專利名稱：采用AxI作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物標(biāo)志物的方法
采用Axl作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物標(biāo)志物的方法本發(fā)明涉及用于檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) (epithelial-to-mesenchymaltransi tion)的發(fā)生的生物標(biāo)志物以及診斷/預(yù)測(cè)方法。更具體而言，本發(fā)明涉及與AxI的表達(dá)和 /或活性有關(guān)的診斷、預(yù)測(cè)和療法。
背景技術(shù)：
AxI為受體酪氨酸激酶亞家族的成員。盡管與其他受體酪氨酸激酶相似，但是AxI 蛋白顯示出胞外區(qū)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中IgL和FNIII重復(fù)結(jié)構(gòu)并列，并且還具有含胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)(其一部分為激酶結(jié)構(gòu)域)。AxI通過結(jié)合生長(zhǎng)因子(如維生素K依賴性蛋白生長(zhǎng)停滯特異性基因6(Gas6))將信號(hào)從細(xì)胞外基質(zhì)傳導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)。AxI的胞外結(jié)構(gòu)域可被切割，并且可以釋放65kDa的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域。切割增強(qiáng)了受體周轉(zhuǎn)并生成部分激活的激酶(0' Bryan JP 等(1995) J Biol Chem. 270 (2) :551-557)。然而，被切割的結(jié)構(gòu)域的功能是未知的。在專利文獻(xiàn)WO 03/068983中描述了與人AxI基因和基因產(chǎn)物有關(guān)的結(jié)構(gòu)信息。下列專利文獻(xiàn)也涉及AxI或其他受體酪氨酸激酶US 5, 468, 634 ；US 6, 087, 144 ；US 5,538, 861 ；US 5,968, 508 ；US6, 211, 142 ；US 6, 235, 769 ；WO 99/49894 ；WO 00/76309 ；WO 01/16181 和 WO 01/32926。AxI參與細(xì)胞增殖的刺激。具體而言，AxI為慢性粒細(xì)胞白血病相關(guān)致癌基因，其與結(jié)腸癌和黑色素瘤也有關(guān)。AxI鄰近位于19ql3. I_ql3. 2的bcl3致癌基因。AxI基因在脊椎動(dòng)物物種之間是進(jìn)化保守的，并且在間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育過程中表達(dá)。與配體互相作用時(shí)，AxI開始自磷酸化，并且發(fā)生級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。已知 PI3K, AKT、src、Bad、14-3-3、PLC、ERK, S6K (有絲分裂原調(diào)節(jié)激酶)和STAT均參與該級(jí)聯(lián)反應(yīng)。具有富含y-羧基谷氨酸的區(qū)域(GLA結(jié)構(gòu)域)，其允許Ca++依賴性結(jié)合至膜磷脂。是弱的有絲分裂原并且在OTH3T3成纖維細(xì)胞受到TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性或去除生長(zhǎng)因子的壓力時(shí)具有抗凋亡的效應(yīng)。在NIH3T3中，Gas6與AxI的結(jié)合可以激活PI3K、AKT、 src 禾口 BacL已有研究表明AxI在腫瘤形成中起了很多不同的作用。AxI在包括內(nèi)皮細(xì)胞遷移、 增殖和管生成在內(nèi)的血管生成行為中是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)子。人乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤也需要Axl，表明AxI調(diào)節(jié)的是對(duì)新生血管和腫瘤發(fā)生而言關(guān)鍵的過程(Holland S.等，Cancer Res2005 ；65 (20)，2005 年 10 月 15 日)。AxI受體酪氨酸激酶的活性與腫瘤轉(zhuǎn)移正相關(guān)。更具體而言，已有研究表明AxI能增強(qiáng)AxI介導(dǎo)的侵染所需的MMP-9的表達(dá)。AxI通過NF-B κ和Brg-I的活化誘導(dǎo)ΜΜΡ-9的活性從而促進(jìn)細(xì)胞侵染 CTai，K-Y 等，Oncogene (2008),27,4044-4055)。AxI在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并且可以用于預(yù)測(cè)患有多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)患者的不良預(yù)后(Vajkoczy P.等，PNAS, April 11,2006, vol 103，no. 15， 5799-5804 ；Hutterer Μ.等，Clinical Cancer Res2008 ； 14 (I)Jan 1,2008) 與最小侵染性肺癌細(xì)胞株相比，AxI還在高侵染性肺癌細(xì)胞株中相對(duì)地過表達(dá)(Siieh，Y-S等，
6Neoplasia, vol 7，no. 12，Dec 2005，1058-1064)。因此認(rèn)為AxI在腫瘤侵染和發(fā)展中起到極為重要的作用。類似地，AxI在高侵染性乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，而在低侵染性乳腺癌細(xì)胞中沒有過表達(dá)。更具體而言，抑制AxI的信號(hào)傳導(dǎo)(通過顯性失活的AxI突變體、針對(duì)AxI的胞外結(jié)構(gòu)域的抗體、或短發(fā)夾RNA基因抑制AxI)降低了高侵染性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵染性。小分子AxI抑制劑干擾了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵染。因此，AxI被認(rèn)為是控制乳腺癌細(xì)胞遷移 /侵染的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因素(aiang，Y-X等，Cancer Res 2008 ；68 (6), March 15， 2008)。在系膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)具有致有絲分裂效應(yīng)，指示其可能在腎血管球硬化癥中起了一定的作用。已有證據(jù)表明fes6/AxI通路在腎小球腎炎中也起了一定作用(Yanagita M.等，The Journal of Clinical Investigation，2002，110 ( 239-246)。進(jìn)一步的研究表明在動(dòng)脈損傷模型中，Gas6促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活。已經(jīng)表明，在血管平滑肌細(xì)胞中，血管緊張肽II通過其AT 1受體增加了 AxI的mRNA和蛋白受體(Melaragno M. G.等，Circ Res.， 1998，83 (7) :697-704)。已經(jīng)證實(shí)AxI參與免疫系統(tǒng)中細(xì)胞粘附、細(xì)胞的增殖和動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)(Lu Q.， 2001, Science 293(5528) :306-311)。AxI活化后，觀測(cè)到以下現(xiàn)象凋亡的抑制、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在“正?！奔?xì)胞(非轉(zhuǎn)化)存活方面的增多、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的遷移 (AxI激酶的失活阻斷了遷移)、血管壁中新內(nèi)膜形成的增強(qiáng)(Melaragno M. G.等，Trends Cardiovasc Med.，1999，(Review) 9 (8) :250-253)以及參與動(dòng)脈粥樣硬化的病變形成和發(fā)展。本發(fā)明旨在提供與AxI有關(guān)的新的診斷、預(yù)測(cè)和治療應(yīng)用。特別是，本發(fā)明致力于提供檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生的方法，其在癌癥(更具體為轉(zhuǎn)移性和抗藥性癌癥) 的治療中具有治療意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及AxI作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的用途。本發(fā)明基于AxI表達(dá)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生相關(guān)這一發(fā)現(xiàn)。據(jù)我們所知， 本發(fā)明第一次提出了這種相關(guān)性。有利的是，這一發(fā)現(xiàn)開辟了令人振奮的新機(jī)遇，其用于在癌癥領(lǐng)域(更特別是轉(zhuǎn)移性和抗藥性癌癥領(lǐng)域)中提供診斷、預(yù)測(cè)和治療方法。本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了受體酪氨酸激酶AxI在侵染轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)中作為必需的EMT 誘導(dǎo)效應(yīng)物這一以前從未意識(shí)到的作用。結(jié)果表明EMT過程的激活導(dǎo)致AxI上調(diào)，這對(duì)惡性乳腺癌細(xì)胞的侵染力和自發(fā)轉(zhuǎn)移以及抗藥性表型而言是關(guān)鍵的。AxI表達(dá)與乳腺癌患者的死亡率(包括間期乳腺X光檢測(cè)的腫瘤和臨床鑒定的乳腺腫瘤)密切相關(guān)，表明了 AxI 激活與轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展之間的聯(lián)系。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及檢測(cè)樣品中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的方法，所述方法包括以下步驟(i)從細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人中分離樣品；(ii)與對(duì)照樣品相比，確定樣品中AxI的表達(dá)，其中相比于對(duì)照樣品，AxI表達(dá)的上調(diào)指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。有利的是，AxI表達(dá)的確定提供了檢測(cè)EMT事件發(fā)生的“永久性”標(biāo)志物，而實(shí)際上 EMT事件發(fā)生自身是瞬時(shí)的。因此，AxI表達(dá)的檢測(cè)提供了 EMT事件是否已經(jīng)發(fā)生的獨(dú)特而永久的指標(biāo)。本申請(qǐng)人的研究已經(jīng)表明這是因?yàn)榕cEMT相關(guān)的激活建立了對(duì)惡性細(xì)胞有利的自分泌AxI-Gase信號(hào)傳導(dǎo)回路。AxI也可通過旁分泌機(jī)制激活。已經(jīng)發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)是復(fù)雜的，這是因?yàn)槠潴w現(xiàn)在現(xiàn)有的標(biāo)志物(如波形蛋白、N-鈣粘著蛋白、缺乏E-鈣粘著蛋白)基于在正常基質(zhì)細(xì)胞中存在的間質(zhì)細(xì)胞骨架和連接蛋白。區(qū)分腫瘤細(xì)胞與周圍的基質(zhì)細(xì)胞是困難的。AxI的表達(dá)更可能被限制在實(shí)體瘤的腫瘤細(xì)胞中，從而為惡性腫瘤細(xì)胞提供了顯著的區(qū)分特征。EMT的可逆性對(duì)于在遠(yuǎn)端形成轉(zhuǎn)移是重要的。AxI的表達(dá)可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及通過檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生來診斷受試者中轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，包括確定從受試者獲取的樣品中的AxI受體多肽的水平，其中所述多肽的水平比未患轉(zhuǎn)移性癌癥的受試者的水平更高指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及AxI或編碼AxI的基因在監(jiān)測(cè)能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的活性中的用途。本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人，并監(jiān)測(cè)AxI的活性和/或表達(dá)。本發(fā)明的第六個(gè)方面涉及檢測(cè)抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的能力的方法，所述方法包括(i)將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人；(ii)測(cè)量來源于已處理或未處理的細(xì)胞、動(dòng)物或人的樣品中AxI的表達(dá)；以及(iii)檢測(cè)已處理樣品中AxI的表達(dá)或活性相比于未處理樣品的增加或減少，作為抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力的指標(biāo)。本發(fā)明的第七個(gè)方面涉及監(jiān)測(cè)AxI抑制劑活性的方法，所述方法包括通過下述步驟檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生(i)將所述AxI抑制劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人；以及(ii)測(cè)量來源于已處理或未處理的細(xì)胞、動(dòng)物或人的樣品中AxI的表達(dá)；以及(iii)檢測(cè)已處理樣品中AxI的表達(dá)或活性相比于未處理樣品的增加或減少，作為AxI抑制活性的指標(biāo)。本發(fā)明的第八個(gè)方面涉及鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)將所述試劑與AxI受體或表達(dá)所述AxI受體的細(xì)胞接觸；(ii)在所述試劑的存在下測(cè)量AxI受體的活性；以及(iii)將步驟(ii)中測(cè)得的活性與在對(duì)照條件下測(cè)得的活性相比較，其中活性降低表明所述試劑能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。本發(fā)明的第九個(gè)方面涉及通過篩選多種試劑來鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括以下步驟
(i)將所述多種試劑與AxI受體或表達(dá)所述AxI受體的細(xì)胞接觸；(ii)在所述多種試劑的存在下測(cè)量AxI受體的活性；(iii)將步驟(ii)中測(cè)得的活性與在對(duì)照條件下測(cè)得的活性相比較，其中活性降低表明所述多種試劑能抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)；以及(ν)分別確定所述多種試劑中的哪種或哪些試劑能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)。本發(fā)明的第十個(gè)方面涉及根據(jù)本發(fā)明方法鑒定得到的試劑在制備用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明的第十一個(gè)方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明方法鑒定得到的試劑與可藥用的稀釋劑、賦形劑或載體的混合物的藥物組合物。本發(fā)明的第十二個(gè)方面涉及制備組合物的方法，包括(i)使用根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑； 以及(ii)將所述試劑與可藥用的稀釋劑、載體或賦形劑混合。本發(fā)明的第十三個(gè)方面涉及抑制或逆轉(zhuǎn)需要接受治療的受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。本發(fā)明的第十四個(gè)方面涉及對(duì)需要接受治療的受試者中的轉(zhuǎn)移性癌癥進(jìn)行治療的方法，所述方法包括通過對(duì)所述受試者施予AxI抑制劑，從而抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)。本發(fā)明的第十五個(gè)方面涉及AxI抑制劑在制備用于抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)的藥物中的用途。本發(fā)明的第十六個(gè)方面涉及AxI抑制劑在制備通過抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)來治療轉(zhuǎn)移性癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第十七個(gè)方面涉及用于評(píng)價(jià)抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑能力的試劑盒，所述試劑盒包含抗AxI抗體、針對(duì)AxI的核酸探針或針對(duì)AxI的QPCR引物。本發(fā)明的第十八個(gè)方面涉及如上述限定的試劑盒在本發(fā)明的方法中的用途。發(fā)明詳述轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥相關(guān)死亡的根本原因。因此，進(jìn)一步理解能夠使腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的分子機(jī)制是一個(gè)重要的健康問題。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)賦予癌細(xì)胞增強(qiáng)的遷移和存活特性，其促進(jìn)惡性發(fā)展。EMT效應(yīng)物的表征可能為轉(zhuǎn)移和治療的新途徑產(chǎn)生新的認(rèn)識(shí)。本申請(qǐng)人已經(jīng)示出了，在乳腺X光檢測(cè)的原發(fā)性乳腺癌中受體酪氨酸激酶AxI的存在獨(dú)立地預(yù)示了顯著降低的總體患者存活率，并且匹配的患者的轉(zhuǎn)移病灶顯示出增強(qiáng)的AxI表達(dá)。本申請(qǐng)人也證明了 AxI受到惡化前乳腺上皮細(xì)胞中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其中AxI 與其配體建立了自分泌信號(hào)傳導(dǎo)回路。通過在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中采用表觀等位基因(epi-alleliC)RNA干擾分析，本申請(qǐng)人劃定了間質(zhì)細(xì)胞類體外細(xì)胞侵染以及在體內(nèi)異體和組織工程微環(huán)境中形成腫瘤的AxI表達(dá)的不同閾值。重要的是，在兩種不同的基于光學(xué)成像的實(shí)驗(yàn)乳腺癌模型中AxI基因抑制(knockdown)完全防止了高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞從乳腺到淋巴結(jié)和幾個(gè)主要器官的擴(kuò)散，并且增加了總體生存率。因而，AxI代表了乳腺癌轉(zhuǎn)移所需的腫瘤細(xì)胞EMT的新下游效應(yīng)物。對(duì)表達(dá)AxI的腫瘤的檢測(cè)和針對(duì)性的治療代表了乳腺癌的新的重要治療策略。AxI在EMT和轉(zhuǎn)移中的作用間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞特性的獲取賦予上皮癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)移相關(guān)的單細(xì)胞侵染細(xì)胞能動(dòng)性(Theirry，2002Weinberg，2007)。如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明AxI是侵染-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵的EMT誘導(dǎo)效應(yīng)物。結(jié)果表明EMT過程激活導(dǎo)致AxI上調(diào)，其對(duì)惡性乳腺癌細(xì)胞侵染和自發(fā)轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵的。 從間期乳腺X光檢測(cè)的腫瘤來看，AxI的表達(dá)與乳腺癌患者死亡率密切相關(guān)，表明了 AxI激活和轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展之間的聯(lián)系。AxI在功能性基因篩選中最初被鑒定為侵染性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子(Holland 等，2005)。我們這里證明了響應(yīng)不同趨化誘導(dǎo)物(血清、SDF-1)，在三維基質(zhì)中AxI在惡性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)是侵染力所需要的。與此形成對(duì)比的是，我們觀察到在基于平板的2D 分析(增殖、刮痕)或細(xì)胞粘附中，AxI基因抑制幾乎沒有效應(yīng)。