專利名稱：乳腺癌易患基因gt198和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)方面通常涉及分子生物學(xué)、基因診斷學(xué)和基因治療的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥是影響大部分人口的常見(jiàn)致命疾病。(美國(guó))國(guó)立癌癥研究院估算在美國(guó)每年校正年齡的癌癥死亡率是每100，000個(gè)男性和女性中的192. 7人。在2003年1月份，大約1050萬(wàn)美國(guó)人患過(guò)癌癥。乳腺癌是女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，并且特別是在美國(guó)是45歲以上女性中死亡率的主因。每年確診185，000例以上新病例，并且超過(guò)40，000名女性死于該疾病。然而，只有非常小百分比的乳腺癌和卵巢癌歸因于癌癥易患基因BRCAl和BRCA2中突變的遺傳。大多數(shù)乳腺癌和卵巢癌都需要用于診斷和治療的另外的乳腺癌基因知識(shí)。癌癥是一組疾病，其特征在于異常細(xì)胞的不受抑制的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。如果擴(kuò)散不受抑制，它可以引起死亡。癌癥是由外因(煙草、化學(xué)制品、輻射和傳染性生物體)和內(nèi)因(遺傳突變、激素、免疫狀況和由于新陳代謝所引起的突變)引起的。已經(jīng)深入研究了參與癌癥發(fā)展的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，但是仍舊需要用于檢測(cè)癌癥的治療的方法。BRCAl和BRCA2基因中種系突變解釋了家族乳腺癌和卵巢癌中增加易患性的原因(Nathanson, K. L.，et al.，Nat Med, 7 552-6 (2001)) BRCAl 編碼帶有 N-末端環(huán)形結(jié)構(gòu)域和C-末端BRCT結(jié)構(gòu)域的1863個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該N-末端環(huán)形結(jié)構(gòu)域有利于遍在蛋白化作用，該C-末端BRCT結(jié)構(gòu)域刺激轉(zhuǎn)錄激活(Welcsh，P. L.，et al.，TrendsGenet，16 69-74 (2000))。一旦電離輻射時(shí)，該BRCT結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)RNA聚合酶II的切割(Bennett, C. B. et al.，PLoS ONE, 3 :el448 (2008)) BRCAl 的大外顯子 11 所編碼的序列結(jié)合Rad51，Rad51是對(duì)同源重組和DNA損傷應(yīng)答至關(guān)重要的蛋白質(zhì)(Chen，J. J.，et al.，Cancer Res，59 :1752s_1756s (1999))。BRCAl 的可變剪接變異體，諸如 BRCAl Δ lib 和BRCA1-IRIS(Wilson, C. A. et al.，Oncogene,14 :1-16(1997) ；ElShamy, W. Μ. &Livingston,D. Μ. , Nat Cell Biol, 6 :954-67(2004))已經(jīng)被鑒定具有對(duì)BRCAl功能有潛在影響作用。BRCA2編碼3418個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，并且具有與BRCAl非常相似的組織表達(dá)模式(Chodosh，L. A.，J Mammary Gland Biol Neoplasia, 3 :389-402 (1998))。它的大外顯子11編碼8個(gè)序列重復(fù)，命名為BRC重復(fù)，其中6個(gè)與Rad51相互作用(Bork，P.，Blomberg, N.&Nilges， Μ. ， Nat Genet, 13 :22-3(1996) ；Bignell, G. ， et al. ， Hum MolGenet，6 :53-8(1997) ；Davies, A. A. et al.，Mol Cell, 7 :273-82 (2001))。晶體結(jié)構(gòu)分析證明BRC重復(fù)模擬Rad51寡聚界面之間的分子構(gòu)象(Pellegrini, L. et al.，Nature,420 287-93 (2002))，并且證明BRCA2與Rad51的結(jié)合對(duì)兩者的功能是必需的(Gudmundsdottir，K. Mshworth, Α.，Oncogene, 25 :5864-74 (2006)) BRCA2 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也經(jīng)歷復(fù)雜的可變剪接，并且由于其比較大的基因尺寸，它的剪接產(chǎn)物完全不能被確定(Speevak，Μ. D.，et al., Eur J Hum Genet,11 :951-4(2003) ；Bieche, I. &Lidereau, R. , Cancer Res,59 2546-50(1999))。BRCA1和BRCA2之間親密的功能關(guān)系表明了乳腺癌和卵巢癌中DNA修復(fù)路徑的參與。然而，明顯地與激素調(diào)節(jié)相關(guān)的乳腺癌和卵巢癌的特定風(fēng)險(xiǎn)還沒(méi)有被充分地解釋。此外，在染色體17q21基因座的早期連鎖分析已經(jīng)提供了乳腺癌和卵巢癌易感性的實(shí)質(zhì)性證據(jù)，該乳腺癌和卵巢癌易感性以孟德?tīng)柗绞皆诰哂性缙诎l(fā)病癌癥的家族中遺傳(Hall, J. Μ. et al.，Science, 250 :1684-9(1990) ；Hall, J. Μ.，et al.，Am J Hum Genet,50 :1235-42(1992) ；Narod, S. Α.，et al.，Lancet, 338 :82-3 (1991))。然而，BRCAl 突變僅僅解釋一部分具有 17q21 關(guān)聯(lián)的家族(Nathanson，K. L.，et al.，Nat Med, 7 :552-6(2001)；Miki, Y. , et al.，Science，266，66-71 (1994))。這種矛盾現(xiàn)象引起了對(duì) BRCAl 基因座內(nèi)另外候選基因存在的思考(Vogelstein, B. Minzler，K. W.，Cell,79 :1-3(1994))。在1995年，在17q21的BRCAl附近尋找新基因的作圖期間，GT198 (基因組轉(zhuǎn)錄物■，基因符號(hào) PSMC3IP，也稱為 TBPIP 或 Hop2)被鑒定為一個(gè) cDNA 克隆(Rommens，J. Μ.，et al.，Genomics, 28 :530-42 (199 )。GT198后來(lái)被鑒定為核受體激活因子，其與核受體相互作用，并且參與雌激素、雄激素和孕激素受體介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)(Ko，L.，et al. , Mol CellBiol, 22，357-69 (2002) ；Satoh，T.，et al. ,Endocrinology, 150 :3283-90 (2009)) 后來(lái)也發(fā)現(xiàn) GT198 與酵母 Hop2 是同源的(Petukhova，G. V.，et al. ,Dev Cell, 5 :927-36 (2003)),與Rad51相互作用，并且刺激同源重組中DNA鏈交換與參與DNA修復(fù)路徑(Enomoto，R.，et al.，J Biol Chem, 281 :5575-81 (2006) ；Pezza, R. J.，et al.，Genes Dev, 21 1758-66(2007) ；Enomoto, R.，et al.，J Biol Chem, 279 :35263-72(2004))。用現(xiàn)有的BRCAl和BRCA2基因來(lái)檢測(cè)乳腺癌和卵巢癌以及治療癌癥通常是不夠的，因?yàn)檫@些基因突變不發(fā)生在大量的偶發(fā)的癌癥。因此，本發(fā)明通過(guò)確認(rèn)GT198基因突變存在于偶發(fā)的癌癥中來(lái)提供了用于癌癥，例如乳腺癌和卵巢癌，的早期檢測(cè)或診斷的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了用于與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀治療的方法。另一個(gè)目的是提供用于篩選藥物諸如化合物和小生物分子，和抗體的方法，該化合物和小生物分子可抑制或減緩由于一個(gè)或多個(gè)GT198基因突變而引起癌細(xì)胞的病理發(fā)展。另一個(gè)實(shí)施方式是提供了用GT198作為癌癥檢測(cè)和診斷的生物標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
