專利名稱：基于流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的分子檢測的制作方法
基于流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的分子檢測相關(guān)申請本申請依據(jù)美國法典第35篇第119條要求2009年3月15日提交的美國臨時申請第61/160，335號的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述美國臨時申請的全部公開內(nèi)容都以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
癌癥是由許多腫瘤抑制基因的表達來主動地避免，這些腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)細胞分裂周期并介導(dǎo)細胞間相互作用。對良性和惡性腫瘤的研究已顯示，癌癥經(jīng)過多步過程而發(fā)展，在所述多步過程中，隨機累積的改變增強原癌基因的表達或減少腫瘤抑制基因和DNA 修復(fù)基因的表達或功能。體細胞突變是腫瘤抑制基因和DNA修復(fù)基因的這些改變中某些改變的原因。然而，已愈加表明的是，諸如DNA過度甲基化和甲基化不足的表觀遺傳改變也經(jīng)由腫瘤抑制基因或原癌基因的失活作用或增強作用而在癌癥的發(fā)展中起著巨大作用。 CpG啟動子島的過度甲基化發(fā)生于癌癥發(fā)展的早期，且事實上這已在所有腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，使得所述過度甲基化潛在地成為極其適用的診斷標(biāo)記物，使癌癥在治療最有效時的早期就被非侵入性地檢測到。舉例來說，已報道了在診斷出鱗狀細胞肺癌之前至多3年，在吸煙者的痰液中檢測出諸如DAP激酶、pl6和MGMT的基因啟動子區(qū)的過度甲基化(Belinsky等人， (2006). Cancer Res. 66 :3338-44, Palmisano 等人，2000. Cancer Res. 60 :5954-8)。同樣地， 一小組基因的過度甲基化可能是非小細胞肺癌的有價值的早期檢測指示物。一小組基因的過度甲基化是在乳癌早期被檢測到，但在正?；蛄夹匀榉拷M織中檢測不到(Krassenstein 等人，(2004). Clin Cancer Res. 10 :28-32) CpG島中胞嘧啶的甲基化是大多數(shù)癌癥的早期事件，它導(dǎo)致包括腫瘤抑制基因的許多基因的表達減少。對腫瘤細胞DNA中CpG島甲基化的調(diào)查暗示，這種表觀遺傳改變通常足以對抗腫瘤進程中的突變影響。異常甲基化的早期檢測可引出正規(guī)篩查和早期診斷， 早期的治療最為有效。通?？稍谘寤蚱渌w液(尿液、痰液、唾液)中而并非僅僅在腫瘤組織本身中檢測到早期的表觀遺傳改變，這就意謂著可使用這些液體來非侵入性地進行表觀遺傳診斷測試。基于CpG島甲基化的診斷測試也可用于藥物開發(fā)、鑒別對這些藥物有反應(yīng)的患者群體以及治療后的監(jiān)測。近來對甲基化檢測的靈敏度的改進和對用于特定癌癥的甲基化標(biāo)志的闡明已使得通過從體液提取DNA樣本來分析腫瘤成為可行的。在疾病的相對早期，腫瘤細胞將DNA 釋放到血液中。已發(fā)現(xiàn)癌癥患者血液中的3%至90%以上的DNA具有腫瘤起源(Kim等人， (2004) J. Clin. Oncol. 22 :2363-70)。基于PCR的甲基化試驗的開發(fā)已使得從血液、痰液和尿液中非侵入性地檢測腫瘤的存在成為可能。在一項研究中，甲基化檢測在檢測異常癌變前細胞中比尿液細胞學(xué)檢查更靈敏。使用單一甲基化標(biāo)記物調(diào)查血液樣品時，臨床靈敏度 (所檢測病例的確認比例)通常較低。然而，血液樣品的臨床特異性(測試為陰性的正常對照物的比例)達到100%。臨床靈敏度應(yīng)隨評定多于單個CpG島的甲基化測試而增加。體液自身出現(xiàn)的異常甲基化的DNA并不有助于精確定位受腫瘤影響的器官。令人意外地，幾乎不需要信息來確立腫瘤的組織起源。許多甲基化篩查研究都具有已確立的甲基化標(biāo)志；與特定器官的癌癥強烈相關(guān)的甲基化CpG島的集合。在一項調(diào)查中，3至4種候選CpG島的異常甲基化足以識別出15種癌癥類型中的70-90% (Esteller等人，(2001) Cancer Res. 61 :3225-9)。開發(fā)用于原發(fā)性腫瘤的甲基化譜分析(methylation profile) 可被用于腫瘤細胞系以精確地識別原發(fā)性腫瘤的親本腫瘤的組織起源(Graziano等人， (2004) Cl in. Cancer Res. 10 :2784)。這個結(jié)果暗示，不同腫瘤類型的甲基化標(biāo)志并不明顯地受與培養(yǎng)物中的生長相關(guān)的選擇性壓力的影響。甲基化譜分析的可用性將大大增強通過簡單血液測試來檢測難以接近的器官中的癌癥的能力。對臨床樣品中的甲基化的檢測使得癌癥的早期檢測能夠?qū)崿F(xiàn)。簡單且靈敏的多重檢測試驗的開發(fā)將允許對臨床的小樣品進行譜分析而獲得多個CpG島的狀態(tài)。這種信息在診斷和治療中很有價值。用于檢測DNA甲基化的方法已使用許多方法來檢測靶DNA中的甲基化CpG (mCpG)。下文詳細描述目前使用的
三種主要方法。亞硫酸氫鹽方法.最常用的甲基化檢測方法是基于DNA的亞硫酸氫鹽修飾，這種修飾引起胞嘧啶殘基脫氨基成為尿嘧啶，同時保留甲基化胞嘧啶不被改變。PCR擴增之后，將甲基化胞嘧啶復(fù)制到胞嘧啶并將尿嘧啶復(fù)制到胸腺嘧啶。因此，在特定位置處胞嘧啶的保留指示了甲基化。隨后，例如通過序列分析、甲基化特異性PCR(MSP) (Herman等人， (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :9821-26)或雜交(例如與微陣列或印跡雜交)來分析所修飾的DNA。在MSP中，將一對甲基化的特異性寡核苷酸引物添加到經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA，并且進行PCR以擴增靶DNA。還可以對經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA進行基于熒光的定量實時 PCR(Eads 等人，(2000) Nucl. Acids Res. 28 :E32 ;Zeschnigk 等人，(2004) Nucl. Acids Res. 32 :el25)。MSP的經(jīng)校準(zhǔn)的基于熒光的變化方法拓展了實時PCR以提供對樣品中的甲基化 DNA數(shù)量的定量分析。這些基于PCR的方法的重要基本假設(shè)在于幾乎沒有被引物/探針識別的CpG位點會反映靶CpG島的整體狀態(tài)。雖然這個假設(shè)通常對大量甲基化或完全未甲基化的島來說屬實，但是部分甲基化的靶可能不易在甲基化或未甲基化特異性反應(yīng)中被計分記錄(scored)。亞硫酸氫鹽修飾的優(yōu)點在于，它將甲基化位點相對于未甲基化位點進行差異性標(biāo)記，從而允許測序方法檢測甲基化模式?？寺〉慕?jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的測序是用于甲基化檢測最常用的方法。除比基于MSP的方法提取到更大數(shù)量的CpG位點之外，它還提供了有關(guān)亞硫酸氫鹽處理成功的信息。然而，由于它的復(fù)雜性和費用，亞硫酸氫鹽測序比臨床診斷更好地適于標(biāo)記物探索。亞硫酸氫鹽處理破壞了大比例的輸入DNA，造成有限的靈敏度和對大量DNA的需求。在進行檢測試驗之前，經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的質(zhì)量控制評定是必要的，從而避免誤導(dǎo)的結(jié)果。由于亞硫酸氫鹽處理期間不完全的胞嘧啶脫氨基，基于MSP的試驗可能存在假陽性結(jié)果。經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的擴增受偏好未甲基化的DNA的PCR 偏向性的影響。雖然這個問題通常可通過最佳化引物退火條件來校正，但是可能使引物設(shè)計和測試變復(fù)雜?？墒褂脭?shù)字亞硫酸氫鹽PCR消除模板偏向性。將DNA樣品稀釋到每次反應(yīng)小于一個拷貝的平均值，從而消除模板間的競爭?？稍跊]有由克隆引入的偏向性條件下將各個分子測序。
用于分析mCpG的使用亞硫酸氫鹽處理的商業(yè)試劑盒、試劑和系統(tǒng)是可獲得的。表觀遺傳學(xué)(Berlin)提供了 MethyLight試驗的兩種變化方法，是稱為定量的 MethyLight(QM)和Heavy Methyl (HM)的定量實時PCR的改編方法。QM利用Taqman 探針來產(chǎn)生熒光信號。在擴增過程中，熒光劑從Taqman 探針切割，產(chǎn)生可被實時檢測的熒光 (Wojdacz & Dobrovic (2007) Nucl. Acids Res. 35 :e41) HM 是 QM 的改編方法，其中將阻斷劑寡核苷酸添加到反應(yīng)中。這些阻斷劑寡核苷酸能防止未甲基化DNA的擴增，產(chǎn)生增大的試驗靈敏度(Cottrell 等人，(2004)Nucl. Acids Res. 32 :elO)。Pyrosequencing 也用于對經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA的甲基化定量分析，如來自Biotage的Pyro Q-CpG系統(tǒng)所例證 (Uppsala, Sweden ；Tost 等人，(2003) Biotechniques 35:152-56)。雖然亞硫酸氫鹽修飾被廣泛使用，但是其所引起的廣泛DNA降解可在幾乎沒有分子足夠長而得以擴增時引入取樣誤差(Hirich等人，(2007)Nucl. Acids Res. 35 :e29) 0此外，試驗是耗時的，需要苛刻的堿基變性步驟并由于亞硫酸氫鹽處理期間不完全的胞嘧啶脫氨基而使假陽性結(jié)果的概率高。甲基化靈敏性的限制性內(nèi)切酶消化方法.用于檢測DNA中的mCpG的第二類型的方法依賴于通過限制性內(nèi)切核酸酶的差異性切割。用MSRE(甲基化靈敏性限制性內(nèi)切核酸酶)或MDRE(甲基化依賴性限制性內(nèi)切核酸酶)處理DNA，擴增并隨后通過微陣列或凝膠電泳進行分析。諸如HpaII和AciI的MSRE只是在它未甲基化時才切割DNA序列。MDRE是為達切割而需要DNA序列甲基化的限制性內(nèi)切核酸酶。通過用這些酶中的任一酶來處理DNA 樣品并隨后與對照樣品相比較，可確定DNA樣品的甲基化狀態(tài)。如果特定DNA樣品的消化發(fā)生在用MDRE處理之后，那么可假設(shè)DNA被甲基化。相反地，如果DNA在用MSRE處理時未經(jīng)切割，那么可假設(shè)樣品被甲基化。通過比較經(jīng)切割DNA相對未經(jīng)切割DNA的數(shù)量，可估算出甲基化的水平。這種類型的甲基化分析的常見讀出是所消化的DNA的后續(xù)擴增和熒光標(biāo)記。隨后，可將片段與微陣列文庫雜交并通過電泳來分析或簡單地解析。