對(duì)Ax I的抑制也抑制了膠質(zhì)瘤和肺癌細(xì)胞的遷移而不影響增值(Angelillolcherrer等，2005 ；Shieh等，2005)。 因此，共同的主旨是AxI信號(hào)傳導(dǎo)是惡性腫瘤細(xì)胞中的間質(zhì)細(xì)胞遷移表型所必需的。與此一致，我們證明了 AxI代表了由多種轉(zhuǎn)錄因子(包括Twist、Snail、Slug和 ZEP2)誘導(dǎo)的EMT的新標(biāo)志物。這些轉(zhuǎn)錄因子在上皮細(xì)胞的表達(dá)引起瞬時(shí)上調(diào)上皮細(xì)胞中的間質(zhì)細(xì)胞特征的正常發(fā)展程序。惡化前上皮細(xì)胞被認(rèn)為是通過線索信號(hào)(如局部基質(zhì)細(xì)胞發(fā)出的TGF β )來激活EMT (Weinberg, 2007)。由于EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)(如E-鈣粘著蛋白)在腫瘤中變化很大，該過程在體內(nèi)是動(dòng)態(tài)的。事實(shí)上在我們的研究中，AxI是獨(dú)立的預(yù)兆指標(biāo)，并且與E-鈣粘著蛋白的變化不相關(guān)。EMT的臨床證據(jù)的缺乏被廣泛記載并且受到爭(zhēng)議。本申請(qǐng)人已經(jīng)證明AxI的表達(dá)代表更持久的EMT誘導(dǎo)的變化。為了確定AxI是否對(duì)乳腺微環(huán)境的轉(zhuǎn)移是必需的，我們將高轉(zhuǎn)移性(體內(nèi)傳代) 的乳腺癌細(xì)胞系(MDA-231-DH2LN)移植到乳腺中，并通過熒光素酶生物發(fā)光的體內(nèi)光學(xué)成像監(jiān)測(cè)擴(kuò)散。在所有對(duì)照小鼠中植入觀天內(nèi)，整體時(shí)域光學(xué)成像(temporal whole body optical imaging)顯示MDA-231-DH2LN大范圍擴(kuò)散到淋巴結(jié)、肺、卵巢和腎臟。在最初4 個(gè)星期，在所有動(dòng)物中均檢測(cè)到自發(fā)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。在之后的9周均檢測(cè)到器官轉(zhuǎn)移灶。 處死動(dòng)物后，將切除的器官分別掃描，顯示出包含轉(zhuǎn)移灶，之后經(jīng)組織學(xué)得到證實(shí)。相比之下，通過生物發(fā)光或組織學(xué)，在具有AxI基因抑制細(xì)胞(MDA-231-DHLN-AxIshRNA)的小鼠器官中沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)移灶。這種對(duì)原發(fā)乳腺部位的擴(kuò)散強(qiáng)烈的抑制作用表明，AxI是轉(zhuǎn)移所必需的。綜上所述，我們的結(jié)果表明對(duì)表達(dá)AxI的乳腺腫瘤的檢測(cè)和針對(duì)性治療是乳腺癌治療發(fā)展的重要的新戰(zhàn)略。診斷工具本發(fā)明的一個(gè)方面涉及檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生的診斷工具。因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及AxI作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，AxI為用于檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生的生物標(biāo)志物。實(shí)體瘤導(dǎo)致的死亡中以轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端部位為最主要的誘因(Gupta2006，Sporn1996)。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞解除上皮的限制，重新定義連接復(fù)合體，并獲得侵染性運(yùn)動(dòng)以穿過整個(gè)基膜界限。這些轉(zhuǎn)移性細(xì)胞之后進(jìn)入淋巴和血行循環(huán)，傳播到體內(nèi)的遠(yuǎn)端部位。這些轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中的一些成功透出毛細(xì)血管壁，并在極少數(shù)情況下侵染異源組織基質(zhì) (Weinberg等)。該惡化過程受到上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的促進(jìn)，其為這樣一種發(fā)展過程 在原腸胚形成和器官發(fā)生期間，上皮細(xì)胞瞬時(shí)呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型，從而允許單細(xì)胞侵染性運(yùn)動(dòng)遠(yuǎn)離上皮層(Hall，1985 ;Thierry，2002)。EMT過程由成形素信號(hào)傳導(dǎo)通路的情況激活所啟動(dòng)，所述成形素信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(包括Twist、Snail、Slug和Zeb2) 的表達(dá)，并改變連接復(fù)合體蛋白的表達(dá)(Thiery和SLeeman 2006)。伴隨波形蛋白和N-鈣粘著蛋白的誘導(dǎo)，EMT基因表達(dá)譜反映了表型的轉(zhuǎn)變、E-鈣粘著蛋白和細(xì)胞角蛋白的抑制 (Weinberg 等，2007)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及AxI作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)惡性腫瘤的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及AxI作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的用途。優(yōu)選地，所述腫瘤為癌，更優(yōu)選為乳腺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于確定受試者是否為接受AxI抑制劑治療的合適候選者的診斷方法。例如，如果AxI的表達(dá)顯示出上調(diào)，則這可以用作治療方案和執(zhí)行的指導(dǎo)(即個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用的預(yù)測(cè))，從而選擇可能對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感的受試者。例如，如果原發(fā)瘤中AxI的表達(dá)顯示出上調(diào)，則可用于推測(cè)轉(zhuǎn)移的概率增加。該信息可用作治療方案的指導(dǎo)(即在個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用的預(yù)測(cè))，從而選擇可能需要更積極的抗癌手術(shù)、化療或放療(如根治性乳房切除術(shù))的受試者。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于確定受試者是否對(duì)會(huì)采用AxI抑制劑的治療易感的方法，所述方法包括以下步驟(i)從細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人中分離樣品；(ii)與對(duì)照樣品相比，確定樣品中AxI的表達(dá)，其中相比于對(duì)照組，AxI表達(dá)的上調(diào)指示對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物”或“生物標(biāo)志物”是指其在來源于細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的樣品中的表達(dá)被改變或被調(diào)節(jié)的基因或蛋白，例如，當(dāng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生時(shí)，其被上調(diào)或下調(diào)。當(dāng)生物標(biāo)志物為蛋白質(zhì)時(shí)，表達(dá)的調(diào)節(jié)或改變包括通過不同的翻譯后修飾進(jìn)行的調(diào)節(jié)。翻譯后修飾為共價(jià)處理事件，其通過溶蛋白性裂解或向一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加修飾性基團(tuán)來改變蛋白質(zhì)性質(zhì)。常用的翻譯后修飾包括磷酸化、乙?；?、甲基化、?；?、 糖基化、GPI錨定、泛素化等。這樣的修飾和檢測(cè)方法的綜述可在文獻(xiàn)“Marm等Nature Biotechnology March 2003, Vol. 21, pages 255—261” 中找至Ij。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，AxI的上調(diào)指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及檢測(cè)樣品中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的方法，所述方法包括以下步驟(i)從細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人中分離樣品；(ii)與對(duì)照樣品相比，確定所述樣品中AxI的表達(dá)，其中相比于對(duì)照樣品，AxI表達(dá)的上調(diào)指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及通過檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生來診斷受試者中轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，所述方法包括確定從受試者獲取的樣品中AxI受體多肽的水平，其中所述多肽表達(dá)水平比未患轉(zhuǎn)移性癌癥的受試者中的水平更高指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。特別是，所關(guān)注的癌癥包括任意的癌，更優(yōu)選為乳腺、肺、胃、頭頸部、大腸、腎、胰腺、子宮、肝、膀胱、子宮內(nèi)膜和前列腺癌以及白血病。更優(yōu)選為轉(zhuǎn)移性乳腺癌。優(yōu)選地，采用抗AxI抗體或親和性試劑測(cè)量AxI基因的表達(dá)或AxI受體多肽的水平。新治療劑的診斷本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的診斷分析，從而在增生性疾病(如癌癥)的治療中具有潛在的治療應(yīng)用。因而，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及AxI或編碼AxI的基因在監(jiān)測(cè)能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的活性中的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人，然后監(jiān)測(cè)AxI的存在。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人，并監(jiān)測(cè)AxI的活性和/ 或表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人，并檢測(cè)已處理的樣品相比于未處理對(duì)照樣品的AxI表達(dá)的改變?！案淖兊谋磉_(dá)”意思是相比于未處理的對(duì)照樣品，來源于已處理細(xì)胞的樣品中表達(dá)的增加、減少或以其它方式調(diào)節(jié)的水平或模式。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因的DNA模板的轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA和該mRNA的翻譯以產(chǎn)生相應(yīng)的基因產(chǎn)物(即肽、多肽、或蛋白質(zhì))，以及已經(jīng)發(fā)生翻譯后修飾的一種或多種形式的蛋白質(zhì)的“表達(dá)”。改變的表達(dá)(包括基因表達(dá))的檢測(cè)可以通過本領(lǐng)域所知的任意一種方法進(jìn)行， 尤其是通過微陣列分析、Western印跡或PCR技術(shù)(如QPCR)進(jìn)行。改變的表達(dá)也可通過采用本文所述的方法(如ELISA、PET或SELDI-TOF MS)和進(jìn)一步使用分析技術(shù)(如2D凝膠電泳)分析樣品中蛋白含量而進(jìn)行檢測(cè)。諸如這樣的技術(shù)可特別用于檢測(cè)處于蛋白質(zhì)的可選的翻譯后修飾形式的改變的表達(dá)形式。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于檢測(cè)試劑的抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力的方法，所述方法包括(i)將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人；以及(ii)測(cè)量來源于已處理或未處理的細(xì)胞、動(dòng)物或人的樣品中的AxI的表達(dá)；以及(iii)檢測(cè)已處理樣品相比于未處理樣品的AxI表達(dá)的增加或減少，作為抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力的指標(biāo)。所述抑制可以在任意水平(如在基因表達(dá)水平或蛋白質(zhì)水平)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及監(jiān)測(cè)AxI抑制劑的活性的方法，包括通過下述步驟檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生(i)將所述AxI抑制劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人；以及
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(ii)測(cè)量來源于已處理或未處理的細(xì)胞、動(dòng)物或人的樣品中的AxI表達(dá)；以及(iii)檢測(cè)已處理樣品相比于未處理樣品的AxI表達(dá)或活性的增加或減少，作為 AxI抑制活性的指標(biāo)。從該方面來說，樣品優(yōu)選通過蛋白質(zhì)分析進(jìn)行分析，更優(yōu)選通過ELISA、PET、流式細(xì)胞術(shù)、SELDI-TOF MS或2-D PAGE進(jìn)行分析。如本文所用，來源于處理或未處理細(xì)胞的樣品可以為來源于組織培養(yǎng)物或動(dòng)物或人的一組細(xì)胞的裂解液、提取物或核酸樣品。對(duì)于蛋白質(zhì)分析，樣品可以為組織培養(yǎng)上清液。細(xì)胞可從個(gè)體分離(如來自血液、血清或血漿樣本的全細(xì)胞)，或可以為組織樣本的一部分(如活組織檢查樣品)。優(yōu)選的，所述的一組細(xì)胞為細(xì)胞培養(yǎng)物。優(yōu)選的細(xì)胞類型選自結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系(如HD9)、肺腫瘤細(xì)胞系(如A549)、腎腫瘤細(xì)胞系(如A498)、膀胱腫瘤細(xì)胞系(如HT 13)、乳腺腫瘤細(xì)胞系(如MDA-MB-231)、子宮內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞系(如AN3CA)、子宮腫瘤細(xì)胞系(如MESSA DH6子宮肉瘤細(xì)胞)、肝腫瘤細(xì)胞系(如H印2G)、前列腺腫瘤細(xì)胞系(如DU145)、T細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系(如Cem T細(xì)胞)、胰腫瘤細(xì)胞系(如MiaPaCa2)?；蛘撸?xì)胞可以是腫瘤活檢組織學(xué)樣品(如激光捕獲顯微手術(shù)獲得的樣品)的形式。在活檢樣品中檢測(cè)基因表達(dá)的合適的方法包括使用能識(shí)別本文所確定的基因的抗體的FISH或免疫組織化學(xué)技術(shù)，以及分析樣品中蛋白質(zhì)組成的方法。另外，所述細(xì)胞可為血細(xì)胞培養(yǎng)物如PBMC。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“PBMC”是指外周血單核細(xì)胞并且包括PBL (外周血淋巴細(xì)胞)。適宜地，監(jiān)測(cè)取自哺乳動(dòng)物或人類的樣品中的表達(dá)改變，包括基因表達(dá)的改變。合適的樣品包括(但不限于)組織樣品，如活檢樣品、血、尿、口腔擦拭物等。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)的檢測(cè)優(yōu)選在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行，所述腫瘤細(xì)胞特別是源于腫瘤(如乳腺、肺、 胃、頭頸部、大腸、腎、胰腺、子宮、肝、膀胱、子宮內(nèi)膜和前列腺癌以及白血病)的細(xì)胞或來自血細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞，優(yōu)選外周血單核細(xì)胞，如PBMC)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)改變的蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)在來自哺乳動(dòng)物或人的血清或血漿或組織培養(yǎng)上清液中進(jìn)行。在檢測(cè)患者的血清以及尤其是血漿樣品中的蛋白質(zhì)時(shí)，樣品被取出，并進(jìn)行本文所述的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、PET和SELDI-TOF MS。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括從所述樣品中提取RNA和通過QPCR檢測(cè)基因表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)的檢測(cè)通過檢測(cè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物(如通過Western印跡法)進(jìn)行。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)將所述試劑與AxI受體或表達(dá)所述AxI受體的細(xì)胞接觸；(ii)在所述試劑的存在下測(cè)量AxI受體的活性；以及(iii)將步驟(ii)中測(cè)得的活性與在對(duì)照條件下測(cè)得的活性相比較，其中活性降低表明所述試劑能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。優(yōu)選地，測(cè)定的活性為AxI受體底物的酪氨酸磷酸化程度。