GT198和其可變剪接變異體是有用的生物標(biāo)記，優(yōu)選地用于卵巢癌和乳腺癌的檢測(cè)和診斷。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)17q21上的GT198基因在其調(diào)節(jié)和功能方面與BRCAl具有驚人的相似性。一種實(shí)施方法是通過(guò)確定獲自受試者的生物樣品中GT198基因的一個(gè)或多個(gè)突變、改變或重排的存在，來(lái)檢測(cè)或幫助癌癥的診斷。在一些實(shí)施方法中，通過(guò)用探針接觸樣品完成確定步驟，該探針對(duì)GT198基因的一個(gè)或多個(gè)突變、改變或重排或者GT198基因產(chǎn)物有特異性，以在探針和GT198基因或基因產(chǎn)物之間形成可檢測(cè)的復(fù)合物。生物樣品中有可檢測(cè)的復(fù)合物的存在表示癌癥。GT198中優(yōu)選的突變包括，但是不限于GT198外顯子4中取代，在外顯子4的核苷酸85的突變，在GT198內(nèi)含子4的核苷酸88的突變，或者在GT198的5’非翻譯區(qū)的核苷酸31的突變。首選的GT198剪接變異體包括，但不限于GT198a、GT198-l、GT198-2、GT198-3、GT198-4 和 GT198a_4。另一個(gè)實(shí)施方式是提供了用于檢測(cè)由于GT198中基因突變和拷貝數(shù)缺失或含有GT198蛋白質(zhì)剪接變異體蛋白增加的的細(xì)胞所引起的癌癥的方法。使用PCR、構(gòu)象敏感的凝膠電泳和直接測(cè)序方法可以檢測(cè)GT198突變。通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR、Southern印跡法和基因組步移、原位熒光雜交方法可以檢測(cè)拷貝數(shù)改變。用于檢測(cè)癌癥組織中GT198變異體蛋白質(zhì)表達(dá)的示例性方法包括，但不限于免疫組織化學(xué)分析。檢測(cè)出由一個(gè)或多個(gè)GT198突變而造成的GT198變異體表達(dá)的增加表示癌癥的發(fā)生。用于診斷或幫助癌癥診斷的另一種方法包括通過(guò)用探針接觸樣品，確定獲自受試者的樣品中GT198的胞漿表達(dá)水平，該探針對(duì)GT198特異并在探針和GT198基因或基因產(chǎn)物之間形成可檢測(cè)的復(fù)合物，其中相對(duì)于對(duì)照組升高的GT198胞漿表達(dá)水平表示癌癥的發(fā)生。還有另一個(gè)實(shí)施方法是使用生物分子治療癌癥的方法，該生物分子抑制、減少、阻斷或防止GT198和GT198變異體蛋白質(zhì)起作用?；蛘撸@些化合物可以減少或抑制GT198或其變異體的生物可利用性。用化合物拮抗或干擾具有GT198變異體蛋白質(zhì)異位胞漿表達(dá)的細(xì)胞中GT198和/或其可變剪接變異體，包括GT198a的生物活性，是首選方法。另一個(gè)實(shí)施方法是篩選合成或天然的化合物的方法，該合成或天然的化合物抑制GT198或其可變剪接變異體的活性。該方法包括篩選抗體或小核酸分子，就像siRNA、微小RNA(miRNA)、適體和肽核酸以抑制GT198或可變剪接變異體的活性。也可以制造試劑盒。范例的試劑盒包括裝有核酸探針的容器，該核酸探針具有在嚴(yán)格條件下與編碼GT198變異體蛋白質(zhì)的核酸雜交，而在嚴(yán)格條件下不與編碼野生型GT198蛋白質(zhì)的核酸雜交并至少含10個(gè)核苷酸。


圖1&是81^^1、變異體81^^1八1113、81^^2、61198和變異體611983結(jié)構(gòu)的圖示，其中含有BRC重復(fù)的序列表示為黑盒。GT198 N末端和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域表示為明盒。圖Ib是使用ClustalW 2. 0. 8軟件得到的蛋白質(zhì)同源性分析，BRCA2和GT198 C-末端結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO. 3)中 BRC3(SEQ ID NO. 1)禾口 BRC4 SEQ ID NO. 2)的序列對(duì)齊。與 BRCA2 的 BRC重復(fù)具有同源性的堿基被框出。相同的堿基用箭頭表示，剩余的陰影的殘基是保守的。數(shù)字表示氨基酸。圖Ic是表示GT198或BRCAl或BRCA2的剪接變異體對(duì)它們野生型起顯性失活作用的圖示。在Rad51 (圓形)相互作用中，GT198潛在地與BRCA2競(jìng)爭(zhēng)。圖加是通過(guò)5’互補(bǔ)DNA末端的快速擴(kuò)增(5’ RACE)和測(cè)序(沒(méi)有繪制)所鑒定的人GT198剪接變異體的圖示。哺乳動(dòng)物包括人GT198具有8個(gè)外顯子。內(nèi)含子表示為線條，外顯子表示為條形，蛋白質(zhì)編碼區(qū)表示為粗條形。示出了推知的翻譯起始和終止密碼子。頂部示出了引物位置。圖2b-e是用500nM視黃酸(RA)誘導(dǎo)4天以形胚胎體(EB2-EB4)和未分化P19干細(xì)胞(EC)中相對(duì)的mRNA水平的條形圖。使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得野生型 BRCAl (圖 2b)、BRCAl Δ 1 Ib (圖 2c)、野生型 GT198 (圖 2d)或 GT198a(圖 2e)的相對(duì)的mRNA水平。結(jié)果用相對(duì)的mRNA水平的平均數(shù)士 s. e. m來(lái)表示，顯示野生型與其剪接變異體呈現(xiàn)拮抗的表達(dá)。圖3a是用所表示的MMTV-熒光素酶報(bào)道基因(IOOng)和結(jié)合MMTV啟動(dòng)子的糖皮質(zhì)激素受體(IOng) —起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的P19細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性的條形圖。在配體地塞米松(IOOnM)存在(實(shí)心條形)或不存在(清晰的條形)的情況下，誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)夜，并且通過(guò)Dynex發(fā)光計(jì)測(cè)量熒光素酶活性。圖北是除了使用遞增量的質(zhì)粒_0. Ong(清晰的條形)、50ng(陰影條形)、100ng(影線條形)和200ng (實(shí)心條形)，如圖3a中所轉(zhuǎn)染和用地塞米松(IOOnM)誘導(dǎo)的P19細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性的條形圖。所示熒光素酶活性是三次重復(fù)轉(zhuǎn)染的平均值士 s. e. m(n = 3)。圖如是人GT198基因的示圖。內(nèi)含子表示為線條，外顯子表示為盒子，Alu和L2重復(fù)序列表示為空的定向三角形，示出了翻譯起始和終止密碼子。填充的箭頭表示突變，空的箭頭表示單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的位置。圖4b是概述發(fā)病年齡、所鑒定的等位基因突變和SNPs(rs2292751，rs2292752)的表。圖如是具有乳腺癌的病例1、病例3和病例9(填充的圓形和方形)，其它類型癌癥(陰影圓形和方形)或健康人(清晰的圓形和方形)的家族系譜。圓形表示女性，方形表示男性。里面的數(shù)字表示另外的健康同胞兄妹。斜線符號(hào)表示已故的個(gè)體。癌癥類型、發(fā)病年齡和死亡年齡(d)如所得到的一樣被表示(BC，乳腺癌；CRC，結(jié)直腸癌；ST，胃癌；SK，皮膚癌；Li，肝癌；ES，食道癌；PC，前列腺癌；LC，肺癌)。
具體實(shí)施例方式I.診斷癌癥的診斷學(xué)和方法GT198和其可變剪接變異體的變化可作為有用的癌癥生物標(biāo)記，優(yōu)選地用于卵巢癌和乳腺癌的檢測(cè)和診斷。GT198和其變異體的生物活性或生物可利用性的拮抗劑可以用于治療一種或多種癌癥的病癥。在實(shí)施方法中，GT198的胞漿表達(dá)指示癌癥發(fā)生。在另一種實(shí)施方法中，GT198剪接變異體的表達(dá)增高指示癌癥發(fā)生。優(yōu)選的GT198變異體包括，但不限于 GT198a、GT198-l、GT198-2、GT198-3、GT198-4 和 GT198a_4。通過(guò)篩選抑制 GT198 或其變異體的生物活性可以鑒定用于治療癌癥的藥物。A. GT198當(dāng)檢索BRCAl基因座的另外乳腺癌基因時(shí)，GT198最初被鑒定為轉(zhuǎn)錄物(Rommens，J. Μ.，et al.，Genomics，28 :530-42 (1995))。GT198 基因位于BRCAl 下游和近端的 470Kb，及HSD17B1遠(yuǎn)端的15Kb，在BRCAl定位克隆之前，HSD17B1是早期連鎖分析期間所鑒定的最緊密連鎖的標(biāo)記之一(Anderson, L. A.，et al.，Genomics, 17 :618-23(1993) ；Black, D. Μ. , etal. ,Am J Hum Genet，52 :702-10 (1993))。人類GT198 基因位于染色體 17q21 上HSD17B1 和BRCAl基因之間。處于HSD17B1遠(yuǎn)端的15Kb和BRCAl近端的470Kb。哺乳動(dòng)物及人GT198跨越5Kb，并且編碼包含N-末端功能區(qū)和C-末端DNA結(jié)合功能區(qū)(DBD)的217個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(Enomoto, R.，et al.，J Biol Chem, 279 :35263-72 (2004))，該 N-末端功能區(qū)和C-末端DNA結(jié)合功能區(qū)(DBD)被亮氨酸拉鏈所連鎖。GT198蛋白質(zhì)二聚體依靠其亮氨酸拉鏈所形成(Ko，L.，et al. , Mol Cell Biol, 22，357-69 (2002))。GT198的一級(jí)序列與BRCA2中BRC重復(fù)共同分享同源性，這為它與Rad51相互作用提供了有力的證據(jù)。GT198蛋白質(zhì)的體內(nèi)內(nèi)源表達(dá)與BRCAl和BRCA2的內(nèi)源表達(dá)極為相似，這表明它們通過(guò)相同的功能路徑起作用。GT198具有雙轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，該特征也存在于BRCAl中，允許野生型和它的剪接變異體轉(zhuǎn)錄物使用不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行差異化表達(dá)。GT198剪接變異體編碼包含與BRC重復(fù)同源性的C-末端DNA結(jié)合功能區(qū)蛋白質(zhì)序列，卻不含N-末端功能區(qū)，從而抑制野生型GT198活性。在GT198和BRCAl中，正常的干細(xì)胞分化伴隨有減少的剪接變異體和增加的野生型表達(dá)。