市售的基于限制性內(nèi)切核酸酶的系統(tǒng)包括Orion的利用微陣列讀出的 MethylScope (Lippman 等人，(2004) Nature 430 :471-76)和使用定量實時 PCR 的 MethyScreen (Ordway ^A, (2006) Carcinogenesis 27:2409—23)。MSRE/MDRE消化的優(yōu)點在于不必預(yù)處理DNA，盡管在稱為COBRA的程序中所述預(yù)處理經(jīng)常連同DNA的亞硫酸氫鹽處理一起進行(Xiong & Laird (1997) Nucl. Acids Res. 25 2532-34)。這個程序的一些缺點在于，它冗長且取決于靶DNA內(nèi)部的MSRE/MDRE識別序列的存在。此外，這種方法相對低效，從而可降低結(jié)果的可靠性。僅所評定的CpG位點是處于少量限制性內(nèi)切酶識別位點內(nèi)部的那些CpG位點，且那些位點的狀態(tài)可能并不反映所述位點所屬的整個CpG島的狀態(tài)。不完全消化導(dǎo)致頻繁的假陽性，尤其在裂解反應(yīng)物會經(jīng)歷后續(xù)的擴增步驟時如此。與諸如MSP的亞硫酸氫鹽方法相比，限制性內(nèi)切核酸酶的酶解試驗的靈敏度較差，允許檢測樣品中不少于10%的甲基化DNA(Singer-Sam等人，Nucleic Acids Res, 1990. 18 687 ；Yegnasubramanian 等)κ, Nucleic Acids Res. (2006)34 :el9)。染色質(zhì)免疫沉淀方法.常用于檢測mCpG的第三種方法是染色質(zhì)免疫沉淀法 (Chip)。通常，將細胞固定，并隨后通過使用對甲基結(jié)合蛋白特異性的抗體而使甲基化的 DNA免疫沉淀。將所得DNA擴增、標(biāo)記并通過在微陣列試驗中的雜交來分析。這種方法的優(yōu)點在于，可對活細胞進行試驗而幾乎無需或無需DNA純化。該試驗也具有增大的靈敏度，因為在分析之前除去了不需要的污染DNA。然而，ChIP程序是極其耗時的，涉及若干步驟并需要昂貴的試劑。一些試驗可能耗費長達5天來完成。使用甲基結(jié)合蛋白的方法.將甲基化的DNA與未甲基化的DNA分離的替代的更靈敏的方法涉及使用甲基-CpG結(jié)合域(MBD)蛋白或抗5-甲基-C的抗體。MBD蛋白對甲基化的 CpG位點具有高的親和力而對未甲基化的DNA具有極低親和力(Fraga等人，Nucleic Acids Res. (2003)31:1765-74)。將樣品與固定化的MBD蛋白以各種格式(磁珠、柱、PCR管壁) 一起孵育。甲基化的DNA俘獲通常后接所俘獲DNA的擴增?；贛BD的DNA檢測具有的主要優(yōu)點在于，所有甲基化位點都可有助于結(jié)合，從而允許對整個島取樣以用于甲基-Cpk。 這種特征使結(jié)合試驗在部分甲基化島中的未甲基化位點對應(yīng)于引發(fā)位點/探針位點時，不易傾向于影響基于MSP和基于限制性內(nèi)切核酸酶的試驗的假陰性aegnasubramanian等人，Nucleic Acids Res. (2006) 34 :el9)。這種情況可能常見于含有早期腫瘤細胞的臨床樣品中，所述腫瘤細胞含有部分甲基化CpG島?；贛BD的結(jié)合試驗極為敏感，允許檢測 500個未甲基化分子中的少到160pg的甲基化DNA(相當(dāng)于約25個細胞)或1個甲基化分子(Gebhard 等人，Nucleic Acids Res. (2006)34 :e8256)。這接近 MSP 的靈敏度(1 個甲基化分子/1，000未甲基化分子)。COMPARE MBD試驗因在結(jié)合步驟之前包括了用HpaII ( 一種MSRE)的消化而可與實時MSP —樣靈敏(1個甲基化分子/10，000未甲基化分子)。未甲基化的DNA在PCR引發(fā)位點之間的位置處的裂解產(chǎn)生了高靈敏度與DNA混合物，所述DNA 混合物含有完全甲基化的人工甲基化DNA (Yegnasubramanian等人，Nucleic Acids Res. (2006)34:el9)o然而，這個策略可遭受與使用限制內(nèi)切核酸酶相關(guān)的缺點，因為臨床樣品中的一些部分甲基化島會被計為未甲基化的aegnasubramanian等人，同上)?？紤]到CpG甲基化在癌癥發(fā)展和進程中的重要性，用于甲基化CpG DNA的快速、可靠和靈敏的測試將為癌癥篩查提供重要和適用的工具。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于檢測樣品中的靶多核苷酸的方法。所述方法通常涉及，使含有靶多核苷酸的樣品與引物對接觸，所述引物對與所述多核苷酸的靶序列特異性地雜交并將所述靶序列擴增。對這個步驟來說，引物對包括具有與側(cè)接所述靶多核苷酸序列的第一序列互補的3'序列和5'俘獲標(biāo)簽(capture tag)的第一引物。所述對的第二引物具有在相反鏈上與側(cè)接所述多核苷酸靶序列的第二序列互補的3'序列和提供用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄 (Abscription)的構(gòu)件(means)的5'序列。在使用這種引物對的擴增(例如PCR)之后， 使擴增的靶序列與結(jié)合5'俘獲標(biāo)簽的固定化分子接觸，以俘獲所擴增的靶序列。隨后，由用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的構(gòu)件轉(zhuǎn)錄至少一個Abscript，并將所述Abscript作為靶多核苷酸存在的檢測指示。俘獲通常是經(jīng)由親和力試劑或與或能夠與固體支持物結(jié)合的結(jié)合對來進行。舉例來說，5'俘獲標(biāo)簽可為可容易摻入到寡核苷酸引物中的生物素，并且與5'俘獲標(biāo)簽結(jié)合的分子可為固定在固體支持物上的鏈霉親和素(streptavidin)。諸如珠、管和微量滴定板的多種固體支持物均適用于本發(fā)明的方法。適宜地，鏈霉親和素和其他結(jié)合對分子可與磁珠結(jié)合，從而允許固相與呈溶液的未結(jié)合試劑的快速分離。在本發(fā)明的某些實施方案中，可在程序的后續(xù)步驟之前，將未結(jié)合試劑、引物和多核苷酸從固定和俘獲的多核苷酸中洗滌， 從而可以提高方法的效率。然而，這并非必要的，因為整個方法可在單個罐或管中進行而無需分離步驟。使用例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶或熱穩(wěn)定RNA聚合酶的PCR是通常用于擴增步驟。然而，本領(lǐng)域中已知的各種靶擴增方法可適用于本發(fā)明的方法。用于檢測如本文所述的Abscript的各種方法均可利用，包括但不限于質(zhì)譜分析法、毛細管電泳或薄層色譜法。在某些方面中，可將可檢測的經(jīng)標(biāo)記核苷酸或其他標(biāo)記摻入到由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的Abscript信號中，以增大靈敏度或擴展可使用的檢測技術(shù)。例如，可檢測的經(jīng)標(biāo)記核苷酸可為熒光核苷酸。由本發(fā)明產(chǎn)生的Abscript通常較短，例如長度為3_20個核苷酸。長度少到3個核苷酸的Abscript通常用于本文所述的方法。在擴增期間使用的所述對的第二引物具有在相反鏈上與側(cè)接所述多核苷酸靶序列的第二序列互補的3'序列和提供用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的構(gòu)件的5'序列。在某些實施方案中，所述構(gòu)件是由用于標(biāo)記或識別靶的α_ΤΑΡ(靶連接探針， Target Attachment ftx)be)序列來提供。α-TAP被設(shè)計成與TAP序列互補，并允許連接 APC (流產(chǎn)啟動子盒，Abortive Promoter Cassette)。為將α-TAP維持為單鏈，進而可用于與TAP序列雜交，可在5' α-TAP序列與3'序列之間包括非天然核苷酸，所述3‘序列與側(cè)接引物中靶的序列互補。諸如亞乙烯基-脫氧腺苷的非天然核苷酸在擴增期間不會被聚合酶識別。因此，引物中非天然核苷酸下游的序列不被復(fù)制，并且那些序列仍為單鏈。一旦APC經(jīng)由所形成的TAP- α -TAP雜交體與擴增的靶結(jié)合，就由APC轉(zhuǎn)錄作為檢測靶存在的指示物或信號的Abscript。所結(jié)合的APC為雙鏈區(qū)或因探針的雜交變成雙鏈。在本發(fā)明的某些實施方案中，全雙鏈體APC可在擴增反應(yīng)期間由包括一個APC鏈的引物序列產(chǎn)生。適宜地，可在擴增期間，通過在反應(yīng)中包括熱穩(wěn)定RNA聚合酶和核苷酸來進行流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄。因此，在這些實施方案中，用于擴增反應(yīng)的第二引物包括APC序列。由于產(chǎn)生(例如通過PCR產(chǎn)生)雙鏈體APC，所以從APC來轉(zhuǎn)錄Abscript，并可在Abscript產(chǎn)生時來檢測它們(例如實時檢測)，或通過本文所述的Abscript檢測方法在稍后的時間進行分析。本發(fā)明提供用于檢測各種各樣目標(biāo)靶多核苷酸(包括DNA靶和RNA靶)的快速、 靈敏和特異的方法，并與PCR相比提供擴展全面能力的檢測技術(shù)。與PCR不同，該方法也適于檢測諸如甲基化DNA靶的被修飾的多核苷酸靶。根據(jù)這類方法，首先通過切割含有甲基化靶多核苷酸(諸如CpG島)的基因組DNA樣品來分離甲基化的基因組DNA片段，同時限制性內(nèi)切酶在切割期間不切割靶多核苷酸或產(chǎn)生靶的合適代表性片段。隨后，使經(jīng)切割的基因組DNA與諸如本文所述的GST-MBD2融合蛋白的固定化甲基結(jié)合域接觸。這樣，甲基化的基因組DNA片段被固定，且因此與樣品中的非甲基化的DNA片段分離。任選地，甲基化的基因組DNA片段可從固定化的MBD中洗脫并在分析之前回收。例如，在GST-MBD2融合蛋白用于固定甲基化CpG島靶的情況下，可將融合蛋白的GST部分與谷胱甘肽樹脂(在與DNA 相互作用之前或之后)結(jié)合，并可用谷胱甘肽洗脫所結(jié)合的甲基化DNA片段。本發(fā)明的方法也適于多次復(fù)用。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，通過在反應(yīng)中包括多個第一和第二引物對來同時處理多種不同的靶多核苷酸，各引物對被設(shè)計成與不同的靶多核苷酸特異性地雜交。通過設(shè)計用于各種靶的不同的獨特APC，可由所產(chǎn)生的APC信號來識別多種靶的各種靶的存在，所述不同的獨特APC是經(jīng)由引物擴增(作為含有APC的引物的組成部分或如本文所述經(jīng)由TAP-α-TAP雜交體)與靶連接。例如，各APC可根據(jù)分子量或核苷酸序列來設(shè)計以便可以區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案，可在單一試驗中檢測到至少5、10、20、50、100個或更多的靶。附圖簡述

