專利名稱：用于細胞或組織培養(yǎng)的設備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于細胞或組織培養(yǎng)的設備。還提供了基于使用所述設備培養(yǎng)細胞的方法。
背景技術：
對用于長期維持功能性肝培養(yǎng)物的灌注生物反應器系統(tǒng)的開發(fā)是生物工程師們面對的挑戰(zhàn)性任務之一，所述功能性肝培養(yǎng)物在體外藥物測試中具有很強的預測能力 (Brandon，EF，Raap，CD 等，Toxicol Appl Pharmacol (2003) 189，3，233-246)。作為以細胞-細胞相互作用、細胞-基質相互作用和最大傳質(maximal mass transport)為特征的體內微環(huán)境瓦解的結果，原代肝細胞在分離后便喪失了肝特異性功能。一些方法提出通過為原代肝細胞重建類似于體內的微環(huán)境(通過使用半透性中空纖維膜、凝膠封裝或多孔支架)以克服細胞機能的喪失?？赏ㄟ^微載體或懸浮于膠原凝膠基質中的方式實現(xiàn)細胞的固定化，以形成2D、3D或球狀體結構的培養(yǎng)物(Landry，J，Bernier, D等，J Cell Biol(1985) 101,3,914-923 ；Kan，P，Miyoshi，H等，(2004)Tissue Eng 10，9-10，1297-1307 ； Park, J, Berthiaume, F φ, Biotechnol Bioeng(2005) 90, 5,632-644 ；Park, J. , Li, Y^, Biotechnol Bioeng(2008) 99，2，455—467)。已有研究表明，三明治培養(yǎng)(sandwich culture)提供了模擬體內環(huán)境的微環(huán)境。 這種培養(yǎng)方法提供了肝細胞附著的錨定物，并通過鄰近細胞間的膽小管網(wǎng)絡的形成建立了肝極性，同時維持了所述細胞的膽汁分泌功能。Du Y等報道了利用用于肝細胞的3D肝細胞單層三明治培養(yǎng)的生物活性-合成原料進行的肝極性的重建和體外肝功能的長期維持。 該研究表明，經(jīng)過14天的培養(yǎng)后，與膠原三明治培養(yǎng)中的肝細胞相比，所述合成的3D單層培養(yǎng)物顯示出相似的肝極性形成進程、更好的細胞-細胞相互作用和改進的分化功能。該研究強調了這種技術完美地適合于肝組織工程學的應用，如藥物代謝/毒性測試(Durm， JC, Tompkins, RG φ, Biotechnol Prog (1991) 7, 3, 237-245 ；Kern, A, Bader, A^, Biochem Pharmacol(1997)54，7，761-772 ；De Smet, K. ， Bruning, T 等，Arch Toxicol(2000)74, 10,587-592 ；Kemp DC, Brouwer, KL, Toxicol In Vitro (2004) 18,6,869-877 ；Kemp, DC, Zamek-Gliszczynski, MJ 等，Toxicol Sci (2005)83,2,207-214)。為維持原代肝細胞培養(yǎng)物中的細胞存活力和肝功能，灌注生物反應器的應用已是不可缺少的。已有研究證明，灌注生物反應器增強了溶解氧和營養(yǎng)物質向細胞培養(yǎng)物的傳質，使其具有存活力和功能(Rotem, A，Toner, M 等，Biotechnol Bioeng (1994) 43，7， 654-660 ；McClelland, RE, Coger, RN, Tissue Eng (2004) 10,1-2, 253-266) 然而，許多現(xiàn)有的體外灌注藥物測試平臺缺乏維持長期的細胞存活力和肝特異性功能的能力。此外，這些測試平臺的許多設計與標準的細胞培養(yǎng)板規(guī)格并不一致，導致將細胞培養(yǎng)物轉移至其它的標準藥物測試平臺具有難以想象的困難。因此，仍然存在對解決現(xiàn)存的體外藥物測試生物反應器設計中的現(xiàn)有缺點的培養(yǎng)平臺的需求。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種裝置或設備以克服這些缺點中的至少一部分。 通過提供根據(jù)權利要求1所述的裝置來實現(xiàn)這一目的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的設備可稱為灌注生物反應器。它也可用作細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(也可稱為生物反應器系統(tǒng))中的模塊。該設備可用作體外培養(yǎng)平臺，并將已知的表面改性的微加工三明治培養(yǎng)整合至這樣的設備架構(architecture)中該設備克服了上述的在細胞存活力和組織特異性功能方面的困難。所述設備進一步允許使用標準分析規(guī)格的多孔板，甚至還允許細胞在這些標準的多孔板設計和本發(fā)明的設備之間轉移。該設備含有多個細胞培養(yǎng)腔， 其中至少有一些培養(yǎng)腔包含具有透水性的并且例如可以是膜的可移除的嵌入物(inset)。 將多個細胞培養(yǎng)腔的具有透水性的嵌入物整合入該設備的中間面。該中間面可逆地密封于該設備中，以使它能轉移至另一個相似的設備或轉移至常規(guī)的分析平臺。第一方面，本發(fā)明提供了用于細胞或組織培養(yǎng)的設備。該設備包含底板、中間面和頂板。所述設備的中間面可移除地設置在所述底板和所述頂板之間。所述底板具有周壁、 底面和頂壁。所述底板的頂壁包含多個凹部，這些凹部排列為η行。數(shù)值η為從1到約25 的整數(shù)。各行凹部的范圍為從第一個凹部到最后一個凹部。各凹部都具有凹部周壁。各凹部的凹部周壁具有一個凹部入口和一個凹部出口。所述底板的周壁包含數(shù)目為2η的端口(port)。各端口連結(coupled)至所述η行凹部中的單行凹部，所述多個凹部排列在這η行中。各行凹部的凹部相互之間通過所述凹部入口和所述凹部出口流體連通(fluid communication) 0各行凹部的凹部也與包含于底板的周壁中的2η個端口中的第一端口和第二端口流體連通。因此，各行凹部的所述第一個凹部連結至第一端口，各行凹部的所述最后一個凹部連結至第二端口。所述設備的中間面具有多個凹部。這些凹部排列成m行。數(shù)值m為從1到約25的整數(shù)，并且m等于或小于η (上文中的η)。將該設備的中間面的凹部裝配到該設備的底板頂壁的多個凹部中。所述中間面的凹部具有透水性。該設備的頂板可逆地密封至該設備的中間面。該設備的中間面可逆地密封至該設備的底板。因此，該設備底板頂壁的凹部限定了培養(yǎng)腔。這些培養(yǎng)腔中的各培養(yǎng)腔具有周壁，該周壁由該設備底板頂壁的相應的凹部的凹部壁限定。各培養(yǎng)腔進一步具有可移除的頂部。該頂部由所述設備的頂板的一部分限定。第二方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)細胞的方法。所述方法包括設置底板。所述底板具有周壁、底面和頂壁。所述底板的頂壁包含多個凹部。這些凹部排列成η行。數(shù)值η 為從1到約25的整數(shù)。各行凹部的范圍為從第一個凹部到最后一個凹部。各凹部都具有凹部周壁。各凹部的凹部周壁具有一個凹部入口和一個凹部出口。所述底板的周壁包含數(shù)目為2η的端口。各端口連結至η行凹部中的單行凹部。各行凹部的凹部通過凹部入口和凹部出口相互之間流體連通。各行凹部的凹部進一步與2η個端口中的第一端口和第二端口流體連通。因此，各行凹部的第一個凹部連結至所述第一端口，各行凹部的最后一個凹部連結至所述第二端口。該方法還包括設置中間面。該中間面具有多個凹部，所述凹部排列為m行。數(shù)值m為從1到約25的整數(shù)，并且m等于或小于η。所述中間面的凹部具有透水性。該中間面的多個凹部能裝配到所述底板頂壁的多個凹部中。該方法進一步包括將所述中間面安裝到所述底板的頂壁上。結果，所述中間面的凹部裝配到所述底板頂壁的凹部中。 進一步地，該方法包括將細胞接種到所述中間面的多個凹部中。所述方法還包括設置頂板。 所述方法包括將所述頂板安裝到所述中間面上。結果，所述中間面便可移除地設置在所述底板和所述頂板之間。進一步地，該方法包括將所述頂板可逆地密封至所述中間面。該方法也包括將所述中間面可逆地密封至所述底板。結果，所述底板頂壁的凹部限定了培養(yǎng)腔。 這些培養(yǎng)腔中的各培養(yǎng)腔具有由凹部壁限定的周壁以及可移除的頂部。所述培養(yǎng)腔的頂部由所述頂板的一部分限定。


當與非限制性實施例和附圖結合考慮時，參考具體的說明，將更好地理解本發(fā)明。圖1表示通過用固定化有半乳糖的多孔Si3N4膜覆蓋而進行的底板的組裝測試，所述底板上接種了細胞(Α，Β)；以及頂板的組裝(C)限定了培養(yǎng)腔(D)，所述培養(yǎng)腔被放置在合適的容器中(E，F(xiàn))。將原代大鼠肝細胞接種至固定化有半乳糖的PET膜(底板)上并在上面培養(yǎng)Mh。圖2通過SEM圖像表示了在整個6天的培養(yǎng)中，在固定化有半乳糖的PET膜(A-C) 上、固定化有半乳糖的Si3N4膜(D-F)上、以及三明治結構的Si3N4-SC上(對應于本發(fā)明的設備中所使用的結構)(G-I)中培養(yǎng)的肝細胞形態(tài)的穩(wěn)定性測試。組裝過程參見圖1。圖3表示示范性的96孔灌注生物反應器和灌注路徑的組件。圖3A為灌注路徑的示意圖，50 96孔生物反應器，51 蠕動泵，52 三向閥門，53 截止閥，54 介質儲存器，55 加熱板。圖3B為96孔生物反應器的正視橫截面，1 底板，2(帶陰影線的)中間面，3 頂板， 11 端口，12 底板的凹部，14 底板的底面，15 凹部周壁，16 底板的頂壁，21 中間面的凹部，40，41 底板凹部的凹部入口 /凹部出口。圖3C為96孔生物反應器的透視圖，1 底板， 2 中間面，3 頂板，11 端口，12 底板的凹部，13 底板的周壁，16 底板的頂壁，21 :中間面的凹部，22 中間面的凹部的開口，31 頂板的凹部。圖4表示示范性的底板(1)的以下視圖從底板的端口看到的橫截面視圖(A),沿凹部的直行側向看到的橫截面視圖(B)，透視圖(C) (11:端口，12:底板的凹部，13:底板的周壁)和俯視圖(D)。圖5表示示范性的中間面O)的以下視圖從凹部的直行方向看到的橫截面視圖 (A)，沿凹部的直行側向看到的橫截面視圖(B)，透視圖(C) Ql 中間面的凹部，22 :中間面的凹部的開口)和俯視圖(D)。圖6表示示范性的頂板(3)的以下視圖從凹部的直行方向看到的橫截面視圖 (A)，沿凹部的直行側向看到的橫截面視圖(B)，透視圖(C) (31:頂板的凹部)和俯視圖 (D)。