而且，當(dāng)用免疫組織化學(xué)分析幾百個(gè)病例時(shí)，GT198變異體的異位表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，阻斷Rad51聚集灶形成，并且在初期乳腺癌，卵巢癌，子宮癌組織的細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)該GT198變異體的異位表達(dá)。與上述一致的是，已知BRCAl 的變異體 BRCAl Δ lib 在乳腺癌的胞質(zhì)中表達(dá)(Wilson, C. Α.，et al.，Oncogene, 14，1-16(1997))。而且，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了早期發(fā)病家族乳腺癌患者中GT198的種系突變。在33歲年齡發(fā)病的人中有一人具有產(chǎn)生提前終止密碼子的突變，該提前終止密碼子將阻止全長(zhǎng)野生型GT198的表達(dá)，但是允許GT198剪接變異體的表達(dá)。在40歲年齡具有乳腺癌發(fā)病的她的姐妹也帶有同樣的突變。這一起表明GT198活性通過(guò)其可變剪接變異體可被調(diào)節(jié)。GT198基因突變?cè)斐杉艚幼儺愺w活性的增加可以誘導(dǎo)癌癥起始。GT198是新的乳腺癌和卵巢癌易患基因，有助于對(duì)17q21相關(guān)的癌癥易患性病例的詮釋。GT198是小蛋白質(zhì)，并能夠形成同源和異源二聚體，并且與包含核受體的鋅指結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白及Rad51相互作用。GT198在轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)方面的雙重功能與BRCAl和BRCA2在轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)方面的雙重功能相同。因?yàn)锽RCAl包含直接地修飾轉(zhuǎn)錄中RNA聚合酶 II 的 C-末端結(jié)構(gòu)域(Bennett, C. B. et al.，PLoS ONE，3 :el448 Q008))，并且已經(jīng)顯示了作為核受體輔激活蛋白的功能，所以當(dāng)BRCAl和GT198同時(shí)工作時(shí)，BRCAl可以介導(dǎo)GT198的轉(zhuǎn)錄活性。相反，乳腺癌和卵巢癌中BRCAl的激素誘導(dǎo)活性也可能通過(guò)核受體相關(guān)的GT198起作用。BRCAl和GT198作為配偶體是一個(gè)正確的模型并將能解釋它們?cè)诮M織中的共表達(dá)，它們?cè)诟杉?xì)胞分化中的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)路徑中的共同參與，以及它們?cè)谌橄侔┖吐殉舶┲械南嗨聘淖儭Ｒ郧暗淖C據(jù)已經(jīng)支持在乳腺癌和卵巢癌的起始中類固醇激素調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)活性是等同參與的。可變剪接調(diào)控控制機(jī)制是pre-mRNA轉(zhuǎn)錄中的不可缺少的組成步驟，并且人類基因組中90%以上的多外顯子基因是可變剪接的(Pan，Q.，et al. , Nat Genet,40 1413-5 (2008) )0在正常發(fā)育和細(xì)胞分化中，剪接變異體影響野生型活性。在各種疾病或癌癥中經(jīng)常地發(fā)現(xiàn)剪接變異體缺陷或增加(Kalnina，Ζ.，Genes Chromosomes Cancer, 42 342-57(2005) ；Venables, J. P. , Bioessays, 28 :378-86 Q006))。BRCAl 和 BRCA2 的突變篩選表明幾千種變化(Meindl，A.，Int J Cancer, 97 :472-8(^2002))，其中的許多可以改變可變剪接變異體(Brose,M. S.，et al.，Genet Test, 8 :133-8 (2004))。在 BRCAl 的遠(yuǎn)處增強(qiáng)子或啟動(dòng)子區(qū)域的等位基因序列缺失和重排也可以影響它的可變剪接調(diào)節(jié)(0rban，T. I.&Olah，Ε. , Mol Pathol, 56 :191-7 (2003)) 0 GT198的多個(gè)剪接變異體產(chǎn)生相同功能的結(jié)果。如果這種現(xiàn)象也存在于BRCAl中，那么野生型BRCAl活性可以受各種其剪接變異體控制。野生型和變異體轉(zhuǎn)錄物的差異化表達(dá)可以通過(guò)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)完成，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在早期干細(xì)胞分化期間交替使用，并且相似地存在于GT198和BRCAl中。在干細(xì)胞分化期間也發(fā)現(xiàn)了野生型BRCA2的增加的表達(dá)，盡管BRCA2變異體被表征不易檢測(cè)。通常，剪接變異體到野生型的轉(zhuǎn)換存在于以前發(fā)表報(bào)道的癌基因CoAA中，表明在干細(xì)胞分化中可變剪接調(diào)控的關(guān)鍵作用(Brooks, Y. S.，et al.，J Biol Chem, 284 :18033-46(2009) ；Yang, Ζ.，etal.，Nucleic Acids Res, 35 1919-1932 (2007))。因?yàn)榧艚幼儺愺w是競(jìng)爭(zhēng)地表達(dá)，并且常常功能上與野生型對(duì)抗，變異體的下調(diào)允許野生型的上調(diào)。相反，由大范圍突變所引起的變異體異常上調(diào)可以表型地等同其野生型缺陷，即“癌癥抑制基因的缺失”。當(dāng)需要GT198或BRCAl時(shí)，這將阻止正常細(xì)胞分化。 來(lái)自于遺傳連鎖研究的早期證據(jù)證明了家族乳腺癌與BRCAl和HSD17B1標(biāo)記的緊密關(guān)聯(lián)(Hall, J. Μ.，et al.，Science, 250 :1684-9(1990) ；Hall, J. Μ.，et al.，Am J HumGenet,50 :1235-42(1992) ；Anderson, L. Α.，et al.，Genomics,17 :618-23(1993) ；Black,D. Μ.，et al.，Am J Hum Genet, 52 :702-10(1993) ；Easton, D. F.，Bishop, D. Τ.，et al.，Am J Hum Genet 52 :678-701 (199 )，后者編碼17 β -羥留類脫氫酶。因?yàn)樵谶B鎖家族中HSD17B1 基因內(nèi)沒(méi)有鑒定出突變(Simard, J.，et al.，Hum Mol Genet, 2 1193-9 (1993)),后來(lái)的努力聚焦在BRCAl標(biāo)記上。BRCAl的克隆基于家族與D17S1321和D17S1325區(qū)域的連鎖，該區(qū)域側(cè)翼于BRCA1，但是排除HSD17B1和GT198基因(Miki，Y.，et al.，Science,266 :66-71(1994) ；Neuhausen, S. L.，et al.，Hum Mol Genet, 3 1919-26(1994))。GT198在HSD17B1附近5Kb具有小基因尺寸，因此在歷史候選基因鑒定中被遺漏。隨后的研究表明在17q21相關(guān)癌癥家族中BRCAl的參與有限，產(chǎn)生了在BRCAl基因座內(nèi)存在另外未鑒定候選基因的推測(cè)(Vogelstein, B. &Kinzler, K. W.，Cell,79 :1-3(1994))。鑒于如這里所述的GT198的功能和遺傳的證據(jù)，GT198很可能是在染色體17q21基因座上另一個(gè)乳腺癌易患基因。在過(guò)去偶發(fā)性乳腺癌和卵巢癌的研究中沒(méi)有用遺傳方法鑒定出GT198，存在另一個(gè)可能的原因。以前對(duì)體細(xì)胞突變的大多數(shù)遺傳分析依賴于腫瘤塊，而不是依賴于稀少的引發(fā)腫瘤的干細(xì)胞。一個(gè)還在爭(zhēng)論的新出現(xiàn)的假說(shuō)是說(shuō)腫瘤細(xì)胞不是從引發(fā)癌癥的細(xì)胞生長(zhǎng)出來(lái)的，但引發(fā)癌癥的細(xì)胞才帶有首發(fā)的遺傳突變。而是，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受包含引發(fā)癌癥的癌干細(xì)胞的腫瘤環(huán)境影響，但不攜帶首發(fā)遺傳突變。如果這種假說(shuō)證明是正確的，那么沒(méi)有可見(jiàn)的標(biāo)記，不可能從腫瘤塊鑒定出小百分?jǐn)?shù)GT198陽(yáng)性細(xì)胞中的遺傳改變。因此，GT198和BRCAl的功能性分析可能是鑒定該候選者的必需步驟，癌基因候選者GT198可能參與偶發(fā)性癌癥，此點(diǎn)以被在初期腫瘤中其異常胞漿表達(dá)的證據(jù)所支持。B.診斷學(xué)GT198變異體蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸片段可以用在診斷測(cè)定法，篩選測(cè)定法及治療應(yīng)用中。在一些實(shí)施方法中，可用GT198剪接變異體和可變剪接變異體的表達(dá)來(lái)作為診斷標(biāo)記對(duì)所引起的癌癥進(jìn)行檢測(cè)。代表性的剪接變異體包括GT198a、GT198-l、GT198-2、GT198-3、GT198-4和GT198a_4。代表性癌癥包括，但不限于卵巢癌和乳腺癌。受試者癌組織中一個(gè)或多個(gè)GT198剪接變異體表達(dá)水平的的升高可作為檢測(cè)癌癥的指標(biāo)，諸如對(duì)乳腺癌和卵巢癌的確定或診斷。GT198可以是多肽或核酸。