圖1示出流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄(abortive transcription)的過程，本發(fā)明的Abscription 方法拓展了此方法。當(dāng)RNA聚合酶(RNAP)在啟動子處俘獲時，流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄發(fā)生于大多數(shù)啟動子上，重復(fù)制得短的流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物(abortive transcript)(通常長2至12個nt)。在流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄期間，RNAP不會移位或離開啟動子。在正常轉(zhuǎn)錄期間，RNAP最后經(jīng)歷構(gòu)象變化成為穩(wěn)定的逐漸延伸的復(fù)合物(一種稱為啟動子逃離的過程)，隨后持續(xù)轉(zhuǎn)錄直到到達終止信號。已開發(fā)出人工啟動子或流產(chǎn)啟動子盒(APC)，它們俘獲流產(chǎn)復(fù)合物中的RNAP，每分鐘反復(fù)合成出數(shù)千個相同的短寡核苷酸。各APC被設(shè)計成制造可分離和定量的具有特定長度和特異序列的不同Abscript。圖2示出了使用Abscription 檢測蛋白質(zhì)、RNA和DNA靶。將APC連接于特異性地與分子靶結(jié)合的靶連接探針(TAP)(圖2A)。對DNA和RNA的檢測來說，TAP包括特異性地與核酸靶雜交的寡核苷酸或特異性地與核酸靶結(jié)合的蛋白質(zhì)(圖2B)。對蛋白質(zhì)檢測來說，APC可連接到與蛋白質(zhì)靶結(jié)合的任何分子，諸如抗體或配體。圖2C示出本發(fā)明的一個實施方案，其中APC與抗體連接。與用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的策略相似，可將靶蛋白質(zhì)“夾在”APC-抗體復(fù)合物與固定在固體支持物上的第二抗體之間，以便俘獲和檢測蛋白質(zhì)靶。圖3示出Abscription 的二核苷酸起始以及添加一個NTP之后的終止?？赏ㄟ^包括如所描繪的鏈終止NTP (R3處的3 ‘ -O-Me-NTP)或通過從反應(yīng)中省略一個或多個NTP來限制 Abscript 長度。Rl =親和力標(biāo)簽，熒光標(biāo)簽；R2 = 0H、0Me、H ；R3 = 0H、0Me、H ;R4 = OH、OMe、H。圖4A和圖4B示出了通過質(zhì)譜分析法檢測Abscript。通過反相HPLC來分級分離包括起始子GpA和GTP的Abscription 反應(yīng)。將柱的輸出引入質(zhì)譜儀中。圖4A顯示了基于總離子計數(shù)與保留時間的函數(shù)變化的柱譜分析。圖4B顯示三核苷酸Abscript GAG峰的離子光譜(保留時間5. 4分鐘)。單電荷和雙電荷GAG物質(zhì)的m/z值分別為956. 1和477. 6。 雙電荷物質(zhì)的鈉加合物的m/z值為978. 2。圖5是用于本發(fā)明的甲基化檢測方法的GST-MBD蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5A顯示 MBD域與GST域羧基末端的連接。連接所述域的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)含有由箭頭指示的凝血酶切割位點。圖5B顯示用于小鼠MBD2b的DNA結(jié)合域的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。劃線的氨基酸對應(yīng)于MBD蛋白的DNA結(jié)合域中的保守殘基(Ohki等人，(1999)EMB0 J. 18 :6653-61)。圖5C顯示使用固定化GST-MBD的甲基化DNA分級分離的結(jié)果。S(上清液)分級分離物含有擴增的未甲基化的SNRPN CpG島DNA。El含有從固定蛋白質(zhì)洗脫的擴增的甲基化SNRPN CpG島DNA。分級分離物E2和E3是來自同一固定蛋白質(zhì)的另外兩個系列的洗脫液。圖5D顯示Hela細胞中的未甲基化的PTGS2 DNA的分級分離。在未結(jié)合的上清液分級分離物S中回收到所有PTGS2 DNA。圖6是流程圖，示出用于基于α-TAP Abscript ion 的CpG甲基化檢測的策略，包括TAP-APC與靶CpG島的擴增片段的結(jié)合。通過數(shù)字指示方法中的步驟。圖6A示出含有甲基化CpG的DNA的初始俘獲。步驟1 用固定化GST-MBD蛋白使甲基化的DNA片段與未甲基化的DNA片段分離。步驟2 通過熱處理或?qū)Φ鞍酌富蚬入赘孰牡谋┞夺尫偶谆?DNA片段。圖6B顯示擴增標(biāo)簽和所標(biāo)記DNA片段的俘獲。步驟3 用親和力標(biāo)記(諸如所示的生物素(B))來標(biāo)記靶CpG島，并且在PCR期間，經(jīng)由摻入生物素化引物和在引物序列與反TAP序列(a-TAP)之間含有非編碼核苷酸的引物進行單鏈延伸。步驟4:使生物素化擴增子與鏈霉親和素磁珠結(jié)合。步驟5 通過TAP序列與α -TAP序列之間的雜交將APC與擴增子結(jié)合。Abscript ion 是通過使RNA聚合酶(RNAP)與含有APC的珠粒固定復(fù)合物接觸來進行。圖7A-7C示出示例性靶特異性擴增引物與反TAP ( α -TAP)引物/探針之間的相互作用。圖7A示出用于CpG島擴增的PCR引物和它們在擴增子中的相對位置。圖7B和圖7C 示出因設(shè)計較差的α "TAP引物/探針的不利試驗結(jié)果。圖8顯示出TaqMan PCR相對圖6中描繪的Abscr ipt ion /PCR方法的DNA檢測相對靈敏度。從起始拷貝數(shù)/PCR為9000到30開始擴增來自未分級分離的甲基化HeLa DNA 的 GSTPl CpG 島的片段。圖 8A 顯示 TaqMan PCR 結(jié)果。TaqMan PCR 引物是 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO :4。檢測9000個拷貝需要觀次PCR循環(huán)。圖8B顯示四次PCR循環(huán)后的Abscription /PCR檢測結(jié)果。流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄/PCR 引物是 SEQ ID N0:12 和 SEQ ID N0:13。 TAP-APC 是通過退火 SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 32 來制得。APC 編碼 Abscript GAG。使用薄層色譜法(TLC)和UV造陰影法檢測Abscript。面積指的是含有Abscript的色譜峰的面積。圖9顯示了對指定數(shù)量的輸入DNA進行PCR擴增，接著進行2小時和8小時的 Abscr ipt ion 之后，使用TLC的CT5標(biāo)記Abscript檢測。圖10是流程圖，顯示在使用APC-引物的情況下，使用APC向擴增子中的直接摻入時的用于甲基化DNA檢測的策略。數(shù)字指示策略中的步驟。步驟1和2描繪使用如圖6A 所示的固定化GST-MBD蛋白的甲基化DNA的分級分離。步驟3顯示中靶序列與用于將APC 連接到擴增子的引物之間的關(guān)系。左側(cè)的引物是常規(guī)PCR引物。右側(cè)引物具有3'引發(fā)序列和5'末端處的單鏈APC。步驟4和5表示靶標(biāo)的PCR擴增。步驟6表示PCR之后的 Abscr ipt ion 步驟。PCR反應(yīng)物補充有RNA聚合酶、起始子和一種或多種NTP。圖11示出用于GAPDH CpG島的APC啟動子對的證實。圖IlA顯示了對歸結(jié)于因 APC引物C443的自引發(fā)的背景信號和歸結(jié)于C443(SEQ ID NO :33)與反向引物C446 (SEQ ID NO 34)之間的引物-二聚體的形成的背景的評估。在56.4°C至68.5°C的退火溫度范圍內(nèi)進行了缺乏僅含有C443或含有C443和C446的組合的DNA的PCR反應(yīng)，接著進行1小時的 Abscr ipt ion 。通過TLC-UV造陰影法分析Abscript的產(chǎn)生。只有含有HeLa DNA的陽性對照才產(chǎn)生Abscript GAG。圖IlB顯示來自同一樣品組的Abscript的LC-MS檢測結(jié)果。發(fā)明詳述定義應(yīng)理解，上文一般描述和下文詳細描述僅僅是示例性和解釋性的，并非限制所要求保護的本發(fā)明。如本文所使用，除非另外特別地說明，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。如本文所使用，除非另外說明，否則“或”意思是“和/或”。如本文所使用，術(shù)語“包含”和“包括” 或其任何其他的變化形式都欲涵蓋非排他性的包括，以使得包括要素清單的方法、組合物、反應(yīng)混合物、試劑盒或裝置并不只是包括那些要素本身，而可以包括未明確列出的或此種方法、組合物、反應(yīng)混合物、試劑盒或裝置固有的其他要素。本文使用的章節(jié)標(biāo)題僅出于編寫目的，并不應(yīng)解釋為對所描述標(biāo)的物的限制。除非提供特定的定義，否則關(guān)聯(lián)使用的命名法和本文所述的分子生物學(xué)、生物化學(xué)和有機化學(xué)的實驗程序和技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的命名法和實驗程序和技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)和生物學(xué)符號和縮寫可與由這類符號和縮寫表示的全名互換使用。因此，例如，術(shù)語“脫氧核糖核酸”和“DNA”應(yīng)理解為具有相同的含義。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于例如化學(xué)合成、化學(xué)分析、 重組DNA方法和寡核苷酸合成。反應(yīng)和純化技術(shù)可例如使用試劑盒，根據(jù)制造商的說明書、 按本領(lǐng)域中通常所完成或如本文所述來實施。通常，可根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)方法和如遍及本說明書所引用和論述的各種一般的或更特定的參考文獻中所述的來實施前述技術(shù)禾口程序。參見例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)) ；Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons Inc. , N. Y. (2003)), 其中的內(nèi)容可因任何目的而以引用的方式全部并入本文中。如本文所使用的“約”意思是被稱為“約”的數(shù)字包含所述的數(shù)字加上或減去所述數(shù)字的1-10%。例如，“約”50個核苷酸可意謂著45-55個核苷酸或視情況而定少達49-51 個核苷酸。無論何時在本文中出現(xiàn)時，數(shù)值范圍(諸如“45-55”)指的是給定范圍內(nèi)的各個整數(shù)；例如，“45-55個核苷酸”意思是核酸可含有45個核苷酸、46個核苷酸，依此類推，直到并包括55個核苷酸。 