圖7示意性地表示置于常規(guī)的多孔板(60)上的本發(fā)明的設備的兩個中間面(2， 2')。圖 8 表示在 0. lml/min (A)，0. 06ml/min (B)，0. 03ml/min (C)和 0. 015ml/min (D)的流速下，本發(fā)明的96孔設備中的壁剪切應力分布。圖 9 表示在 0. lml/min (A), 0. 06ml/min (B), 0. 03ml/min (C)和 0. 015ml/min (D)的流速下，本發(fā)明的96孔設備中的速度分布。圖 10 表示以 0. 015ml/min (A)，0. 03ml/min (B)，0. 06ml/min (C)和 0. lml/min (D) 的流速灌注培養(yǎng)6天后通過活細胞(綠色)和死細胞(紅色)染色示出的細胞存活力。圖 IOA-圖IOD代表了既有紅色信號又有綠色信號(全光譜)的各幅圖像。圖IOE-圖IOH為只顯示綠色信號的圖像，紅色、黃色、藍色、紫紅色和青綠色通道的飽和度變?yōu)榱?。圖101-圖 IOL為只顯示紅色信號的圖像，黃色、綠色、藍色、紫紅色和青綠色通道的飽和度變?yōu)榱?。圖11表示在6天的培養(yǎng)期中利用不同方法(如所指示的)的原代肝細胞的尿素生產(chǎn)。圖12表示在利用靜態(tài)膠原凝膠三明治(■)、靜態(tài)Si3N4-SC(Cl)和流速為0. 015ml/ min的Si3N4-SC灌注(E3)進行培養(yǎng)的12天培養(yǎng)期中原代肝細胞的尿素生產(chǎn)。圖13表示在利用靜態(tài)膠原凝膠三明治(_)、靜態(tài)Si3N4-SC(CI)和流速為0. 015ml/ min的Si3N4-SC灌注(0)進行培養(yǎng)的12天培養(yǎng)期中原代肝細胞的CYP450酶促活性。圖14表示本發(fā)明的96孔設備的不同孔中培養(yǎng)的細胞在傳質效率(A)和細胞存活力(B)方面的均一性。圖15表示暴露至APAP的Si3N4-SCP中的原代大鼠肝細胞的較高的藥物敏感性 (在靜態(tài)條件下的膠原凝膠三明治，□在靜態(tài)條件下的Si3N4-SC,Si3N4-SC灌注)。圖16顯示了通過機器人液體處理系統(tǒng)測定的Si3N4-SCP中對APAP-誘導的肝細胞毒性的響應的較低的IC5tl值。在C3A細胞中測定APAP-誘導的肝細胞毒性(IC5tl值 Si3N4-SCP 為 7ImM ( Θ)，Si3N4-SC 為 SOmM ( ■)，膠原凝膠三明治為 S4. 6mM (□))。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種用于細胞或組織培養(yǎng)的設備。該設備包含底板、中間面和頂板。典型地，這三個元件可移除地組裝，以提供水密密封(water-tight seal)和氣密密封 (gas-tight seal)。該設備可具有任意期望的規(guī)格。典型地，跨越所述設備的內橫截面的最大距離(即，它的最大寬度)選自如下范圍約Icm到約500cm、約2cm到約250cm、約2cm到約IOOcm或約2cm到約50cm(如，約2. 5cm到約25cm、約4cm到約25cm、約2cm到約15cm、 約4cm到約15cm或約2cm到約IOcm)。該設備包含多個培養(yǎng)腔。這些培養(yǎng)腔可具有相同、相似或不同的幾何形狀和規(guī)格。 典型地，所述設備的培養(yǎng)腔的規(guī)格具有至少基本上相同的尺寸和幾何形狀。所述培養(yǎng)腔由周壁和可移除的頂部限定。在某些實施方式中，所述培養(yǎng)腔具有底面。培養(yǎng)腔的底面和頂壁可以被布置為至少基本上相互平行。如下文中進一步詳述的，各培養(yǎng)腔的周壁和底面(如果存在的話)由設備底板中的凹部限定。培養(yǎng)腔的內橫截面具有任意期望的輪廓，如卵形、 環(huán)形、蛋形、字母V形或U形、三角形、長方形、正方形或任意多角形(polyhedron)。在培養(yǎng)腔的底面和頂壁相互平行布置的一個實施方式中，培養(yǎng)腔限定了至少基本上為圓柱形的內腔(interior)。所述培養(yǎng)腔可為任意容量。典型地，各培養(yǎng)腔具有內腔，所述內腔可提供的容量范圍為從約0. Iml到約10ml，如約0. 2ml到約IOml或約0. 2ml到約5ml，包括約0. 5ml到約IOmUO. 5ml到約5ml或0. 25ml到約2. 5ml，諸如例如0. 35ml或0. 5ml。培養(yǎng)腔的內腔表示在任意入口或出口(例如開口)被密封時，與裝入該培養(yǎng)腔中的流體直接接觸的任意空間或實體。它也指可包含在與所述流體接觸的空間或實體內的任意空間或實體。作為示例性的例子，典型地，具有透水性的中間面的周壁(參見下文)可移除地包含在培養(yǎng)腔中， 由此成為培養(yǎng)腔的內腔的一部分。因此，當術語“內面”分別用于與培養(yǎng)腔和底板的凹部相關的場合時，尤其是當任意開口被密封時，該術語“內面”表示的是朝向培養(yǎng)腔內腔的表面區(qū)域(表面區(qū)域在培養(yǎng)腔的內腔能夠接觸裝入培養(yǎng)腔的內腔的流體)。然后，培養(yǎng)腔能接收流體和/或樣品，例如細胞懸浮液、血液或血漿以及可選的其它物質。因此，在某些實施方式中，培養(yǎng)腔中填充著介質，例如用于培養(yǎng)細胞的含水介質，如現(xiàn)有技術中可用的熟知的細胞培養(yǎng)基之一(“生長培養(yǎng)基”)，在此僅舉幾個例子，例如LB培養(yǎng)基；含有單糖的液體， 例如，可能包括例如漢克氏鹽(Hank’ s Salts)；伊格爾氏(fegle’ s)基本成分培養(yǎng)基(包括例如 Dulbecco，s 改良的伊格爾培養(yǎng)基)；RPMI (Roswell Park Memorial Institute)培養(yǎng)基；HyClone培養(yǎng)基；Ham，s組織培養(yǎng)培養(yǎng)基；Chee' s培養(yǎng)基；YM肉湯；或Murashige和 Skoog培養(yǎng)基、或血液。在另外的實施方式中，需要在培養(yǎng)腔中裝入上述介質以培養(yǎng)細胞或利用培養(yǎng)腔中的細胞使所述介質去毒。所述培養(yǎng)腔可被設計為能容納任意的期望的流體(同樣參見下文)。所述流體可具有任意性質，無論是極性的或非極性的。典型地，所述流體是如細胞培養(yǎng)基、血液或血漿這樣的含水液體。所述流體可通過周壁中的入口注入或進入培養(yǎng)腔中。所述流體通過周壁中的出口可流出培養(yǎng)腔。在培養(yǎng)腔的內腔中，可設置有其它元件，如例如用于檢測溫度或氧氣水平的一個或多個傳感器(如納米傳感器)，或一個或多個供氧元件。供氧元件例如可被設計為包含與外部的氧氣供應流體接觸的毛細管。這些元件與裝入培養(yǎng)腔中的流體直接接觸，并因此包含在培養(yǎng)腔的內腔中。然而，與這些元件相連的其它實體，如管道(tubing)或配線 (wiring)，典型地并不與裝入培養(yǎng)腔中的流體直接接觸，因而不是培養(yǎng)腔內腔的一部分。因此，像這樣的培養(yǎng)腔的周壁、底面(如果存在的話)和可移除的頂壁用于防止裝入培養(yǎng)腔的流體和周圍環(huán)境的任何聯(lián)系。通常，所述的底面、周壁和可移除的頂壁(如果存在的話)由此防止培養(yǎng)腔的內腔與周圍環(huán)境的任何流體連通。元件(如傳感器或供氧元件)被設計成通過膜或一個或多個壁防止與所述培養(yǎng)腔的內腔流體連通。在供氧元件具有膜且諸如氣體等流體能夠通過該膜接觸裝入腔中的流體并溶入流體中的情況下，由膜提供的屏障防止各流體間的任何直接接觸。因此，術語“流體連通”被理解為不包含跨越屏障的擴散或滲透。因此，這些元件可具有的例如用于供應流體的任意入口或出口均不與裝入培養(yǎng)腔中的流體發(fā)生流體連通，因而不是所述培養(yǎng)腔的內腔的一部分。然而，如上所述的，培養(yǎng)腔的周壁具有入口和出口。通過該入口和該出口并且通常只通過該入口和該出口(因為一般不存在額外的入口或出口)，培養(yǎng)腔的內腔與外界流體連通。所述入口和出口可相互獨立地包含任意部件或由任意部件組成。各個部件例如可為開口、通道或閥門。各個通道的輪廓和各個開口可為任意尺寸和形狀。例子包括但不限于環(huán)形、長方形或正方形或三角形。在某些實施方式中，所述設備的外殼(housing)的入口和