更優(yōu)選地，測(cè)定的活性為AxI受體的自磷酸化程度。對(duì)于這個(gè)具體的實(shí)施方案，優(yōu)選接觸步驟(i)中的細(xì)胞已經(jīng)預(yù)先被AxI基因轉(zhuǎn)染。更優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(iii)中的對(duì)照條件包括將試劑與缺乏活性AxI基因的細(xì)胞接觸。更優(yōu)選的是，所述細(xì)胞具有AxI基因的突變的失活形式。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(iii)中的對(duì)照條件包括將活性與試劑不存在時(shí)測(cè)得的活性相比較。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，AxI受體包括胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，AxI受體是固定化的，例如通過附著到固相上而固定化。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于通過篩選多種試劑來鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)將所述多種試劑與AxI受體或表達(dá)所述AxI受體的細(xì)胞接觸；(ii)在所述多種試劑的存在下測(cè)量AxI受體的活性；(iii)將步驟(ii)中測(cè)得的活性與在對(duì)照條件下測(cè)得的活性相比較，其中活性降低表明所述多種試劑能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)；以及(ν)分別確定所述多種試劑中的哪種或哪些試劑能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)。在本發(fā)明上述的方法中，所述試劑優(yōu)選地用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥。通過所述方法鑒定的試劑另一方面涉及根據(jù)上述任意方法鑒定得到的試劑在制備用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述癌癥選自乳腺、肺、胃、頭頸部、大腸、腎、胰腺、子宮、肝、膀胱、子宮內(nèi)膜和前列腺癌和白血病。更優(yōu)選地，所述癌癥為乳腺癌?；?蛋白標(biāo)志物的表達(dá)改變的測(cè)量可采用許多不同的技術(shù)確定基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。(a)在 RNA 水平可在RNA水平下檢測(cè)基因表達(dá)?？刹捎肦NA提取技術(shù)從細(xì)胞中提取RNA，所述技術(shù)包括(例如)使用酚/異硫氰酸胍提取(RNAzolB ；Biogenesis公司)、RNeasy RNA制備試劑盒toiagen公司)或PAXgene (PreAnalytix公司，瑞士 )。利用核糖核酸雜交的典型分析模式包括核運(yùn)行分析、RT-PCR、RNA酶保護(hù)分析(Melton等，Nuc. Acids Res. 12 :7035)、 Northern印跡和原位雜交。還可通過如下所述的微陣列分析來檢測(cè)基因表達(dá)。對(duì)于Northern印跡，首先通過在變性條件下用瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)大小分離RNA 樣品。然后將RNA轉(zhuǎn)印到膜上，交聯(lián)并與標(biāo)記探針雜交。可以使用非同位素或高特異性活性放射標(biāo)記探針，其包括隨機(jī)引物的、缺口翻譯的或PCR產(chǎn)生的DNA探針，在體外轉(zhuǎn)錄的RNA 探針和寡核苷酸。此外，只具有部分同源性的序列(例如得自可能含有外顯子的不同物種或基因組DNA片段的cDNA)可用作探針。核酸酶保護(hù)分析(包括核糖核酸酶保護(hù)分析和Sl核酸酶分析)提供了用于檢測(cè)和定量特定mRNA的高靈敏方法。NPA的基礎(chǔ)為反義探針(放射性標(biāo)記的或非同位素的)與 RNA樣品的溶液雜交。雜交后，單鏈未雜交的探針和RNA被核酸酶降解。留下的經(jīng)保護(hù)的片段在丙烯酰胺凝膠上分離。NPA允許同時(shí)檢測(cè)多種RNA種類。原位雜交(ISH)是用于特定mRNA在細(xì)胞或組織中的定位的強(qiáng)大和靈活的工具。探針的雜交發(fā)生在細(xì)胞或組織內(nèi)。由于整個(gè)過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到保持，因此ISH提供了 mRNA 在組織樣品中的位置信息。該過程通過在中性緩沖福爾馬林中固定樣品，并將組織包埋在石蠟中而開始。然后將樣品切成薄片，并放置到顯微鏡玻片上?；蛘?，可以將組織切片冷凍并且在多聚甲醛中后固定。在將切片經(jīng)過一系列清洗以脫蠟和再水化后，進(jìn)行蛋白酶K消化以增加探針的進(jìn)入度，然后將標(biāo)記的探針與樣品切片雜交。放射性標(biāo)記探針通過切片上干燥后的液膜而顯現(xiàn)，而非同位素標(biāo)記的探針則采用比色法或熒光試劑來簡(jiǎn)便地檢測(cè)。后者的檢測(cè)方法是熒光原位雜交(FISH)技術(shù)的基礎(chǔ)。檢測(cè)可采用的方法包括放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、熒光標(biāo)記和其他合適的標(biāo)記。通常，RT-PCR用于擴(kuò)增RNA目標(biāo)物。在這個(gè)過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶用于將RNA轉(zhuǎn)換為互補(bǔ)的DNA(cDNA)，然后將其擴(kuò)增以方便檢測(cè)。相對(duì)定量RT-PCR技術(shù)包括同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)部對(duì)照物以及所關(guān)注的基因。內(nèi)部對(duì)照物用于校正樣品。一旦進(jìn)行校正，可在樣品之間對(duì)特定 mRNA的相對(duì)豐度進(jìn)行直接比較。常用的內(nèi)部對(duì)照物包括(例如)GAPDH、HPRT、肌動(dòng)蛋白和親環(huán)蛋白。許多DNA擴(kuò)增方法是已知的，其中大部分都依賴于酶的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、或自身持續(xù)序列復(fù)制)或?qū)⑷炕虿糠州d體復(fù)制進(jìn)入被克隆的 DNA。許多目標(biāo)和信號(hào)放大(TAQ方法已在文獻(xiàn)中記載，例如文獻(xiàn)“Landegren， U.等，Science 242 :229-237 (1988) ” 和"Lewis，R.，Genetic Engineering News 10:1， 54-55(1990) ”對(duì)這些方法進(jìn)行了綜述。PCR為在(例如)專利文獻(xiàn)US 4，683，195和4，683，202等中描述的核酸擴(kuò)增方法。 PCR在診斷情況中可用于擴(kuò)增任意已知的核酸(Mok等，1994，Gynaecologic Oncology 52: ^7-25 。自身持續(xù)序列復(fù)制(3SR)是TAS的一種變形，其包括借助于逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性的順次循環(huán)(通過多種酶混合液和合適的寡核苷酸引物介導(dǎo))而等溫?cái)U(kuò)增核酸模板(Guatelli 等，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1874)。連接擴(kuò)增反應(yīng)或連接擴(kuò)增系統(tǒng)使用DNA連接酶和4種寡核苷酸(每種目標(biāo)鏈兩種)。該技術(shù)在文獻(xiàn)“mi，D.Y.和 Wallace, R. B. ,1989, Genomics 4 :560”中有所描述。在復(fù)制酶技術(shù)中，復(fù)制單鏈RNA 的噬菌體Q^的RNA復(fù)制酶用于擴(kuò)增目標(biāo)DNA(如文獻(xiàn)“Lizardi等，1988, Bio/Technology 6:1197”所述的那樣)。定量PCR(Q-PCR)為獲得待確定的樣品中轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量的技術(shù)。本文描述了執(zhí)行QPCR的合適方法。在本發(fā)明中可以采用其它可供選用的擴(kuò)增技術(shù)。例如，滾環(huán)(rolling circle)擴(kuò)增(Lizardi等，1998，Nat Genet 19 :225)是市售可得的擴(kuò)增技術(shù)(RCAT )，其由DNA聚合酶推動(dòng)并且可以在等溫條件下以線性或幾何動(dòng)力學(xué)復(fù)制環(huán)形寡核苷酸探針。另一項(xiàng)技術(shù)-鏈置換擴(kuò)增(SDA ；Walker 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA80 :392)以專屬于特定目標(biāo)物的特別確定的序列開始。
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用于檢測(cè)本文鑒定的AxI表達(dá)的合適的探針可處于合適的容器中方便地封裝為檢測(cè)試劑盒的形式。在這種試劑盒中，探針可以結(jié)合到到固體載體上，其中試劑盒所針對(duì)的設(shè)計(jì)的分析模式需要這種結(jié)合。該試劑盒可以包含用于處理待探測(cè)樣品、將探針與樣品中核酸雜交的合適試劑，對(duì)照試劑，用法說明等。合適的試劑盒可包括(例如)QPCR反應(yīng)的引物或執(zhí)行FISH的標(biāo)記探針。(b)在多肽水平改變的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)也可通過測(cè)量由AxI基因編碼的多肽檢測(cè)。這可通過采用能結(jié)合AxI基因編碼的多肽的分子實(shí)現(xiàn)。直接或間接結(jié)合多肽以檢測(cè)蛋白的存在的合適的分子/試劑包括天然形成的分子如肽和蛋白質(zhì)(例如抗體)，或者其也可以是合成分子。AxI的基因或蛋白質(zhì)的抗體可由市售來源得到或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案(其中改變的表達(dá)通過蛋白生物標(biāo)志物的翻譯后修飾形式的改變的表達(dá)自我表征)中，可采用特異性針對(duì)這些不同形式的抗體?？贵w的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如果需要多克隆抗體，則用具有多肽表位的免疫原多肽來接種所選的動(dòng)物(例如，鼠、兔、羊、馬等)。收集接種動(dòng)物的血清，并且根據(jù)已知的程序處理。如果含有針對(duì)多肽表位的多克隆抗體具有針對(duì)其它抗原的抗體， 則可采用免疫親和層析來純化該多克隆抗體。多克隆抗血清的制備和處理技術(shù)為本領(lǐng)域已知。為了產(chǎn)生較大的免疫原性反應(yīng)，多肽或其片段可經(jīng)半抗原修飾為另一多肽，以用作動(dòng)物或人體的免疫原。針對(duì)多肽中表位的單克隆抗體也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備。由雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體的一般方法是眾所周知的?？赏ㄟ^細(xì)胞融合來構(gòu)建永久的制備抗體的細(xì)胞株，并且也可通過其他技術(shù)(如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或用EB病毒傳染)制備。 針對(duì)本發(fā)明多肽表位制得的單克隆抗體群可通過各種特性(即同型和抗原表位親和性)篩選。另一項(xiàng)可供選用的技術(shù)包括篩選噬菌體展示庫(kù)，其中，(例如)噬菌體在其外殼表面表達(dá)scFv片段，其中所述外殼具有一系列互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。這種技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明的目的，除非另外指明，否則術(shù)語(yǔ)“抗體”包括全抗體，或全抗體的保留了其靶抗原結(jié)合活性的片段。這些片段包括Fv、F(ab')和F(ab' )2片段，以及單鏈抗體 (scFv)。另外，抗體及其片段可以為在(例如)EP239400A中所述的人源化抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括類抗體親和試劑。例如單克隆和多克隆抗體、重組抗體、抗體的蛋白水解和重組片段(Fab、Fv, scFv、雙抗體)、單結(jié)構(gòu)域抗體(VHH、sdAb、納米抗體、IgNAR, VNAR)以及構(gòu)建為具有類抗體特異結(jié)合性的與抗體無關(guān)的蛋白質(zhì)，具體如下名稱基于
Affibodies蛋白 A、Z 結(jié)構(gòu)域 6 kDa
AffitinsS ac7d (源自嗜酸熱硫化葉菌)7 kDa
Anticalins脂籠蛋白 20 kDa
DARPins錨蛋白重復(fù)序列模體14 kDa
FynomersFyn, SH3 結(jié)構(gòu)域 7 kDa
Kunitz域多肽各種蛋白酶抑制劑6 kDa
Monobodies 纖連蛋白如上所述，諸如免疫印跡等標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)可用于檢測(cè)AxI活性相比于相同細(xì)胞群的未處理細(xì)胞的改變水平。基因表達(dá)也可通過檢測(cè)多肽的翻譯后加工或核酸的轉(zhuǎn)錄后修飾的變化來確定。例如，可以測(cè)量多肽的差異磷酸化、多肽的斷裂或RNA的選擇性剪接?？赏ㄟ^采用專門的蛋白質(zhì)分析法或諸如2D聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)來檢測(cè)基因產(chǎn)物(如多肽)的表達(dá)水平以及它們的翻譯后修飾的表達(dá)水平。可通過下列方法將抗體用于檢測(cè)AxI的表達(dá)，所述方法包括(a)提供本發(fā)明所述的抗體；(b)在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下將生物樣品與所述抗體孵育；(c)確定是否形成包含所述抗體的抗體-抗原復(fù)合物。合適的樣品包括組織提取物，所述組織例如為大腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰腺、睪丸，肝、肌肉和骨組織，或來源于這些組織的贅瘤。其他合適的例子包括血液或尿液樣品。特異性結(jié)合AxI蛋白的抗體可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的診斷或預(yù)測(cè)方法和試劑盒中，以檢測(cè)或定量體液或組織中AxI蛋白的表達(dá)。上述測(cè)試的結(jié)果可用于診斷或預(yù)測(cè)癌癥和其他細(xì)胞運(yùn)動(dòng)或細(xì)胞存活介導(dǎo)的疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，或評(píng)價(jià)藥物劑量和治療的有效性。可通過本領(lǐng)域已知的任意方法分析抗體的免疫特異性結(jié)合?？刹捎玫拿庖叻治霭?但不限于)競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性分析系統(tǒng)，其采用的技術(shù)例如為western印跡、免疫組織化學(xué)、放射性免疫分析、ELISA、夾心免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散分析、凝集反應(yīng)分析、補(bǔ)體固定分析、免疫放射分析、熒光免疫分析和蛋白A免疫分析。上述分析法為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)(參見(例如)文獻(xiàn)“Ausubel等，eds，1994， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc. ,New York，，， 其全文以引用方式并入本文中)。本發(fā)明所用的抗體優(yōu)選結(jié)合到固體載體，并且/或者處于合適的容器中與合適的試劑、對(duì)照物、說明等一起封裝在試劑盒內(nèi)。其它方法包括(但不限于)2D_PAGE，雖然這較為不適合大規(guī)模篩選。更新的技術(shù)包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F MS)。在MALDI-T0F分析中，將復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)都固定在固態(tài)金屬基體中，用脈沖激光束解吸附以產(chǎn)生橫穿零場(chǎng)飛行管的氣態(tài)離子，然后根據(jù)其質(zhì)量依賴的速度分離?？赏ㄟ^使用信息工具搜索蛋白質(zhì)和多肽序列數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定每種蛋白質(zhì)和多肽。表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF MS) 是一種基于親和性的質(zhì)譜，其中蛋白質(zhì)被選擇地吸附到化學(xué)修飾的固體表面，通過洗滌除去雜質(zhì)，應(yīng)用吸收能量的基質(zhì)，并且通過激光解吸質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)。SELDI-T0F-MS可用于檢測(cè)完整的蛋白或特定蛋白質(zhì)片段的存在/缺失。此外 SELDI-T0F-MS也可因?yàn)橛苫瘜W(xué)基團(tuán)的添加/去除所導(dǎo)致的質(zhì)量差異而用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。因此，單個(gè)殘基的磷酸化由于磷酸酯基團(tuán)而導(dǎo)致80Da的質(zhì)量變化?？捎煞g后修飾產(chǎn)生的分子量的數(shù)據(jù)庫(kù)可在互聯(lián)網(wǎng)上自由獲得(http://www. abrf. org/index. cfm/ dm. home avgmass = all)。此外，特定的多肽可采用SELDI-T0F-MS通過基于親和性的方法用抗體捕獲，其中所述抗體能特異性識(shí)別蛋白質(zhì)的翻譯后修飾形式，或者可同等識(shí)別蛋白質(zhì)的所有形式。陣列一般來說，陣列技術(shù)和與之相關(guān)的各種技術(shù)及應(yīng)用在眾多的教科書和文件中均有描述。這些包括文獻(xiàn) Lemieux 等，1998，Molecular Breeding 4 :277-289 ；Schena 禾口 Davis. Parallel Analysis with Biological Chips, in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. GeIfand, J. Sninsky) ；Schena 禾口 Davis,1999, Genes, Genomes and Chips. In DMA Microarrays :A Practical Approach (ed.M.Schena), Oxford University Press, Oxford, UK,1999) ；The Chipping Forecast(Nature Genetics special issue ； January 1999Supplement) ；Mark Schena(Ed. ),Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company) ；Cortes,2000, The Scientist 14(17) 25 ；Gwynne and Page, Microarray analysis :the next revolution in molecular biology, Science,1999, August 6 ;Eakins 和 Chu，1999，Trends in Biotechnology，17 :217-218 ；以及各種萬(wàn)維網(wǎng)。陣列技術(shù)克服了分子生物學(xué)傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，其中傳統(tǒng)方法一般基于“一個(gè)實(shí)驗(yàn)一個(gè)基因”的方式進(jìn)行，從而導(dǎo)致低通量以及無法認(rèn)識(shí)基因功能的“全貌”。目前，陣列技術(shù)的主要應(yīng)用包括序列的識(shí)別(基因/基因突變)和基因表達(dá)水平(豐度)的確定?；虮磉_(dá)分析可以利用陣列技術(shù)，可任選地結(jié)合蛋白組學(xué)技術(shù)(Celis等，2000，F(xiàn)EBS Lett, 480(1) 2-16 ；Lockhart 和 Winzeler，2000，Nature 405(6788) :827-836 ；Khan 等，1999，20 ) 223-9)。陣列技術(shù)的其它應(yīng)用也為本領(lǐng)域所公知；例如基因的發(fā)現(xiàn)、癌癥研究(MarX，2000， Science 289 1670-1672 ;Scherf■等，2000，Nat Genet 24(3) :236-44 ;Ross 等，2000，Nat Genet 2000,24(3) :227-35)、SNP 分析(Wang 等，1998，Science 280(5366) :1077-8 、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物基因組學(xué)、疾病診斷(例如，utilising microfluidics devices =Chemical & Engineering News, February 22，1999，77 (8) :27-36)、毒理學(xué)(Rockett 和 Dix (2000)， Xenobiotica 30(2) :155-77 ;Afshari 等，1999，Cancer Res 59(19) :4759-60)以及毒理基因組學(xué)(功能基因組與分子毒理學(xué)的雜化)。毒理基因組學(xué)的目的在于找到對(duì)有毒物質(zhì)的毒性反應(yīng)與接觸該有毒物質(zhì)的對(duì)象的基因圖譜的變化之間的關(guān)系(Nuwaysir等，1999， Molecular Carcinogenesis 24:153-159)。在本發(fā)明的情況中可采用陣列技術(shù)來(例如)分析AxI蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，陣列技術(shù)可用于分析候選化合物對(duì)AxI活性的影響。一般情況下，任何樣品庫(kù)或組可以有序方式布置在陣列中，這通過空間分隔所述庫(kù)或組中的成員來進(jìn)行。用于陣列分析的合適的庫(kù)的例子包括核酸庫(kù)(包括DNA、cDNA、寡核苷酸等庫(kù))、肽、多肽和蛋白質(zhì)庫(kù)，以及包含任意分子(如配體庫(kù))等的庫(kù)。因此，如果在本發(fā)明中引用“庫(kù)”時(shí)，除非上下文另有規(guī)定，否則這種引用應(yīng)被認(rèn)為包括陣列形式的庫(kù)的引用。樣品(例如庫(kù)的成員)一般是固著或固定到固相上(優(yōu)選為固體基質(zhì))，以限制樣品的擴(kuò)散和摻雜。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可制備結(jié)合DNA的配體庫(kù)。特別是，所述的庫(kù)可以固定在基本平坦的固相上，包括膜和非多孔基質(zhì)(如塑料和玻璃)。此外，樣品優(yōu)選以有利于索引(即引用或訪問特定樣品)的方式布置。通常情況下將樣品以點(diǎn)的形式施加在網(wǎng)格形式中。常見分析系統(tǒng)可適用于該目的。例如，可將陣列固定在微孔板表面，其中多個(gè)樣品位于一個(gè)孔中，或是每個(gè)孔中具有單一樣品。此外，固體基質(zhì)可為膜，如硝酸纖維素或尼龍膜 (例如印跡實(shí)驗(yàn)中所用的膜)?？蛇x用的其它基質(zhì)包括玻璃或硅基基質(zhì)。因此，可通過本領(lǐng)域已知的任意合適的方法(例如通過電荷相互作用或通過化學(xué)偶合)將樣品固定到孔壁或孔底部、或膜表面。可采用其他布置和固定的手段，例如吸移、滴觸(drop-touch)，壓電手段、噴墨和氣泡噴射技術(shù)、靜電施加等。在硅基芯片的情況下，可利用光刻法將樣品布置和固定在芯片上?？赏ㄟ^“點(diǎn)”在固體基質(zhì)上來布置樣品；這可通過手工或使用機(jī)器人沉積樣品來完成。一般情況下，陣列可被描述為巨陣列或微陣列，其區(qū)別在于樣品點(diǎn)的大小。巨陣列通常包含點(diǎn)大小為約300微米或更大的樣品，并且可以容易地通過現(xiàn)有的凝膠和印跡掃描儀成像。微陣列上的樣品點(diǎn)大小通常具有小于200微米的直徑，并且這些陣列通常包含成千上萬(wàn)個(gè)點(diǎn)。因此，微陣列可需要專門的機(jī)器人技術(shù)和成像設(shè)備，這可能需要定制。在文獻(xiàn) "Cortese, 2000, The Scientist 14(11) :26，，的綜述中大致描述了該裝置。