如本文所使用的“轉(zhuǎn)錄”指的是通過RNA聚合酶(例如依賴DNA的RNA聚合酶)催化的一條DNA鏈(即模板)的RNA拷貝的酶促合成?！傲鳟a(chǎn)轉(zhuǎn)錄(abortive transcription) ”是RNA聚合酶介導(dǎo)的過程，其反復(fù)合成寡核苷酸和終止寡核苷酸的合成，所述寡核苷酸對應(yīng)于互補核酸模板序列的至少一部分?；铙w內(nèi)合成的流產(chǎn)寡核苷酸在核苷酸長度上不同，并且與轉(zhuǎn)錄起始位點處或其附近的序列互補。"Abscription ”是經(jīng)最佳化用于活體外分析用途的一種流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄形式，用以在活體外以高頻率從合成或天然存在的啟動子序列反復(fù)產(chǎn)生短的均一 RNA轉(zhuǎn)錄物或“流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物(abscript)”。本文使用術(shù)語“Abscript”(首字母大寫)來將Abscript ion 反應(yīng)或試驗中產(chǎn)生的最佳化合成轉(zhuǎn)錄物與更一般的術(shù)語“流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物”相區(qū)別，所述更一般的術(shù)語“流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物”也涵蓋在與天然發(fā)生的轉(zhuǎn)錄一樣的正常轉(zhuǎn)錄過程期間產(chǎn)生的短的流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物。“反復(fù)”指的是重復(fù)合成目標(biāo)序列的多個相同或大體上相同的拷貝。如本文所使用的“終止子”或“轉(zhuǎn)錄終止子”指的是使化合物、復(fù)合物或方法終止的 RNA鏈。本發(fā)明的終止子可例如為核苷酸類似物，其可在RNA合成期間摻入到RNA鏈中，以防止額外的核苷酸添加到RNA鏈上。如本文所使用的“擴增”指的是制造多核苷酸(諸如DNA片段或區(qū)域)的相同拷貝的過程。擴增通常是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來完成，但本領(lǐng)域中已知的其他方法可適于擴增本發(fā)明的DNA片段。“靶DNA序列”或“靶DNA”是需要進行檢測、表征或定量分析的目標(biāo)DNA序列。靶 DNA的實際核苷酸序列可為已知的或未知的。靶DNA通常是對其查詢CpG甲基化狀態(tài)的DNA?！鞍蠨NA片段”是含有靶DNA序列的DNA的區(qū)段?？赏ㄟ^包括例如剪切或超聲處理的任何方法來產(chǎn)生靶DNA片段，但其最通常是通過用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶消化來產(chǎn)生。如本文所使用，“模板”是由其合成互補寡核苷酸或多核苷酸拷貝的多核苷酸。“合成”通常指的是經(jīng)由化學(xué)或酶促手段產(chǎn)生核酸的過程?；瘜W(xué)合成通常是用于產(chǎn)生可使用的核酸的單鏈和引物和探針。酶介導(dǎo)的“合成”涵蓋從模板的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。合成包括制造靶的單拷貝或多拷貝?！岸嗫截悺币馑际侵辽?個拷貝?！翱截悺辈⒉槐匾庵^與模板序列的理想的序列互補性或一致性。舉例來說，拷貝可包括核苷酸類似物、在合成期間發(fā)生的有意序列改變(諸如，經(jīng)由包含可與模板雜交而不與模板互補的序列的引物引入的序列改變)和/或序列誤差。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸(分子)”可互換使用來指具有任何長度的核苷酸的多聚體形式。多核苷酸可含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類似物。核苷酸可被修飾或未被修飾，并具有任何三維結(jié)構(gòu)，且可執(zhí)行已知或未知的任何功能。術(shù)語“多核苷酸” 包括單鏈、雙鏈和三鏈螺旋分子。下面是多核苷酸的非限制性實施方案基因或基因片段、 外顯子、內(nèi)含子、1^嫩31 嫩、沙嫩、核酶、(^嫩、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物?！肮押塑账帷敝傅氖蔷哂薪橛?與約100個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸(通常為DNA) 的多核苷酸。寡核苷酸又稱為寡聚物或寡聚體(oligo)，并可從基因和其他生物材料分離或通過本領(lǐng)域中已知的方法化學(xué)合成。“引物”指的是通常為單鏈的含有至少6個核苷酸的寡核苷酸，其提供用于啟動酶介導(dǎo)的核酸合成的3'-羥基末端?！岸嗪塑账崽结槨被颉疤结槨?是與互補多核苷酸序列特異性地雜交的多核苷酸。如本文所使用，“特異性地結(jié)合”或“特異性地雜交”指的是一個分子與另一個分子在給定條件下的結(jié)合、形成雙鏈體或雜交。因此， 探針或引物僅在給定結(jié)合條件下與它的預(yù)期靶多核苷酸“特異性地雜交”，并且抗體僅在給定結(jié)合條件下與它的預(yù)期靶抗原“特異性地結(jié)合”。給定條件是被指示用于結(jié)合或雜交的那些條件，且包括完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員學(xué)識范圍內(nèi)的緩沖液、離子強度、溫度和其他因素。 本領(lǐng)域技術(shù)人員也可學(xué)習(xí)獲得有關(guān)破壞或解離特異性結(jié)合，因而洗脫或熔融例如抗體-抗原、受體-配體和引物-靶多核苷酸組合的條件?！昂怂嵝蛄小敝傅氖蔷哂泄押塑账峄蚨嗪塑账?諸如DNA或RNA)中的核苷酸堿基的序列。對雙鏈分子來說，單鏈可用以表示兩個鏈，互補鏈通過Watson-Crick堿基配對來推定。術(shù)語“互補的”或“互補性”是用于指第一多核苷酸(可為寡核苷酸)，其與第二多核苷酸(也可為寡核苷酸)呈“反平行締合(antiparallel association) 如本文所使用，術(shù)語“反平行締合”指的是對準(zhǔn)兩個多核苷酸以使得兩個締合的多核苷酸的個體核苷酸或堿基大體上按照Watson-Crick堿基配對法則來配對。互補性可能是“部分的”，其中多核苷酸僅有一些堿基是根據(jù)堿基配對法則而匹配?；蛘?，多核苷酸之間可能有“完全”或“整體”的互補性。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過考量許多變量而經(jīng)驗性地確定雙鏈體穩(wěn)定性，所述變量包括例如可為寡核苷酸的第一多核苷酸的長度、第一多核苷酸的堿基組成和序列，以及離子強度和錯配堿基對的發(fā)生率。如本文所使用，術(shù)語“雜交”用于指包括含有6個或更多核苷酸的多核苷酸和寡
12核苷酸的互補核酸的堿基配對。雜交和雜交強度(即，核酸之間締合的強度)受到諸如以下的因素影響核酸之間的互補程度、所涉及反應(yīng)條件的嚴格性、所形成雜交物的解鏈溫度 (Tffl)以及雙鏈體核酸內(nèi)的G C比率。通常，“雜交”方法涉及將互補多核苷酸退火至靶核酸(即，欲通過直接或間接手段檢測的序列)。含有互補序列的兩個多核苷酸和/或寡核苷酸經(jīng)由堿基配對相互作用而彼此定位并彼此退火的能力是已完全公認的現(xiàn)象?！皬?fù)合物”是組分的組裝體。復(fù)合物可能是或可能不是穩(wěn)定的并可直接地或間接地被檢測。舉例來說，如本文所述，給定反應(yīng)的某些組分和反應(yīng)的產(chǎn)物類型時，可推定復(fù)合物的存在。舉例來說，在本文所述的流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄方法中，就最終的反復(fù)合成產(chǎn)物，諸如最終的流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄或復(fù)制產(chǎn)物而言，復(fù)合物通常是中間物?！凹谆敝傅氖窍蚍肿?、通常是向DNA或RNA中的核苷酸堿基中添加甲基(-CH3)。 “mCpG”指的是5' -CG-3' 二核苷酸，其中位置5 (5-甲基胞嘧啶或5_Me C)處的C被甲基化?！癈pG島”是含有高頻率的CpG 二核苷酸的基因組區(qū)。CpG島存在于哺乳動物基因的40% 或接近40%的啟動子中，并且人類啟動子的約70%具有高CpG含量。參見例如!^temi等人，(2005)Nucleic Acids Res. 33 :el76. doi :10.1093/nar/gni180. PMID 16314307。如本文所使用的“啟動子”指的是促進鄰近基因的轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)。啟動子通常是基因中轉(zhuǎn)錄起始的開始位點的5'和其近端，并指導(dǎo)RNA聚合酶和相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子到基因轉(zhuǎn)錄的正確位置?！拔㈥嚵小焙汀瓣嚵小笨苫Q使用來指化合物、樣品或分子(諸如寡核苷酸或多核苷酸)的集合的布置。陣列通?！翱蓪ぶ贰币允沟眉系母鱾€成員在布置的內(nèi)部具有獨特的可識別的位置。陣列可形成在諸如載玻片的固體基底上，或諸如硝化纖維素膜的半固體基底上，或諸如管或微量滴定板孔的容器中。陣列的典型布置是諸如使用微量滴定板時的8行乘12列構(gòu)造，然而適用于本發(fā)明的方法的其他布置完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的學(xué)識范圍內(nèi)。術(shù)語“固體支持物”指的是可用于固定的任何固相，例如俘獲探針或其他寡核苷酸或多核苷酸、多肽、抗體或其他所需的分子或復(fù)合物。合適的固體支持物是本領(lǐng)域中熟知的且包括但不限于反應(yīng)托盤(諸如微量滴定板)的孔壁、試管壁、聚苯乙烯珠、順磁性珠或非磁性珠、載玻片、硝化纖維素膜、尼龍薄膜和微顆粒(諸如乳膠顆粒)。用于固體支持物的典型材料包括但不限于聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、纖維素、瓊脂糖、右旋糖苷、玻璃、尼龍、乳膠及其衍生物。另外，固體支持物可被涂覆、衍生化或另外改性以促進所需分子的粘著力， 和/或阻止非特異性結(jié)合或其他不需要的相互作用。特定“固相”的選擇通常不是關(guān)鍵的， 而可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所使用的方法和試驗來選擇。適宜地，可選擇固體支持物來適應(yīng)各種檢測方法。舉例來說，96或384孔板可用于(例如)通過機器人工作站自動進行的試驗，和/或使用(例如)讀板器來檢測的那些試驗。對可涉及例如利用基于薄膜的顯現(xiàn)方法的自動射線照相檢測步驟的本發(fā)明方法來說，固體支持物可為薄膜，諸如硝化纖維素或尼龍薄膜；凝膠或薄層色譜板。