/或出口可完全密封。如上所述，所述設備的培養(yǎng)腔可通過放置并可逆地密封設備的底板和頂板而組裝或拆卸。此外，通過組裝而包含中間面，所述中間面位于所述設備的底板和頂板之間。所述設備的底板具有周壁、底面和頂壁。所述底板可包含任意希望的材料。典型地，它為固體并能夠在該設備中進行的整個培養(yǎng)過程中保持完整無損。作為幾個示例性的例子，所述底板或其部分或其元件可包含玻璃、聚丙烯(PP)或聚四氟乙烯(PFTE，特氟龍)。 在某些實施方式中，所述底板可包含彈性體或由彈性體組成，如硅聚合物(例如聚二甲基硅氧烷、聚丙甲基硅氧烷、聚三氟丙甲基硅氧烷或聚苯甲基硅氧烷)。期望彈性體的使用可使所述底板更易于可逆密封至所述中間面。如作適當變動，上述彈性體的使用也適用于所述設備的頂板。在某些實施方式中，所述底板的至少一部分(例如周壁、底面和/或頂壁)是允許光進入該設備的內腔中的實體，所述設備的內腔包含例如包含于該設備中的培養(yǎng)腔。術語 “光”被理解為包括任意波長的電磁輻射(包括電磁波譜的某一明確的波長、一組明確的波長或任意區(qū)域)。電磁波譜區(qū)域的兩個例子為可見光和紫外光，所述可見光對應于約400nm 到約700nm的波長范圍，所述紫外光對應于約30nm到約400nm的波長范圍。在某些實施方式中，所述周壁、底面和/或頂壁中的至少一部分是允許光從該設備的內腔(包含培養(yǎng)腔) 中射出的實體。允許光射出的各個壁部分(包括底面)可與允許光進入培養(yǎng)腔的壁部分 (包括底面)相同、部分相同或不同。壁部分例如可為透明的或半透明的。允許光穿過的壁部分的合適材料的例子包括但不限于玻璃、石英和塑料材料。構建各個壁部分的合適的塑料材料包括但不限于聚甲基丙烯酸甲酯類(例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或基于咔唑的甲基丙烯酸酯類和二甲基丙烯酸酯類)、聚苯乙烯、聚碳酸酯和多環(huán)烯烴類。對于壁部分的制造而言，進一步適合于只在一定程度上允許光透過的材料的示例性的例子為全氟乙丙烯 (FEP)。底板的底面和頂壁都可具有任意的內部和外部幾何形狀，并可包含任意希望的材料。在某些實施方式中，所述底面和/或頂壁例如可為彎曲的、圓形的、筆直的或平坦的。在某些實施方式中，所述底面和/或頂壁可為具有例如長方形、正方形、三角形、卵形或環(huán)形輪廓的平板。所述底面和/或頂壁可為弧形(如凹面或凸面)、波形或包含凹痕(dent)、凹角(nook)或任意其他幾何形狀的元件。在典型的實施方式中，所述底面和頂壁均為固體， 并能在其中進行的整個培養(yǎng)過程中保持完整無損。在某些實施方式中，設備底板的底面、 周壁和頂壁中的任一個可分別為另一個通常為較大的壁或底面的一部分。在某些實施方式中，底板的底面、頂壁和周壁包含一種或多種相同的材料。在一個實施方式中，所述底板的底面、頂壁和周壁由相同材料制成。所述底面和頂壁相互之間可按照任意希望的方向布置。 在某些實施方式中，所述底板的底面或頂壁中的一個或二個至少基本上與所述底板的周壁垂直地布置。在一個實施方式中，所述底板的底面和頂壁至少基本上相互平行地布置。所述底板的周壁可為固體底板的表面或特定厚度的壁，在后一種情況下，它可具有任意的厚度/強度，只要組裝后它能在所述設備的細胞培養(yǎng)期間至少基本上保持完整無損。在某些實施方式中，本發(fā)明設備的外部形狀的幾何形狀可在很大程度上由底板決定，從而主要由底板的周壁決定。
所述底板的底面通常設置有與周圍環(huán)境的接觸表面，該設備放置于所述周圍環(huán)境 (例如，桌子的表面)之上。因此，該底板的底面可設計成具有非常適合將該設備放置于希望的表面上的幾何形狀和表面性質。在某些實施方式中，所述底板的底面因此為平的表面。當本發(fā)明的設備以下述方式取向時，本文使用的術語“水平的”、“垂直的”、“下面”、“上面”、“下部”、“上部”、“頂部”及“在頂部”表示方位該設備的多個培養(yǎng)腔在至少基本上垂直于地球重力方向的平面中取向。在上述取向中，相對于培養(yǎng)腔內腔而言，該設備的頂板被置于至少基本上與地球重力方向相反的位置。在這點上，所述培養(yǎng)腔排列成行(同樣見下文)。這樣的一行培養(yǎng)腔通常被置于設備內的一個平面中，該平面至少很大程度上 (如果不是至少本質上)與地球重力的方向垂直地被取向。典型地，由培養(yǎng)板的布置限定的該平面至少大體上平行于地面。在上述取向中，相對于培養(yǎng)板而言，所述培養(yǎng)腔的入口和出口被置于所述培養(yǎng)板的平面內，并指向這樣的方向該方向至少很大程度上垂直于地球重力起作用的方向。在上述取向中，設備底板的周壁通常沿至少大體上約為地球重力的方向延伸。所述設備底板的頂壁包含多個凹部。各凹部可具有自己單獨的構形(topography) 和幾何形狀。所述多個凹部中的凹部的尺寸和規(guī)格可分別選擇。所述多個凹部中的每個凹部都具有凹部周壁。所述凹部的內面可由該周壁限定。在某些實施方式中，一個或多個(包括每個)凹部具有凹部周壁和凹部底面。如果設備被置于使得底板朝向大約垂直于重力方向的位置，則頂板的凹部在該垂直于重力方向的平面內具有特定的最大寬度。在該平面中的凹部的內橫截面可具有任意希望的輪廓，如半卵形、半圓形、字母V形或U形、三角形、長方形、正方形或任意多角形。在某些實施方式中，所述底板的頂壁(可被用來限定底板的上表面)至少基本上是平坦的。底板的這種平坦的頂壁還可按照如下取向布置在組裝的設備中當所述設備被置于地面、桌子等上并在運行中時，所述取向限定了垂直于重力方向的平面。當所述設備在運行時，可將該平面置于至少基本上平行于地球表面的位置。在這些實施方式中，上述大約垂直于重力方向上的凹部最大寬度為設備頂板底壁的平面中的最大寬度。所述凹部周壁和所述凹部底面(如果存在的話)可具有任意表面性質，只要它們允許介質(尤其是液體)的儲存。所述凹部周壁和所述凹部底面(如果存在的話)的表面性質和材料可經(jīng)選擇，以滿足將在所述設備中進行培養(yǎng)的細胞的需要。在某些實施方式中， 凹部的任意表面或表面部分可轉化為親水的或疏水的。如果需要，凹部的不同部分可提供不同的表面性質。對凹部、底板的其它部分或設備的任何其它部分所進行的實現(xiàn)表面性質改變的處理可為任意的能夠改變各自表面性質的處理，所述改變能夠在接下來的與待作用的流體 (如細胞培養(yǎng)基)或待作用的細胞接觸的過程中持續(xù)足夠長的時間。典型地，該處理并不影響接觸各表面區(qū)域的流體的組成。在某些實施方式中，所述處理并不影響接觸各表面區(qū)域的任意流體的組成?？捎糜诟淖儽砻嫘再|的處理可包括多種手段，如機械手段、熱學手段、電學手段或化學手段?，F(xiàn)有技術中常用的方法為用對所述流體樣品具有不同水平親和力的化學試劑來處理。舉例來說，可通過用稀鹽酸或稀硝酸處理，將塑料材料的表面轉化為親水性表面。 再例如，可通過氧氣或空氣等離子體氧化，將聚二甲基硅氧烷(PDMQ表面轉化為親水性表面?？蛇x地，可通過用親水性聚合物涂覆或通過用表面活性劑處理，將任何疏水性表面的表面性質轉化得較為親水?；瘜W表面處理的實例包括但不限于暴露至下列物質中六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、丙基三氯硅烷、四乙氧基硅烷、縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、2- (3，4-環(huán)氧-環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷、3- (2， 3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷、聚二甲基硅氧烷(PDMQ、γ-(3，4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚甲基丙烯酸酯共聚物、氨基甲酸乙酯、聚氨基甲酸乙酯、含氟聚丙烯酸酯、聚(甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚 [N-(2-羥基-丙基)甲基丙烯酰胺](PHPMA)、α -磷酸膽堿-0-(N，N- 二乙基二硫代氨甲?；?-i^一烷基寡 DMAAm-寡-ST 嵌段共低聚物(見 Matsuda，T 等，Biomaterials (2003)， 24，24,4517-4527)、聚(3，4-環(huán)氧-1- 丁烯)、3，4_環(huán)氧-環(huán)己基甲基丙烯酸甲酯、2，2-雙 W-(2，3-環(huán)氧丙氧基)苯基]丙烷、3，4_環(huán)氧-環(huán)己基丙烯酸甲酯、(3'，4'-環(huán)氧環(huán)己基甲基)-3，4_環(huán)氧環(huán)己基羧酸酯、二-(3，4_環(huán)氧環(huán)己基甲基)己二酸酯、雙酚A(2，2-雙 (P-(2，3-環(huán)氧丙氧基)苯基)丙烷)或2，3-環(huán)氧-1-丙醇。通過入口和出口，一些培養(yǎng)腔以及設備底板頂壁中的相應數(shù)目的凹部相互之間流體連通。培養(yǎng)腔例如可通過導管(conduit)的方法連結，例如連接(connect)兩個相鄰的培養(yǎng)腔。所述導管可連結(例如連接)第一個培養(yǎng)腔的出口與第二個培養(yǎng)腔的出口。在某些實施方式中，各導管(例如下表面通道)可具有跨越其橫截面的最大寬度，該最大寬度選自從約0. 2mm到約6mm的范圍內，如約0. 5mm到約6mm、約Imm到約5mm、約2mm到約5mm或約Imm到約4mm。培養(yǎng)腔以及底板頂壁中的凹部(培養(yǎng)腔與底板頂壁中的凹部相互間流體連通)排列為η行。整數(shù)η表示包含在所述設備的底板頂壁中的這些行的數(shù)目。所述整數(shù)η通常選自從1到約30的范圍內，如從1到約25、從1到約20、從1到約15、從1到約12、從1到約 9或從1到約5，如例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16行。每一行培養(yǎng)腔和底板頂壁中的每一行凹部的范圍為從第一個凹部/培養(yǎng)腔到最后一個凹部/培養(yǎng)腔。在第一個凹部/培養(yǎng)腔和最后一個凹部/培養(yǎng)腔之間，可布置若干額外的培養(yǎng)腔/凹部，所述培養(yǎng)腔/凹部串聯(lián)地連結在一起。各個額外的培養(yǎng)腔因此置于兩個培養(yǎng)腔/凹部之間，并通過各自周壁中的凹部入口和凹部出口與相鄰的培養(yǎng)腔/凹部連接。