為了檢測(cè)或診斷癌癥，可以建立GT198表達(dá)或活性的基準(zhǔn)值以作為受試者中癌癥的診斷和/或預(yù)后的基礎(chǔ)。優(yōu)選的受試者包括哺乳動(dòng)物，包括但不限于人類。在一些實(shí)施方式中，這是通過(guò)取自正常受試者(無(wú)癌癥的受試者)的體液、組織活檢或細(xì)胞提取物與在適合于復(fù)合物形成的條件下特異地與編碼GT198變異體的核酸雜交的一個(gè)或多個(gè)抗體或核酸的結(jié)合來(lái)完成。這種條件是本領(lǐng)域所公知的。通過(guò)比較正常樣品中抗體-靶復(fù)合物的水平與陽(yáng)性對(duì)照的稀釋系列，可以定量標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合物形成的量，包括已知數(shù)量的抗體結(jié)合和已知濃度的純化的GT198變異體。獲自正常樣品的標(biāo)準(zhǔn)值可以與獲自懷疑患有癌癥的受試者的樣品的值比較。標(biāo)準(zhǔn)值和受試者值之間的偏差可建立疾病狀態(tài)的存在或易患性的數(shù)據(jù)。在其它實(shí)施方式中，確定癌癥表型中不同細(xì)胞狀態(tài)的GT198剪接變異體的表達(dá)水平；即，評(píng)估無(wú)癌癥的組織中和癌癥組織中GT198變異體的表達(dá)水平，以提供表達(dá)圖譜。特定細(xì)胞狀態(tài)或發(fā)育點(diǎn)的表達(dá)圖譜基本上是狀態(tài)的“指紋”；雖然兩種狀態(tài)可以具有任何特定的基因或相似表達(dá)的GT198變異體，但是對(duì)基因或GT198變異體數(shù)量的評(píng)估可對(duì)細(xì)胞狀態(tài)作出特異的基因或GT198變異體表達(dá)的圖譜。通過(guò)比較不同狀態(tài)中細(xì)胞的表達(dá)圖譜，則可獲得關(guān)于在這些狀態(tài)中基因或GT198變異體的重要的信息(包括基因或變異體的上調(diào)和下調(diào))。然后，通過(guò)確定來(lái)自于特定患者的組織是否具有正?；虬┙M織的基因表達(dá)圖譜來(lái)完成或確定診斷。如這里所用的“差異表達(dá)”或語(yǔ)法上的等同用語(yǔ)意是指在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞之間的GT198變異體的時(shí)間和/或細(xì)胞表達(dá)中定性及定量的差異。因此，差異表達(dá)的GT198變異體在例如對(duì)卵巢癌組織比較中可以定性地具有改變的表達(dá)，包括激活或失活。即，GT198變異體可以在相對(duì)于另一種狀態(tài)的特定狀態(tài)中被打開(kāi)或關(guān)閉。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見(jiàn)地可以進(jìn)行兩種或多種狀態(tài)的任何比較。這種定性調(diào)節(jié)的GT198或其變異體將在不同狀態(tài)或細(xì)胞類型中顯示不同表達(dá)，該狀態(tài)或細(xì)胞類型通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以比較檢測(cè)，但是在兩者中不可都單獨(dú)檢測(cè)。或者定量的檢測(cè)表達(dá)是增加或減少。即，GT198變異體的表達(dá)或者被上調(diào)，引起增加數(shù)量的轉(zhuǎn)錄物，或者被下調(diào)，引起減少數(shù)量的轉(zhuǎn)錄物。表達(dá)不同的程度僅僅需要足夠大以通過(guò)如下所列的標(biāo)準(zhǔn)表征技術(shù)，諸如通過(guò)Affymetrix GeneChip 表達(dá)陣列，Lockhart, Nature Biotechnology, 14 1675-1680 (1996)的使用來(lái)定量。其它技術(shù)包括,但不限于定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，Northern分析和RNase保護(hù)。表達(dá)的改變(即，上調(diào)或下調(diào))是至少約50%，更優(yōu)選地至少約100%，更優(yōu)選地至少約150%，更優(yōu)選地至少約200%，從300到至少1000%是特別地優(yōu)選的結(jié)果。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這可以通過(guò)對(duì)GT198變異體轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)表達(dá)水平的評(píng)估來(lái)完成；也就是，可以使用GT198變異體轉(zhuǎn)錄物的DNA或RNA等同物的核酸探針來(lái)監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的量，并且例如，通過(guò)使用GT198變異體蛋白質(zhì)的抗體和標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定法(ELISAs，等)或其它技術(shù)，包括質(zhì)譜測(cè)定法、2D凝膠電泳測(cè)定法等，可以監(jiān)測(cè)GT198變異體表達(dá)水平或者可最終測(cè)定GT198變異體產(chǎn)物本身(蛋白質(zhì))的量。因此，可以在癌癥診斷檢測(cè)評(píng)估對(duì)應(yīng)于GT198變異體的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)即在癌癥表型中被鑒定為是重要的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，GT198變異體的抗體可以用在原位成像技術(shù)中。優(yōu)選方法可以是用對(duì)GT198變異體多肽特異的抗體，而不與野生型GT198多肽結(jié)合的抗體來(lái)檢測(cè)。在這個(gè)方法中，細(xì)胞與GT198變異體多肽的一個(gè)至多個(gè)抗體接觸。沖洗以移除非特異性抗體結(jié)合后，檢測(cè)單個(gè)或多個(gè)抗體的存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)與包含可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗體溫育來(lái)檢測(cè)抗體。在另一個(gè)方法中，GT198變異體的第一抗體包含有可檢測(cè)的標(biāo)記。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，多個(gè)第一抗體中每個(gè)抗體都可包含不同的可檢測(cè)的標(biāo)記。這個(gè)方法在同時(shí)篩選多個(gè)癌癥標(biāo)記，例如BRCAl或BRCA2方面特別適合應(yīng)用。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的，大量其它的組織成像技術(shù)都可以使用。在一些實(shí)施方式中，用熒光計(jì)來(lái)檢測(cè)標(biāo)記，該熒光計(jì)具有檢測(cè)和區(qū)分不同波長(zhǎng)發(fā)射的能力。此外，熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)也可以用在該方法中。
在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記的GT198或GT198核酸探針與組織陣列可原位雜交。例如，組織樣品是包括癌癥組織和/或正常(無(wú)癌癥組織)的陣列。如本領(lǐng)域所知，然后可以做原位雜交。相對(duì)于對(duì)照具有升高水平的一個(gè)或多個(gè)GT198變異體的細(xì)胞表示癌癥可能存在。示例性的對(duì)照樣品可包括來(lái)自于無(wú)癌癥的受試者的細(xì)胞。已知當(dāng)比較個(gè)體和標(biāo)準(zhǔn)之間的表達(dá)指紋時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行診斷及預(yù)后。進(jìn)一步已知的是診斷的基因可以不同于預(yù)后的基因。來(lái)自于如上所訴陣列的數(shù)據(jù)可以用于診斷癌癥和幫助預(yù)后。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，GT198變異體蛋白質(zhì)、抗體、核酸可用于預(yù)后。在這些實(shí)施方式中，于長(zhǎng)期預(yù)后方面，可以產(chǎn)生與癌癥嚴(yán)重性相關(guān)的基因表達(dá)圖譜。而且，這可以在蛋白質(zhì)或基因水平上完成。在一些實(shí)施方式中，GT198蛋白質(zhì)或核酸探針附著固相支持體，用于受試者組織中GT198變異體序列的檢測(cè)和定量。如用于所概述的陣列進(jìn)行診斷。在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞胞漿中野生型GT198的存在表示有癌癥存在。通常地，對(duì)野生型GT198特異的抗體可以用在細(xì)胞或組織的免疫檢測(cè)中，以檢測(cè)或定量胞漿中GT198。在另一個(gè)實(shí)施方式中，相對(duì)于對(duì)照，野生型GT198胞漿表達(dá)水平的升高表示癌癥陽(yáng)性。另一個(gè)實(shí)施方式提供了通過(guò)確定自受試者的樣品中GT198變異體的表達(dá)及一個(gè)或多個(gè)另外基因中突變的表達(dá)來(lái)幫助癌癥診斷的方法。例如，該方法可以包括確定BRCAl或BRCA2中突變的表達(dá)及確定一個(gè)或多個(gè)GT198變異體的表達(dá)。C.治療藥劑的效力使用上述的診斷測(cè)定法也可以確定治療藥劑的藥效，諸如抗體和/或其它候選藥物的治療效力。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，確定治療藥劑的效力的測(cè)定法需要基準(zhǔn)值的建立。