行5分鐘的陽極處理。將陽極氧化鋁的臨界層在常溫條件下浸入6% (wt)的磷酸溶液中將其除去，然后，在陽極氧化鋁區(qū)域外側(cè)會沉積450 厚的二氧化硅。(3)構(gòu)成底部電極的金納米線是使用硫酸在按pH4配的ImM的氯金酸(HAuC14)電解質(zhì)溶液中施加1. IV的恒定電壓電積于納米線內(nèi)部，金電極的上部(0.3 X 5.5 mm)是在陽極氧化鋁區(qū)域內(nèi)利用光刻和lift-off方法制作。(4)然后，使PDMA微細流動通道緊貼于傳感器上。5-2 利用AAO傳感器的靶物質(zhì)的檢測。將實施例5-1中制造的AAO傳感器與流動系統(tǒng)連接后，再將3’末端帶有硫氫基的適體(序列號27的#3適體)IOnM溶于結(jié)合緩沖器(25mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, 25mM KCl, IOmM MgC12, pH 8.0)中，然后按0. lml/hr的速度流入。同時，將其孵化一夜。由于在AAO傳感器的表面涂覆有金粒子，因此，金粒子與適體3’末端的硫氫基構(gòu)成共價鍵，就可以使適體與AAO傳感器的表面結(jié)合。作為對照菌，在沒有適體的情況下可以使用僅加入結(jié)合緩沖器后孵化的傳感器。使雙酚A結(jié)合緩沖器按0. 5ml/hr的速度流入，同時將其清洗1 小時，然后，按照標準緩沖溶液的水平準備。流入InM，IOnM, IOOnM濃度的雙酚A后，再通過結(jié)合緩沖器進行清洗，然后再測定傳感器的靜電容量(capacitance，nF)。為了確定測定靜電容量的頻率，就需要進行掃頻實驗。使頻率從0到1000赫茲之間變化，再將使適體與傳感器結(jié)合時與使雙酚A流入時的靜電容量進行比較，如圖7所示，在100赫茲時出現(xiàn)最理想的結(jié)果。因此，在實驗中測定 100赫茲時的靜電容量。另外，利用未與適體結(jié)合的AAO傳感器作為對照菌并利用與適體結(jié)合的AAO傳感器作為實驗菌進行雙酚A的檢測實驗。其結(jié)果如圖8a所示，未與適體結(jié)合的AAO傳感器中流入雙酚A時靜電容量沒有變化。相反，如圖8b所示，與適體結(jié)合的AAO傳感器中流入IOnM的雙酚A時靜電容量減少 25%,當流入IOOnM的雙酚A時減少36. 1%。同時，當雙酚A按照InM，IOnM, IOOnM的濃度流入時，靜電容量的變化以函數(shù)圖來
表示。其結(jié)果如圖9所示，當濃度達到InM之前，稍微存在一些誤差。但是，畫面的函數(shù)圖大體成直線形狀。上述實驗結(jié)果表明，基于依據(jù)本發(fā)明AAO傳感器的檢測方法，對于因傳輸太低的電荷而不能檢測的溶液中含有的低分子量無極性分子也能夠特異地檢測出來。工業(yè)實用性
如上所述，利用依據(jù)本發(fā)明適體的靶物質(zhì)檢測方法及檢測用試劑盒，對于依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)很難檢測的低分子量物質(zhì)也能夠檢測出來，從而可以檢測出存在于溶液中的疾病相關(guān)的代謝物、環(huán)境污染物及食品毒素等，作為一種直接而簡便的方法，利用能夠按一貫性再生產(chǎn)并且能夠以較低費用生產(chǎn)的適體，因此也可以提高其經(jīng)濟性。在上述說明中，對本發(fā)明內(nèi)容的特定部分進行了詳細敘述，對于具有本行業(yè)相關(guān)知識的工作人員來說，這種具體的技術(shù)只是理想的實施形態(tài)，并不意味著本發(fā)明的范圍僅限定于此。因此，必須根據(jù)權(quán)利要求項確定本發(fā)明的實際范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用適體的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，其包括如下幾個步驟(a)固定于固相載體且與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體中，添加含有靶物質(zhì)的試料以及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合且附著有標志物的第2適體，并使其反應(yīng)的步驟；(b)分析上述標志物并檢測靶物質(zhì)的步驟。
2.如權(quán)利要求項1所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于， 上述標志物為熒光物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求項2所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，上述熒光物質(zhì)的分析是通過測定上述熒光物質(zhì)的發(fā)光或者顏色變化而實現(xiàn)的。
4.如權(quán)利要求項1所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，上述試料為水、血液、小便、眼淚、汗、唾液、淋巴液、腦脊液、土壤、空氣、食品、廢棄物、 動植物臟器內(nèi)及動植物組織中任意一種或以上中提取。
5.如權(quán)利要求項1所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，上述第1適體或第2適體從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。