第一個凹部和最后一個凹部之間的培養(yǎng)腔的數(shù)目選自從0到約100的范圍內，如0到約50、0到約40、0到約30、0到約25、0到約20、0到約15、0到約10或0到約5。在η大于1的實施方式中，即在所述底板的頂壁中布置了多行凹部的實施方式中，這些行的凹部可按照任意合適的陣列布置。正如下文所進一步解釋的，該陣列可相當于標準的多孔格式(format)，如6-孔、12-孔、24-孔、 48-孔、96-孔、384-孔、或1536-孔格式。如上所示，一行培養(yǎng)腔/凹部中的培養(yǎng)腔/凹部布置于共同的平面中。在某些實施方式中，該平面至少本質上平行于由該設備的底板的底面限定的平面。各行培養(yǎng)腔/凹部中的第一個凹部/培養(yǎng)腔和最后一個凹部/培養(yǎng)腔連結至(包括連接至)端口，所述端口包含在該設備底板的周壁中。通常每個這樣的端口僅連接至一個培養(yǎng)腔/凹部，并因此僅連結至一行培養(yǎng)腔/凹部。因此，各行培養(yǎng)腔/凹部與兩個相應的端口相連結，一個端口連結至(包括連接至)該行的第一個凹部/培養(yǎng)腔，一個端口連結至(包括連接至)該行的最后一個凹部/培養(yǎng)腔。各個端口例如可通過導管分別連接至第一個凹部/培養(yǎng)腔或最后一個凹部/培養(yǎng)腔。因此，所述設備底板的周壁包含總共2η個端如上所示，典型地，所述設備的培養(yǎng)腔/凹部包含具有透水性的嵌入物。所述嵌入物可用作篩子。通過孔隙(aperture)(如開口)提供透水性。該開口可具有選自從約0. Imm 到約6mm范圍內的最大寬度如從約0. 2mm到約5mm，例如約5mm、約4mm、約3mm、約2mm、約 Imm或約0. 5mm。各個開口可選為具有足夠小的規(guī)格，以防止所選擇的細胞也從該開口中穿過。也可將各個開口布置在這樣的位置即所述嵌入物的開口朝向所述底板頂壁的凹部的周壁的沒有入口或出口的部分。因此，所述底板頂壁的凹部的入口和出口與所述嵌入物的開口被置于不相重疊的位置。在這樣的實施方式中，所述嵌入物的開口與所述底板中的凹部的入口和/或出口不能限定連續(xù)的通路(即通道)。通常，由所述嵌入物的周壁和底板中的凹部的周壁之間的最大距離決定是否能夠防止所選細胞從所述嵌入物的開口通過底板中的各凹部的入口和/或出口。如果這些周壁是緊密配合的，通?？煞乐勾蠖鄶?shù)的細胞類型從該嵌入物中流出。在某些實施方式中，該嵌入物是透水性的，該嵌入物中具有透水性材料。在某些實施方式中，該嵌入物是透水性的并含有孔隙。在預先選定的某種程度上，該嵌入物允許流體通過。在運行中，該設備可提供穿過η行凹部/培養(yǎng)腔的連續(xù)的流體流。相應地，該流體流能夠穿過所述流體透過性的嵌入物并由此對培養(yǎng)腔進行灌注。由該流體流提供的傳質可允許例如代謝產(chǎn)物、營養(yǎng)物質和溶解氧擴散入及擴散出培養(yǎng)腔。該嵌入物也可用作貼壁依賴性細胞(anchorage-d印endent cells)的支架或粘附基底。該嵌入物例如可為多孔的。它可具有為改進的傳質而選擇的預定孔尺寸和預定孔間距。該嵌入物例如可通過徑跡蝕刻膜(track-etch membrane)限定，該膜可包含以下聚合物如聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯 (PP)、聚酰亞胺、CR-39或聚碳酸酯(PC)。這樣的膜中的孔的形狀可自由選擇?？稍谶@些孔形成時，將其形狀控制為例如圓柱形、圓錐形、漏斗狀或雪茄狀。對徑跡蝕刻工藝的概述例如已由Apel(Radiation Measurements (2001) 34, 559-566)給出。在某些實施方式中，該嵌入物可為透氣性材料，如聚(ι-三甲基硅烷基-ι-丙炔)或芳香族聚乙炔，例如聚[1-苯基-2-[ρ-(三苯基硅烷基)苯基]-乙炔]或2-[[p-(三異丙基甲硅烷基)苯基]乙炔]。該嵌入物可具有籃形或半球形的形狀。該嵌入物被裝配到所述培養(yǎng)腔/凹部中， 并且具有與培養(yǎng)腔/凹部的周壁和底面(如果存在的話)的形狀和規(guī)格相匹配的形狀和規(guī)格。各個嵌入物內是本發(fā)明的設備的中間面的凹部。因此，該中間面的凹部可具有與所述底板頂壁的相應凹部的內部形狀和內部規(guī)格相符合的外部形狀和外部規(guī)格，該中間面的凹部被裝配到該底板頂壁的凹部中。所述中間面在設備的底板和頂板之間的距離(即厚度) 方向上可具有提供足夠機械穩(wěn)定性的最大寬度，從而使所述中間面在設備運行過程中能夠基本上保持完整無損。該厚度通常選擇為足夠小以至少基本上不影響、不干擾或至少不阻礙該設備的灌注操作。因此，該中間面的確切厚度通常將取決于該設備的其他規(guī)格和參數(shù)并取決于該中間面的材料。作為示例性的例子，所述厚度可選自從約0. Imm到約2mm的范圍內，如從約0. 2mm到約1mm、從約0. 3mm到約0. 8mm、從約0. Imm到約0. 8mm或從約0. 3mm 到約 0. 6mm,例如 0. 4mm 或 0. 5mm。在中間面的凹部使用透水性材料的情況下，本領域技術人員在設計該中間面的時候將會考慮毛細管力的作用。如果整個中間面都是透水性材料，培養(yǎng)基可經(jīng)由中間面的凹部以外的部分從該中間面的凹部漏出。因此，在中間面的較大的部分(包括全部中間面) 是透水性材料的一些實施方式中，可期望設置有一個或多個密封墊或墊圈來阻止毛細管力的作用。所述中間面的凹部也可選擇為比其所要插入的底板中的凹部具有更小的深度，即在重力方向上(參見上文)具有更小的規(guī)格。同樣地，所述中間面的凹部也可選擇為比其所要插入的底板中的凹部具有更小的寬度，即在與重力方向垂直的方向上(參見上文)具有更小的規(guī)格。在這樣的實施方式中，空隙可保留在所述培養(yǎng)腔/凹部的周壁與所述中間面的凹部限定的嵌入物之間和/或所述培養(yǎng)腔/凹部的底面(如果存在的話)與所述中間面的凹部限定的嵌入物之間。如下所述，通過將細胞接種于該中間面的凹部上以對細胞進行培養(yǎng)。因此，本發(fā)明設備的架構包含可設置的孔深度，從而使得能夠對細胞表面上的流體導致的剪切應力進行微調。通過選擇所述中間面凹部的希望的深度和寬度(相對于底板頂壁的凹部的深度和寬度)，可調節(jié)其中培養(yǎng)有細胞的孔的有效孔深度和孔直徑。這種調節(jié)使得能夠對在培養(yǎng)腔中培養(yǎng)的細胞的細胞表面上的流體所導致的剪切應力進行操控和微調。 為了這樣的調節(jié)以及在這方面的比較，可使用和/或評價具有不同中間面的相同底板或具有不同底板的相同中間面。該設備的中間面具有多個凹部，所述凹部被裝配到所述底板頂壁的多個凹部中。 在一個實施方式中，該設備中間面中的凹部數(shù)目與底板頂壁中的凹部數(shù)目相等。在該實施方式中，底板頂壁的各凹部都包含一個裝配在其中的中間面的凹部。如上所示，該中間面的凹部的規(guī)格大約等同于或小于所述底板頂壁中的凹部的規(guī)格。在某些實施方式中，該設備中間面中的凹部數(shù)目少于底板頂壁中的凹部數(shù)目。在該實施方式中，底板頂壁只有一些凹部(少于底板頂壁的凹部總數(shù))包含中間面的凹部。所述中間面的凹部被布置為m行，m為等于或小于η(上文中的η)的整數(shù)。因此，根據(jù)η的值，m可選自從1到約30的范圍內，如從1到約25、從1到約20、從1到約15、從1到約12、從1到約9或從1到約5，如例如1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 行。包含有所述底板頂壁中的各行凹部的行可具有在從1到約200的范圍內選擇的凹部數(shù)目。如上所述，通常各行凹部具有連結至底板周壁中的第一端口的第一個凹部和連結至該壁的第二端口的最后一個凹部。只要第一個凹部和最后一個凹部為不同的凹部，各行凹部中的凹部數(shù)就為2個或更多個。在某些實施方式中，一行凹部中的凹部數(shù)目因此可選自從2到約200的范圍內。在某些實施方式中，所述底板頂壁中的各行凹部具有獨立選擇的數(shù)目為ο的凹部，其中0為整數(shù)。各整數(shù)例如可被區(qū)分為ο、ο'、o"等。該整數(shù)ο可為1、 2或更大。舉例來說，ο可獨立地選自從1到約200的范圍內，包括2到約200、2到約150、 1到約150,2到約120,2到約100、1到約100,2到約80、2到約60、2到約50、1到約50、2 到約40、1到約40、2到約30、1到約30、2到約25、1到約25、2到約20、1到約20、2到約12 或1到約12。在一個實施方式中，底板頂壁中的所有行凹部的整數(shù)ο是相等的。中間面的各行凹部中的凹部數(shù)目可等于或小于底板頂壁中的相應行凹部中的凹部數(shù)目，并且中間面的各行凹部被裝配到所述相應行的凹部中。在某些實施方式中，中間面的m行凹部中的至少一行凹部的數(shù)目與底板頂壁的η行凹部中的至少一行凹部的數(shù)目相等。在一個實施方式中，中間面的至少一行凹部中的凹部數(shù)目與底板頂壁的相應行凹部中的凹部數(shù)目相等，并且中間面的該行凹部被裝配到所述相應行的凹部中。在該實施方式中，所有由所述底板頂壁的該至少一行凹部限定的培養(yǎng)腔都具有嵌入物，所述嵌入物是由中間面的相應凹部所限定。包含有所述中間面中的各行凹部的行可具有在從1到約200的范圍內選擇的凹部數(shù)目。在某些實施方式中，在中間面中的各行凹部具有獨立選擇的數(shù)目為P 的凹部，其中P為整數(shù)。各整數(shù)例如可被區(qū)分為P、P'、P"等。該整數(shù)P可為1、2、3或更大。舉例來說，P可獨立地選自從1到約200的范圍內，包括2到約200、2到約150、1到約 150,2到約120,2到約100、1到約100,2到約80、2到約60、2到約50、1到約50、2到約40、 1到約40、2到約30、1到約30、2到約25、1到約25、2到約20、1到約20、2到約12或1到約12。在一個實施方式中，中間面中的所有行凹部的整數(shù)ρ是相等的。