在一些實(shí)施方式中，這是在用候選藥物治療前，通過(guò)取自患癌癥的受試者的體液、組織活檢或細(xì)胞提取物與GT198變異體的一個(gè)或多個(gè)抗體在適合于復(fù)合物形成的條件下結(jié)合來(lái)完的。這種條件是本領(lǐng)域所共知的。通過(guò)比較正常樣品中抗體-靶復(fù)合物的水平與陽(yáng)性對(duì)照的稀釋系列，可以定量標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合物形成的量，包括已知數(shù)量的抗體結(jié)合和已知濃度純化的GT198變異體。獲自治療前患者的標(biāo)準(zhǔn)值可以與獲自治療后受試者的值比較。標(biāo)準(zhǔn)值和受試者值之間的偏差建立了藥物的效力。II.篩選方法在一些實(shí)施方式中，GT198變異體蛋白質(zhì)、抗體、核酸和含有GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的細(xì)胞可用于篩選方法之中。例如，可以進(jìn)行調(diào)節(jié)癌癥表型的藥劑篩選。這可以通過(guò)篩選個(gè)體基因或蛋白質(zhì)水平上基因表達(dá)，包括GT198變異體表達(dá)的調(diào)節(jié)劑或GT198變異體蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)劑，或者通過(guò)評(píng)估藥物候選者對(duì)“基因表達(dá)圖譜”的效果來(lái)完成。在一些實(shí)施方式中，對(duì)表達(dá)圖譜與高通量篩選技術(shù)結(jié)合的使用可以監(jiān)測(cè)候選藥劑治療后的效果(參見(jiàn) Zlokamik，et al.，Science, 279 :84-8 (1998))?！罢{(diào)節(jié)”包括基因表達(dá)或活性方面的增加和減少。優(yōu)選的調(diào)節(jié)量將取決于正常與腫瘤組織比較中基因表達(dá)的原始數(shù)值的改變，至少10%，優(yōu)選地50%，更優(yōu)選地100-300%，及在一些實(shí)施方式中300-1000%或更多改變。如果與正常組織比較，腫瘤中基因顯示了 4倍的增加，而期望的是約4倍的減少；如腫瘤比正常組織中10倍的減少給出了候選藥劑表達(dá)中10倍的增加則是期望的，等等。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這可以通過(guò)變異體轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)水平的評(píng)估來(lái)完成；也就是，可以使用核酸探針監(jiān)測(cè)GT198變異體mRNA表達(dá)的量，或者，通過(guò)使用GT198變異體的抗體和標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定法可以監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)水平的量。或者，與蛋白質(zhì)的結(jié)合和生物活性測(cè)定可以如下所概述完成。在一些實(shí)施方式中，完成了基因表達(dá)監(jiān)測(cè)，并且除了同時(shí)監(jiān)測(cè)GT198變異體以外，還同時(shí)監(jiān)測(cè)了大量基因，即，表達(dá)圖譜。如果需要，也可以完成多個(gè)蛋白表達(dá)監(jiān)測(cè)。在監(jiān)測(cè)多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的實(shí)施方式中，相應(yīng)的GT198變異體探針被固定于固相支持體?？梢岳斫獠⑶乙阎氖?，可以通過(guò)以下任何方法進(jìn)行固定，包括例如，通過(guò)共價(jià)結(jié)合，通過(guò)靜電固定，通過(guò)利用配體/配體相互作用的結(jié)合，通過(guò)接觸或通過(guò)表面沉積?！肮滔嘀С煮w”或“固相基質(zhì)”指在其上合成、附著、連接或以另外方式固定GT198變異體序列或抗體的任何固相材料。固相支持體可以由有機(jī)聚合物，諸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺，以及共聚物和其分支體組成。固相支持體也可以是無(wú)機(jī)的，諸如玻璃、硅石、可控孔度玻璃(CPG)或反相硅石。固相支持體的構(gòu)型可以是珠子、球形、粒子、顆粒、凝膠或表面的形式。表面可以是平面的，基本上平面的，或非平面的。固相支持體可以是多孔或非多孔的，并且可以具有膨脹或非膨脹特征。固相支持體可以由孔、凹陷或其它容器、器皿、特征或位置的形式構(gòu)成。多個(gè)固相支持體可以在可尋址試劑的機(jī)器遞送的各個(gè)位置的陣列中構(gòu)成，或者由檢測(cè)裝置，包括通過(guò)激光照明和共焦或偏轉(zhuǎn)光聚集的掃描構(gòu)成。通常，在分析前添加候選生物活性藥劑。這里所用的術(shù)語(yǔ)“候選生物活性藥劑”或“藥物候選者”或語(yǔ)法上等同的術(shù)語(yǔ)描述了待要被檢測(cè)生物活性藥劑的任何種分子例如，蛋白質(zhì)、寡肽、小有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、多糖、多核苷酸等，它們能夠直接或間接地改變癌癥表型，結(jié)合和/或調(diào)節(jié)GT198變異體的生物活性，或者GT198變異體序列的表達(dá)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，候選藥劑抑制癌癥表型，例如達(dá)到正常組織指紋。通常，用不同的藥劑濃度平行地進(jìn)行大量測(cè)定混合物以獲得對(duì)各種濃度的差異應(yīng)答。通常，這些濃度之一作為陰性對(duì)照，即，在零濃度或檢測(cè)水平以下。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抑制一個(gè)或多個(gè)GT198變異體的表達(dá)。在一方面，候選藥劑將中和一個(gè)或多個(gè)GT198變異體的作用。用“中和”意指蛋白質(zhì)的活性被抑制或者抵消，以實(shí)質(zhì)上對(duì)細(xì)胞沒(méi)有作用。候選藥劑包括大量化學(xué)類別，盡管它們通常是有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，優(yōu)選地具有大于100，但是小于約2，500道爾頓分子量的小有機(jī)化合物。優(yōu)選的小分子是小于2000，或小于1500或小于1000或小于500道爾頓。候選藥劑包含對(duì)于與蛋白質(zhì)，特別是氫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)相互作用所必需的功能團(tuán)，并且通常包含至少一個(gè)胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選地至少功能化學(xué)團(tuán)中的兩個(gè)。候選藥劑常常包含被一個(gè)或多個(gè)上述功能團(tuán)所取代的環(huán)形碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族或聚芳香族結(jié)構(gòu)。在生物分子，包括肽、蛋白質(zhì)、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或它們的組合中也可以發(fā)現(xiàn)候選藥劑。候選藥劑獲自各種廣泛的來(lái)源，包括合成或天然化合物庫(kù)。例如，可得到大量的方法用于各種廣泛有機(jī)化合物和生物分子的隨機(jī)和直接合成，包括隨機(jī)寡核苷酸的表達(dá)?；蛘?，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物的提取物形式的天然化合物庫(kù)是可以獲得的或容易生產(chǎn)候選藥劑的來(lái)源。另外，通過(guò)常規(guī)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法可以很容易地修飾天然或合成產(chǎn)生的庫(kù)和化合物。已知的藥理學(xué)藥劑易受直接或隨機(jī)的化學(xué)修飾，諸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
在用于改變一個(gè)或多個(gè)GT198變異體序列的表達(dá)圖譜的測(cè)定法中，添加候選藥劑及允許細(xì)胞溫育一段時(shí)間后，向固相支持體添加待要分析的包含GT198變異體序列的樣品。如果需要，使用已知的技術(shù)制備GT198變異體序列。例如，使用已知的裂解緩沖液、電穿孔等可以處理樣品以裂解細(xì)胞，同時(shí)如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知到的，如果需要，可進(jìn)行純化和/或擴(kuò)增，諸如PCR。一般的情況下，測(cè)定法的組分之一可被標(biāo)記以提供檢測(cè)結(jié)合復(fù)合物的方法。這里用“標(biāo)記”意指化合物是具有可結(jié)合的至少一個(gè)元素、同位素或化合物是能夠檢測(cè)的化合物。通常，標(biāo)記屬于三類a)同位素標(biāo)記，其可以是放射性的或重同位素；b)免疫標(biāo)記，其可以是抗體或抗原；和c)染色或熒光染料。標(biāo)記可以在任何位置摻入GT198變異體核酸、蛋白質(zhì)和抗體中。例如，標(biāo)記應(yīng)該能夠直接或間接地產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。可檢測(cè)的組成成分可以是放射性同位素，諸如M、14C、32P、35S或1251，熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，諸如異硫氰酸熒光素、羅丹明或熒光素或酶，諸如堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶。可以使用本領(lǐng)域已知的用于綴合抗體和標(biāo)記的任何方法，包括Hunter et al. , Nature,144 :945(1962) ；David et al. , Biochemistry, 13:1014(1974) ；Pain et al. , J. Immunol.Meth. ,40 :219(1981)；和 Nygren，J. Histochem. and Cytochem. ,30 :407(1982))所述的方法。標(biāo)記也可以是酶，諸如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，當(dāng)給它們提供適合的基質(zhì)時(shí)就會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的產(chǎn)物?；蛘?，標(biāo)記可以是標(biāo)記的化合物或小分子，諸如酶抑制劑，是結(jié)合但是不被酶催化或改變。標(biāo)記也可以是組成成分或化合物，諸如特異性結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的附加表位或生物素。對(duì)于生物素的例子，如上所述是標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素，因此提供了結(jié)合靶序列的可檢測(cè)的信號(hào)。如本領(lǐng)域所知，分析前移除未結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，這些測(cè)定法可以是直接雜交測(cè)定法或者可以包括“夾心測(cè)定法”，這包括使用多個(gè)探針，如在美國(guó)專利號(hào)5，681，702,5, 597，909,5, 545，730、5，594，117,5，591，584,5，571，670,5，580，731,5，571，670,5，591，584,5，624，802,5，635，352,5, 594，118,5, 359，100,5, 124，246 和 5，681，697 中所通常概述的探針，因此所有這些文獻(xiàn)整體地被并入為參考文獻(xiàn)?？梢允褂酶鞣N雜交條件，包括高、中和低嚴(yán)格性的條件。測(cè)定法通常在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，該嚴(yán)格條件允許僅僅在靶存在的情況下標(biāo)記探針雜交復(fù)合物的形成。通過(guò)改變其熱力學(xué)變量的步驟參數(shù)可以控制嚴(yán)格性，該參數(shù)包括，但不限于溫度、甲酰胺濃度、鹽濃度、離液序列高的鹽濃度PH，有機(jī)溶劑濃度等。為了獲得在各種條件下的雜交，可以使用對(duì)GT198變異體多核苷酸特異的探針。探針小于約1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，優(yōu)選的是小于500個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。優(yōu)選的探針是至少約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，最優(yōu)選的至少約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。這種探針可以用相應(yīng)的GT198變異體序列來(lái)PCR擴(kuò)增樣品。 可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。用“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指在該條件下探針將與其靶序列雜交達(dá)到比與其它序列可測(cè)的更大的程度(例如，背景的至少2倍以上)。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，并且在不同環(huán)境中不同。通過(guò)控制雜交和/或沖洗條件的嚴(yán)格性，以鑒定100%與探針互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))?；蛘?，可以調(diào)整在嚴(yán)格條件下所允許的序列的一些錯(cuò)配，這樣就檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。
通常，嚴(yán)格條件將是這樣的條件，其中在pH 7. 0到8. 3，鹽濃度小于約1. 5M Na離子，通常約0.01到1.0M Na離子濃度(或其它鹽)，并且對(duì)于短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)，溫度是至少約30°C，對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)，至少約60°C。通過(guò)添加去穩(wěn)定劑，諸如甲酰胺也可以獲得嚴(yán)格條件。示例性低嚴(yán)格條件包括在37°C，和30到35%甲酰胺緩沖液、IM NaClU % SDS (十二烷基硫酸鈉)雜交，以及在50到55°C，在Ix到2. χ標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉(SSC) (20xSSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中沖洗。示例性中嚴(yán)格性條件包括在37°C，在40到45%甲酰胺、1. OM NaClU % SDS中雜交，和在55到60°C，在0. 5x到IxSSC中沖洗。示例性高嚴(yán)格性條件包括在37°C，在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，和在60到65°C，在0. IxSSC中沖洗。可選擇的條件是，沖洗緩沖液可以包含約0. 到約SDS0雜交期間通常不少于約M小時(shí)，通常約4到約12小時(shí)。這些參數(shù)也可以用于控制非特異性結(jié)合，如美國(guó)專利號(hào)5，681，697中所通常概述的。因此，可以期望在較高嚴(yán)格條件下進(jìn)行一些步驟以減少非特異性結(jié)合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，可以通過(guò)各種方法完成這里所概述的反應(yīng)。在下面所概述的優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以同時(shí)地或順序地或任意順序地添加反應(yīng)的組分。此外，反應(yīng)可以包含測(cè)定法中所包含的各種其它試劑。這些試劑包括，如鹽、緩沖液、中性蛋白質(zhì)，例如白蛋白、去污劑等，可以使用它們以有利于最佳的雜交和檢測(cè)，和/或減少非特異性或背景的相互作用。并且，根據(jù)樣品制備方法和靶的純度，可以使用另外改進(jìn)測(cè)定法效率的試劑，諸如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。此外，可以使用固相或基于溶液(即，動(dòng)態(tài)PCR)的測(cè)定法。一旦進(jìn)行測(cè)定，就可分析數(shù)據(jù)以確定GT198變異體或個(gè)體GT198變異體蛋白質(zhì)的狀態(tài)之間表達(dá)水平及表達(dá)水平的變化，形成表達(dá)圖譜。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)行篩選以改變GT198變異體的表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能。而且，如下面所充分地概述，可以進(jìn)行鑒定特定狀態(tài)中變異體的重要性，篩選結(jié)合和/或調(diào)節(jié)變異體生物學(xué)活性的藥劑。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)篩選并首先發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的候選藥劑，然后這些藥劑可以用于在評(píng)估候選藥劑調(diào)節(jié)GT198變異體活性和癌癥表型能力的測(cè)定法中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以進(jìn)行的大量不同的測(cè)定法；結(jié)合測(cè)定法和活性測(cè)定法。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)行結(jié)合測(cè)定法。通常，使用純化的或分離的GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸。方法包括結(jié)合GT198蛋白質(zhì)或核酸與候選生物活性藥劑，并且確定候選藥劑與GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的結(jié)合。通常，GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸或候選藥劑非擴(kuò)散地結(jié)合到有分離的樣品的固相支持體(例如，微量滴定板和陣列等)。微量滴定板和陣列特別方便，因?yàn)槭褂眯×康脑噭┖蜆悠房梢酝瑫r(shí)進(jìn)行大量的陣列。只要組合物與試劑相適合，維持組合物的活性并且是不可擴(kuò)散的，這樣組合物特定的結(jié)合方式就不是至關(guān)重要的了。優(yōu)選的結(jié)合方法包括抗體(當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)合支持體時(shí)，抗體空間上不阻斷配體結(jié)合位點(diǎn)或激活序列)，直接結(jié)合“粘性”的或離子的支持體，化學(xué)交聯(lián)，表面蛋白質(zhì)或試劑的結(jié)合都可應(yīng)用。