6.如權(quán)利要求項1所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于， 上述靶物質(zhì)為雙酚A。
7.一種利用適體的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，包括如下幾個步驟(a)固定于固相載體上且與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體中，添加含有靶物質(zhì)的試料以及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體，并使其反應(yīng)的步驟；(b)使標志物與上述第2適體結(jié)合的步驟；(c)分析上述標志物并檢測靶物質(zhì)的步驟。
8.如權(quán)利要求項7所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，上述(b)步驟使附著有標志物并與上述第2適體互補結(jié)合的核酸片段與上述第2適體互補結(jié)合。
9.如權(quán)利要求項8所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于， 上述核酸片段與第2適體的末端互補結(jié)合。
10.如權(quán)利要求項7所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于， 上述標志物為熒光物質(zhì)。
11.如權(quán)利要求項10所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，上述熒光物質(zhì)的分析是通過測定上述熒光物質(zhì)的發(fā)光或者顏色變化而實現(xiàn)的。
12.如權(quán)利要求項7所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，上述第1適體或第2適體從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。
13.如權(quán)利要求項7所述的靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于， 上述靶物質(zhì)為雙酚A。
14.一種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其特征在于，包括固定有與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體的固相載體；以及含有與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑。
15.如權(quán)利要求項14所述的靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其特征在于， 上述第2適體與標志物結(jié)合。
16.如權(quán)利要求項14所述的靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其特征在于，還包含有附著標志物并與上述第2適體互補結(jié)合的核酸片段。
17.—種雙酚A檢測用試劑盒，其特征在于，包括固定有與雙酚A特異結(jié)合的第1適體的固相載體；以及含有與附著標志物的雙酚A特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑，且上述第1適體或第2適體從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。
18.—種適體標記用核酸片段，其特征在于，附著有標志物并與適體末端互補結(jié)合。
19.一種利用適體的場效應(yīng)晶體管(FET)傳感器基礎(chǔ)靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，包括如下幾個步驟(a)在包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的源極及漏極、與上述源極及漏極接觸并在基板上形成的入口，并且與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定于上述源極表面、入口表面及漏極表面中任意一個上的FET傳感器中添加含有靶物質(zhì)的試料及與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的步驟；(b)測定當上述靶物質(zhì)和第2適體與固定于上述FET傳感器上的第1適體結(jié)合時產(chǎn)生的上述FET傳感器的源極及漏極間流動的電流變化而檢測靶物質(zhì)的步驟。
20.如權(quán)利要求項19所述的方法，其特征在于，上述金屬電極可以由金、鉬、鉻、銅、鋁、鎳、鈀及鈦構(gòu)成的組中選擇的任意一種或以上形成。
21.如權(quán)利要求項19所述的方法，其特征在于，碳納米管沉積于基板上并與上述源極及漏極接觸形成通道區(qū)，上述第1適體固定于上述金屬電極表面。
22.如權(quán)利要求項19所述的方法，其特征在于，上述試料從水、血液、小便、眼淚、汗、唾液、淋巴液、腦脊液、土壤、空氣、食品、廢棄物、 動植物臟器內(nèi)及動植物組織中任意一種或以上中提取。
23.如權(quán)利要求項19所述的方法，其特征在于，上述第1適體或者第2適體是從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。
24.如權(quán)利要求項19所述的方法，其特征在于，上述靶物質(zhì)為雙酚A。