在一個實施方式中， 中間面中的所有行凹部的整數(shù)P與底板頂壁中的所有行凹部的整數(shù)ο相等，所述中間面凹部被裝配到所述底板頂壁的凹部中。當該設備中間面的凹部通常為透水性材料和透氣性材料時，中間面上的剩余部分 (即不是凹部并且不包含凹部的部分)可為任意希望的材料。在某些實施方式中，該剩余部分同樣為透水性材料和透氣性材料，在一個實施方式中，該剩余部分的材料與中間面凹部的材料相同。在另外的實施方式中，該剩余部分是至少基本上不是透水性和透氣性的固體材料。然而，中間面的任意部分通常是在該設備中將要進行的整個培養(yǎng)過程期間能夠保持完整無損的材料。在一個實施方式中，中間面的所有凹部都是相同的材料。在這些實施方式中的一些實施方式中，整個中間面都是相同的材料。作為示例性的例子，中間面或至少其凹部可包含氮化硅(Si3N4)或是由氮化硅(Si3N4)形成的，所述氮化硅(Si3N4)例如是如前所述的超薄微加工的多孔氮化硅膜(aiang等，2008，上文中)的形式。該中間面的表面、或至少其凹部的表面可通過所選的處理方式進一步改性。作為示例性的例子，例如為了提供增強的細胞附著，可用半乳糖配體對相應的微加工的氮化硅(Si3N4)膜進行表面改性。只要設備的中間面的形狀和規(guī)格允許以將所述中間面位于該設備的底板頂面和頂板之間的層疊形式緊密組裝，該設備的中間面便可具有任意希望的形狀和規(guī)格。該中間面例如可具有與底板頂壁的形狀和規(guī)格匹配的形狀和規(guī)格。在某些實施方式中，在由培養(yǎng)腔的行限定的平面中，中間面具有比底板小的規(guī)格。在某些實施方式中，中間面可具有以下述方式與底板頂壁的形狀和規(guī)格相適應(例如相匹配)的形狀和規(guī)格所述中間面的所有凹部裝配到底板頂壁的凹部中。在所述中間面的至少一行凹部被裝配到具有相等數(shù)目凹部的底板頂壁的至少一行凹部中的實施方式中，該中間面可具有以下述方式與所述底板頂壁的形狀和規(guī)格相適應(例如相匹配)的形狀和規(guī)格使所述中間面的凹部能夠裝配到其將要插入的底板頂壁的至少一行的凹部中。與中間面中的凹部不同的中間面的一部分或多部分可具有與各凹部相同的材料或不同的材料。在中間面中包含多個凹部的實施方式中，所述與中間面中的凹部不同的中間面的一部分或多部分可包含該中間面的單個凹部間的區(qū)域。在某些實施方式中，所述與中間面中的凹部不同的中間面的一部分或多部分至少基本上是平坦的。該平坦的中間面可進一步以如下的取向被布置在組裝的設備中當所述設備被置于地面、桌子等上并在運行中時，所述取向限定了垂直于重力方向的平面。當所述設備在運行中時，該平面可置于至少基本上平行于地球表面的位置。中間面凹部的材料通常被選擇為使得細胞能夠在所述底板的凹部中生長。該中間面的凹部對于水、營養(yǎng)物質和氣體來說是可透過的，因此，一旦該設備在使用中并且流體 (如血漿或細胞培養(yǎng)基)流過該設備的底板中的凹部行，保持(k印t)在這些凹部中的細胞可與連續(xù)供應的營養(yǎng)物質和氧氣相接觸。另一方面，該中間面的凹部的材料能夠將細胞維持在凹部中。作為示例性的例子，當中間面的凹部為多孔材料時，通常選擇足夠小的孔尺寸，以防止細胞被動地穿過中間面。因此，該中間面的凹部材料和/或對其進行的任何處理 (包括例如涂覆)也可被選擇用來防止所選細胞類型的細胞主動地遷移通過所述中間面。 因為不存在通過入口或出口可能將細胞沖洗出相應的細胞培養(yǎng)腔的風險，這使得所述底板凹部的入口或出口可為任意期望的設計。本發(fā)明設備的具有可移除的中間面的凹部的設計使該中間面能夠被設置為該設備的可重復使用的組件或一次性使用的組件。該設計也使得能夠將細胞從本發(fā)明的設備轉移至具有相應孔架構的任意其它平臺，如可商購的分析或測試工作站，例如液體處理機器人或自動機器人式液體處理/分析系統(tǒng)。如在自動篩選系統(tǒng)中(例如在HTS和UHTS中) 常規(guī)使用的一樣，各個平臺可以基于具有96孔、384孔、1536孔或3456孔的微孔板的架構。 因此本發(fā)明的設備可用來培養(yǎng)細胞和以隨時可測的模式提供培養(yǎng)的細胞，而不必在物理上分別轉移細胞。這防止了對培養(yǎng)物的干擾和對它們存活力的削弱。該中間面十分適合本發(fā)明的設備中的串行及并行流動灌注。當所述凹部/培養(yǎng)腔例如匹配常規(guī)的96孔板的位置時，該中間面可被轉移至機器人系統(tǒng)上的普通96孔板上進行進一步的評價。利用各機器人系統(tǒng)可進行任意的沖洗或孵育步驟，使得在進行分析前不需要可能削弱細胞存活力的額外時間。因此，該中間面可用于提供可商購的系統(tǒng)和本發(fā)明的設備之間的紐帶。如上所述，頂板可逆地密封至該設備的中間面。為了該目的，密封流體(如凝膠或液體)例如可在例如由溫度驅動的反應中硬化(cured)或經(jīng)過其它的處理。密封材料可包含由光敏和/或熱敏聚合物前體衍生而得的聚合物。中間面和頂板之間的密封及底板和中間面之間的密封是可逆的，因為所述密封可被解除。也可通過中間面和頂板的規(guī)格及表面幾何形狀的足夠精確的匹配來實現(xiàn)所述密封。相應地，中間面和底板間也適用于利用上述相同的匹配方式實現(xiàn)密封。如上所示，在某些實施方式中，可通過適當選擇包含于中間面和 /或頂板中的柔韌材料而實現(xiàn)所述密封。在某些實施方式中，可將諸如墊圈(例如0形圈) 等密封工具形式的其它實體置于外殼中。這樣的密封工具可為任意合適的剛性或半剛性材料。在某些實施方式中，密封材料可用來提供希望的緊密密封，例如，可硬化以形成或維持緊密密封的例如凝膠或液體形式的密封流體。作為示例性的例子，密封材料可包含由光敏和/或熱敏聚合物前體衍生而得的聚合物。因此，將各自的前體置于頂板和中間面之間的接觸面后，可通過聚合作用形成所述密封材料。只要所述密封本身可被解除，相應的密封過程可具有可逆性或不可逆性。作為例子，不經(jīng)氧化處理，PDMS形成具有平滑表面的非共價可逆密封。在某些實施方式中，各密封可通過粘著劑進行?？墒褂门c該設備在細胞培養(yǎng)中希望的用途相容的任意粘著劑。頂板可具有任意的內部或外部幾何形狀并包含任意希望的材料。例如，它可為彎曲的、圓形的、筆直的或平坦的。它可為弧形(如凹面或凸面)、波形、或包含凹痕、凹角或任意其他幾何形狀的元件。在典型的實施方式中，至少與設備的中間面相接觸的頂板下表面至少基本上為筆直的(包括平面)并可用來限定直壁。通常，頂板至少是基本上不透水的材料。在某些實施方式中，該頂板至少是基本上不透水且不透氣的材料。該頂板的尺寸和規(guī)格使它能以如下程度接觸中間面所述頂板覆蓋并封閉了中間面的所有凹部。通常，該頂板的尺寸和規(guī)格使它能以如下程度置于底板上方所述頂板覆蓋并封閉了底板的所有凹部。因此，由于底板的所有凹部通常包含于培養(yǎng)腔內，底板凹部的所有周壁通常限定了培養(yǎng)腔的周壁。所述頂板通常具有朝向周圍環(huán)境的頂壁和朝向中間面的底壁，所述頂壁可作為上表面，所述底壁可作為下表面。在某些實施方式中，該設備的頂板(通常為可移除的)具有一個或多個凹部。這樣的一個或多個凹部可被置于所述頂板的底壁(下表面)中。當設備處于組裝狀態(tài)時，所述凹部通常朝向中間面。該凹部可具有周壁。各個凹部也可具有底面。 在某些實施方式中，當設備被布置在底板朝向重力方向(參見上文)的位置時，該凹部典型地可在大約與重力相反的方向上跨越頂板最大寬度的約1/2、約2/3、約3/4或更多。在某些實施方式中，頂板中的凹部的各個底面可由頂板的頂壁限定。在這些實施方式中，頂板中凹部的底面可為透氣性材料。在某些實施方式中，這些凹部被置于與中間面中凹部的位置相對應的位置，所述中間面中的凹部被裝配到底板的凹部中(上文中)。在某些實施方式中，包含于頂板中的所有凹部被置于與底板中凹部的位置相對應的位置。在某些實施方式中，頂板中的凹部數(shù)目與中間面中的凹部數(shù)目相等。在一個實施方式中，頂板中的凹部數(shù)目、中間面中的凹部數(shù)目和底板中的凹部數(shù)目是相等的。如果該設備被置于頂板朝向大約垂直于重力方向的位置， 頂板的凹部在垂直于重力方向的該平面中具有特定的最大寬度。在某些實施方式中，該凹部的最大寬度可約等于或小于在該平面中的底板中的凹部的最大寬度。底板中的相應凹部的周壁、頂板中的相應凹部的周壁、以及底板中的凹部的底面和頂板中的凹部的底面(如果存在的話)可用于限定如上所述的培養(yǎng)腔。由設備頂板中的凹部限定的該培養(yǎng)腔的部分可用于限定培養(yǎng)腔的可移除的頂部。在各個培養(yǎng)腔中，該設備的中間面的凹部可按照如下方式進行裝配中間面的凹部被裝配到底板頂壁的凹部中。因此中間面的凹部限定了培養(yǎng)腔中的嵌入物(上文中)。在某些實施方式中，頂板的底壁(下表面)至少基本上是平坦的。該頂板的這種平坦的底壁可進一步以如下取向被布置在組裝的設備中當該設備位于地面、桌子等上并在運行中時，所述取向限定了垂直于重力方向的平面。當該設備在運行中時，可將該平面被置于至少基本上平行于地球表面的位置。在這些實施方式中，上述在大約垂直于重力方向上的凹部的最大寬度是指該設備頂板的底壁平面中的最大寬度。在一個實施方式中，底板的頂壁和頂板的底壁至少基本上是平坦的并限定了平行布置的平面。在該實施方式中，所述中間面是平坦的并且設置在底板的頂壁和頂板的底壁之間。因此，在該實施方式中，所述中間面同樣至少基本上是平坦的并限定了與頂板的底壁和底板的頂壁的平面平行布置的平面。如上所述，對于細胞或組織培養(yǎng)，在中間面的多個凹部中接種細胞或放置組織。如上所述的，中間面的這些凹部可被用來限定設備的培養(yǎng)腔的嵌入物。通常在通過將頂板密封至中間面上而將設備完全組裝之前，將細胞接種到這些嵌入物中或將組織放置到這些嵌入物中。例如，可通過分配(dispensing)接種細胞，這也可通過使用分配機器人或移液機器人來完成。在組織樣品被放置到凹部中的情況下，該組織樣品的規(guī)格可被選為至少基本上與其將要放入的凹部的規(guī)格匹配。