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了制備固定化的DNA分子庫(kù)的技術(shù)。一般來說，大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)的方法都描述了如何合成單鏈核酸分子庫(kù)，其采用(例如)掩模技術(shù)在固體基質(zhì)的各種離散位置建立各種序列排列。US 5，837，832(其內(nèi)容以引用方式并入本文)描述了改進(jìn)的基于超大規(guī)模整合技術(shù)制備固定到硅基基質(zhì)的DNA陣列的方法。特別是，US5, 837，832描述了被稱為“嵌裝”的策略以在基質(zhì)的空間限定的位置合成特定的探針組，所述策略可用于制備本發(fā)明的固定化的DNA庫(kù)。US 5，837，832也提供了可采用的較早技術(shù)的文獻(xiàn)。也可按照下述方式在表面上合成肽(或多肽模擬物)陣列將每個(gè)不同的庫(kù)成員(例如獨(dú)特的肽序列)設(shè)置在陣列中離散的預(yù)定的位置。每個(gè)庫(kù)成員的特征是由其在陣列中的空間位置確定的。確定陣列中在預(yù)定的分子(例如靶標(biāo)或探針)與反應(yīng)性庫(kù)成員之間發(fā)生結(jié)合相互作用的位置，從而基于空間位置確定反應(yīng)性庫(kù)成員的序列。在文獻(xiàn) US 5，143,854 ；WO 90/15070 禾口 WO 92/10092 ；Fodor 等，1991，Science 251 :767 ；Dower 禾口 Fodor, 1991，Ann. Rep. Med. Chem. 26 :271 中描述了這些方法。為了有助于檢測(cè)，靶標(biāo)和探針可用任意容易檢測(cè)的報(bào)告物標(biāo)記，例如熒光、生物發(fā)光、磷光、放射性等報(bào)告物標(biāo)記。在本文的其它部分討論了這樣的報(bào)告物、其檢測(cè)、其與靶標(biāo) /探針的偶聯(lián)等。在文獻(xiàn)"Shalon等，1996，Genome Res 6(7) :639-45”中也公開了探針和靶標(biāo)的標(biāo)記。DNA陣列的具體例子包括如下模式I 采用機(jī)器人點(diǎn)樣法將探針cDNA( 500- 5，000堿基長(zhǎng)度)固定到固體表面(如玻璃)上，并將其暴露于一組獨(dú)立地或以混合物的形式存在的靶標(biāo)。這種方法被廣泛認(rèn)為是在斯坦福大學(xué)開發(fā)的(Ekins和Chu，1999，Trends in Biotechnology, 17 217-218)。模式II 原位(芯片上)或通過常規(guī)合成隨后芯片上固定來合成寡核苷酸陣列 ( 20- 25-mer寡核苷酸)或肽核酸(PNA)探針。將該陣列暴露于已經(jīng)標(biāo)記的樣品 DNA、雜交并確定互補(bǔ)序列的特征/豐度。該DNA芯片由Affymetrix有限公司銷售，商標(biāo)為 GeneChip ο在(例如)文獻(xiàn)"Marshall 禾口 Hodgson, 1998，Nature Biotechnologyl6 (1) 27-31”中描述了一些市售可得的微陣列模式的例子。數(shù)據(jù)分析也是陣列實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要部分。微陣列實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)通常為圖像，其需要轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)矩陣-表格，其中行代表(例如)基因，列代表(例如)各種樣品(如組織)或?qū)嶒?yàn)條件，并在每個(gè)單元格中的數(shù)字表示(例如)特定樣品中特定基因的表達(dá)水平。 如果需要提取潛在的生物過程有關(guān)的知識(shí)，這些矩陣必須進(jìn)一步分析。數(shù)據(jù)分析方法(包括監(jiān)督和未監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析以及生物信息學(xué)方法)在Brazma和ViIo J，2000，F(xiàn)EBS Lett 480(1) :17-24 中披露。如上所述，蛋白質(zhì)、多肽等也可被固定在陣列中。例如，抗體已經(jīng)被應(yīng)用于采用蛋白質(zhì)芯片的蛋白質(zhì)組的微陣列分析中(Borrebaeck CA, 2000, Immunol Today 21(8) 379-82)。例如，在文獻(xiàn)"MacBeath 和 Schreiber, 2000, Science, 289 (5485) 1760-1763”中綜述了多肽陣列。藥物組合物另一個(gè)方面涉及包含根據(jù)上述方法鑒定得到的試劑與可藥用的稀釋劑、賦形劑或載體的混合物的藥物組合物。另一個(gè)方面涉及制備藥物組合物的方法，包括(i)根據(jù)上述任意方法鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑；以及(ii)將所述試劑與可藥用的稀釋劑、賦形劑或載體混合。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及通過本發(fā)明方法鑒定的試劑在制備用于治療增殖疾病的藥物中的用途，所述增殖疾病更優(yōu)選為癌癥。根據(jù)本發(fā)明所述的用途，通過上述方法鑒定的試劑可作為藥物制劑，其包含化合物或其生理上可接受的鹽、酯或其它生理功能的衍生物，以及一種或多種可藥用的載體和可任選的其它治療和/或預(yù)防的成分。載體必須與制劑中的其他成分相容，并且對(duì)其接受者無害。該藥物組合物可在人類和獸醫(yī)學(xué)中用于人和動(dòng)物使用。用于本文所述各種不同形式藥物組合物的這樣的合適的賦形劑的例子可在文獻(xiàn) "Handbook of Pharmaceutical Excipients,2nd Edition, (1994)，由 A Wade 禾口 PJ Weller 編輯”中找到。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑為制藥領(lǐng)域公知，并且在(例如)文獻(xiàn) “Remington' s Pharmaceutical Sciences,Mack 出版公司(A. R. Gennaro edit. 1985)，，中
有記載。合適的載體的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨醇等。合適的稀釋劑的例子包括乙醇、甘油和水?？筛鶕?jù)施用的期望途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐來選擇藥物載體、賦形劑或稀釋劑。該藥物組合物可包含(或除了載體、賦形劑或稀釋劑可包含)任何合適的粘結(jié)劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑、緩沖劑、調(diào)味劑、表面活性劑、增稠劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等，以及使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的物質(zhì)。合適的粘結(jié)劑的例子包括淀粉、明膠、天然糖(如葡萄糖)、無水乳糖、自由流動(dòng)乳糖、β -乳糖、玉米甜味劑、天然和合成膠(如阿拉伯樹膠、黃蓍膠或海藻酸鈉)、羧甲基纖
維素和聚乙二醇。合適的潤(rùn)滑劑的例子包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉寸。藥物組合物中可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料、甚至調(diào)味劑。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸酯。也可使用抗氧化劑和懸浮劑。藥物制劑包括適合經(jīng)口施用、局部施用(包括經(jīng)皮膚、口腔和舌下施用)、經(jīng)直腸或胃腸外施用(包括經(jīng)皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈施用)、經(jīng)鼻腔和肺部施用(例如通過吸入施用)的那些。在適當(dāng)情況下，所述制劑可方便地以離散劑量單位的形式提供，并且可由藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任意技術(shù)制備。所有的方法包括將活性化合物與液體載體和/或細(xì)碎的固體載體的步驟，然后如有必要，將產(chǎn)品成形成為所需制劑。適合于經(jīng)口施用的藥物制劑(其中載體為固體)最優(yōu)選以單位劑量制劑的形式 (如含預(yù)定量活性劑的丸藥、膠囊或片劑)提供。片劑可通過任選地與一種或多種附加成分一起壓縮或模壓制得。壓縮片可通過如下方式制備在合適的機(jī)器中將自由流動(dòng)形式(如粉末或顆粒)的活性劑可任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑或分散劑混合后壓縮。模壓片可通過將活性劑與惰性液體稀釋劑模壓得到。可以任選地將片劑包衣，并且如果沒有包衣的話，可任選地將其刻痕。膠囊可通過將活性劑單獨(dú)或與一種或多種附加成分的混合物填入膠囊殼中，然后以通常方式將其密封。扁囊劑類似于膠囊，其中活性劑以及任意附加成分密封在米紙?zhí)字??；钚詣┮部膳渲茷榉稚⑿灶w粒，其(例如)可在施用前懸浮在水中，或?yàn)⒃谑澄镏?。膠囊可被封裝在(例如)小袋中。其中載體為液體的適合于經(jīng)口施用的制劑可以在水或非水液體中的溶液或懸浮液的形式，或以水包油型乳液的形式提供。用于經(jīng)口施用的制劑包括控釋劑型(例如片劑)，其中活性劑被配制在適當(dāng)?shù)目蒯尰|(zhì)中，或包被有合適的控釋膜。這種制劑可特別便于預(yù)防性應(yīng)用。適合經(jīng)直腸施用的藥物制劑(其中載體為固體)最優(yōu)選以單位劑量栓劑的形式提供。合適的載體包括本領(lǐng)域常用的可可脂和其他材料。栓劑可以方便地通過混合活性劑與軟化或熔化的載體，然后冷卻并且在模具中成型來制備。適合經(jīng)胃腸外施用的藥物制劑包括活性劑在水性或油質(zhì)載體中的無菌溶液或懸浮液。注射制劑可適合于彈丸注射或連續(xù)輸注。該類制劑方便地提供于單位劑量或多劑量容器中，該容器在導(dǎo)入制劑后直到使用時(shí)均被密封?；蛘?，活性劑可為粉末形式，其在使用前用合適的載體(如無菌的、無熱原水)重構(gòu)?；钚曰衔镆部芍苽錇殚L(zhǎng)效儲(chǔ)存型制劑(long-acting depot pr印aration)，其可通過肌內(nèi)注射或植入(例如經(jīng)皮下或肌肉植入)來施用。長(zhǎng)效制劑可包括(例如)合適的聚合物或疏水性材料、或離子交換樹脂。這種長(zhǎng)效制劑特別便于預(yù)防性使用。
適合于通過頰間隙經(jīng)肺部施用的制劑被提供為使得包含活性化合物的顆粒(直徑為0. 5至7微米)被遞送到接受者的支氣管樹中。所述制劑的一種可能是精細(xì)磨碎的粉末形式，其可便于提供在用在吸入裝置中的可穿孔膠囊(例如，明膠的膠囊)內(nèi)，或者以自推進(jìn)(self-propelling)制劑的形式提供， 其中所述制劑包含活性劑、合適的液態(tài)或氣態(tài)推進(jìn)劑和可選的其他成分(如表面活性劑和 /或固體稀釋劑)。適當(dāng)?shù)囊后w推進(jìn)劑包括丙烷和含氯氟烴，并且合適的氣體推進(jìn)劑包括二氧化碳。也可采用這樣的自推進(jìn)制劑，其中活性劑以液滴的形式懸浮在溶液或懸浮液中。這種自推進(jìn)制劑類似于本領(lǐng)域已知的那些，并且可通過既定程序制備。合適的是， 它們提供于容器中，該容器設(shè)置有具有所需的噴霧特性的可手動(dòng)操作或自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)的閥門； 有利的是，所述閥門為計(jì)量型，從而在每次操作后輸送固定的體積，例如25至100微升。另一種可能是，活性劑可為用在噴霧器或霧化器中的溶液或懸浮液形式，由此采用加速氣流或超聲波攪拌以產(chǎn)生用于吸入的細(xì)液滴霧。適合經(jīng)鼻腔施用的制劑包括制備大體上類似于上述肺部施用的制劑。當(dāng)分配所述制劑時(shí)，其粒徑應(yīng)當(dāng)有利地在10到200微米的范圍內(nèi)，以使其能夠在鼻腔中停留；這可通過適當(dāng)?shù)夭捎煤线m粒徑的粉末或合適的閥門選擇來實(shí)現(xiàn)。其他合適的制劑包括粒徑在20至 500微米范圍內(nèi)的粗顆粒，以從靠近鼻子的容器通過鼻孔快速吸入施用；以及滴鼻劑，其包含0. 2至5% w/v的在水性或油性溶液或懸浮液中的活性劑?？伤幱玫妮d體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括(但不限于)0. 1M、優(yōu)選0. 05M的磷酸鹽緩沖液或0. 8%生理鹽水。此外，可藥用的載體可以為水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的例子為丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)以及可注射有機(jī)酯(如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鈉林格氏注射液或固定油。也可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等等。適合局部施用的制劑可以(例如)凝膠、乳膏或軟膏的形式提供。上述制劑可施加于(例如)傷口或潰瘍，其直接涂抹在傷口或潰瘍的表面或承載在合適的支持物(如繃帶、紗布、網(wǎng)等)上然后施加覆蓋在待處理的區(qū)域。也可提供液體或粉末制劑，其可被直接噴灑或撒到待處理的位置，如傷口或潰瘍。 或者，可將制劑噴灑或撒在諸如繃帶、紗布、網(wǎng)等載體上，然后施加到待處理的位置。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制備上述的藥物或獸藥組合物的方法，所述方法包括將活性化合物與載體結(jié)合，例如通過混合來結(jié)合。一般情況下，通過下列方法制備上述制劑將活性劑與液體載體和/或細(xì)碎的固體載體均一且密切的結(jié)合，然后如有必要將產(chǎn)品成形。本發(fā)明擴(kuò)展到制備藥物組合物的方法，其包括將藥劑與藥物可接受或獸藥可接受的載體或賦形劑結(jié)合。治療應(yīng)用在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及抑制需要接受治療的受試者中已經(jīng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞或其它細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。如本文所用，“抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化”是指受試者體內(nèi)正在經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的細(xì)胞數(shù)量的減少。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，需要接受治療的受試者患有癌癥。優(yōu)選的，當(dāng)受試者患有癌癥時(shí)，本發(fā)明的方法抑制已經(jīng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 的腫瘤細(xì)胞至使得癌細(xì)胞不能轉(zhuǎn)移的程度，即該抑制使得癌癥不能發(fā)展為轉(zhuǎn)移性癌癥，或者已經(jīng)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞不能在體內(nèi)遠(yuǎn)端位置生長(zhǎng)。在一個(gè)極優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法抑制已經(jīng)完成上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 的細(xì)胞向體內(nèi)遠(yuǎn)端位置擴(kuò)散，即該抑制使得依賴于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的擴(kuò)散消除。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療需要接受治療的受試者中轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，所述方法包括通過對(duì)所述受試者施予AxI抑制劑，從而抑制發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的腫瘤細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“AxI抑制劑”是指能抑制AxI、AxI信號(hào)傳導(dǎo)通路或AxI信號(hào)傳導(dǎo)通路中任意一種或多種組分的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子能減少或抑制AxI或 AxI蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，AxI抑制劑為抗AxI抗體。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，AxI抑制劑為小分子激酶抑制劑。上述小分子抑制劑的例子為文獻(xiàn)“Holland等2010”所述的R似8。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。優(yōu)選的，所述癌癥為乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、胰腺癌。轉(zhuǎn)移導(dǎo)致90%的癌癥相關(guān)的死亡率。了解能夠使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是一個(gè)重大的健康問題。本發(fā)明人已經(jīng)證明，受體酪氨酸激酶AxI是患有原發(fā)性乳房X光檢測(cè)的乳腺癌的患者的低總體生存率的強(qiáng)預(yù)測(cè)指標(biāo)。轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞需要AxI的表達(dá)以維持侵染性惡性表型并且在不同微環(huán)境中形成乳腺腫瘤。乳腺上皮細(xì)胞中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的誘導(dǎo)上調(diào)AxI的表達(dá)，從而與其配體生成自分泌信號(hào)傳導(dǎo)回路。AxI表達(dá)的抑制防止從乳腺的原位向淋巴結(jié)和主要器官的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。因此在早期惡性轉(zhuǎn)變過程中，AxI的不適當(dāng)EMT依賴性激活可能會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)移和對(duì)患者總體生存率產(chǎn)生負(fù)面影響。因而通過所建立的治療策略中斷AxI信號(hào)傳導(dǎo)代表了針對(duì)細(xì)胞增殖性疾病(如乳腺癌)以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞生存介導(dǎo)的疾病的治療發(fā)展的一個(gè)令人鼓舞的途徑。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及AxI抑制劑在制備用于抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及AxI抑制劑在制備用于通過抑制依賴于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)的腫瘤細(xì)胞來治療轉(zhuǎn)移性癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療需要接受治療的受試者中轉(zhuǎn)移性癌癥或晚期癌癥的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及AxI抑制劑在制備用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥或晚期癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及抑制需要接受治療的受試者中的轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。另一個(gè)方面涉及抑制患癌癥受試者中EMT誘導(dǎo)的侵染性疾病的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。另一個(gè)方面涉及AxI抑制劑在制備用于抑制患癌癥受試者中EMT誘導(dǎo)的侵染力的藥物中的用途。優(yōu)選地，AxI抑制劑為抗AxI抗體或小分子抑制劑。施用方式本發(fā)明的藥物組合物可適合于經(jīng)直腸施用、經(jīng)鼻施用、經(jīng)支氣管施用、經(jīng)局部施用 (包括經(jīng)口腔和舌下施用)、經(jīng)陰道或胃腸外施用(包括經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)和皮內(nèi)施用)、經(jīng)腹腔或鞘內(nèi)施用。優(yōu)選的制劑為經(jīng)口服施用的制劑。制劑可方便地以單位劑型 (即包含單位劑量的離散部分的形式)提供，或者以多單位或亞單位的單位劑量提供。作為例子，制劑可為片劑和緩釋膠囊的形式，并且可通過藥學(xué)領(lǐng)域中公知的任意方法制備。本發(fā)明的經(jīng)口施用的制劑可以下列形式提供含預(yù)定量活性劑的離散單位，如膠囊、藥丸(gellule)、滴劑、扁囊劑、丸劑或片劑；粉末或顆粒；活性劑在水性液體或非水性液體中的溶液、乳液或懸浮液；或水包油型乳液或油包水型乳液；或丸藥等。優(yōu)選地，組合物每劑量包含l_250mg活性成分，更優(yōu)選為IO-IOOmg活性成分。