25.—種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其特征在于，包括FET傳感器，該傳感器包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的源極及漏極、以及與上述源極及漏極接觸并在基板上形成的入口 ；且與靶物質(zhì)特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定于上述源極表面、入口表面及漏極表面中任意一個上，以及含有與上述靶物質(zhì)特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑。
26.如權(quán)利要求項25所述的靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其特征在于，上述金屬電極可以從由金、鉬、鉻、銅、鋁、鎳、鈀及鈦構(gòu)成的組選擇任意一種或以上而形成。
27.如權(quán)利要求項25所述的靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其特征在于，碳納米管沉積于基板上并與上述源極及漏極接觸構(gòu)成通道區(qū)，上述第1適體固定于上述金屬電極表面。
28.一種雙酚A檢測用試劑盒，其特征在于，包括FET傳感器，該傳感器包含基板、在上述基板兩側(cè)相互分離形成的Au電極、以及含有與上述Au電極接觸并在上述基板上形成通道的單壁碳納米管的通道區(qū)，且上述傳感器中與雙酚A特異結(jié)合的第1適體作為探測器固定于上述Au電極表面； 含有與雙酚A特異結(jié)合的第2適體的檢測試劑，且上述第1適體或第2適體從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。
29.—種利用適體的陽極氧化鋁(AAO，Anodic aluminum oxide)傳感器基礎(chǔ)靶物質(zhì)檢測方法，其特征在于，包括如下幾個步驟(a)在包含基板、在上述基板上形成具有納米大小的孔的陽極氧化鋁、以及在上述陽極氧化鋁的表面進行涂覆的金屬；并且把與靶物質(zhì)特異結(jié)合的適體作為探測器固定于上述金屬表面的AAO傳感器中添加含有靶物質(zhì)的試料的步驟；(b)測定當上述靶物質(zhì)與適體結(jié)合時產(chǎn)生的上述AAO傳感器的靜電容量的變化并檢測靶物質(zhì)的步驟。
30.如權(quán)利要求項四所述的方法，其特征在于， 上述金屬為金。
31.如權(quán)利要求項四所述的方法，其特征在于，上述適體的AAO傳感器的固定利用與適體的一個末端結(jié)合的功能基實現(xiàn)。
32.如權(quán)利要求項31所述的方法，其特征在于， 上述功能基為硫氫基。
33.如權(quán)利要求項四所述的方法，其特征在于， 上述AAO傳感器與流動系統(tǒng)連接。
34.如權(quán)利要求項四所述的方法，其特征在于，上述試料可以從水、血液、小便、眼淚、汗、唾液、淋巴液、腦脊液、土壤、空氣、食品、廢棄物、動植物臟器內(nèi)及動植物組織中任意一種或以上中提取。
35.如權(quán)利要求項四所述的方法，其特征在于，上述適體是從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。
36.如權(quán)利要求項四所述的方法，其特征在于， 上述靶物質(zhì)為雙酚A。
37.一種靶物質(zhì)檢測用試劑盒，其特征在于，包括陽極氧化鋁(AAO)傳感器，該傳感器包含基板、在上述基板上形成并具有納米大小的孔的陽極氧化鋁、以及對上述陽極氧化鋁的表面進行涂覆的金屬以及與靶物質(zhì)特異結(jié)合的適體。
38.如權(quán)利要求項37所述的試劑盒，其特征在于， 上述金屬為金。
39.如權(quán)利要求項37所述的試劑盒，其特征在于，上述適體為利用與適體末端結(jié)合的功能基固定于AAO傳感器上。
40.如權(quán)利要求項39所述的試劑盒，其特征在于， 上述功能基為硫氫基。
41.如權(quán)利要求項37所述的試劑盒，其特征在于，還包括流動系統(tǒng)。
42.如權(quán)利要求項37所述的試劑盒，其特征在于， 上述適體從序列號2至觀的核酸序列中所示的適體中選擇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用適體的靶物質(zhì)檢測方法及檢測用試劑盒，具體地說，涉及以下靶物質(zhì)檢測方法及檢測用試劑盒向固定于固相載體的第1適體添加試料及第2適體使第1適體、靶物質(zhì)及第2適體間形成夾層結(jié)合的靶物質(zhì)檢測方法及檢測用試劑盒；FET傳感器基礎(chǔ)靶材檢測方法及檢測用試劑盒；AAO傳感器基礎(chǔ)靶材檢測方法及檢測用試劑盒。依據(jù)本發(fā)明的檢測方法對于依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)很難檢測的低分子量物質(zhì)也能夠檢測出來，從而就可以檢測出與存在于溶液中的疾病相關(guān)的代謝物、環(huán)境污染物及食品毒素等，它利用能夠按一貫性再生產(chǎn)并且能夠以較低費用生產(chǎn)的適體，因此還可以提高其經(jīng)濟性。
文檔編號C12Q1/68GK102395684SQ201080016373
公開日2012年3月28日 申請日期2010年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日
發(fā)明者金邵妍 申請人:東國大學校產(chǎn)學協(xié)力團