因此，培養(yǎng)細胞和/或組織的方法包括設置如上所述的底板。設置如上所述的中間面，并將該中間面安裝到上述底板的頂壁上。通過將中間面安裝到底板的頂壁上，中間面的凹部被裝配到底板的頂壁的凹部中?？商峁┘毎?組織的培養(yǎng)基，并將其置于由中間面的多個凹部中接種細胞的凹部限定的孔中?？蓪⑷我庀Ｍ募毎蚪M織類型接種/置于所述孔中。細胞例如可為細胞系的細胞或分離自周圍環(huán)境的細胞。該細胞可從生物體中得到。在某些實施方式中，所述細胞是從生物體分離而得。在某些實施方式中，所述細胞是從生物體直接分離而得，而在另外的實施方式中，將所述細胞從生物體分離后進行了培養(yǎng)生長，隨后才將它們置于本發(fā)明的設備中。在某些實施方式中，所述細胞為動物細胞， 例如哺乳動物種(包括嚙齒動物種)的細胞；兩棲動物(例如包括例如青蛙、蟾蜍、火蜥蜴 (salamanders)或蠑螈(newts)的無甲亞綱)的細胞；無脊椎動物種的細胞或植物細胞。哺乳動物的實例包括但不限于大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、松鼠、倉鼠、刺猬、鴨嘴獸、美國鼠兔、犰狳、狗、狐猴、山羊、豬、負鼠、馬、大象、蝙蝠、美洲旱獺、猩猩(orang-utan)、恒河猴、絨毛猴 (woolly monkey)、獼猴、黑猩猩、狨猴(tamarin)(絨頂檉柳猴(saguinus oedipus))、指猴 (marmoset)或人類。所述細胞例如可為組織(如器官或其部分)的細胞。各器官的實例包括但不限于腎上腺組織、骨骼、膀胱、腦、軟骨、結腸、眼、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、肌肉、神經(jīng)、 卵巢、胰腺、前列腺、皮膚、小腸、脾臟、胃、睪丸、胸腺、腫瘤、血管或子宮組織、或結締組織。 在某些實施方式中，所述細胞包括肝細胞?？杀唤臃N的細胞包括貼壁依賴性細胞和懸浮生長的細胞。在某些實施方式中，用于貼壁依賴性細胞的合適的貼壁基底沉積于培養(yǎng)腔內腔的一部分。為維持細胞與細胞培養(yǎng)基流的充分接觸，預先測試在選定的中間面凹部中可耐受多大含量的貼壁基底是有利的，所述含量的貼壁基底不會顯著地影響營養(yǎng)物質/氧氣供應或不會在超出可接受水平外影響細胞的存活力。通常，在接種細胞前首先沉積貼壁基底。 如上所述，貼壁依賴性細胞也可與配體(如半乳糖配體)一塊提供，以支持細胞附著。這些配體可被直接固定在中間面上，從而免除了任意貼壁基底的使用(參見上文中的^iang等， 2008)。在某些實施方式中，將相同類型的細胞接種到所有接種細胞的孔中。在某些實施方式中，將不同的細胞接種到不同的孔中。為避免細胞培養(yǎng)基的流失，底板的周壁中的端口可以是閉合的。可將細胞接種于或將組織放置于中間面的任意希望數(shù)目的凹部中(包括中間面的所有凹部)?？稍O置如上所述的頂板并將其安裝到中間面上。因此，如上所述的那樣，中間面可移除地設置在底板和頂板之間。如上所述的那樣，頂板可被可逆地密封至中間面。同樣地，該中間面可被可逆地密封至底板。從而可組裝成如上所述的設備。如上所述的那樣，頂板的一部分和底板頂壁的凹部限定了培養(yǎng)腔。各培養(yǎng)腔具有由凹部壁限定的周壁以及由頂板的一部分限定的可移除的頂部。底板周壁的端口可被連結至流體儲存器。所述端口也可被連結至泵(如蠕動泵)， 從而例如通過提供連續(xù)的營養(yǎng)物質流和氧氣流以維持細胞和/或組織。各個設備可進一步包含提供希望的功能(如在例如溫度、大氣成分和濕度方面維持合適的周圍環(huán)境)的裝置。因此，所述設備中可包含用于監(jiān)測如PH、溫度、氧氣水平或所選代謝物水平的相關數(shù)據(jù)的傳感器，包括納米傳感器或微傳感器。也可將該設備包含于細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，該系統(tǒng)還可包含用于機械性血液過濾(包括通過例如吸附作用、血過濾和/ 或滲濾進行的血液純化)的裝置。作為示例性的例子，該系統(tǒng)可包含用于連續(xù)血過濾的透析模塊?！┰撛O備完成組裝，介質流便可通過該設備。該介質能夠通過底板的周壁端口 (上文中)進入該設備。如上所述，該設備的底板端口可流體連結至流體源(如介質源)。 由于底板頂壁中的凹部是成行排列并通過入口和出口彼此連結，所述凹部是串聯(lián)連結的。 因此，利用本發(fā)明的設備，能夠使帶有介質的串行流從一個凹部/培養(yǎng)腔流至后續(xù)的凹部/ 培養(yǎng)腔。在η大于1(參見上文)的實施方式中，底板的頂壁中平行地布置著若干行凹部/ 培養(yǎng)腔。這種設計使介質能夠在不同行的凹部/培養(yǎng)腔的凹部/培養(yǎng)腔中并行流動。底板的頂壁中的各行凹部和各行培養(yǎng)腔具有連結至第一端口的第一個凹部及連結至第二端口的最后一個凹部(上文中)。如果允許介質進入第一端口，它將由此流過該行培養(yǎng)腔并通過第二端口流出設備。因此，對于所述η行中的各行，可允許并單獨控制穿過η行培養(yǎng)腔的介質流，所述培養(yǎng)腔由置于底板中的凹部限定。因此，在各行凹部/培養(yǎng)腔中的流速、包括流動方向可被單獨控制，并可獨立于可置于該設備中的其他行凹部/培養(yǎng)腔的流速。因此，可為本發(fā)明的設備的中間面凹部中培養(yǎng)的細胞提供連續(xù)的體外灌注。為了更容易地理解本發(fā)明并產(chǎn)生實際效果，現(xiàn)在將通過下面的非限制性實施例描述具體的實施方式?？梢岳斫?，可進行細節(jié)的改變而不脫離本發(fā)明的范圍。實施方式基于微加工的多孔Si3N4膜的三明治(Si3N4-SC)中的肝細胞形態(tài)穩(wěn)定性將原代大鼠肝細胞接種至固定化有半乳糖的PET膜上，培養(yǎng)24h后用固定化有半乳糖的多孔 Si3N4 膜覆蓋(圖 1) (Zhang, S，Xia, L 等，Biomaterials (2008) 29, 29, 3993-4002)。在整個6天的培養(yǎng)期間，與在固定化有半乳糖的基底上培養(yǎng)的細胞(圖2A-圖 2C和圖2D-圖2F)相比，在當前的三明治結構中培養(yǎng)的肝細胞維持了更為穩(wěn)定的形態(tài)(圖 2G-圖21)。穩(wěn)定的細胞形態(tài)允許對細胞功能進行更精確、更一致的分析，并允許在不同的培養(yǎng)時間點進行藥物測試。96孔生物反應器裝置的設計和制造利用SolidWork對96孔生物反應器裝置建模，該裝置具有三個部分 (compartment)用于灌注路徑連接的底部灌注生物反應器，用于細胞培養(yǎng)的篩板和用于密封整個組裝體的上部鎖定板(圖4-圖6)。在篩板和上部鎖定板之間放置有氧透過性膜，從而使足夠的氧氣能夠到達各孔中的肝細胞。底部灌注生物反應器以及篩板中的孔通過3mm 直徑的孔洞連接，該孔洞用作介質灌注通道?？赏ㄟ^蠕動泵的抽吸作用將培養(yǎng)基從介質儲存器中串行或并行地灌注到各孔中(圖3)。不同流速下生物反應器中的流型(flow profile)和氧氣譜圖為選擇用于在96孔生物反應器中運行的灌注的最佳流速，我們模擬了在0. 1、 0. 06,0. 03和0. 015ml/min的不同流速下的生物反應器中的流型(速度分布和壁剪切應力分布)(圖8和圖9)。模擬的結果顯示出在所有流速下產(chǎn)生的壁剪切應力都比臨界值 (0. 033Pa)低的多。因此，在所有4個被測流速下產(chǎn)生的壁剪切應力對細胞存活力是無害的。用于灌注培養(yǎng)的流速的優(yōu)化為進一步優(yōu)化灌注培養(yǎng)中的流速，在不同流速(0. 015,0. 03,0. 06和0. lml/min) 下進行灌注達6天，在灌注結束時研究細胞存活力。以下簡要地描述活細胞和死細胞染色的過程用PBS溶液漂洗細胞，并根據(jù)供應商提供的標準方法，用鈣黃綠素AM (Molecular Probes, USA)和PI在37°C下孵育細胞30min。然后用PBS溶液漂洗細胞并用封片劑(Dako， Denmark)封片，以用于共聚焦觀察。在6天的灌注后，除在0. lml/min的流速下灌注的細胞培養(yǎng)物外，在其它流速下灌注的細胞培養(yǎng)物仍是存活的(圖10)。96孔生物反應器中的大鼠肝細胞的細胞功能比較在0. 015ml/min、0. 03ml/min和0. 06ml/min的流速下的培養(yǎng)的肝特異性功
能，以篩選用于灌注培養(yǎng)的最佳流速。圖11顯示出在不同流速下的96孔生物反應器中培養(yǎng)的肝細胞的尿素生產(chǎn)。將靜置條件下的膠原三明治(sc-s)和靜置條件下的Si3N4-SC(Sg-S) 作為對照。該結果顯示出灌注下培養(yǎng)的肝細胞的尿素生產(chǎn)比靜置條件下培養(yǎng)的肝細胞的尿素生產(chǎn)高很多。目前的研究顯示出，經(jīng)過6天的培養(yǎng)，在0.015ml/min的流速下的灌注肝細胞培養(yǎng)中觀察到的尿素生產(chǎn)水平始終比在其它流速下的灌注肝細胞培養(yǎng)中的尿素生產(chǎn)水平尚。在優(yōu)化的灌注培養(yǎng)中的肝細胞的長期功能維持優(yōu)化實驗的結果顯示出，在6天的培養(yǎng)期中，在0. 015ml/min的流速下的灌注肝細胞培養(yǎng)中觀察到的尿素生產(chǎn)水平始終比在其它流速下的灌注肝細胞培養(yǎng)中的尿素生產(chǎn)水平高，因此，進一步的實驗都是在0. 015ml/min流速的灌注中完成。將培養(yǎng)期延長至12天， 利用靜置的膠原凝膠三明治和靜置的Si3N4-SC作為對照研究肝特異性功能(包括尿素生產(chǎn)和CYP450(I相)酶促活性)。從第2天到第6天，Si3N4-SC灌注中的原代肝細胞的尿素生產(chǎn)為 200 μ g/百萬細胞/天，在第8天和第10天尿素生產(chǎn)有所降低，但是在第12天再次恢復至 200 μ g/百萬細胞/天(圖12)。