用于將分子固定在固相上的合適方法包括離子、疏水性、 共價相互作用及類似作用和其組合。然而，固定方法通常不是重要的，而可能涉及尚未表征的吸附機理。如本文所使用的“固體支持物”可因此涉及不溶解或可通過后續(xù)反應(yīng)而變得不溶解的任何材料?？筛鶕?jù)吸引和固定俘獲試劑的固有能力來選擇固體支持物?；蛘撸腆w支持物可保留具有吸引和固定例如“俘獲”試劑的能力的額外分子。如本文所使用的“抗體”包括天然存在的物質(zhì)，諸如多克隆抗體和單克隆抗體，以及天然存在的分子的任何抗原結(jié)合部分、片段或亞基，諸如抗體的Fab、Fab'和F(ab)2等片段。還被涵蓋用于本發(fā)明的方法的是重組抗體、截短抗體、單鏈抗體、嵌合抗體和雜合抗體， 包括但不限于人源化抗體和靈長類動物化抗體，和其他非天然存在的抗體形式。本發(fā)明是基于稱為Abscript ion 的分子檢測技術(shù)，而Abscript ion 是基于稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的自然現(xiàn)象(圖1)。Abscription 是用于檢測和定量包括蛋白質(zhì)、核酸、SNP和CpG 甲基化的廣泛范圍靶的穩(wěn)健等溫方法(美國專利申請第10/602，045號、第10/790，766號以及第 10/488,971 號；美國專利第 7，045，319 號和第 7, 226, 738 號)。Abscr ipt ion 發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的起始階段期間，這個階段中，RNA聚合酶(RNAP)反復(fù)產(chǎn)生短的RNA或流產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄物(Abscript)，同時仍與啟動子緊緊地結(jié)合(Hsu, Biochim. Biophys. Acta(2002) 1577 191-207 ；Hsu 等人，Biochemistry(2003)42 :3777-86 ；Vo 等人，Biochemistry(2003)42 3798-811 ；Vo 等人，Biochemistry (2003)42 :3787-97 ；Hsu 等人，Biochemistry (2006)45 8841-54)。啟動子和最初所轉(zhuǎn)錄區(qū)段的序列對優(yōu)勢Abscript的長度以及它們的合成速率具有顯著效應(yīng)(Hsu等人，Biochemistry (2006) 45 :8841-54.觀)。稱為流產(chǎn)啟動子盒(APC) 的多個最佳高度流產(chǎn)啟動子已被開發(fā)和最佳化來以極高速率制得具有不同序列和長度 (介于3與12個nt之間)的Abscript0短的Abscript的產(chǎn)生是極為高效的，因為RNAP并不會像它在產(chǎn)生各個全長轉(zhuǎn)錄物之后那樣在各輪次的截短RNA合成之間從啟動子上解離，從而持續(xù)以高的周轉(zhuǎn)速率產(chǎn)生 Abscript直到底物耗盡為止。這會引起每分鐘每APC數(shù)千個Abscript的極為快速的產(chǎn)生。 Abscription 是信號擴增方法，而不是靶擴增方法。本發(fā)明提供由包括最佳化甲基結(jié)合域(MBD)多肽的mCpG靶位點探針檢測DNA中的CpG甲基化的簡單靈敏方法。mCpG靶位點探針可直接或間接與信號產(chǎn)生器偶聯(lián)，所述信號產(chǎn)生器產(chǎn)生可作為CpG甲基化指示物來測量的可檢測信號。在本發(fā)明的某些實施方案中，信號產(chǎn)生是基于流產(chǎn)啟動子盒(APC)信號產(chǎn)生器經(jīng)由mCpG靶特異性探針與靶mCpG位點結(jié)合的Abscr ipt ion 方法。RNA聚合酶從APC中的合成或天然存在的流產(chǎn)啟動子產(chǎn)生均一、短的RNA分子，以作為甲基化CpG存在的信號(指示物)。在本發(fā)明的其他實施方案中，信號產(chǎn)生盒可經(jīng)由PCR或其他復(fù)制和/或擴增方法來產(chǎn)生可檢測的RNA或DNA信號。因為不需要亞硫酸氫鹽處理，所以本發(fā)明的方法提供了超過當(dāng)前CpG甲基化檢測方法的顯著優(yōu)點。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，可完全避免與靶DNA的化學(xué)處理相關(guān)的廣泛的DNA降解和序列復(fù)雜性的降低。本發(fā)明的方法是快速的并通?？稍谝惶熘畠?nèi)完成。此外，本發(fā)明可適于多重和自動化應(yīng)用。本發(fā)明的某些基于Abscription 的甲基化檢測試驗提供將線性穩(wěn)健的信號擴增方法(Abscription )與靶擴增方法(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR)結(jié)合的獨特能力。這樣提供了極高的靈敏度并允許測試僅使用少量的起始物料。另外，與諸如從樣品的各個靶產(chǎn)生相同信號分子的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的其他信號擴增方法不同，基于 Abscription 的擴增可被格式化以從各個靶產(chǎn)生不同的信號。隨后，可通過各種方法來檢測呈短寡核苷酸形式的這些信號?；贏bscription 的試驗需要的人工作時比其他DNA甲基化檢測試驗更少，試劑成本極有競爭力并且儀器裝備成本低。另外，這些試驗通過包括陽性對照和陰性對照模板來產(chǎn)生高度特異性的檢測和比用于靶檢測的其他方法更少的假陽性。Abscript ion 技術(shù)Abscription 技術(shù)是基于以下觀察結(jié)果在啟動全長RNA的轉(zhuǎn)錄之前，通過RNA聚合酶在制得全長RNA轉(zhuǎn)錄物之前合成流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物。如下文所述，流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物是轉(zhuǎn)錄過程的正常副產(chǎn)物，也可與全長RNA轉(zhuǎn)錄物(是轉(zhuǎn)錄過程的功能性信息產(chǎn)物)在大小和制造它們的方式上予以區(qū)分。轉(zhuǎn)錄過程.轉(zhuǎn)錄是真核生物和原核生物從DNA模板(即基因)選擇性合成RNA 轉(zhuǎn)錄物時所利用的復(fù)雜和高度受控的過程(綜述參見Record等人，(1996)Escherichia coli and Salmonella, (Neidhart 編；ASM Press, Washington, DC) ；deHaseth 等人’ (1998) J. Bact. 180 :3019-25 ；Hsu (2002) Biochim. Biophys. Acta. 1577 :191-207 ；Murakami & Darst (2003) Curr. Opin. Struct. Biol. 13 :31-39 ;Young 等人，(2002) · Cell. 109 : 417-120)。細胞環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄包括5個階段1.預(yù)起始，在此期間使轉(zhuǎn)錄機器(例如RNA聚合酶(RNAP)和轉(zhuǎn)錄因子)募集到啟動子；2.起始，在此期間開始合成RNA;3.啟動子逃離， 在此期間RNA聚合酶離開啟動子且流產(chǎn)起始停止(通常在近似12-mer RNA的合成之后)； 4.延伸，在此期間RNAP沿模板DNA鏈逐漸行進，從而合成全長RNA轉(zhuǎn)錄物；和5.終止，在此期間RNA合成停止且RNAP從模板DNA上解離。在全長RNA轉(zhuǎn)錄之前產(chǎn)生流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物.通常，RNAP在它第一次試圖從啟動子上逃離時不能成功，取而代之的是，其卷入合成與釋放被稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物的短RNA產(chǎn)物的多次流產(chǎn)循環(huán)中。僅在RNAP成功合成具有臨界長度的RNA產(chǎn)物時，RNAP才不可撤銷地中斷它與啟動子DNA的相互作用，并開始沿DNA模板移位，逐漸合成全長RNA轉(zhuǎn)錄物(參見Hsu (2002) Biochim. Biophys. Acta. 1577 :191-207 ；Hsu 等人，口00；3) Biochemistry 42 :3777-86 ；Vo 等人，(2003)Biochemistry 42 :3787-97 ；Vo 等人，(2003)Biochemistry :42 :3798-11)。在啟動子逃離(第三階段，上文)之前，RNAP仍在啟動子區(qū)域處或其附近與模板DNA結(jié)合，從而允許在短時間內(nèi)的多輪次的流產(chǎn)合成。始icWpiio/7 技術(shù).Abscription 技術(shù)拓展了流產(chǎn)RNA合成的自然現(xiàn)象，從而產(chǎn)生大量可檢測的流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物(Abscript)。Abscription 是基于流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的等溫、穩(wěn)健、線性信號產(chǎn)生系統(tǒng)。在Abscription 方法中，流產(chǎn)啟動子盒(APC)經(jīng)由靶位點探針(TSP)與靶分子結(jié)合。隨后，諸如大腸桿菌RNA聚合酶(E. coli RNA polymerase)的RNA聚合酶使用APC作為模板來針對每個靶產(chǎn)生大量呈短的、均一 RNA分子或Abscript (流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物) 形式的信號。Abscription 檢測方法具有三個基本步驟，可適于檢測多種目標(biāo)分子(即靶)。首先，經(jīng)由靶位點探針(TSP)將APC定位到目標(biāo)靶分子。其次，由所定位的APC合成Abscript。 最后，檢測Abscript以作為靶檢測的手段，并可將其定量以作為存在的靶分子數(shù)量的指示。該方法極為高效，因為RNAP并不會像它在產(chǎn)生各個全長轉(zhuǎn)錄物之后那樣在各輪次的流產(chǎn)RNA合成之間從啟動子上移開或解離。此外，僅合成均一的、短RNA信號，其可比較長的寡核苷酸和多核苷酸更快速產(chǎn)生并更不費力。雖然啟動子逃離(和因此，流產(chǎn)合成的結(jié)束)所需的因素和條件并未完全被了解， 但是可利用足夠的知識來創(chuàng)造有利于流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物合成并排除全長RNA產(chǎn)生的合成環(huán)境。