蛋白質(zhì)或試劑結(jié)合后，通過(guò)沖洗移除過(guò)多未結(jié)合的材料。通過(guò)與牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它無(wú)害的蛋白質(zhì)或其它組成成分溫育可以阻斷樣品非特異結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸可以結(jié)合到支持體上，并且向測(cè)定中添加候選的生物活性劑?；蛘撸煤蜻x劑結(jié)合的支持體，并且添加GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸。新結(jié)合的候選劑包括特異性抗體、在化學(xué)庫(kù)篩選中鑒定的非天然結(jié)合劑，肽類似物、適體等。一個(gè)特殊的目的是篩選測(cè)定對(duì)人類細(xì)胞具有低毒性的藥劑。廣泛不同種類的測(cè)定法可以用于該目的，包括標(biāo)記的體外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定法，電泳遷移率變動(dòng)分析，蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫測(cè)定法，功能性測(cè)定法(磷酸化測(cè)定法等)等等?？梢酝ㄟ^(guò)大量方法進(jìn)行對(duì)候選生物活性劑與GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸結(jié)合的確定。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)記候選生物活性劑，并且直接地測(cè)定結(jié)合。例如，這可以通過(guò)連接所有或部分的GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸于固相支持體上，添加標(biāo)記的候選藥劑(例如，熒光標(biāo)記)，沖洗掉多余的試劑，并且確定標(biāo)記是否存在于固相支持體上來(lái)完成?？梢岳帽绢I(lǐng)域所已知的各種阻斷和沖洗步驟。在一些實(shí)施方式中，只標(biāo)記組分之一。例如，可以使用125I或用熒光團(tuán)在酪氨酸位置標(biāo)記蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)性質(zhì)的候選藥劑)?；蛘?，用不同的標(biāo)記可以標(biāo)記一個(gè)以上的組分；例如，蛋白質(zhì)使用1251，候選藥劑使用熒光團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)使用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法確定候選生物活性劑的結(jié)合。在該實(shí)施方式中，競(jìng)爭(zhēng)劑是已知的結(jié)合GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的結(jié)合組成成分，諸如抗體、肽、結(jié)合配偶體、配體等。在一些條件下，如生物活性劑和結(jié)合組成成分之間可以存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，其中結(jié)合組成成分置換生物活性劑。在一些實(shí)施方式中，可標(biāo)記候選生物活性劑。如果存在候選生物活性劑或競(jìng)爭(zhēng)劑或者兩者，首先將其添加到蛋白質(zhì)中給與一段充足的時(shí)間以允許結(jié)合。在有利于最佳活性的任何溫度，通常4和40°C之間可以進(jìn)行溫育。選擇溫育期間為最佳活性，但是也可以優(yōu)化溫育時(shí)間以利于快速高通量篩選。通常0. 1到1小時(shí)之間將是充足的。通常移除或洗掉過(guò)量的試劑。然后添加第二種成分，接著是用標(biāo)記成分的存在或不存在以表示是否結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，首先添加競(jìng)爭(zhēng)劑，接著是候選生物活性劑。競(jìng)爭(zhēng)劑置換的是候選生物活性劑結(jié)合的GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸，因此是能夠既結(jié)合又和潛在地調(diào)節(jié)GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的活性指標(biāo)。在該實(shí)施方式中，可以標(biāo)記兩者中任一成分。因此，例如，如果標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)劑，沖洗液中標(biāo)記的存在則表明該試劑的置換?；蛘?，如果用標(biāo)記候選生物活性劑，支持體上標(biāo)記的存在表示置換。在其它實(shí)施方式中，首先添加候選生物活性劑，同時(shí)溫育和沖洗，接著添加競(jìng)爭(zhēng)劑。不存在競(jìng)爭(zhēng)劑的結(jié)合可以表示生物活性劑以高度親和性結(jié)合了 GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸。因此，如果標(biāo)記候選生物活性劑，那么沒(méi)有偶聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)劑結(jié)合的支持體上存在標(biāo)記則可以表示候選劑能夠結(jié)合GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸。在一些實(shí)施方式中，方法包括差異篩選以鑒定能夠調(diào)節(jié)GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的活性的生物活性劑。在該實(shí)施方式中，方法包括在第一樣品中讓GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸與競(jìng)爭(zhēng)劑結(jié)合。第二樣品包含候選生物活性劑，作為GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的競(jìng)爭(zhēng)劑。確定兩個(gè)樣品的競(jìng)爭(zhēng)劑的結(jié)合，兩個(gè)樣品之間結(jié)合的變化或差異表示能夠結(jié)合GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸及潛在地調(diào)節(jié)其活性的藥劑的存在。也就是，如果競(jìng)爭(zhēng)劑的結(jié)合在第一種樣品和第二種樣品中不同，藥劑就能夠結(jié)合GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸。在一些實(shí)施方式中，提供了篩選能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的活性的生物活性劑的方法。該方法包括向具有GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的細(xì)胞添加如上所限定的候選生物活性劑。通常，使用具有一個(gè)或多個(gè)GT198變異體擴(kuò)增子的細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞的方法和測(cè)定細(xì)胞分散、粘著和遷移的方法如Russell et al. , J. Cell Sci. ,116 3543-3556(2003)中所述，這篇文獻(xiàn)的整體內(nèi)容在這里并入為參考文獻(xiàn)。在測(cè)定中可以使用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。優(yōu)選的方法是，以至少3次重復(fù)進(jìn)行所有對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣品以獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的結(jié)果。所有樣品的溫育都進(jìn)行充足時(shí)間的藥劑和蛋白質(zhì)的結(jié)合。溫育后，沖洗所有的樣品直到?jīng)]有非特異性結(jié)合為止，測(cè)定結(jié)合，通常是測(cè)標(biāo)記藥劑的量。例如，如果使用放射性標(biāo)記，可以在閃爍計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)樣品以確定結(jié)合化合物的量。各種其它試劑可以包含在篩選測(cè)定法中。這些包括試劑，如鹽、中性蛋白質(zhì)，例如白蛋白、去污劑等，可以使用它們以有利于最佳的蛋白-蛋白結(jié)合，和/或減少非特異性或背景相互作用。也可以使用另外地改進(jìn)測(cè)定法效率的試劑，諸如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。可以按照提供所需結(jié)合的任何順序添加混合組分。在一方面，可用以下情況評(píng)估測(cè)定法。如用生理學(xué)信號(hào)，例如激素、抗體、肽、抗原、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、動(dòng)作電位，藥理學(xué)試劑，包括化學(xué)療法、輻射、致癌法或其它細(xì)胞(即，細(xì)胞-細(xì)胞接觸)存在或不存在，以前或隨后出現(xiàn)的情況下來(lái)評(píng)估測(cè)定法。在另一個(gè)例子中，在細(xì)胞周期過(guò)程的不同階段進(jìn)行測(cè)定。III.藥物制造和治療方法A.藥物制造法另一個(gè)實(shí)施方式是使用藥物，其包含GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的一種或多種拮抗劑。這里用“藥理學(xué)活性”意指化合物能夠抑制或干擾GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸的活性。具有期望的藥理學(xué)活性的化合物可以在生理學(xué)可接受的載體中向受試者或患者給藥?！笆茉囌摺被颉盎颊摺卑ㄈ祟惡推渌鼊?dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物和家畜。因此，該方法可以應(yīng)用于人類治療和獸醫(yī)應(yīng)用。在一些實(shí)施方式中，生物活性劑包括識(shí)別GT198變異體蛋白質(zhì)及已被證明抑制或調(diào)節(jié)GT198變異體蛋白質(zhì)活性或生物可利用性的抗體。在其它實(shí)施方式中，生物活性劑包