而在整個培養(yǎng)期內，靜置的膠原三明治和靜置的 Si3N4-SC中肝細胞產(chǎn)生的尿素低于50 μ g/百萬細胞/天，比在Si3N4-SC灌注中的肝細胞的尿素生產(chǎn)低很多。通過與代謝底物3-氰基-7-乙氧基香豆素(CEC) (Molecular Probes, OR, USA)進行孵育，利用CEC的去烷化生產(chǎn)高熒光的3-氰基-7-羥基香豆素(CHC)來測定 CYP450酶促活性。Si3N4-SC灌注中的肝細胞的CHC生產(chǎn)為 40 μ mol/百萬細胞，隨后降至 15 μ mol/百萬細胞，但又恢復至 40 μ mol/百萬細胞。在第8天，CHC的生產(chǎn)顯著提高，并在以后的灌注培養(yǎng)期維持在 100 μ mol/百萬細胞的水平(圖13)。而對照組的CHC 生產(chǎn)處在低于 20 μ mol/百萬細胞的水平。這顯示出肝特異性功能(尤其是CYPlAl和 CYP1A2酶促活性)在Si3N4-SC灌注中維持在較高的水平。96孔生物反應器的不同孔間培養(yǎng)的細胞均一性對在生物反應器的不同孔間培養(yǎng)的細胞均一性進行了研究。因為所述孔是串聯(lián)連接的，分析了在不同孔中培養(yǎng)的細胞在營養(yǎng)物質傳質和存活能力上是否顯示出任何梯度效應。通過向介質中灌注熒光探針研究了串聯(lián)的不同孔中的傳質效率(圖14A)。通過各細胞面積的熒光強度指示所述傳質效率。數(shù)據(jù)顯示出各孔間在傳質效率方面無顯著的差異。因此，通過灌注入培養(yǎng)物的熒光探針標記細胞的熒光強度測定的傳質效率在所有不同的孔間都是相似的。在2天的灌注培養(yǎng)后，通過對細胞進行MTS分析研究了在串聯(lián)的不同孔中培養(yǎng)的細胞的細胞存活力(圖14B)。數(shù)據(jù)顯示出各孔間在細胞存活力方面無顯著性差異。因此，不同孔中的細胞存活力是可比的。這顯示出所述生物反應器是均一的。對于如藥物測試目的的各種應用而言，細胞的均一性使得能夠對不同孔間的結果進行比較。
為檢驗串聯(lián)連接的不同孔中傳質的均一性，首先，用20μΜ的CellTracker Orange (Invitrogen)(紅色通道)對在生物反應器中培養(yǎng)的所有細胞進行標記。然后將所述細胞轉移至生物反應器中，并用含有3μ M的CellTracker Green(Invitrogen)(綠色通道)的介質進行灌注培養(yǎng)。在池后，將來自于不同孔的細胞固定，并利用Olympus FV300 共聚焦顯微鏡獲得Z-stack圖像。然后進行圖像處理以對傳質效率進行定量。為鑒定各圖中細胞占據(jù)的陽性面積，將紅色通道提取至單獨的文件夾中并利用低通濾波器去除噪音。隨后，通過閥值算法根據(jù)各圖生成掩碼(mask)。一個z-stack圖像的總面積被定義為掩碼圖像中的所有陽性面積的總和。通過在細胞中發(fā)現(xiàn)的對應于綠色通道的總強度的 CellTracker Green的量標示營養(yǎng)物質傳質。總強度被定義為原始圖像的陽性面積中的所有像素強度的總和。然后，將各孔中的傳質效率定義為(總的綠色通道強度/總的紅色通道面積)。為檢驗不同孔間的細胞存活力的均一性，將細胞在生物反應器中培養(yǎng)2天。之后， 將它們從生物反應器中移出，并轉移至標準的96孔板。利用CellTilter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, USA)，通過MTS分析測定各孔的細胞存活力。藥物誘導的肝細胞毒性測試利用在本發(fā)明的設備中培養(yǎng)的暴露于APAP的Si3N4-SCP中的原代大鼠肝細胞進行藥物誘導的肝細胞毒性測試。觀察到Si3N4-SC灌注對藥物誘導的肝細胞毒性顯示出較高的敏感性(圖15)。用對乙酰氨基酚(APAP) (Sigma)處理在Si3N4-SCP中培養(yǎng)的肝細胞，以評價它們對藥物誘導的肝細胞毒性的不同響應，并以在靜置的膠原凝膠三明治或靜置的Si3N4-SCP中培養(yǎng)的肝細胞作為對照。將Si3N4-SCP中的肝細胞和兩種靜置三明治結構中的肝細胞暴露
^lJM CellTilter 96 Aqueous One Solution Reagens (Promega, USA), fflilMTS 分析測定細胞存活力。機器人液體處理器中IC5tl值的測定利用在上述生物反應器中培養(yǎng)的人類肝癌細胞系C3A，利用機器人液體處理器測定IC5tl值(圖16)。結果顯示出Si3N4-SC灌注中應答APAP-誘導的肝細胞毒性的IC5tl值較低。更顯著地，這套結果證實了本發(fā)明的生物反應器設計適合于標準的機器人液體處理器的使用，后者常用于對具有希望的藥學活性的候選藥物進行高通量篩選。它也證實了其他細胞類型(如人類肝細胞系)可在本發(fā)明的生物反應器中進行培養(yǎng)。結果壁剪切應力圖11列表顯示了肝細胞培養(yǎng)的表面(該模型的上、下表面)上的平均壁剪切應力水平和最大壁剪切應力水平。將肝細胞培養(yǎng)允許的< 0.033Pa的值作為臨界閾值(Park，J 等，Biotechnol Bioeng (2008) 99，2，55-67)，由 lml/min 禾口 5ml/min 的流速生成的壁剪切應力水平都在可接受的范圍內。另一方面，由lOml/min的流速在細胞表面生成的最大剪切應力水平對肝細胞培養(yǎng)可能是有害的。圖7顯示出在lml/min時跨越兩個培養(yǎng)板之間的流的表面的壁剪切應力的等值線圖。當流體進入和流出流容量時在流模型的入口和出口區(qū)分別都觀察到了大約0. 0048Pa的提高的壁剪切應力。當流體在兩個板之間流動時，所述壁剪切水平降低至約0. 0016Pa。
肝細胞的存活力和功能在本研究中，通過對大鼠肝細胞進行2. 12ml/min下(相當于0. 00421 的壁剪切應力)的10天的灌注期的培養(yǎng)，評價本發(fā)明的疊板(Stack-plate)設備。已表明這個剪切應力水平遠低于不利于長期維持肝細胞培養(yǎng)的臨界閾值(上文中的Park等， 2008)?？紤]到生物反應器的串流結構和肝細胞的高氧消耗率，將所述生物反應器中的入口氧分壓保持在 466mmHg的提高的水平(上文中的Park，等，2008 ;Curcio E等， Biomaterials(2007)36，5487-5497 ；Allen, JW 等，Toxicol Sci (2005)84,1,110-119) 圖 9顯示出在Mh的預灌注靜置穩(wěn)定化后、膠原頂層覆蓋前的2D單層肝細胞的形態(tài)。圖10中顯示了經(jīng)10天灌注后的肝細胞的活細胞染色和死細胞染色。通過鈣黃綠素AM對活細胞進行染色并以明亮色調(綠色)示出，同時通過PI對死細胞的細胞核進行染色并以紅色示出靜置培養(yǎng)(A)，灌注培養(yǎng)中的底層(B)，灌注培養(yǎng)中的中間層(C)和灌注培養(yǎng)中的頂層(D)。經(jīng)10天的灌注后，生物反應器中3個不同位置的所有的肝細胞幾乎都能存活。圖14顯示出在10天的灌注后，通過MTS分析所監(jiān)測的肝細胞的線粒體脫氫酶活性(％)。利用靜置培養(yǎng)的活性對該生物反應器中的三明治灌注培養(yǎng)的活性進行標準化。 MTS分析常被用作細胞存活力的指示物。與靜態(tài)細胞的存活力(100%)相比，灌注培養(yǎng)顯示出194%的存活力。這些結果證實了，與靜置培養(yǎng)中的細胞存活力相比，如所述生物反應器的本發(fā)明的系統(tǒng)中的灌注肝細胞培養(yǎng)可維持高的細胞存活力。圖15顯示出經(jīng)10天的灌注后，在生物反應器中的各三明治培養(yǎng)的脫氫酶活性。由此可看出，各灌注培養(yǎng)板具有比在靜置培養(yǎng)中觀察到的更高的存活力。在目前的研究中，用尿素的合成作為灌注培養(yǎng)中的肝細胞的代表性的區(qū)別功能。 圖16比較了灌注培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)的每日尿素合成速度。已經(jīng)表明灌注培養(yǎng)的標準化的尿素合成速度始終比靜置培養(yǎng)的尿素合成速度高。在灌注培養(yǎng)的前兩天，觀察到尿素合成從 73 μ g/X106細胞/天到31 μ g/X106細胞/天的顯著降低，隨后從第二天到第四天緩慢降低，最終從第五天到第十天穩(wěn)定在10-20 μ g/X IO6細胞/天。對于靜置培養(yǎng)，在第五天后， 尿素合成速度低于5 μ g/X IO6細胞/天。結論公開了一種將表面改性的微加工三明治培養(yǎng)技術與新型的96孔灌注裝置整合到一起的獨特的灌注生物反應器系統(tǒng)，該系統(tǒng)非常適合于在藥物測試應用中使用。上述數(shù)據(jù)證實了所述三明治灌注系統(tǒng)為原代肝細胞或其他上皮細胞的培養(yǎng)提供了類似于體內的環(huán)境，以增強并長期維持所述細胞的功能和存活力。本領域技術人員很容易理解，本發(fā)明非常適于實現(xiàn)其目的并得到上述結果和優(yōu)點及其固有的結果和優(yōu)點。此外，對本領域技術人員來說顯而易見的是，可對本文公開的發(fā)明進行各種取代和改變而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。本文所述的組合物、方法、程序、處理、 分子和特定的化合物是目前優(yōu)選的實施方式的代表，均為示例性的，并不旨在用于限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員能夠想到其變化和其它用途，這些變化和用途包含在權利要求書的范圍所限定的本發(fā)明的精神內。在本申請文件中所列舉或討論的先前公開的文件無需被認為是承認該文件是本領域現(xiàn)有技術的一部分或是公知常識。本文所述的發(fā)明可適宜地在缺少本文未特別公開的任意單個要素或多個要素、單個限制因素或多個限制因素時加以實施。因此，例如，術語“包含/包括/含有”(comprising/including/containing)等應該開放地及非限制性地理解。此外，本文使用的術語和表述被用作描述性的術語，而非限制性的術語，所述術語和表述的使用并不旨在排除這些術語和表述顯示或記載的特征的任何等同特征或其一部分，但是應該認識到， 在本發(fā)明請求保護的范圍內的任何修改都是可以的。因此，應當明白，盡管已通過優(yōu)選的實施方式和可選的特征具體公開了本發(fā)明，本領域技術人員仍可以采用此處所公開的其所包含的本發(fā)明的修改和變化，并且這些修改和變化被視為落入本發(fā)明的范圍內。本文已經(jīng)對本發(fā)明進行了寬泛和一般性的描述。落入該一般性公開內容的每種范圍較窄的形式和下位群組也構成本發(fā)明的一部分。這包括了利用但書和否定式限定從大類中排除了任何主題的本發(fā)明的上位說明，無論本文中是否對所排除的材料進行了具體敘述。其它實施方式也落入下述權利要求和非限制性實施例內。此外，一旦本發(fā)明的特征和方面是以馬庫什組的方式進行描述，本領域技術人員將認識到，本發(fā)明也因此將以馬庫什組中任意的單個成員或成員亞組的方式進行描述。