在一個實施方案中，在合成階段控制Abscription 以產(chǎn)生Abscript，S卩，如圖3中所示的非限制性實施例所說明，以規(guī)定的二核苷酸起始子起始，并隨后在添加一個或多個NTP之后終止。可使用鏈終止NTP (例如，3' -Ο-Me-NTP)或通過從反應(yīng)中省略一個或多個NTP將 Abscript長度限制到短達3個核苷酸(nt)。在其他實施方案中，在啟動子/模板階段，通過在到達終止信號之前，提供可用于轉(zhuǎn)錄的具有離散、有限數(shù)量的核苷酸的合成模板來控制Abscript長度。在單一 Abscript ion 反應(yīng)中從單一 APC產(chǎn)生Abscript的均一性，產(chǎn)生與存在的靶數(shù)量成正比的 Abscript信號。因此，Abscript ion 是用于測量諸如mCpG的靶的定性和定量系統(tǒng)。流產(chǎn)啟動子可經(jīng)由靶擴增方法摻入到DNA靶中或通過第二條鏈的雜交而在單鏈 DNA靶上形成。然而更一般而言，Abscript ion 可通過將APC結(jié)合到那些靶上而用于檢測多個靶分子(圖2)。對蛋白質(zhì)、RNA或DNA的檢測來說，將APC連接到會與分子靶結(jié)合的靶連接探針(圖2A)。對DNA和RNA的檢測來說，TAP包括與核酸靶特異性地結(jié)合的寡核苷酸或蛋白質(zhì)(圖2B)。對蛋白質(zhì)的檢測來說，APC可連接到與蛋白質(zhì)靶結(jié)合的任何物上。已開發(fā)使用針對同一靶的兩種抗體的若干試驗，與ELISA相類似，一個抗體用于靶的俘獲而另一個用于APC的連接(圖2C)。三核苷酸合成可在包括鏈終止子NTP時或通過省略一個或多個NTP來專門地制得三核苷酸 Abscript0可在Abscription 期間，通過摻入經(jīng)修飾的二核苷酸(Dissinger & Hanna, J.Biol. Chem(1990) 265 :7662-8 ；Dissinger & Hanna，J. Mol. Biol. (1991)219 :11-25 ； Hanna, Meth.Enzymol. ， (1989) 180:383-409 ；Hanna 等人，Biochemistry (1989)28 5814-20 ；Hanna & Meares，Proc.Natl.AcacL Sci.USA，(1983)80 :4238-42 ；Hanna & Meares, Biochemistry (1983) 22 :3546-51. 29-34) NTP (Hanna ^A, Nucleic Acids Res. (1999)27 :1369-76 ；He 等人，Nucleic Acids Res (1995) 23 :1231-8)來標(biāo)記 Abscript 以便用于檢測或俘獲。如本文所使用的“標(biāo)記”指的是一個部分，可直接或間接檢測和辨別它在分子上的存在。檢測標(biāo)記通常比檢測天然的未標(biāo)記物質(zhì)更容易、效率更高和/或特異性更高。適用于本發(fā)明的方法的標(biāo)記包括熒光基團、親和力標(biāo)簽(諸如生物素)和經(jīng)電荷或團塊(mass)修飾的核苷酸。在一個實施方案中，本文所述的試驗涉及產(chǎn)生區(qū)別在于分子量或遷移率的不同三核苷酸Abscript。三核苷酸是通過加入二核苷酸起始子和三磷酸核苷，由RNAP以每分鐘 1000至2000個的速率在APC上制造?？稍诓粯?biāo)記的情況下，通過快速TLC和UV造陰影法或質(zhì)譜分析法來檢測三核苷酸Abscript?；蛘撸山?jīng)由摻入到二核苷酸起始子中的標(biāo)記(例如熒光部分)來檢測Abscript。本發(fā)明提供通過使含有多核苷酸的樣品與引物對接觸來檢測樣品中的多核苷酸的方法，所述引物對與所述多核苷酸的靶序列特異性地雜交并將所述靶序列擴增。所述引物對包括第一引物，其與多核苷酸互補，側(cè)接靶序列并含有5'俘獲標(biāo)簽。第二引物具有三個區(qū)與多核苷酸互補的3'序列，所述多核苷酸側(cè)接來自第一引物的靶序列的相反一側(cè)上的靶序列；5' α-TAP序列，其用于連接APC，隨后擴增；和3'序列與5'序列之間的非天然核苷酸，其通常為亞乙烯基-脫氧腺苷。隨后，使用第一和第二引物將多核苷酸的靶序列擴增(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，并在含有結(jié)合5'俘獲標(biāo)簽的分子的固體支持物上俘獲所擴增的靶序列。這個步驟可使用任何可用的PCR技術(shù)或合適的核酸擴增方法，諸如使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶和/或RNA 聚合酶的PCR方法。例如，俘獲標(biāo)簽可為生物素，且固體支持物可為鏈霉親和素珠，諸如磁珠。隨后，可將所俘獲的擴增子洗滌以除去未結(jié)合的引物，并在需要時，從固體支持物中洗脫出來。對靶多核苷酸序列的檢測來說，使探針與擴增子雜交。這個探針包括與α-TAP 序列互補的5' TAP序列。由于在第二 PCR引物中包括了非天然核苷酸，因此在PCR期間 α -TAP序列不被復(fù)制并且在擴增期間仍為單鏈，從而允許探針的TAP序列雜交而不需要使所擴增的靶變性。亞乙烯基-脫氧腺苷可用作非天然核苷酸，但本領(lǐng)域技術(shù)人員知道終止復(fù)制并可因此代替亞乙烯基-脫氧腺苷的額外的合適非天然核苷酸(例如核苷酸類似物)。 探針也包括APC，其為使用如上文所述的Abscript ion 方法來合成Abscript提供模板。最后，通過任何合適的方法，尤其本文所述用于Abscript檢測的方法，諸如質(zhì)譜分析法、毛細管電泳或薄層色譜法來檢測Abscript。通常，Abscript的長度為3至20個核苷酸，并可通過在Abscription 期間摻入可檢測的經(jīng)標(biāo)記的(例如熒光的)核苷酸來標(biāo)記Abscript。在本發(fā)明的其他實施方案中，可通過在第二擴增引物的5'末端處包括APC序列并省略非天然存在的核苷酸來消除TAP/ α -TAP步驟。在這類實施方案中，在擴增期間，在擴增的靶序列附近產(chǎn)生雙鏈APC，其在添加RNAP和核苷酸后指導(dǎo)Abscript ion 。如果在擴增期間存在這些Abscr ipt ion 試劑，那么可在同一管中同時進行Abscr ipt ion 和擴增。通過在反應(yīng)中包括對各個多核苷酸具有特異性的引物對，本發(fā)明的這些方法可適于多次復(fù)用(即，同時檢測多個多核苷酸)。根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案，設(shè)計各引物對以與多核苷酸的獨特靶序列特異性地雜交并將所述獨特靶序列擴增。用于各引物對的α "TAP 序列也是獨特的，從而充當(dāng)靶序列的標(biāo)示符。通過雜交包括獨特鑒別APC的互補TAP序列隨后PCR擴增，可基于多重反應(yīng)中產(chǎn)生的Abscript來查詢各多核苷酸的存在。因此，獨特的APC是連接到各擴增的靶多核苷酸，并且可檢測和測量作為靶多核苷酸存在的指示的由 APC產(chǎn)生的可區(qū)分的Abscript信號。舉例來說，各APC可根據(jù)分子量或核苷酸序列設(shè)計來產(chǎn)生可區(qū)分的Abscript。在單一反應(yīng)中，可檢測到5、10、20個或更多的獨特靶序列。本發(fā)明也提供在不使用亞硫酸氫鹽的脫氨基作用情況下測定CpG島甲基化狀態(tài)的方法。此類方法結(jié)合了靶擴增與線性信號擴增方法Abscription ,使其極為敏感。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述靶多核苷酸是甲基化CpG島或多個(即，多次復(fù)用的)CpG島。在這些實施方案中，首先使用預(yù)定的限制性內(nèi)切酶來切割含有甲基化CpG島的基因組DNA，所述預(yù)定限制性內(nèi)切酶不會在多重試驗中切割所述島或所述多個島中的任何一個。隨后，使用固定化的MBD試劑和用于查詢目標(biāo)特異性CpG序列的俘獲片段來從基因組DNA中俘獲甲基化的DNA片段。根據(jù)本發(fā)明的一種方法，該方法以使用甲基化的DNA 富集方法使甲基化的DNA與片段化的基因組DNA分離開始。在本發(fā)明的一個方面中，富集方法使用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白，其含有來自小鼠MBD2的對甲基化的DNA具有高度特異性的甲基結(jié)合域。與MBD2-融合蛋白結(jié)合的甲基化DNA被谷胱甘肽磁珠快速俘獲，并直接洗脫到緩沖液中以便通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增。目標(biāo)CpG島是使用一對修飾的PCR 引物來擴增。第一個含有生物素基團，用于后續(xù)將中靶的CpG島俘獲到鏈霉親和素磁珠上。 第二引物含有島特異性序列，其“標(biāo)記”用于連接特定APC的擴增子。一旦擴增，就將島俘獲到鏈霉親和素珠上；獨特的APC通過雜交相連接；并且啟動Abscript ion 。各CpG島從而產(chǎn)生不同的Abscript ；因此，可在各反應(yīng)中查詢到多個CpG島?；蛘撸蓪PC序列摻入到第二擴增引物中，并且在擴增期間產(chǎn)生APC雙鏈體。這種方法通過在擴增反應(yīng)中包括RNAP和核苷酸而允許同時進行擴增和Abscript ion 。因為這種方法將靶擴增與信號擴增結(jié)合，所以需要的起始DNA比大多數(shù)甲基化DNA檢測方法的少， 小于2ng的基因組DNA就足以用于分離甲基化DNA的最初步驟。整個試驗極為快速，需要的操作時間要比大多數(shù)競爭性試驗的少。該試驗可如所述使用磁珠，并且還可被格式化以在微量滴定板格式下用于高流量篩查。