對(duì)于經(jīng)口施用的組合物(例如，片劑或膠囊)，術(shù)語(yǔ)“可接受的載體”包括賦形劑， 如常見賦形劑，例如粘合劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠、聚乙烯吡咯烷酮 (聚維酮)、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、蔗糖和淀粉；填料和載體，例如玉米淀粉、明膠、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、磷酸二鈣、氯化鈉和海藻酸；以及潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸鈉和其他金屬硬脂酸鹽、甘油硬脂酸酯硬脂酸、 硅酮油，滑石蠟、油和膠體二氧化硅。也可使用調(diào)味劑，如薄荷、冬青油、櫻桃調(diào)味劑等?？赡苡欣氖牵砑又珓┦顾鰟┬鸵子谧R(shí)別。也可采用本領(lǐng)域已知方法對(duì)片劑包衣。片劑可通過任選地與一種或多種附加成分壓縮或模壓制得。壓縮片可通過如下方式制備在合適的機(jī)器中將自由流動(dòng)形式(如粉末或顆粒)的活性劑，可選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合后壓縮。模壓片可通過在合適的機(jī)器中將用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物的混合物模壓制得。片劑可任選地被包衣或刻痕，并且其可被配制為緩釋或控釋活性劑。其他適合經(jīng)口施用的制劑包括錠劑，其包含在調(diào)味基質(zhì)(通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中的活性劑；軟錠劑，其包含在惰性基質(zhì)(如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)中的活性劑；以及漱口劑，其包含在合適的液體載體中的活性劑。其他的施用形式包括可經(jīng)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹腔或肌內(nèi)注射的溶液或乳劑，其由無菌或可消毒溶液制備。注射形式通常每劑量含10-1000mg、優(yōu)選為 10-250mg的活性成分。本發(fā)明的藥物組合物也可為栓劑、陰道栓劑、混懸劑、乳劑、洗劑、軟膏、乳膏、凝膠劑、噴霧劑、溶液或粉劑的形式。透皮施用的替代方法是通過使用皮膚貼劑。例如，可將活性成分摻入到由聚乙二醇或液體石蠟的水性乳液組成的乳膏中?；钚猿煞忠部梢?-10重量％的濃度摻入由白蠟或白色軟石蠟基質(zhì)組成的軟膏中，可根據(jù)需要加入穩(wěn)定劑和防腐劑。劑量本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地確定本發(fā)明的組合物之一對(duì)受試者施用的合適的劑量，而無需過度的試驗(yàn)。通常情況下，醫(yī)生可確定最適合個(gè)別患者的實(shí)際用量，而這取決于多種因素，包括采用的具體藥劑的活性、所述藥劑的代謝穩(wěn)定性和作用長(zhǎng)短、年齡、 體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用方式和時(shí)間、排泄率，藥物組合、特定病情的嚴(yán)重程度以及接受治療的個(gè)體。本文所披露的劑量是平均情況的示例。當(dāng)然可以有個(gè)別例子，其中應(yīng)該使用更高或更低的劑量，這些劑量在本發(fā)明的范圍中。根據(jù)本發(fā)明，可以施用有效劑量的藥劑來抑制AxI。當(dāng)然，該劑量可進(jìn)一步根據(jù)藥劑的施用類型進(jìn)行調(diào)整。例如，為了達(dá)到急性治療的“有效劑量”，腸胃外施用是優(yōu)選的。雖然肌內(nèi)靜推注射液是有用的，靜脈輸注在5 %的葡萄糖水或生理鹽水中的化合物，或具有合適的賦形劑的類似制劑是最有效的。通常情況下，腸胃外劑量為約0. 01至約100mg/kg ；優(yōu)選在0. 1至20mg/kg之間，其方式為維持藥物在血漿中的能有效地抑制激酶的濃度。藥劑以達(dá)到每日總劑量為約0.4-約400mg/kg/天的水平每日施用1-4次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過比較藥劑在血中的水平與具有治療效果所需的濃度，容易地確定活性劑的治療有效的精確劑量，以及所述藥劑的最佳施用途徑。本發(fā)明的藥劑也可以按照如下方式經(jīng)口施用給患者，所述方式使得使藥物濃度足以達(dá)到本文所述的一個(gè)或多個(gè)治療指標(biāo)。通常情況下，包含藥劑的藥物組合物的施用的口服劑量為約0. 1至約50mg/kg，施用方式需與患者的病情一致。優(yōu)選的口服劑量為約0.5至約 20mg/kg。本發(fā)明的藥劑可經(jīng)一種或幾種生物分析檢測(cè)來確定達(dá)到指定藥理學(xué)效應(yīng)所需的藥劑濃度。試劑盒部分本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于評(píng)價(jià)抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑能力的試劑盒，所述試劑盒包含抗AxI抗體。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于評(píng)價(jià)抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑能力的試劑盒，所述試劑盒包含針對(duì)AxI的核酸探針。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于評(píng)價(jià)抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑能力的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種針對(duì)AxI的QPCR引物。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及上述試劑盒在上述任意方法中的用途。診斷和預(yù)測(cè)本發(fā)明還涉及AxI作為生物標(biāo)志物在診斷或預(yù)測(cè)以增殖活性為特征的疾病中(特別是在用AxI抑制劑治療的個(gè)體中)的用途。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)測(cè)方法”是指能夠預(yù)測(cè)已診斷為具有疾病(特別是癌癥)的人或動(dòng)物中的疾病的進(jìn)展的方法。更具體而言，所關(guān)注的癌癥包括乳腺癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、大腸癌、腎癌、胰腺癌、子宮癌、肝癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌以及白血病。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“診斷方法”是指能夠確定人或動(dòng)物中的癌癥的存在和類型的方法。合適的是，標(biāo)志物允許對(duì)采用AxI抑制劑的治療的成功性進(jìn)行評(píng)價(jià)。如上所述，合適的診斷包括針對(duì)本文確定的任意基因的探針，如QPCR引物、FISH探針等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)測(cè)方法”是指能夠確定受試者對(duì)特定試劑/方案治療易感或反應(yīng)的可能性的方法。這種預(yù)測(cè)方法提供了特定治療方案的可能結(jié)果的信息，例如受試者對(duì)所述治療反應(yīng)的可能性，和/或在特定治療方案中應(yīng)當(dāng)以何種程度治療個(gè)體的信息，以
25及/或采用傳統(tǒng)治療方法(如放療/化療)應(yīng)當(dāng)以何種程度治療個(gè)體的信息。因此，本文所述預(yù)測(cè)方法在個(gè)性化醫(yī)療領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用。因此，一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及上述生物標(biāo)志物在個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用中的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用旨在確定受試者是否會(huì)對(duì)采用AxI 抑制劑的治療易感或有反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用旨在確定受試者是否特別可能患有轉(zhuǎn)移性癌癥。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于確定受試者是否會(huì)對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感的預(yù)測(cè)方法，所述方法包括檢測(cè)所述受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及AxI作為生物標(biāo)志物在用于確定受試者是否會(huì)對(duì)采用 AxI抑制劑的治療易感或有反應(yīng)的預(yù)測(cè)試劑中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及確定受試者是否特別可能患有轉(zhuǎn)移性癌癥的預(yù)測(cè)方法， 所述方法包括檢測(cè)所述受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。優(yōu)選的，上述的預(yù)測(cè)方法包括以下步驟(i)從所述受試者獲得樣品；以及(ii)與對(duì)照樣品相比，確定樣品中AxI的表達(dá)，其中相比于對(duì)照樣品，AxI表達(dá)的上調(diào)指示對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感以及患有轉(zhuǎn)移性癌癥的可能性增大。在本發(fā)明中，優(yōu)選本文所述的方法在體外進(jìn)行。樣品優(yōu)選通過蛋白質(zhì)分析、更優(yōu)選通過ELISA、PET、流式細(xì)胞術(shù)、SELDI-TOF MS或 2-D PAGE進(jìn)行分析。通過以下非限定的例子并且參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行闡釋，其中

圖1示出了 AxI的表達(dá)為乳腺癌生存率的負(fù)性預(yù)測(cè)因子。㈧免疫化學(xué)分析弱 (60% )和強(qiáng)的AxI表達(dá)。(B)8年臨床追蹤的Kaplan-Meier分析。(C)多變量分析。(D) 原發(fā)和轉(zhuǎn)移性人乳腺癌匹配對(duì)(n = 16)中的AxI表達(dá)左為原發(fā)腫瘤(上為AxI陰性，下為AxI陽(yáng)性)，右為轉(zhuǎn)移腫瘤(上為肝，下為骨)。相比于對(duì)應(yīng)的原發(fā)腫瘤，轉(zhuǎn)移腫瘤中AxI 的表達(dá)傾向于更強(qiáng)(P = 0. 11，McNemar檢驗(yàn))。圖2示出了 AxI為乳腺癌細(xì)胞侵染力所需。表觀等位基因MB-MDA-231乳腺癌細(xì)胞系列中AxI表達(dá)的(A)FACS和(B)Western印跡分析。(C)AxI為由血清(D)或SDF-1 (E) 誘導(dǎo)的基質(zhì)膠侵染性檢測(cè)的磷酸化表觀等位基因分析。MB-MDA-231/shLuc (上欄)和 MB-MDA-231/shAxI2 (下欄)的 3D 基質(zhì)膠分析(F，G)。圖3示出了乳腺上皮細(xì)胞中EMT誘導(dǎo)物上調(diào)了 AxI的活性。㈧穩(wěn)定表達(dá)Twist 的MCF IOa細(xì)胞系上的AxI表面水平的流式細(xì)胞分析。(B)分析對(duì)照(wt)和表達(dá)Twist的 MCF IOa細(xì)胞系的提取物的上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-鈣粘著蛋白、β-連環(huán)蛋白)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(N-鈣粘著蛋白)的改變。*采用抗的抗體通過SDS-PAGE和免疫印跡法分析經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基。(C)用流式細(xì)胞術(shù)分析由編碼TWist、kl32、SlUg、Snail的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或?qū)φ蛰d體(GFP)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF IOa細(xì)胞的AxI表面表達(dá)(左)和幾何平均熒光率(右)。(D) 通過免疫印跡法分析由Twist、Zeb2、Slug或Snail逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCFlOa細(xì)胞提取物的上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-鈣粘著蛋白，β-連環(huán)蛋白)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(N-鈣粘著蛋白，波形蛋白)的改變。(E)用Twist、^Λ2、Slug或Snail逆轉(zhuǎn)錄病毒載體傳導(dǎo)的MCFlOa細(xì)胞在接種72小時(shí)后的形態(tài)。圖4示出了組織工程化乳腺腫瘤需要AxI的表達(dá)。㈧N0DSCID小鼠內(nèi) MDA-MB-231/GFP-Luc腫瘤組織工程植入物的體內(nèi)圖像。通過MDA-MB-231/GFP-Luc細(xì)胞的熒光素酶生物發(fā)光的體內(nèi)光學(xué)成像來監(jiān)測(cè)腫瘤的時(shí)域生長(zhǎng)(i)。由對(duì)照植入物(實(shí)線)和表達(dá)MDA-MB-231/GFP-Luc-shAXI2的細(xì)胞植入物(虛線)測(cè)量腫瘤細(xì)胞數(shù)(總光子)和徑向滲透的程度(信號(hào)直徑)，其顯示腫瘤在聚乳酸組織工程支架中的生長(zhǎng)和定殖具有AxI 依賴性(ii)。切割后的兩側(cè)支架的外觀(iii)。在植入后觀天，組織工程腫瘤的采用抗人AxI的免疫組化分析(左欄，對(duì)照載體；右欄，shAxI2) (iv)。通過采用抗人AxI的免疫組化法分析具有野生型對(duì)照(左欄)和表達(dá)shAxI2的細(xì)胞(右欄)的腫瘤組織工程植入物(ν)。黑色方塊劃分了 MDA-MB-231/GFP Luc細(xì)胞的定殖和放射狀擴(kuò)散。與對(duì)照組相比，
< 0.05，〃p < 0.005(配對(duì)t檢驗(yàn))。N = 6小鼠/組。(B)三細(xì)胞植入物的體內(nèi)時(shí)域成像，所述植入物包括原生人類微血管細(xì)胞(EC)、血管平滑肌細(xì)胞(SMC)和MDA-MB-231/ GFP Luc細(xì)胞(i)。在組織工程血管的存在下分析的對(duì)照植入物(實(shí)線)和表達(dá)shAxI2的 MDA-MB-231細(xì)胞植入物(虛線)的腫瘤生長(zhǎng)(總光子)和徑向擴(kuò)散(直徑)測(cè)量(ii)。 由工程化人微血管使切除的腫瘤( 天時(shí))深度血管化(iii)。免疫組化分析表明，工程化抗人CD31染色血管包含指示出開放和散布的腔內(nèi)紅血細(xì)胞(插入物)(iv 左欄，對(duì)照載體；右欄，shAxI-2)。與對(duì)照組相比，* ρ < 0. 05，“ ρ < 0. 005，…ρ < 0. 0005 (配對(duì)t檢驗(yàn))。N = 7小鼠/組。在shAxI2表達(dá)抑制的組織工程化MDA-MB-231腫瘤中，支架內(nèi)血管直徑(左)沒有受到影響，同時(shí)微血管密度(右)輕度增加。圖5示出了體內(nèi)表觀等位基因分析顯示乳腺腫瘤形成所需的明顯AxI表達(dá)閾。(A) 由N0D/SCID ！ 2mnull小鼠內(nèi)的皮下表觀等位基因MDA-MB-231/GFP-Luc異種移植物得到的生物發(fā)光的體內(nèi)時(shí)域成像，其包括相比于無效的靶向AxI的ShRNAs(shAXI279)對(duì)照，靶向 AxlWshRNAs shAxI278 (i)、shAx280 (ii)和 shAxI2(iii)的 AxI 分級(jí)表達(dá)。(C)條形圖示出了基于腫瘤的光學(xué)成像分析的光子和腫瘤直徑平均變化。表觀等位基因MDA-MB-231/ GFP-Luc腫瘤生長(zhǎng)(總光子)和放射性浸潤(rùn)(信號(hào)直徑)的測(cè)量相對(duì)于shAxI279(無效 shRNA)進(jìn)行校正(ii)。(D)針對(duì)AxI基因抑制繪制的腫瘤生長(zhǎng)( 天測(cè)量)揭示了治療閾值(表達(dá)降低80%)。相比于對(duì)照組，、<0.05，*、< 0.005(配對(duì)1檢驗(yàn))。N = 6小鼠/組。圖6示出了 AxI是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移所需的。㈧監(jiān)測(cè)體內(nèi)的原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移， I.隨著時(shí)間而改變的原位生長(zhǎng)(上欄)以及到淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(下欄)。II.通過體內(nèi)光學(xué)成像(GE Explore Optix)監(jiān)測(cè)野生型(實(shí)線)和AxI RNAi的植入物(虛線)的原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。⑶不同器官中轉(zhuǎn)移的檢測(cè)。(C)乳腺癌細(xì)胞的體外檢測(cè)。I.示出了切除器官的圖像。II.相同組織的組織學(xué)分析證實(shí)了向不同器官的轉(zhuǎn)移(箭頭)。(D)原位注射對(duì)照(載體)和shAxI2的小鼠之間的Mann-Whitney (對(duì)數(shù)秩)檢驗(yàn)表明，荷有MDA-MB-231-D3H2LN/ GFP-Luc-shAx12腫瘤的小鼠的生存率增加(P = 0. 013)。圖7示出了 AxI是BALB/c小鼠中同源乳腺癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所必需的。(A)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)表達(dá)鼠的靶向AxI的shRNA (mouse Axl-targeting shRNA) (shmAxI2)或人的靶向 AxI 的 shRNA (human Axl-targeting shRNA) (shAxI279)的 4T1-GFP-LUC小鼠乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行小鼠AxI表面表達(dá)或同型對(duì)照分析。(B)將表達(dá)鼠的靶向 AxI 的 shRNA ^TI-GFP-LucshmAx12)或人特異性 shRNA ^Tl-GFP-Luc_shAxI279)陰性對(duì)照的4T1-GFP-LUC細(xì)胞原位(乳房脂肪墊)注射入BALB/c小鼠，由此得到生物發(fā)光的體內(nèi)時(shí)域成像(i)。在8周的時(shí)期內(nèi)，注射對(duì)照GTl-GFP-Luc shAxI279，實(shí)線)和AxI基因抑制^Tl-GFP-LuC-ShmAXI2，灰線)的BALB/c小鼠的全身生物發(fā)光(總光子)的定量(ii)。 < 0. 05(t檢驗(yàn))，N = 7小鼠/組。(C)從含有對(duì)照或AxI基因抑制腫瘤的BALB/c小鼠切除器官，通過切下器官中的4T1-GFP-LUC細(xì)胞的體外生物發(fā)光檢測(cè)而監(jiān)測(cè)的向不同器官的自發(fā)性轉(zhuǎn)移(原位植入后8周時(shí))的檢測(cè)結(jié)果。圖 8 示出了載體 L383pCSI Puro2AGFP2ALuc2 的序列。圖 9 的 A 欄示出了用 Slug 或 Ha-Ras (pBABE puro H-Ras V12, Addgene 公司)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF IOa細(xì)胞的流式細(xì)胞分析，其利用GFP的共表達(dá)進(jìn)行分析；通過嘌呤霉素處理48小時(shí)選擇Ha-Ras表達(dá)。MCFlOa細(xì)胞中Slug和Ha-Ras的表達(dá)導(dǎo)致癌干細(xì)胞標(biāo)志物 ⑶44的表面表達(dá)顯著增強(qiáng)。圖9的B欄示出了 AxI在編碼Lsug、Ras的MCF IOa細(xì)胞中的表面表達(dá)。AxI表面表達(dá)與Slug和Ha-Ras誘導(dǎo)的EMT中⑶44的存在和間質(zhì)細(xì)胞性狀相關(guān)。圖9的C欄示出了表達(dá)Slug或Ha-Ras的MCF IOa細(xì)胞在接種72小時(shí)后的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，所述MCFlOa細(xì)胞為通過FACS分選的⑶44高表達(dá)(⑶44+)和低表達(dá)(⑶44_)亞群。⑶44-細(xì)胞表現(xiàn)出上皮細(xì)胞形態(tài)，而⑶44+MCF10細(xì)胞表現(xiàn)出伸長(zhǎng)的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。圖9的D欄示出了用編碼Slug、Ras的逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶44-和⑶44+MCF10a 細(xì)胞的Western印跡分析。⑶44_MCF10a細(xì)胞保持上皮細(xì)胞連接和細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)。 與此形成對(duì)比的是，CD44+細(xì)胞表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(波形蛋白，N-鈣粘著蛋白)的強(qiáng)表達(dá)和E-鈣粘著蛋白的損失，這指示了 EMT。圖9的E欄示出了表達(dá)Slug和Ha-Ras的CD44+和CD44_MCF10a細(xì)胞在3D基質(zhì)膠上的生長(zhǎng)，表達(dá)AxI的⑶44+MCFlOa細(xì)胞具有侵染性，與間質(zhì)細(xì)胞表型一致。圖10示出了 MCFlOa細(xì)胞組成型表達(dá)(上部，Western印跡法，總裂解物)和分泌 (中部，Western印跡法，調(diào)理培養(yǎng)基)Gas6，Gas6在Slug誘導(dǎo)的和Snail誘導(dǎo)的AxI表達(dá)中變?yōu)榧?xì)胞相關(guān)(下部，抗fes6，流式細(xì)胞分析)。圖11示出了 MDA-MB-231細(xì)胞組成型表達(dá)AxI的配體Gas6。(上部，Western印跡法，主要是細(xì)胞相關(guān)的總裂解物；中部，Western印跡法，調(diào)理培養(yǎng)基；下部，抗Gas流式細(xì)胞分析)。AxI基因抑制降低了細(xì)胞相關(guān)feS6，而增加了調(diào)理培養(yǎng)基中的水平而不影響整體表達(dá)。