權利要求
1.用于細胞或組織培養(yǎng)的設備，所述設備包含底板(1)、中間面( 和頂板(3)， 所述中間面( 可移除地設置在所述底板(1)和所述頂板( 之間，其中所述底板(1)具有周壁(13)、底面(14)和頂壁(16)，其中所述底板(1)的頂壁(16)包含多個凹部(12)，所述凹部(12)排列為η行，其中η 為從1到約25的整數(shù)，其中各行凹部(1 的范圍為從第一個凹部到最后一個凹部，所述各凹部具有凹部周壁(15)，其中所述各凹部(1 的凹部周壁(1 具有一個凹部入口和一個凹部出口 (40,41),其中所述底板⑴的周壁(1 包含數(shù)目為2η的端口(11)，所述各端口(11)連結至所述η行中的單行凹部(12)，其中各行凹部的凹部(12) :(i)相互之間通過所述凹部入口和所述凹部出口(40，41)流體連通；(ii)與所述2η個端口的第一端口和第二端口(11)流體連通，由此，各行凹部的所述第一個凹部連結至所述第一端口，各行凹部的所述最后一個凹部連結至所述第二端口，其中所述中間面⑵含有多個凹部(21)，所述凹部排列為m行，所述凹部被裝配到所述底板(13)的頂壁(16)的多個凹部(12)中，其中m為從1到約25的整數(shù)，且m等于或小于n，并且其中所述中間面O)的凹部具有透水性，其中所述頂板( 被可逆地密封至所述中間面O)，并且所述中間面( 被可逆地密封至所述底板(1)，由此，所述底板(1)的頂壁(16)的凹部(1 限定了培養(yǎng)腔，各培養(yǎng)腔具有由所述凹部壁(15)限定的周壁和由所述頂板(3)的一部分限定的可移除的頂部。
2.如權利要求1所述的設備，其中，所述頂板(3)是至少基本上不透水的材料， 由此，由所述底板(1)的頂壁(16)的凹部(12)限定的培養(yǎng)腔僅通過所述底板(1)的頂壁(16)中的所述凹部入口和所述凹部出口(40，41)與周圍環(huán)境流體連通。
3.如權利要求1或2所述的設備，其中，通過所述中間面O)的凹部中分別包含的孔隙提供所述中間面O)的凹部的透水性。
4.如權利要求1-3任一項所述的設備，其中，所述中間面的凹部為透氣性材料。
5.如權利要求1-4任一項所述的設備，其中，所述中間面(2)的m行凹部中的至少一行的凹部(12)數(shù)目與所述底板的頂壁的η行凹部中的至少一行的凹部數(shù)目相等，由此，由所述底板(1)的頂壁(16)的凹部(1 限定的各培養(yǎng)腔含有被裝配到所述培養(yǎng)腔中的所述中間面的凹部01)。
6.如權利要求1-5任一項所述的設備，其中，所述中間面的一個或多個凹部具有與所述底板的頂壁的凹部(1 的內部形狀和內部規(guī)格相對應的外部形狀和外部規(guī)格，所述中間面的凹部被裝配到所述底板的頂壁的凹部(12)中。
7.如權利要求1-6任一項所述的設備，其中，所述中間面( 具有與所述底板的頂壁的形狀和規(guī)格匹配的形狀和規(guī)格。
8.如權利要求1-7任一項所述的設備，其中，所述中間面具有以如下方式與所述底板的頂壁的形狀和規(guī)格匹配的形狀和規(guī)格所述中間面的至少一行的凹部裝配到所述底板的頂壁的具有相等數(shù)目的凹部的至少一行的凹部中。
9.如權利要求1-8任一項所述的設備，其中，所述頂板C3)具有一個或多個凹部(31)，所述頂板(3)的凹部(31)被置于所述中間面O)的凹部的位置，由此，所述底板(1) 的頂壁(16)的凹部(12)限定的一個或多個培養(yǎng)腔具有由所述凹部壁(15)限定的周壁和由所述頂板(3)的一部分限定的可移除的頂部，所述頂板(3)的一部分包含所述頂板的凹部(31)。
10.如權利要求1-9任一項所述的設備，其中，所述頂板C3)具有與所述中間面的形狀和規(guī)格匹配的形狀和規(guī)格。
11.如權利要求1-10任一項所述的設備，其中，所述底板(1)的頂壁(16)的各行凹部 (12)具有獨立選擇的數(shù)目為ο的凹部，其中ο為從1到約100的整數(shù)。
12.如權利要求1-11任一項所述的設備，其中，所述底板(1)的頂壁(16)中的所有行凹部(12)的整數(shù)ο是相等的。
13.如權利要求1-12任一項所述的設備，其中，所述中間面O)中的各行凹部具有獨立選擇的數(shù)目為P的凹部，其中P為從1到約100的整數(shù)。
14.如權利要求1-13任一項所述的設備，其中，所述中間面O)中的各行凹部的凹部數(shù)目P與所述底板(1)的頂壁(16)中的凹部數(shù)目ο相等，所述中間面O)的凹部行被裝配到所述底板(1)的頂壁(16)的凹部中。
15.如權利要求1-14任一項所述的設備，其中，所述中間面O)中的所有行凹部的數(shù)目P是相等的。
16.培養(yǎng)細胞的方法，所述方法包括下列步驟(a)設置底板(1)，其中所述底板(1)具有周壁(13)、底面(14)和頂壁(16)，其中所述底板(1)的頂壁(16)包含多個凹部(12)，所述凹部(12)排列為η行，其中η 為從1到約25的整數(shù)，其中所述各行凹部(1 的范圍為從第一個凹部到最后一個凹部，所述各凹部具有凹部周壁(15)，其中所述各凹部(1 的凹部周壁(1 具有一個凹部入口和一個凹部出口 (40,41),其中所述底板⑴的周壁(1 包含數(shù)目為2η的端口(11)，所述各端口(11)連結至所述η行中的單行凹部(12)，其中各行凹部的凹部(12) :(i)相互之間通過所述凹部入口和所述凹部出口(40，41)流體連通；(ii)與所述2η個端口的第一端口和第二端口(11)流體連通，由此，各行凹部的所述第一個凹部連結至所述第一端口，各行凹部的所述最后一個凹部連結至所述第二端口；(b)設置中間面(2)，其中所述中間面(2)含有多個凹部(21)，所述凹部排列為m行，所述凹部能裝配到所述底板(13)的頂壁(16)的多個凹部(12)中，其中m為從1到約25的整數(shù)，且m 等于或小于n，其中所述中間面O)的凹部具有透水性；(c)將所述中間面(2)安裝到所述底板⑴的頂壁(16)上，由此，所述中間面(2)的凹部裝配到所述底板(13)的所述頂壁(16)的凹部(12)中；(d)將細胞接種至所述中間面O)的多個凹部中；(e)設置頂板(3)；(f)將所述頂板C3)安裝到所述中間面( 上，由此，所述中間面( 可移除地設置在所述底板(1)和所述頂板( 之間；以及(g)將所述頂板( 可逆地密封至所述中間面O)，并將所述中間面( 可逆地密封至所述底板(1)，由此，所述底板(1)的頂壁(16)的凹部(1 限定了培養(yǎng)腔，各培養(yǎng)腔含有由凹部壁 (15)限定的周壁和由所述頂板(3)的一部分限定的可移除的頂部。
17.如權利要求16所述的方法，該方法進一步包括以下步驟使介質流能夠穿過由置于所述底板(1)中的凹部(1 限定的η行培養(yǎng)腔，其中，所述介質能夠進入連結至各行培養(yǎng)腔的所述第一端口，并能夠流出連結至各行培養(yǎng)腔的所述第二端口。
18.如權利要求16或17所述的方法，其中，所述細胞包含肝細胞和皮膚細胞中的一種。
全文摘要
一種用于細胞或組織培養(yǎng)的設備，包含底板(1)、中間面(2)和頂板(3)。所述中間面(2)可移除地設置在底板(1)和頂板(3)之間。所述底板(1)具有周壁(13)、底面(14)和頂壁(16)。所述底板(1)的頂壁(16)包含多個凹部(12)，所述凹部(12)排列為n行，其中n為從1到約25的整數(shù)。各行凹部(12)的范圍為從第一個凹部到最后一個凹部。各凹部具有凹部周壁(15)，該凹部周壁(15)具有一個凹部入口和一個凹部出口(40，41)。所述周壁(13)包含數(shù)目為2n的端口(11)。每個端口(11)連結至單行凹部(12)上。各行凹部的凹部(12)(i)相互之間通過所述凹部入口和所述凹部出口(40，41)流體連通；(ii)與2n個端口的第一端口和第二端口(11)流體連通，由此，各行凹部的第一個凹部連結至所述第一端口，各行凹部的最后一個凹部連結至所述第二端口。所述中間面(2)含有多個凹部(21)，所述凹部(21)排列為m行，這些凹部被裝配到所述底板(13)的頂壁(16)的多個凹部(12)中。m為從1到約25的整數(shù)，且m等于或小于n。所述中間面(2)的凹部(21)具有透水性。將所述頂板(3)可逆地密封至中間面(2)，并將中間面(2)可逆地密封至底板(1)。由此，所述底板(1)的頂壁(16)的凹部(12)限定了培養(yǎng)腔。每個培養(yǎng)腔具有由凹部壁(15)限定的周壁和由頂板(3)的一部分限定的可移除的頂部。
文檔編號C12M1/00GK102449135SQ201080023013
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權日2009年3月26日
發(fā)明者梁華亮, 章淑芳, 郁昂里 申請人:新加坡科技研究局