實施例實施例1. Abscription 方法Abscription 先前已有描述；參見例如美國專利申請第09/984，664號(2001年 10月30日提交)，現(xiàn)在的美國專利第7，045，319號；第10/425，037號(2003年4月四日提交)；第10/600，581號(2003年6月23日提交)；第10/602，045號(2003年6月24日提交) ’第10/607，136號(2003年6月27日提交)，現(xiàn)在的美國專利第7，2 ，738號；第 10/686, 713 號(2OO3 年 10 月 I7 日)；第 IO/976，240 號(2004 年 10 月四日提交)；第 10/790, 766號(2004年3月3日提交)；第10/488，971號(2004年10月18日提交)；和第10/551，775號(2006年9月14日提交)，所述各專利申請的內(nèi)容都以引用的方式全部并入本文。實施例2. Abscript的質(zhì)譜分析檢測通過質(zhì)譜分析法，隨后通過HPLC從二核苷酸起始子將它們分級分離來檢測三核苷酸Abscript。如圖4A所示，將分級分離的輸出結(jié)果以總離子計數(shù)對色譜保留時間作圖。 可將任何離子的色譜法譜分析以類似方式作圖。具體的m/z物質(zhì)在特定保留時間下的貢獻可以色譜峰下面積值來進行求和以便得出Abscript的量。圖4B顯示與Abscript GAG (保留時間為5. 4分鐘)相關(guān)的離子光譜。GAG的產(chǎn)率為m/z值為477. 6,956. 1和978. 2的物質(zhì)的總和。這些物質(zhì)分別對應(yīng)雙電荷物質(zhì)、單電荷物質(zhì)和鈉加合物。實施例3. GST-MBD蛋白的制備如圖5所示，構(gòu)建含有來自小鼠MBD2的甲基結(jié)合域(MBD)的GST融合蛋白。將MBD 域的密碼子最佳化以便在大腸桿菌中表達。該構(gòu)建體含有介于GST與MBD域之間的凝血酶切割位點。GST蛋白也含有4個用于連接APC或生物素的表面半胱氨酸殘基。2008年5月 15日提交的美國專利申請第61/053，648號提供了 GST-MBD蛋白的細節(jié)，所述美國專利申請的內(nèi)容以引用的方式并入本文，具體來說，描述MBD融合蛋白的制備和用途的實施例2-11 提供了 GST-MBD蛋白的細節(jié)。GST域允許融合蛋白或它與甲基化DNA的復(fù)合物在谷胱甘肽樹脂或珠上進行分離并用谷胱甘肽洗脫，或者用識別GST的抗體俘獲或檢測。選擇來自MBD2b蛋白的MBD用于最終的構(gòu)建體，因為在已知的甲基CpG結(jié)合蛋白中，MBD2b具有對Me-CpG位點的最高親和力和與未甲基化CpG的最低交叉反應(yīng)性。它具有比MeCP2高介于25至100倍之間的對Me-CpG位點的親和力，并具有比MeCP2高介于9. 7至 43 之間的對甲基化 DNA 的偏好性(Fraga 等人，(2003) Nucleic Acids Res. ,31 :1765-74)。 另外，像需要在CpG位點附近進行一輪4A-Ts的MeCP2 —樣，不存在對MBD2 CpG識別的序列前后效應(yīng)(sequence context effect)。因此，MDB2比MeCP2識別更大數(shù)量的mCpG位點。實施例4.即便在使用2ng或更小的輸入DNA情況下，固定化的GST-MBD2仍保持對甲基化DNA的高特異性將GST-MBD蛋白連接于谷胱甘肽磁珠上并用于分離不同數(shù)量的甲基化DNA， 從而測定可以高特異性回收的最小起始DNA樣品大小。在22°C下，以IOOOrpm下的水平旋轉(zhuǎn)混合方式，將HeLa基因組DNA或用ksl甲基酶人工甲基化的HeLa DNA與 GST-MBD磁珠一起孵育1小時。在除去含有未結(jié)合DNA的上清液之后，通過在80°C下，以 IOOOrpm下的水平旋轉(zhuǎn)混合方式保溫10分鐘，從磁珠中洗脫所結(jié)合的DNA。使用引物對 5 ‘ -ggtacgaaaaggcggaaaga-3‘ (SEQ ID禾口 ~tgtgggaaagctggaatatc-3‘ (SEQ ID NO :7)與用于檢測的SYBR 綠色染料，通過qPCR來測試所洗脫的DNA樣品中 PTGS2 (GenBank GL34576917) DNA的存在。HeLa中的PTGS2是未甲基化的，且預(yù)計其會保留在結(jié)合反應(yīng)的上清液中。在所洗脫的分級分離物中觀察到人工甲基化的DNA的2ng基因組 DNA輸入物的94%的回收率，同時如所預(yù)計，在上清液分級分離物中回收到來自HeLa的未經(jīng)修飾的PTGS2 DNA的100%。在Ing的甲基化HeLa DNA輸入量下，73%的PTGS2 DNA得以結(jié)合，并用熱洗脫來回收。未檢測到來自未經(jīng)修飾的HeLa的未甲基化形式的結(jié)合?？赏ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳染色顯現(xiàn)的最低DNA量(2ng)相當(dāng)于大約300個細胞。甚至可分離更少的DNA，并使用用于擴增子檢測的Abscription 來檢測。實施例5.基于CpG甲基化試驗的Abscription 圖6示出用于測定多個CpG島的甲基化狀態(tài)的總方案。簡單地說，從基因組DNA 樣品中分離出片段化的甲基化DNA，然后擴增正在研究其甲基化狀態(tài)的特異性CpG島。對擴增來說，一種引物含有諸如生物素的親和力標(biāo)簽，其允許所述島的挽回和固定。第二引物含有用于連接流產(chǎn)啟動子盒的序列。這種方法允許擴增和分離樣品中與可設(shè)計的相容PCR引物一樣多的CpG島。因為不用造成“C”轉(zhuǎn)化成“dU”的亞硫酸氫鹽處理來使DNA脫氨基，所以避免了與由脫氨基作用引起的序列異質(zhì)性損失相關(guān)的高水平多次復(fù)用的問題。因為引物位點不會嚴格地限于靶標(biāo)中的特定序列，所以引物放置的足夠靈活性允許設(shè)計多種相容的引物組(Henegariu等人， Biotechniques (1997) 23 :504-11 ；Onishi 等人，J. Agric. Food Chem. (2005)53 :9713)。使不同的APC連接于各個靶CpG島，從而產(chǎn)生各個靶CpG島的不同Abscript信號。因此，可實現(xiàn)從單一樣品中同時檢測多個CpG島。簡單來說，將天然基因組DNA碎裂成片段，然后與含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)-甲基結(jié)合域(MBD)融合蛋白(如上文實施例3中所述制得)的谷胱甘肽珠結(jié)合。 僅甲基化的DNA才會結(jié)合(圖6A，步驟1)。洗滌后，從珠粒中洗脫甲基化的DNA (圖6A， 步驟2)并通過PCR擴增欲查詢的島(圖6B，步驟幻。引物之一在5'末端處含有俘獲標(biāo)簽(例如生物素)(圖7A)。第二引物含有2個區(qū)。第一個是與靶DNA互補的多核苷酸序列。第二個區(qū)是與靶DNA或其他島不同的任意序列(圖7A)。這個第二序列是與連接到流產(chǎn)啟動子盒(APC)的靶連接探針(TAP)序列互補。TAP序列的互補序列稱為反TAP序列 (a-TAP)。α -TAP序列在靶DNA的PCR擴增期間仍為單鏈，原因是在與靶標(biāo)雜交的引物序列和α-TAP序列之間的銜接處包括有非天然核苷酸(圖7A中的εΑ核苷酸)。擴增后，將島固定(例如)在鏈霉親和素珠上(圖6Β，步驟4)，并洗去剩余的基因組DNA和引物。隨后，使TAP-APC多核苷酸與所擴增的靶DNA接觸并與單鏈反TAP序列雜交(圖6C，步驟5)。 將游離的TAP-APC洗去，再加入Abscript ion 試劑以產(chǎn)生Abscript信號(圖6C，步驟5)。 下文給出了該方法的更多細節(jié)。步驟1 基因組DNA的切割設(shè)計初始的消化步驟以產(chǎn)生含有CpG島或CpG島的大部分的片段。選擇落在欲分析的區(qū)域之外的限制性位點，其既無甲基化依賴性又無甲基化敏感性。使用具有4個堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶。表1列出了通過MseI或DdeI對6個被報道為差異甲基化的 CpG島的樣品所產(chǎn)生的片段大小。按照慣例，在供應(yīng)商的限制性緩沖液(NEB緩沖液4)中， 用20個單位的MseI消化至多3 μ g的基因組DNA。在37°C下，將裂解反應(yīng)物保溫至少8小時。通過在消化液樣品上使用含有MseI序列的引物進行PCR來測量裂解的程度。陽性對照是未用MseI處理的基因組DNA，和使用了不受MseI消化影響的引物的MseI處理DNA的擴增反應(yīng)。消化的目的是解除靶島與可被正常甲基化的相鄰CpG序列的連接，從而使未甲基化的島轉(zhuǎn)移到甲基化的DNA分級分離物中。在大多數(shù)情況下，MseI或DdeI產(chǎn)生的單一片段占據(jù)了大部分的島序列而不包括許多相鄰的序列。例外是MGMT被DdeI過度切割的情況。 在這種情況下，替代的酶產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)果。在CpG島被碎裂成若干片段的情況下，各區(qū)段可用它自己的引物組來進行分析。表LCpG島裂解模式
CpG島限制性內(nèi)切酵識別序列所產(chǎn)生的片段數(shù)(nt )APCMseITTAA520,164(GI22458981 7)DdeICTNAG820CCNAlMseITTAA1168(GI22458980 4)DdeICTNAG523,231, 177GSTPlMseITTAA1936(GI34576917 )DdeICTNAG261,131MGMTMseITTAA1967(GI: 34556)DdeICTNAG過度片段化RARBMseITTAA612,163(GI: 35881)DdeICTNAG625PTGS2MseITTAA516,417(GI21190410 9)DdeICTNAG464,229, 87, 37步驟2 甲基化DNA的分離和回收將甲基化DNA的俘獲步驟格式化以用于帶有谷胱甘肽的磁珠。在除去過量
20的GST-MBD蛋白后，將GST-MBD蛋白預(yù)裝載到懸浮在DNA樣品中的珠粒上。在室溫下 (22-24V )，以混合(Eppendorf Thermomixer, IOOOrpm)方式將 DNA 結(jié)合進行 1 小時，以維持珠粒的懸浮狀態(tài)。DNA樣品通常是在50 μ 1體積的結(jié)合緩沖液中含有介于Ing至50ng之間的基因組DNA。完成結(jié)合步驟時，用稀土磁體使珠粒沉淀到管的一側(cè)，并除去含有未甲基化DNA的上清液。用400 μ 1含有與結(jié)合緩沖液相同的NaCl濃度(160mM)的洗滌緩沖液將珠粒洗滌兩次。在室溫下，以混合(IOOOrpm)方式使各次洗滌液溫育5分鐘。最后一次洗滌用TE緩沖液(IOmM Tris, pH 8，ImM EDTA)來進行。使珠粒懸浮在400 μ 1 TE中并立即用磁鐵使其沉淀。棄去TE洗滌緩沖液，將珠粒懸浮在50 μ 1的洗脫緩沖液(IOmM Tris,pH 8，ImM EDTA)中。用若干替代方法從珠粒中洗脫甲基化DNA?？稍?0°C下，以混合(IOOOrpm)方式使TE緩沖液中的珠粒保溫10分鐘。用磁鐵使珠粒沉淀，并回收所洗脫的DNA。在替代方法中，將珠粒懸浮在含有0. 1% SDS的洗脫緩沖液中。所結(jié)合的甲基化DNA的完全洗脫是在 50°C下用單次20分鐘保溫實現(xiàn)的。所洗脫的DNA無需進一步處理即可備用于PCR，條件是 PCR緩沖液中包括諸如吐溫-20的非離子型洗滌劑(參見Goldenberger等人，PCR Methods Appl. (1995)4 :368-70)。洗脫還可如下進行使珠粒暴露于pH 8的含有最少量的2OmM還原谷胱甘肽的洗脫緩沖液10分鐘。圖5C顯示HeLa DNA的SNRPN CpG島的分級分離結(jié)果。 用熱處理來釋放甲基化DNA。SNRPN是一種印跡基因。一個拷貝是完全甲基化的，而另一個拷貝是正常未甲基化的。正如所料，上清液中發(fā)現(xiàn)一半的SNRPN拷貝(圖5C的分級分離物 S，未甲基化的分級分離物)，而在第一次洗脫時從珠粒中洗脫了一半的拷貝(圖5C，分級分離物E1，甲基化的分級分離物)。在第一次洗脫時，萃取所有甲基化的DNA。第一次洗脫后的兩次連續(xù)洗脫(E2和E3)不含有SNRPN DNA。使用PTGS2基因(HeLa中的未甲基化)的 CpG島作為陰性對照(圖5D)。所有PTGS2 DNA都出現(xiàn)在上清液分級分離物中。步驟3 使用標(biāo)記的引物的PCR擴增使用生物素親和力標(biāo)簽和用于連接流產(chǎn)啟動子盒(APC)的單鏈寡核苷酸序列將 CpG島區(qū)段擴增并標(biāo)記。PCR反應(yīng)物含有Ix熱啟動Taq緩沖液(i^ermentas)、0. 