實(shí)施例材料和方法質(zhì)粒和抗體所有shRNAs 均由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 RRI_Red/L087 (Genbank :EU424173)的 LTR 中修飾的人U6啟動(dòng)子表達(dá)，所述載體用于通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染轉(zhuǎn)化MDA-MB-231細(xì)胞。RRI-Red 也表達(dá)Puro2AmRedl，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞中的嘌呤霉素抗性和紅色熒光。cDNA核苷酸編號(hào)如 Genbank :BC032229 所示。采用了下列序列AxI2 ；(小字母為發(fā)夾)
GACATCCTCTTTCTCCTGCGAAGCCCATctggtcATGGGCTTCGCAGGAGAAAGAGGATGTC, shAxI278 ；ACGGGTCTCCTTCTTTCGCCGttggatccctggtcggatccaaCGGCGAAAGAAGGAGACCCG, shAxI279 ；GCTTCAGGCGATTTCCCCGGCGttggatccctggtcggatccaaCGCCGGGGAAATCGCCTGAAGC, shAxI280 ；ATGCACGCCCAGCCGCACAGCGttggatccctggtcggatccaaCGCTGTGCGGCTGGGCGTGCAT shLuc ；GATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGctggtcCCGGATTGTTTACATAACCGGACATAATC。逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體L383pCSI Puro2AGFP2ALuc2 (見圖8)是通過幾個(gè)階段將嘌呤霉素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、EGFP和螢火蟲熒光素酶的編碼序列克隆到CRU5-逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體中制得的(Bl0等，2007)。每個(gè)開放閱讀框與下一個(gè)之間通過編碼來源于手足口病毒的2A區(qū)域(XXSGLRSGQLLNFDLLKLAGDVESNPGP)的接頭分開。在共翻譯時(shí)切割該序列，導(dǎo)致產(chǎn)生大致化學(xué)計(jì)量的每種蛋白(Lorens2004)。通過將得自構(gòu)建體BC0U910、BC015895和 BC060819 (OpenBiosystems公司)的合適片段分別克隆到CRU5-I RES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，從而構(gòu)建表達(dá)hSnail、hSlug和hZEB2的質(zhì)粒(Lorens等，2000)。采用了 2種抗人 AxI的抗體；單克隆小鼠抗人AxI(MAB154，R&D systems公司)和山羊抗人AxI (M-20，Santa Cruz公司)。另外，采用了下述抗體兔抗人pAxI (Y779，R&D公司)、大鼠抗人Snai 1 (SN9H2， Cell Signaling 公司)、小鼠抗人 Slug(L40Cb，Cell Signaling 公司)、兔抗人 E-鈣粘著蛋白(24E10,Cell Signaling公司)、兔抗人N-鈣粘著蛋白(ab 18203，Abcam公司)、肌動(dòng)蛋白、小鼠抗人b-連環(huán)蛋白(L54E2，Cell Signaling公司)、小鼠抗人Gas6 (R&D systems 公司)、兔抗人 Twist (Twist2Cla, Abcam 公司)。細(xì)胞培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖分析所有細(xì)胞在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。Phoenix A細(xì)胞(Gary Nolan博士，斯坦福)，MDA-MB-231人乳腺上皮癌細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville, MD)，人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC) (Cambrex公司，Walkersville，MD， 美國(guó))的保存如前所述(Holland 2005)?？寺〖?xì)胞系MDA-MB-231_DH3L2N(Xenogen公司， Alameda, CA,USA)在具有Earl平衡鹽溶液MEM/EBSS培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% FBS、1 %非必需氨基酸、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)的最低必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用磷酸鈣法(Swift， 1999)轉(zhuǎn)染W(wǎng)ioenix A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后大約30小時(shí)，將培養(yǎng)基更換為待感染細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% FBQ。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集感染性上清液。將靶細(xì)胞暴露于含有5mg/ml魚精蛋白硫酸鹽的上清液中，過夜。用lyg/ml嘌呤霉素選擇感染細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞增殖分析， 以采用Promega公司的MTS分析試劑盒來分析不同AxI基因抑制細(xì)胞相比于對(duì)照細(xì)胞系的增殖潛能。將細(xì)胞接種在未處理或用20 μ L膠原蛋白(來源于鼠尾，Roche公司)、纖連蛋白(Sigma公司)或基質(zhì)膠(BD BIOSCIENCES公司)包被的96孔組織培養(yǎng)板上。將100 μ L 培養(yǎng)基中的2000個(gè)細(xì)胞一式三份接種于96孔板，并且采用Promega公司的MTS分析試劑盒根據(jù)制造商的使用說明每M小時(shí)進(jìn)行分析。免疫染色、流式細(xì)胞分析和細(xì)胞分選采用標(biāo)準(zhǔn)程序使MDA-MB-231細(xì)胞胰蛋白酶化，用PBS-0. 2% BSA洗滌，然后以在PBS-0. 2% BSA中最終濃度為5mg/ml的抗AxI (#MAB154,R&D systems公司)在室溫下染色 40分鐘。在PBS-0. 2% BSA中洗滌細(xì)胞兩次，并用最終濃度為0. 2mg/ml的第二抗體(羊抗鼠APC(Allophyocyanin，交聯(lián)，Molecular Probes公司)在室溫下避光孵育30分鐘。用 PBS-0. 2% BSA洗滌細(xì)胞兩次，并用300ml PBS-0. 2% BSA中重懸，然后在!^acsCalibur流式細(xì)胞儀(BD BIOSCIENCES 公司)上分析。使用 FlowJo 軟件(Tree Star 公司，Ashland，OR, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過FACS Aria SORP以488nm、532nm、638nm和407nm的激光波長(zhǎng)分離高水平表達(dá)GFP、RFP和低水平表達(dá)AxI (shRNA)的細(xì)胞，從而建立穩(wěn)定同質(zhì)的細(xì)胞群。蛋白質(zhì)提取物、SDS-PAGE、免疫印跡和免疫沉淀在RIPA 緩沖液(含 1 % (v/v) Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40)、0· 5 % (w/v)去氧膽酸鈉、0. 1 % (w/v) SDS的PBS)(補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(Complete Mini,不含EDTA, Roche#13457200)和0. 2mM PMSF)中將細(xì)胞裂解。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡。對(duì)于免疫沉淀，在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑和WiosSTOP磷酸酶抑制劑混合物(Roche公司) 的 NP-40 緩沖液(10%甘油、NP-40、50mM TrispH7. 4、0· 2M NaCl、2. 5mM MgCl2)中將細(xì)胞裂解。將偶聯(lián)到protA/G珠子上的抗體與提取物在4°C下孵育1小時(shí)，用NP-40緩沖液洗滌4次珠子后，然后洗脫。侵染性分析和3D基質(zhì)膠分析采用 Becton Dickinson 公司的 BDFalcon 細(xì)胞培養(yǎng)插入物(8 μ m)、Falcon multiwellTM M孔板和生長(zhǎng)因子減少基質(zhì)膠(BD公司)進(jìn)行Boyden小室趨化分析(Albini 等，2004年)。插入物內(nèi)部用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠包被到每個(gè)插入物具有最終濃度為 30 μ g的基質(zhì)膠。在4°C下處理基質(zhì)膠，直到在37°C下凝固30分鐘。在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸5 X IO5個(gè)細(xì)胞，并在每個(gè)插入物頂部添加0. 1%BSA0 FBS富集細(xì)胞培養(yǎng)基用作趨化物。經(jīng)過在37°C、5% CO2條件下孵育20小時(shí)后，采用棉簽除去小室內(nèi)細(xì)胞。將膜的另一側(cè)的細(xì)胞固定，然后用DAPI染色。采用熒光顯微鏡拍攝圖像，并采用ImaReJ (http://rsb. info, nih. gov/nih-image.T, Wayne Rasband, National)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。3D分析為文獻(xiàn)“Sandal等2007”的更改；將30000個(gè)細(xì)胞接種在凝膠上，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)10-12天，然后進(jìn)行分析。臨床樣品目前的乳腺癌系列選自基于挪威乳腺癌篩查項(xiàng)目(Hordaland郡)的人群，該項(xiàng)目于1996年開始，每M個(gè)月進(jìn)行兩視圖乳房X光檢查。簡(jiǎn)單而言，95例侵染性間期癌癥發(fā)生在前兩次篩查間期(1996-2001年)，并且將這些與前兩輪共317例侵染性腫瘤中95例篩查檢測(cè)的腫瘤按照大小匹配(平均直徑分別為15. 6mm和15.7mm)。在匹配后，篩查檢測(cè)的和間期案例的平均腫瘤大小分別為25. Imm和23. 1mm，并且這些群體的相應(yīng)平均年齡為62歲和59歲。除了年齡和腫瘤直徑(通過病理檢查)，還記錄了診斷的基本特征，如乳腺密度、 組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。從上次乳房X光檢查到間期癌癥診斷的中位時(shí)間為17. 1個(gè)月。最近的隨訪日期是2004年11月31日，并且中位隨訪時(shí)間(幸存者)為72個(gè)月。在隨訪期間，31例患者死于乳腺癌。免疫組化分析在本研究中使用組織微陣列載玻片。組織微陣列技術(shù)是組織保持性的，并已在幾項(xiàng)研究中得到證實(shí)。在5 μ m厚的福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片上進(jìn)行免疫組化分析。在 TRS (靴修復(fù)溶液(Target Retrieval Solution) ；DakoCytomation 公司，丹麥，AS) 緩沖液(PH6. 0)中，在微波爐中于750W下煮IOmin然后在350W下煮20min進(jìn)行抗原修復(fù)。 使用 DakoCytomation Autostainer 染色。將切片與抗AxI 的多克隆抗體((H-124 ；cat. #20741)，1 200 稀釋(Santa Cruz 公司，USA))在室溫下孵育過夜。采用DakoCytomation Envision試劑盒(DakoCytomation 公司，丹麥，AS)以二氨基聯(lián)苯胺四氯化碳過氧化物酶作為底物進(jìn)行免疫過氧化物酶染色， 然后用Mayer蘇木精(DakoCytomation公司，丹麥，AS)復(fù)染。染色評(píng)價(jià)染色主要在細(xì)胞質(zhì)中，但是在細(xì)胞膜中有一定濃度的染色?？紤]染色強(qiáng)度和呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的比例，通過半定量和主觀分級(jí)系統(tǒng)記錄染色。從每種情況的所有三個(gè)核進(jìn)行評(píng)價(jià)。強(qiáng)度記錄為O (無染色)至3(強(qiáng)染色)；膜染色區(qū)域的百分比記錄為0(無腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性)，1(< 10^),2(10^-50%)和3(> 50%的腫瘤細(xì)胞)。以染色強(qiáng)度與面積的乘積形式計(jì)算染色指數(shù)(Si)。對(duì)病人的特點(diǎn)和結(jié)果以盲法進(jìn)行免疫組化登記。統(tǒng)計(jì)通過PearSOn>c2檢驗(yàn)進(jìn)行各組的比較。在所有統(tǒng)計(jì)分析中，染色指數(shù)(Si)類別的取舍值基于中間值。采用乘積極限法(Kaplan-Meier法)以主要操作(primary operation) 時(shí)間為進(jìn)入日期進(jìn)行單變量生存率分析(使用由子宮內(nèi)膜癌引起的死亡作為終點(diǎn)；檢查其他原因引起的死亡)。對(duì)數(shù)秩(Mantel-Cox)檢驗(yàn)用來比較針對(duì)每個(gè)變量的不同類別的生存曲線。通過雙對(duì)數(shù)曲線圖檢測(cè)在單因素分析中影響生存率的變量(P ( 0. 15)，從而確定如何將這些變量引入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。小鼠品系和動(dòng)物保護(hù)我們?cè)诒狙芯恐惺褂胒t~kdcSCID/B2mnull (縮寫為N0D/SCID/B2mnull)的雌性小鼠，重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(GADES研究所，挪威)，其為8-10周齡并且體重在20-25g之間。 試驗(yàn)開始前，將它們飼養(yǎng)在12小時(shí)的光/暗周期的標(biāo)準(zhǔn)條件下，并且允許其花費(fèi)至少7天適應(yīng)新的環(huán)境條件。這項(xiàng)研究根據(jù)挪威動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條例、歐洲保護(hù)用于科學(xué)目的脊椎動(dòng)物公約和挪威動(dòng)物研究局的指南進(jìn)行，設(shè)計(jì)為最大限度地減少動(dòng)物的數(shù)量和痛苦。生物發(fā)光成像(BLI)采用安裝在樣本盒上的eXplore Optix(GE Healtcare公司)照相機(jī)進(jìn)行B Li。 通過eXplore Optix軟件進(jìn)行信號(hào)的成像和定量。對(duì)于體內(nèi)成像，通過腹腔內(nèi)注射(i. ρ)以 150mg/kg的量給動(dòng)物施用在PBS (磷酸鹽緩沖液)中的底物D-熒光素(Biosynth公司)， 然后用異氟醚麻醉。將小鼠置于相機(jī)盒內(nèi)預(yù)熱的臺(tái)上，并且連續(xù)暴露于1-2%的異氟醚中并且根據(jù)腫瘤模型從不同視角拍照。確定目標(biāo)區(qū)域并使用eXplore Optix軟件(GE Explore Optix)定量為總光子/秒-1。體內(nèi)生物發(fā)光的背景的光子計(jì)數(shù)范圍為2-3X10。對(duì)于體外成像，將150mg/kg的D-熒光素注入小鼠，隨后立即進(jìn)行剖檢。切割目標(biāo)組織，放入平板中成像。體內(nèi)腫瘤模型組織工程將IX IO6個(gè)MDA-MB 231細(xì)胞(其表達(dá)GFP-Luc生物標(biāo)志物，以及調(diào)節(jié)AxI表達(dá)的不同 RNA 干擾)懸浮于 F-12Kaighn' s (Invitrogen 公司)基質(zhì)膠(BD BIOSCIENCES 公司)的1 1混合物中，并且接種于6X6mm的聚乳酸(PLLA)支架上。在植入過程以及隨后的成像日，將雌性小鼠N0D/SCID/B2mnull暴露于異氟醚中麻醉(Isoba vet. -Schering-Plough A/S)。根據(jù)文獻(xiàn)“Nor 等，Lab Invest. ；81 (4)453 ； 2001”，將兩個(gè)支架經(jīng)皮下(s. c)植入每個(gè)小鼠內(nèi)，其中具有表達(dá)AxI的細(xì)胞的支架植入各小鼠的左側(cè)，同時(shí)將具有AxI被抑制的細(xì)胞的支架植入右側(cè)。外科手術(shù)后，將麻醉小鼠放置在成像系統(tǒng)中，經(jīng)腹腔內(nèi)注射150mg/kg的D-熒光素(Biosynth公司)10-15min后，對(duì)左右兩側(cè)均成像。每周1次通過成像監(jiān)測(cè)體內(nèi)的腫瘤發(fā)展，時(shí)間為4周。異種移植分析將傳染有shRNA 載體和 GFP-Luc 的 1 X IO6 個(gè) MDA-MB 231 細(xì)胞在 100 μ 1 F12K 培養(yǎng)基+10% FBS/基質(zhì)膠(1 1比例，BDBIOSCIENCES公司)中懸浮，并用四號(hào)胰島素針經(jīng)皮下注射到雌性N0D/SCID/B2m的腹部?jī)蓚?cè)。在左側(cè)腹部注射AxI表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，而在右側(cè)腹部注射AxI表達(dá)陰性的細(xì)胞。對(duì)于三細(xì)胞植入，將傳染有shRNA載體和GFP-Luc的MDA_MB_231細(xì)胞與人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)以1 2 2的比例混合。每周通過成像監(jiān)測(cè)體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)，連續(xù)4周。乳房脂肪墊自發(fā)轉(zhuǎn)移模型將人MDA-MB-231細(xì)胞亞系(稱為MDA-MB 231DH3L2N_Xenogen)注射到小鼠乳腺墊，其中所述細(xì)胞表達(dá)GFP-Luc生物標(biāo)志物以及調(diào)節(jié)AxI表達(dá)的不同RNA干擾。將NOD/ SCID/B2mnull小鼠暴露于異氟醚中麻醉，并且將50 μ 1懸浮于MEM/EBSS培養(yǎng)基/基質(zhì)膠(1 1)中的2Χ106個(gè)MDA-MB-231DH3L2N細(xì)胞注射到腹部的乳房脂肪墊中。注射 D-熒光素(Biosynth公司)10-15min后，將小鼠放置在explore Optix成像系統(tǒng)中并從腹面成像。每2周通過生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散直至9周。在重新成像前將每只動(dòng)物的下部覆蓋，以最大程度地減少原發(fā)瘤的生物發(fā)光，使得可以觀察到體內(nèi)轉(zhuǎn)移區(qū)域的信號(hào)。組織收集在每次試驗(yàn)最后，從小鼠中取出腫瘤組織植入物和不同器官，并保存在10%多聚甲醛(Sigma-Aldrich公司)中以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。準(zhǔn)備組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析(石蠟包埋、切片和染色)，并通過顯微鏡評(píng)價(jià)分析。動(dòng)物模型的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果確定每個(gè)試驗(yàn)的平均生物發(fā)光(光子數(shù)/秒―1)、腫瘤直徑和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用回歸圖來描述生物發(fā)光、細(xì)胞數(shù)和腫瘤直徑之間的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)分析基于配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果AxI的表達(dá)是乳腺癌患者總體生存率的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子為了評(píng)價(jià)AxI在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用，我們研究了在挪威乳腺癌篩查項(xiàng)目中確認(rèn)的一系列乳腺癌患者的腫瘤中的AxI表達(dá)，其中所述項(xiàng)目于1996年開始，每?jī)赡赀M(jìn)行兩視圖乳房X光檢查(Wang等，2001)。