8mM dNTP (各 0. 2mM)、2mM MgCljP 5% (ν/ν)的DMSO。生物素化引物禾口 α-TAP引物各自以1 μ M存在。 用2個單位/20 μ 1反應(yīng)物的TrueMart熱啟動iTaq DNA聚合酶(Fermentas)來進行擴增。 一個單位等于在74°C下在30分鐘內(nèi)摻入IOnmol的dNTP。循環(huán)條件是95°C 1分鐘，接著在95°C 30秒、62°C 30秒和72°C 30秒下循環(huán)至多32次。最后的延伸步驟是72°C 5分鐘。 將完全的反應(yīng)物保持在4°C下。圖5C和圖5D顯示通過瓊脂糖凝膠電泳對分級分離的擴增 DNA的檢測。α-TAP引物序列設(shè)計通過最小化PCR反應(yīng)物中存在的三寡核苷酸引物/ α -TAP序列之間的相互作用來最佳化引物以達高的信號強度。使用生物素化的PCR引物和α-TAP的3'末端來引發(fā)在擴增期間的DNA合成，并且使用引物軟件(Oligo Explorer 1. 2)進行設(shè)計以最小化引物引物相互作用和引物發(fā)夾環(huán)的形成。第二引物的5'末端處的α-TAP被設(shè)計成摻入到擴增子中，并且其由于非編碼核苷酸亞乙烯基Α( ε A)的存在而仍為單鏈，所述非編碼核苷酸將引物序列與α-TAP分離。包括Taq聚合酶的大多數(shù)DNA聚合酶不能摻入對著εΑ的 dNTP (dNTP opposite ε Α)并終止合成(圖 7)(參見 Patel 等人，J. Biol. Chem. (2001)276 5044-51)。核苷酸類似物防止α-TAP序列在PCR期間被復(fù)制。使α-TAP序列與任一的引物序列之間的潛在相互作用最小化，從而避免PCR的抑制和由于全單鏈α-TAP的非特異性固定化的假陽性結(jié)果。引物設(shè)計經(jīng)歷3個步驟。首先，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)來最佳化引發(fā)序列1)引物長度在 16至20個nt之間；2)1接近601;3)消除帶堿基配對的3'末端的引物-引物相互作用； 4)其他引物-引物相互作用必須具有< 16°C^Tm ；和5)排除Tm>8°C的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。使用這些標(biāo)準(zhǔn)成功地開發(fā)出6個CpG島的引物對。引物最佳化中的第二個步驟是消除α-TAP-引物寡核苷酸中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)可能干擾PCR或TAP-APC的連接?；赗NA噬菌體MS2、fr和Q β序列設(shè)計了 6 個α-TAP候選序列的集合。對每個候選α-TAP進行電腦虛擬(in silico)測試，將在我們的TAP退火條件下形成Tm > 260C的發(fā)夾的那些候選α -TAP修飾，以便消除發(fā)夾并再次測試(Zuker,Nucleic Acids Res. (2003)31 :3406-15)。修飾 α-TAP序列的唯一限制在于， 它們不會獲得與引發(fā)序列的顯著互補性。對α-TAP與所連接的引物序列之間的潛在發(fā)夾相互作用進行電腦虛擬測試，并在必要時，將α -TAP序列改變以便最小化發(fā)夾穩(wěn)定性和/ 或防止引物從發(fā)夾的延伸。一種示例性的引物-α-TAP寡核苷酸(SEQ ID NO 42)具有在所用PCR條件下的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但是擴增的⑶KN2A DNA與缺乏與反向引物SEQ ID N0:43的α-TAP延伸組合的引物一樣有效。最后，在引物設(shè)計軟件中，使用α-TAP附在文件末尾的CpG島序列文件并選擇其與生物素化引物序列一起作為引物來測試α -TAP與生物素化引物之間的相互作用。開發(fā)了用于CpG島的α-ΤΑΡ和反向引物對，所述CpG島與附在文件末尾的α-TAP相關(guān)并選擇其與生物素化引物序列一起作為引物。開發(fā)了如以下表 2中所列的用于CpG島的α -TAP和反向引物對。表2. α-TAP和反向引物對
權(quán)利要求
1.一種用于檢測樣品中的至少一個靶多核苷酸的方法，其包括a)使含有所述至少一個多核苷酸的樣品與引物對接觸，所述引物對與所述至少一個多核苷酸的靶序列特異性地雜交并將所述靶序列擴增，其中所述引物對由以下i)和ii)組成i)第一引物，其包含(1)3'序列，其與側(cè)接所述多核苷酸的所述靶序列的第一序列互補，和(2)5'俘獲標(biāo)簽； 禾口 )第二引物，其包含(1)3'序列，其與側(cè)接所述多核苷酸的所述靶序列的第二序列互補，和(2)5'序列，其提供用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄(Abscription)的構(gòu)件；b)由所述第一引物和所述第二引物將所述靶序列擴增；c)使所述擴增的靶序列與結(jié)合所述5'俘獲標(biāo)簽的固定化分子接觸，從而俘獲所述多核苷酸的所述擴增的靶序列；d)由所述用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的構(gòu)件轉(zhuǎn)錄至少一個Abscript； 禾口e)檢測步驟d)中轉(zhuǎn)錄的至少一個Abscript。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在進行隨后步驟之前，從固定和俘獲的多核苷酸中洗滌未結(jié)合的試劑、引物和多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中擴增由進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是用熱穩(wěn)定DNA聚合酶和熱穩(wěn)定RNA聚合酶中的至少一個來進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述5'俘獲標(biāo)簽是生物素且與所述5'俘獲標(biāo)簽結(jié)合的所述分子是鏈霉親和素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與所述5'俘獲標(biāo)簽結(jié)合的所述分子是固定在選自磁珠和微量滴定板的固體支持物上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟d)期間將可檢測的經(jīng)標(biāo)記核苷酸摻入到至少一個 Abscript 中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可檢測的經(jīng)標(biāo)記核苷酸是熒光核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測所述至少一個Abscript包括質(zhì)譜分析法、毛細管電泳或薄層色譜法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個Abscript的長度是3-20個核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述至少一個Abscript的長度是3個核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的構(gòu)件包含APC。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的構(gòu)件包含 i)5' α -TAP序列，其鑒別獨特的CpG島；和 )非天然核苷酸，其介于5' α -TAP序列和與側(cè)接所述靶序列的所述第二序列互補的所述3'序列之間；且，步驟d)包含i)使探針與所述擴增的靶序列雜交，其中所述探針包含與所述α-TAP序列互補的 5' TAP 序列和 3' APC ；禾口ii)由所述APC轉(zhuǎn)錄至少一個Abscript。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述非天然核苷酸防止所述α-TAP在擴增期間的復(fù)制，從而所述α-TAP序列在步驟a)至c)期間仍為單鏈。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述非天然核苷酸是亞乙烯基-脫氧腺苷。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個靶多核苷酸包含多個不同的靶多核苷酸，并且同時用多個第一和第二引物對來進行步驟a)至e)，每個引物對都與不同的靶特異性地雜交。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述用于指導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的構(gòu)件對多個靶中的每一個靶都產(chǎn)生獨特的Abscript。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述獨特的APC能根據(jù)分子量或核苷酸序列而彼此區(qū)分。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述多個不同的靶包含至少10個不同的靶。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個靶多核苷酸是甲基化的CpG島且所述樣品包含分離的甲基化的基因組DNA片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述甲基化的基因組DNA片段是通過以下步驟分離的a)用不會切割所述靶多核苷酸CpG島的限制性內(nèi)切酶切割含有至少一個甲基化的靶多核苷酸的基因組DNA樣品；b)使所述經(jīng)切割的基因組DNA與固定化的MBD接觸，從而固定來自所述樣品的甲基化的基因組DNA ；和c)任選地，從所述固定化的MBD中回收所述甲基化的基因組DNA，從而分離出甲基化的基因組DNA片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述MBD是GST-MBD2融合蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中將所述GST-MBD2融合蛋白固定在含有谷胱甘肽的固體支持物上。
全文摘要
本發(fā)明提供基于流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄技術(shù)來檢測生物標(biāo)記物的方法。具體來說，本發(fā)明提供從DNA的小樣品中檢測CpG島甲基化的不含硫酸氫鹽的方法。所述方法適于多次復(fù)用并可用于在短時間內(nèi)分析來自單一樣品中的多個CpG島。
文檔編號C12N15/11GK102421914SQ201080017620
公開日2012年4月18日 申請日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月15日
發(fā)明者大衛(wèi)·麥卡錫, 米歇爾·M·漢娜 申請人:里伯米德生物技術(shù)公司