簡(jiǎn)單而言，95例侵染性間期癌癥發(fā)生在前兩次篩查間期(1996-2001年)，并且將這些與前兩輪共317例侵染性腫瘤中95例篩查檢測(cè)的腫瘤按照大小匹配(平均直徑分別為15. 6mm和15. 7mm) (Collett等，2005)。匹配后，篩查檢測(cè)和間期情況的平均腫瘤大小分別為25. Imm和23. 1mm，并且這些組中的相應(yīng)平均年齡為62歲和59歲。除了年齡和腫瘤直徑(通過病理檢查)，還記錄了診斷的基本特征，如乳腺密度、 組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。從上次乳房X光檢查到間期癌癥診斷的中位時(shí)間為17. 1個(gè)月。最近的隨訪日期是2004年11月31日，并且中位隨訪時(shí)間(生存者)為72個(gè)月。在隨訪期間，31例患者死于乳腺癌。AxI的表達(dá)(通過染色指數(shù)中位數(shù)劃分2組；圖1A)和重要臨床病理特征(如組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、雌激素和孕激素受體表達(dá)和腋淋巴結(jié)狀態(tài))之間沒有顯著關(guān)系。此外， AxI的表達(dá)也與HER2、E-鈣粘著蛋白、基底分化標(biāo)志物(細(xì)胞角蛋白5/6，P_鈣粘著蛋白)、 EZH2、或通過Ki-67表達(dá)進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞增殖不相關(guān)。然而，在單變量生存分析(Kaplan-Meier法，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))中，AxI的表達(dá)與降低的病人生存率顯著相關(guān)(？ = 0.035;圖讓)。在多變量分析(比例風(fēng)險(xiǎn)方法)中，除了組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)狀態(tài)以外，AxI的表達(dá)狀態(tài)仍然在最終模型中作為獨(dú)立的負(fù)性預(yù)測(cè)因子(ρ =0. 021)(參見圖1C)，其中所述多變量分析除AxI表達(dá)以外，還包括基本預(yù)測(cè)因素，如腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)狀態(tài)(步驟一)。因此，AxI的表達(dá)是乳腺癌患者臨床結(jié)果不佳的強(qiáng)預(yù)測(cè)指標(biāo)。然后，我們研究了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者匹配對(duì)(n = 16)的活組織檢查中的AxI表達(dá)。與相應(yīng)的原發(fā)性人乳腺癌相比，在轉(zhuǎn)移時(shí)AxI的表達(dá)傾向于進(jìn)一步提高(ρ = 0. ILMcNemar檢驗(yàn)；圖Id ；右側(cè)為肝(上)和骨(下)的轉(zhuǎn)移)，這表明AxI的表達(dá)是乳腺癌患者臨床結(jié)果不佳的強(qiáng)預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且與轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散相關(guān)。AxI是乳腺癌細(xì)胞侵染性所必需的早期乳腺癌中AxI的表達(dá)與低生存率之間的強(qiáng)相關(guān)性指示了 AxI在整體疾病的發(fā)病機(jī)制中的重要作用。由于乳腺癌的相關(guān)死亡率總是由轉(zhuǎn)移性疾病的并發(fā)癥導(dǎo)致，因此我們?cè)u(píng)價(jià)了 AxI的表達(dá)是否是惡性乳腺癌細(xì)胞侵染性所必需的。AxI在一些高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系(包括MB-MDA-231)中表達(dá)。AxI的配體(Gas6)往往共表達(dá)，導(dǎo)致自分泌激活 (Holland等，200 。為了將MB-MDA-231細(xì)胞中AxI的表達(dá)水平與特定細(xì)胞行為有效地關(guān)聯(lián)，我們開發(fā)了以劑量依賴方式降低AxI表達(dá)的靶向AxI的shRNA的表觀等位基因系列，其使用最近開發(fā)的基于FACS的RNAi法，即CelBelectRNAi (圖2A ；Micklem等，準(zhǔn)備中)。將 AxI的shRNA集合用于產(chǎn)生AxIMB-MDA-231細(xì)胞的表觀等位基因系列以及分級(jí)的總AxI蛋白水平(圖2B)和磷酸化AxI蛋白水平(圖2C)。惡性癌細(xì)胞在與體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的三維細(xì)胞外基質(zhì)蛋白凝膠(基質(zhì)膠)中表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞侵染力(Bissell)。表觀等位基因分析表現(xiàn)出應(yīng)答血清(圖2D)或SDF-I趨化因子(圖2E)(乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要因子)時(shí)，MB-MDA-231細(xì)胞侵染對(duì)AxI表達(dá)的劑量依賴性要求。相比之下，AxI基因抑制對(duì)MB-MDA-231細(xì)胞增殖沒有影響，并且只對(duì)二維(外側(cè)上皮傷口愈合)遷移有適度的影響。這表明三維生長(zhǎng)和侵染力對(duì)AxI的特定要求。因此， 我們?cè)?D-基質(zhì)膠分析中評(píng)價(jià)了 AxI基因抑制對(duì)MB-MDA-231細(xì)胞的效應(yīng)。正常乳腺上皮細(xì)胞在三維基質(zhì)膠中自組織成極化球體腺泡結(jié)構(gòu)，而惡性MB-MDA-231細(xì)胞增殖形成大的無組織定殖區(qū)，其具有反映了迅速蔓延的腫瘤的侵染性、星狀的生長(zhǎng)物(Bissell)。AxI表達(dá)的基因抑制強(qiáng)烈逆轉(zhuǎn)了三維基質(zhì)膠中MB-MDA-231細(xì)胞的惡性表型，從而形成無惡性生長(zhǎng)物的圓形小移殖區(qū)(圖2F，G)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，AxI信號(hào)傳導(dǎo)是維持轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的類間質(zhì)細(xì)胞侵染力所必需的。AxI受到乳腺上皮細(xì)胞中EMT-誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)EMT的功能標(biāo)志為間質(zhì)細(xì)胞侵染力(遷移和入侵ECM的能力)的獲得。誘導(dǎo)EMT 的轉(zhuǎn)錄因子Twist是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移所需的(Yang等，2004年)。因此，我們研究了在乳腺上皮細(xì)胞中Twist表達(dá)是否上調(diào)Axl。正常乳腺上皮細(xì)胞(MCFlOA)中的Twist表達(dá)誘導(dǎo) EMT (圖3A;Glackin等，準(zhǔn)備中)。引人注目的是，在表達(dá)Twist的MCFlOa細(xì)胞中AxI也被較強(qiáng)上調(diào)(圖3A-B)。此外，由于正常乳腺上皮細(xì)胞組成型表達(dá)Gas6，因此Twist誘導(dǎo)的 AxI表達(dá)產(chǎn)生了自分泌激活回路，這被細(xì)胞相關(guān)和酪氨酸磷酸化AxI的增加證實(shí)(圖 3A、C)。為了確定其他誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子是否類似地上調(diào)AxI的表達(dá)，我們分析了表達(dá) ZEB2,Snail和Slug的MCFlOA細(xì)胞。每個(gè)EMT轉(zhuǎn)錄因子在MCFlOA細(xì)胞中都誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且上調(diào)AxI的表達(dá)。這些結(jié)果表明，EMT的誘導(dǎo)導(dǎo)致AxI的表達(dá)，并可產(chǎn)生自分泌信號(hào)傳導(dǎo)。在實(shí)驗(yàn)性組織工程乳腺腫瘤中AxI的表達(dá)是腫瘤形成所必需的為了評(píng)價(jià)體內(nèi)惡性生長(zhǎng)對(duì)AxI的需求，我們使用了包括MB-MDA-231細(xì)胞的組織工程方法，所述細(xì)胞表達(dá)用于有效的體內(nèi)光學(xué)成像的GFP-熒光素酶構(gòu)建體(CSI ；Tiron等， 結(jié)果未發(fā)表)，與基質(zhì)膠一起接種于聚乳酸組織工程支架并且經(jīng)皮下植入免疫功能低下的 NOD-SCID小鼠。由于腫瘤細(xì)胞定殖于支架上，在工程化腫瘤微環(huán)境內(nèi)的生長(zhǎng)與腫瘤細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞特征相關(guān)(Mooney)。MB-MDA-231細(xì)胞容易形成腫瘤的這種仿生微環(huán)境，顯示出支架的蔓延性移殖(圖4A)。AxI基因抑制強(qiáng)烈抑制了腫瘤的形成、側(cè)向擴(kuò)散和惡性形態(tài)(圖 4A)。為了確定AxI是否影響乳腺癌細(xì)胞吸引并且增選血管的能力，我們開發(fā)了三細(xì)胞植入法，包括將MB-MDA-231細(xì)胞與原生人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HuMVEC)和血管平滑肌細(xì)胞 (vSMC) 一起接種，以產(chǎn)生腫瘤血管。在2周的時(shí)間內(nèi)，人EC-vSMC細(xì)胞的植入物在NOD-SCID 小鼠中容易形成散布支架內(nèi)的人微血管(Hegen等，準(zhǔn)備中)。如圖4B所示，在三細(xì)胞植入模型中，MB-MDA-231細(xì)胞形成蔓延性、高度血管化的腫瘤。工程化人腫瘤血管均勻分布并且散布有腔內(nèi)紅血細(xì)胞。相比之下，AxI基因抑制阻止了腫瘤的形成，而不影響散布的人微血管發(fā)展。這表明，即使在微血管(其有可能避免對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)的血管生成的需求)的存在下， AxI也是腫瘤形成所需的。顯著的AxI表達(dá)閾值是乳腺腫瘤形成所需的為了評(píng)價(jià)形成腫瘤所需的AxI表達(dá)水平，我們?cè)谄は翸DA-MB-231腫瘤中進(jìn)行了 AxI的體內(nèi)表觀等位基因分析。將AxI表觀等位基因MDA-MB-231細(xì)胞系列(圖1)經(jīng)皮下注射并且通過生物發(fā)光時(shí)域掃描監(jiān)測(cè)腫瘤的形成。這種方法揭示腫瘤生長(zhǎng)的AxI劑量反應(yīng) (圖5)。與表面AxI水平的相關(guān)性顯示出了腫瘤形成所需的AxI表達(dá)的閾值(圖5B、C)。 此劑量反應(yīng)與AxI抑制對(duì)侵染力的劑量依賴效應(yīng)(圖2)是一致的。AxI是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移所必需的為了評(píng)價(jià)乳腺癌轉(zhuǎn)移對(duì)AxI的要求，我們將MDA-MB-231-D3H2LN(迅速生長(zhǎng)和高轉(zhuǎn)移性的體內(nèi)MDA-231分離物)原位注入乳房脂肪墊中。使用整體時(shí)域生物發(fā)光成像，我們監(jiān)測(cè)了在9周時(shí)間內(nèi)的自發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)展。對(duì)照MDA-MB-231-D3H2LN細(xì)胞生成了大的原位乳腺腫瘤，其在5-6周之內(nèi)壞死(圖6A)。在MDA-MB-231-D3H2LN中的AxI基因抑制降低了原發(fā)性乳腺腫瘤形成的速率，但也生長(zhǎng)出大量的原發(fā)性乳腺腫瘤(圖6A)。在小鼠中注射對(duì)照 MDA-MB-231-D3H2LN，4周后在其標(biāo)記胸淋巴結(jié)中最初檢測(cè)到自發(fā)轉(zhuǎn)移(圖6A)。相比之下， 在植入MDA-23IDHLA-AxIshRNA的小鼠中沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)移。在第9周處死小鼠，由于存在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，對(duì)切除器官單獨(dú)進(jìn)行生物發(fā)光掃描。所有MDA-MB-231-D3H2LN注射小鼠已經(jīng)形成了廣泛的自發(fā)轉(zhuǎn)移，包括淋巴結(jié)、肺、卵巢和腎臟。相比之下，MDA-MB-23IDHLA-AxIshRNA 細(xì)胞沒有形成可檢測(cè)到的轉(zhuǎn)移(除了一只小鼠腎臟的單發(fā)病變)。對(duì)MDA-MB-231-D3H2LN 注射小鼠器官的組織切片的組織學(xué)分析證實(shí)，在所有器官中存在多個(gè)微觀和宏觀轉(zhuǎn)移，如同生物發(fā)光總光子測(cè)量預(yù)測(cè)的那樣(圖6C)。在MDA-MB-231DHLN-AxI shRNA注射小鼠的組織切片中沒有觀測(cè)到微觀或宏觀轉(zhuǎn)移，證實(shí)沒有觀測(cè)到生物發(fā)光是由于轉(zhuǎn)移形成受到抑制。這些結(jié)果表明，AxI是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移所必需的。我們通過原位注射的MDA-MB-231-D3H2LN/GFP-Luc對(duì)照或AxI基因抑制細(xì)胞評(píng)價(jià)了 AxI 對(duì) NOD-SCID 小鼠的總生存率的功能性影響。MDA-MB-231-D3H2LN/GFP-Luc_shAxI2 荷瘤小鼠的總生存率顯著增加(P = 0. 013，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)；圖6D)。這些結(jié)果與我們的臨床觀察證實(shí)了下述結(jié)論，AxI對(duì)轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展和整體患者生存率非常重要。為了在不同的轉(zhuǎn)移性模型中驗(yàn)證我們的研究結(jié)果，我們用CSI構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)了高轉(zhuǎn)移性小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系，并通過FACS篩選了表達(dá)GFP熒光素酶的細(xì)胞^Tl-GFP-Luc)。 4T1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移依賴于Twist的表達(dá)，并表現(xiàn)高水平的AxI表達(dá)(圖7a)。我們開發(fā)了表達(dá)鼠靶向AxI的shRNA(shmAxI2)(可在4T1細(xì)胞中有效抑制鼠AxI 的表面水平)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(圖7a)。不匹配的人靶向AxI的shRNA (shAxI279)對(duì)鼠 AxI的表達(dá)沒有影響。與4T 1細(xì)胞中Twist基因抑制和MDA-MB-231細(xì)胞的結(jié)果類似，AxI 基因抑制的4T1細(xì)胞的組織培養(yǎng)擴(kuò)張沒有受到顯著影響(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)將同源4T 1腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入到雌性正常BALB/c小鼠的乳腺中時(shí)，其表現(xiàn)出雙相生長(zhǎng)模式，這是由于嚴(yán)格的免疫應(yīng)答導(dǎo)致與白細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死相關(guān)的腫瘤退化，之后與多臟器廣泛轉(zhuǎn)移一致在原位重新生長(zhǎng)。4T1-GFPLUC細(xì)胞在免疫抑制NOD-SCID小鼠中只表現(xiàn)出單相生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未示出)。我們將表達(dá)鼠靶向AxI的shRNA^Tl-GFP-LuC-ShmAXI2)或陰性對(duì)照人特異性shRNA GTl-GFP-LucshAxI279)的4Tl-GFP_Luc細(xì)胞注入雌性BALB/c小鼠的乳房脂肪墊中，并且通過整體時(shí)域體內(nèi)光學(xué)成像定量腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(圖7B)。對(duì)照4Tl-GFP-LuC-shmAXI2細(xì)胞表現(xiàn)出迅速的原位增長(zhǎng)，一周后達(dá)到最大。之后是持續(xù)五周的陡峭回歸(圖7B)。在第6周，觀察到在原發(fā)位點(diǎn)的復(fù)發(fā)和多個(gè)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶，其隨后迅速增長(zhǎng)，導(dǎo)致第8周所有小鼠的瀕死和致死。表達(dá)鼠靶向AxI的shRNA^Tl-GFP-LuCShmAXI2) 的4T1-GFP-LUC細(xì)胞最初遵循了類似的過程原發(fā)瘤迅速增長(zhǎng)，由AxI抑制略有減退，之后退化(圖7B)。然而，完全沒有發(fā)生原發(fā)瘤隨后的復(fù)發(fā)和快速生長(zhǎng)的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)(圖 7B)。事實(shí)上，所有注射了 4Tl-GFP-LUC-shmAXI2細(xì)胞的小鼠在處死時(shí)仍然是健康的(8周)。 4T1模型中與白血病反應(yīng)特性相關(guān)的脾腫大在荷有AxI基因抑制腫瘤的小鼠中也降低(數(shù)據(jù)未示出)。第8周處死時(shí)，將單個(gè)切除的器官成像并對(duì)總光發(fā)射進(jìn)行定量，證實(shí)了在所有荷有4Tl-GFP-LuC-shAxI279腫瘤的小鼠內(nèi)常見擴(kuò)散位點(diǎn)處轉(zhuǎn)移灶的存在(圖7C-D)。與此相比，在荷有4Tl-GFP-LUCshmAXI2腫瘤的小鼠的器官中沒有檢測(cè)到生物發(fā)光腫瘤細(xì)胞(圖 7D-E)。這些結(jié)果支持了以下結(jié)論，AxI是乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的調(diào)節(jié)子。Gas6對(duì)自分泌的調(diào)控
AxI的配體feis6通常與AxI共表達(dá)，這與自分泌激活一致。在MDA_MB_231細(xì)胞中 AxI的基因抑制后，指示自分泌信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞相關(guān)和磷酸化AxI水平降低(圖11)。 MCFlOA細(xì)胞組成型表達(dá)Gas6，并且在EMT誘導(dǎo)的AxI表達(dá)上成為細(xì)胞相關(guān)(圖11)。這些結(jié)果表明，EMT過程誘導(dǎo)導(dǎo)致AxI的表達(dá)，并在乳腺上皮細(xì)胞中建立自分泌的信號(hào)傳導(dǎo)。由于往往與共表達(dá)的AxI在許多轉(zhuǎn)移性癌癥中被檢測(cè)到，因此自分泌AxI信號(hào)傳導(dǎo)可能是許多類型的腫瘤中EMT的后果。EMT-誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(如Snail、Slug和Twist)有力地誘導(dǎo)AxI的表達(dá)，表明AxI可以參與維持腫瘤細(xì)胞的惡性間質(zhì)細(xì)胞表型的正反饋回路。這一觀念與我們?cè)谵D(zhuǎn)移性病變中觀察到升高的AxI表達(dá)是一致的。⑶44+表型與AxI的表達(dá)有關(guān)用Slug 或 HA-ras 基因(pBABE puro H-Ras V12, Addgene 公司)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo) MCFlOa細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)利用GFP的共表達(dá)分析Slug轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞；通過嘌呤霉素處理 48小時(shí)選擇HA-Ras表達(dá)。如流式細(xì)胞術(shù)所示(圖9，A欄)，MCFlOa細(xì)胞中Slug和HA-Ras 的表達(dá)導(dǎo)致癌干細(xì)胞標(biāo)志物⑶44的表面表達(dá)強(qiáng)增長(zhǎng)。經(jīng)Slug或Ha-Ras轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCFlOa細(xì)胞的流式細(xì)胞分析進(jìn)一步顯示了表面AxI表達(dá)的強(qiáng)增長(zhǎng)。通過FACS從表達(dá)Slug和HA-Ras 的MCFlOa細(xì)胞中分選出⑶44高(⑶44+)和低(⑶44_)表達(dá)的亞群。CD44-細(xì)胞表現(xiàn)出上皮細(xì)胞形態(tài)，而CD44+MCF10細(xì)胞表現(xiàn)出伸長(zhǎng)的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(圖9，C欄)。這些細(xì)胞的 Western印跡分析(圖9，D欄)表明，⑶44_MCF10a細(xì)胞保持上皮細(xì)胞連接和細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)。與此相比，CD44+細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(波形蛋白，N-鈣粘著蛋白) 的表達(dá)和E-鈣粘著蛋白的損失，從而指示了 EMT。在Slug和HA-ras誘導(dǎo)的EMT中，AxI的表達(dá)與⑶44的存在和間質(zhì)細(xì)胞特征相關(guān)(圖9，B、D欄)。表達(dá)Slug和HA-Ras的⑶44+ 和CD44-MCF10a細(xì)胞在三維基質(zhì)膠上的生長(zhǎng)(圖9，E欄)表明，表達(dá)AxI的CD44+MCF10a 細(xì)胞是侵染性的，其與間質(zhì)細(xì)胞表型一致。這些結(jié)果表明，AxI由MCFlOa細(xì)胞中的Slug和 HA-Ras表達(dá)上調(diào)，并且與間質(zhì)細(xì)胞和癌干細(xì)胞特征相關(guān)。在不脫離本發(fā)明的范圍和主旨的條件下，對(duì)本發(fā)明所述方面進(jìn)行的各種修改和變形是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。盡管本發(fā)明對(duì)具體優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明并不過度地限制于具體的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的實(shí)施本發(fā)明所述方式的各種修改也應(yīng)在本申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)Camp, R. L. , V. Neumeister, and D. L. Rimm, A Decade of Tissue Microarrays Progress in the Discovery and Validation of Cancer Biomarkers. J Clin Oncol, 2008.Collett, K. , et al. , A basal epithelial phenotype is more frequent in interval breast cancers compared with screen detected tumors. Cancer Epidemiol BiomarkersElston, Cff. and I.O.Ellis, Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer-experience from a large study with long-term follow-up. Histopathology,1991. 19(5) :p.403-10.Prev, 2005. 14(5) :p. 1108-12.Gupta PB,Mani S,Yang J,Hartwe11 K,Weinberg RA. The evolving portrait ofcancer metastasis. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2005 ；70 :291-7.Holland S. J.，F(xiàn)riera A. M.，F(xiàn)ranci C，Chan E.，Atchison R.，McLaughlin J.， Swift S. E.，Pali E.，Yam G.，Wong S.，Lasaga J.，Shen Μ.，Yu S.，Xu W.，Hitoshi Y.， Payan D. G,Nor J. Ε.，Powell Μ. J,and Lorens J. B. (2005)The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65 :9294-9303.Kononen，J. ，et al. ，Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med, 1998. 4(7) :p. 844-7.Sun，W.，F(xiàn)ujimoto, J. &Tamaya，T. Coexpression of Gas6/Axl inhuman ovarian cancers. Oncology 66，450-7(2004).Thiery JP. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer. 2002Jun ；2 (6) :442-54Vajkoczy P，Knyazev P，Kunkel A，Capelle HH, Behrndt S，von Tengg-Kobligk H， Kiessling F， Eichelsbacher U， Essig M， Read TA, Erber R， Ullrich A Dominant-negative inhibition of the AxI receptor tyrosine kinase suppresses brain tumor cell growth and invasion and prolongs survival. Proc Natl Acad Sci USA. (2006) 103 :5799-804.Yang J，Mani SA, Weinberg RA Exploring a new twist on tumor metastasis. Cancer Res 2006 66 :4549-52.Yang J，Mani SA,Donaher JL, Ramaswamy S，Itzykson RA, Come C，Savagner P， Gitelman I,Richardson A，Weinberg RA. Twist,a master regulator of morphogenesis， plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 2004 117 :927-39.Yang JiWeinberg RA.Epithelial-mesenchymal transition :at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 2008Jun ； 14(6) :818-29.Wang,H. ,et al. ,Mammography screening in Norway :results from the first screening round in four counties and cost-effectiveness of a modeled nationwide screening. Cancer Causes Control, 2001. 12 (1) :p. 39-45.Holland et al. R428,a selective small molecule inhibitor of AxI kinase， blocks tumour spread and prolongs survival in models of metastatic cancer. Cancer Research ；70(4), February 15,2010.
權(quán)利要求
1.AxI作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中AxI為用于檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的誘導(dǎo)的生物標(biāo)志物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中AxI的上調(diào)指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。
4.一種用于檢測(cè)樣品中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的方法，所述方法包括以下步驟(i)從細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人中分離樣品；( )與對(duì)照樣品相比，確定所述樣品中AxI的表達(dá)，其中相比于所述對(duì)照樣品，AxI表達(dá)的上調(diào)指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。
5.一種通過檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生而診斷受試者中轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，所述方法包括確定從所述受試者獲取的樣品中AxI受體多肽的水平，其中所述多肽的水平比未患轉(zhuǎn)移性癌癥的受試者的水平更高指示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述癌癥為乳腺癌。
7.AxI或編碼AxI的基因在監(jiān)測(cè)能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的活性中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中在對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人施予所述能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑后，監(jiān)測(cè)AxI是否存在。
9.一種鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人，并監(jiān)測(cè)AxI的活性和/或表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該方法包括將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人，并檢測(cè)所述已處理的樣品中AxI表達(dá)相比于未處理對(duì)照組樣品的改變。
11.一種檢測(cè)抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的能力的方法，所述方法包括 (i)將所述試劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人；以及( )測(cè)量來源于已處理或未處理的細(xì)胞、動(dòng)物或人的樣品中的AxI表達(dá)；以及 (iii)檢測(cè)所述已處理樣品中的AxI表達(dá)相比于所述未處理樣品的增加或減少，作為抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力的指標(biāo)。
12.—種監(jiān)測(cè)AxI抑制劑活性的方法，該方法包括通過下述步驟檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)的發(fā)生(i)將所述AxI抑制劑施予細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人；以及 ( )測(cè)量來源于已處理或未處理的細(xì)胞、動(dòng)物或人的樣品中的AxI表達(dá)；以及 (iii)檢測(cè)所述已處理樣品中的AxI表達(dá)或活性相比于未處理樣品的增加或減少，作為AxI抑制活性的指標(biāo)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中通過蛋白分析對(duì)所述樣品進(jìn)行分析。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述蛋白分析通過ELISA、PET、流式細(xì)胞術(shù)、 SELDI-TOF MS 或 2-D PAGE 進(jìn)行。
15.根據(jù)權(quán)利要求4或9-14中任意一項(xiàng)所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述細(xì)胞群為細(xì)胞培養(yǎng)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求4或9-15中任意一項(xiàng)所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞、PBMC或淋巴細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求4-6或10-16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品為血液。
18.根據(jù)權(quán)利要求4-6或10-16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品為血清、血漿或組織培養(yǎng)上清液。
19.一種鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)將所述試劑與AxI受體或表達(dá)所述AxI受體的細(xì)胞接觸； ( )在所述試劑的存在下測(cè)量所述AxI受體的活性；以及(iii)將步驟(ii)中測(cè)得的所述活性與在對(duì)照條件下測(cè)得的活性相比較，其中活性降低表明所述試劑能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中測(cè)得的所述活性是所述AxI受體的底物的酪氨酸磷酸化程度。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中測(cè)得的所述活性是所述AxI受體的自磷酸化程度。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述接觸步驟(i)中的所述細(xì)胞已經(jīng)預(yù)先被所述AxI基因轉(zhuǎn)染。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中步驟(iii)中的所述對(duì)照條件包括將所述試劑與不含活性AxI基因的細(xì)胞接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述細(xì)胞具有所述AxI基因的突變失活形式。
26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述AxI受體包括胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性部分。
27.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述AxI受體為固定化的。
28.一種通過篩選多種試劑來鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的試劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)將所述多種試劑與AxI受體或表達(dá)所述AxI受體的細(xì)胞接觸； ( )在所述多種試劑的存在下測(cè)量所述AxI受體的活性；(iii)將步驟(ii)中測(cè)得的活性與在對(duì)照條件下測(cè)得的活性相比較，其中活性降低表明所述多種試劑能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)；以及(ν)分別確定所述多種試劑中的哪種或哪些試劑抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。
29.根據(jù)權(quán)利要求9- 中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述試劑用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥。
30.根據(jù)權(quán)利要求9- 中任意一項(xiàng)所述的方法鑒定得到的試劑在制備治療轉(zhuǎn)移性癌癥的藥物中的用途。
31.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求9- 中任意一項(xiàng)所述的方法鑒定得到的試劑與可藥用的稀釋劑、賦形劑或載體的混合物。
32.—種制備組合物的方法，該方法包括(i)使用權(quán)利要求9- 中任意一項(xiàng)所述的方法鑒定能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)的試劑；以及( )將所述試劑與可藥用的稀釋劑、賦形劑或載體混合。
33.一種在需要接受治療的受試者中抑制已經(jīng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。
34.一種在需要接受治療的受試者中治療轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，所述方法包括通過對(duì)所述受試者施予AxI抑制劑，從而抑制已經(jīng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中所述AxI抑制劑為抗AxI抗體或小分子抑制劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者為哺乳動(dòng)物。
37.根據(jù)權(quán)利要求33-35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者為人。
38.AxI抑制劑在制備用于抑制已經(jīng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散的藥物中的用途。
39.AxI抑制劑在制備用于通過抑制已經(jīng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散來治療轉(zhuǎn)移性癌癥的藥物中的用途。
40.一種用于評(píng)價(jià)試劑抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力的試劑盒，所述試劑盒包含抗AxI抗體。
41.一種用于評(píng)價(jià)試劑抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力的試劑盒，所述試劑盒包含針對(duì)AxI的核酸探針。
42.一種用于評(píng)價(jià)試劑抑制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種針對(duì)AxI的QPCR引物。
43.權(quán)利要求40-42中任意一項(xiàng)所述的試劑盒在權(quán)利要求1或9- 中任意一項(xiàng)所述的方法中的用途。
44.一種用于確定受試者是否對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感的方法，所述方法包括以下步驟(i)從細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人中分離樣品；( )與對(duì)照樣品相比，確定所述樣品中AxI的表達(dá)，其中相比于所述對(duì)照樣品，AxI表達(dá)的上調(diào)指示對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感。
45.一種對(duì)需要接受治療的受試者中轉(zhuǎn)移性癌癥或晚期癌癥進(jìn)行治療的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。
46.AxI抑制劑在制備用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥或晚期癌癥的藥物中的用途。
47.一種抑制需要接受治療的受試者中的腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。
48.AxI抑制劑在制備用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
49.一種抑制患癌癥受試者中EMT誘導(dǎo)的侵染力的方法，所述方法包括將AxI抑制劑施予所述受試者。
50.AxI抑制劑在制備用于抑制患癌癥受試者中EMT誘導(dǎo)的侵染力的藥物中的用途。
51.實(shí)質(zhì)上如本文所述的方法、用途、藥物組合物或試劑盒。
52.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)志物在個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用中的用途。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的用途，其中所述個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用旨在確定受試者是否對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感或有反應(yīng)。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的用途，其中所述個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用旨在確定受試者是否特別可能患有轉(zhuǎn)移性癌癥。
55.一種用于確定受試者是否會(huì)對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感的預(yù)測(cè)方法，所述方法包括檢測(cè)所述受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的預(yù)測(cè)方法，該方法包括以下步驟 (i)從所述受試者中獲得樣品；以及( )與對(duì)照樣品相比，確定所述樣品中AxI的表達(dá)，其中相比于所述對(duì)照樣品，AxI表達(dá)的上調(diào)指示對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感。
57.AxI作為生物標(biāo)志物在用于確定受試者是否會(huì)對(duì)采用AxI抑制劑的治療易感或有反應(yīng)的預(yù)測(cè)試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及AxI作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的用途。更具體而言，本發(fā)明涉及通過測(cè)量AxI的表達(dá)和/或活性而檢測(cè)受試者中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的各種方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102421919SQ201080020766
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者戴維·羅伯特·米克勒姆, 拉爾斯·阿克斯萊, 詹姆斯·布拉德利·洛倫斯 申請(qǐng)人:卑爾根技術(shù)交易股份公司