GT198 ^ 1 gtaacggcgc cgtgggcgcg gggaagaccc gggagggcag tgggtgaggaggtcggttga gtggccccct cccctgcctt tctctccgta g(SEQ ID NO. 4)的反義或 siRNA 組合物。如本領(lǐng)域所公知的，這些藥劑可以直接地被遞送或在藥物組合物中一起與適合的載體或賦形劑被遞送。目前的治療方法包括給需要治療的患者提供抑制GT198變異體表達(dá)活性的有效量化合物。通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以容易地確定這種藥劑的有效量，也可以確定最有效和方便的給藥途徑和最適合的劑型。各種劑型和藥物遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域可以得到的。適合的給藥途徑可以有，例如包括口服、直腸、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻子或腸內(nèi)給藥以及非腸道的遞送，包括肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。藥劑或其組合物可以以局部而不是系統(tǒng)方式進(jìn)行給藥。例如，適合的藥劑可以通過(guò)注射遞送或在靶向藥物遞送系統(tǒng)中遞送，諸如儲(chǔ)存或緩釋劑?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法制造藥物組合物，諸如通過(guò)常規(guī)的混合、溶解、成粒、制糖錠劑、研磨、乳化、膠囊化、包載或凍干方法。組合物可以包含一種或多種生理學(xué)上可接受的載體，諸如有利于活性分子加工成藥物用途的制劑的賦形劑和輔劑。合適的劑型取決于所選擇的給藥途徑。例如，對(duì)于注射，組合物可以制成水溶液，優(yōu)選地在生理學(xué)相容緩沖液，諸如Hanks液、Ringer液或生理鹽緩沖液中制成。對(duì)于經(jīng)粘膜或鼻給藥，在劑型中使用適合滲透屏障的滲透劑。這種滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于口服給藥，通過(guò)聯(lián)合活性劑和本領(lǐng)域公知的藥物學(xué)上可接受的載體可以容易地制造藥劑。這種載體能夠使本發(fā)明的藥劑被制成用于受試者口服消化的片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等。藥劑也可以制成直腸組合物，諸如栓劑或保留灌腸劑，例如包含常規(guī)栓劑基質(zhì)，諸如可可油或其它甘油酯。用于口服用途的藥物制備可以從固體賦形劑開(kāi)始獲得，如果需要，添加適合的輔劑后，可選地研磨所得到的混合物，加工顆?；旌衔?，以獲得片劑或糖錠劑核芯。特別地，適合的賦形劑是填料，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素制劑諸如，例如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望，可以添加崩解劑，諸如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽諸如藻酸鈉。糖錠劑核芯提供有合適的包衣。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可選地含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和適合的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？梢韵蚱瑒┗蛱清V劑包衣添加染料或顏料用于鑒定或用于表征不同活性劑量的組合。用于口服給藥的藥物制備包括由明膠制成的推入配合膠囊以及由明膠和增塑劑，諸如甘油或山梨糖醇制成的軟密封膠囊。推入配合膠囊可以含有混合填料，諸如乳糖，粘結(jié)劑，諸如淀粉，和/或潤(rùn)滑劑，諸如滑石或硬脂酸鎂，以及可選則的穩(wěn)定劑的活性組分。在軟膠囊中，活性劑可以溶解或懸浮在適合的液體，諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可以添加穩(wěn)定劑。用于口服給藥的所有的劑型應(yīng)該是適合于這種給藥的劑量。對(duì)于吸入給藥，利用適合的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或任何其它適合的氣體，藥劑可以方便地以來(lái)自于加壓容器或噴霧器的氣溶膠噴霧呈現(xiàn)的形式被遞送。在加壓的氣溶膠情況下，通過(guò)提供閥門以遞送所計(jì)量的量，可以確定合適的劑量單位?？梢耘渲圃谖肫骱痛等肫髦兴褂玫哪z囊和彈藥。這些通常含有藥劑和適合的粉末基質(zhì)，諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。例如在安瓿瓶或多劑量容器中帶有添加防腐劑的形式可以制備藥劑用于注射，例如通過(guò)單次快速靜脈注射或持續(xù)靜脈點(diǎn)滴的非腸道給藥的藥物。藥物可以呈現(xiàn)如油或水載體中懸浮液、溶液或乳液形式，并且可以包含輔劑諸如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。用于非腸道給藥的劑型包含給藥的化合物或藥劑的水溶液，包括水溶形式?；钚詣┑膽腋∫阂部梢灾苽錇檫m合的油注射懸浮液。適合的親脂溶劑或載體包括脂肪油，諸如芝麻油和合成的脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯或脂質(zhì)體。水注射懸浮液可以包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖?；蛘?，懸浮液也可以包含適合的穩(wěn)定劑或增加藥劑溶解性的試劑，以允許高濃度溶液的制備。再或者，活性組分可以是粉末形式，用于適合的載體，例如用滅菌無(wú)熱原的水在使用前組合。如上所述，藥物也可以配制成儲(chǔ)存形式。只要起作用的組分可以通過(guò)灌輸(例如，皮下或皮內(nèi)地)或通過(guò)肌內(nèi)注射給藥。因此，例如，可以用適合的聚合或疏水材料或離子交換樹脂制備本藥劑(例如，作為可接受油中乳劑)，或者本藥劑制備為少量可溶的衍生物，例如制備為少量可溶的鹽。
用于本發(fā)明疏水分子的適合載體是本領(lǐng)域所公知的，并且包括共溶劑系統(tǒng)，其包含例如，苯甲醇、非極性表面活性劑、水可混的有機(jī)聚合物和水相。共溶系統(tǒng)可以是VPD共溶系統(tǒng)。VPD是3% w/v苯甲醇、8% w/v非極性表面活性劑聚山梨醇酯80和65% w/v聚乙二醇300、和用無(wú)水乙醇補(bǔ)足體積。VPD共溶系統(tǒng)(VPD:5W)由1 1稀釋的VPD和5%葡萄糖水溶液組成。該共溶系統(tǒng)有效地溶解疏水試劑，并且產(chǎn)生對(duì)系統(tǒng)給藥的低毒性。自然，共溶系統(tǒng)的比例可以相當(dāng)大地變化，而不會(huì)破壞它的溶解度和毒性特征。而且，共溶系統(tǒng)組分的同一性可以變化。例如，其它低毒性非極性表面活性劑可以用于代替聚山梨醇酯80，聚乙二醇的級(jí)分大小可以改變，其它生物相容的聚合物可以取代聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯烷酮，并且其它的糖或多糖可以取代葡萄糖?？梢允褂糜糜谑杷肿拥钠渌f送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是公知的用于疏水藥物的遞送工具或載體的例子。脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)是如上面基因遞送系統(tǒng)上下文中所討論的。也可以使用一些有機(jī)溶劑，諸如二甲基亞砜，盡管通常以更大的毒性為代價(jià)。此外，使用緩釋系統(tǒng)，諸如含有有效量的待給藥組合物的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)可以遞送藥劑。構(gòu)建各種緩釋的材料，并且這種材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到的。緩釋膠囊可以根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)釋放藥劑幾周到100天以上。根據(jù)治療試劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，可以使用其他蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的策略。對(duì)于這里所使用的任何藥物，可以使用本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)來(lái)首先評(píng)估治療的有效劑量。例如，在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中，可以在動(dòng)物模型中配制劑量以獲得包括如細(xì)胞培養(yǎng)中所確定的IC5tl的循環(huán)濃度的范圍。在期望抑制GT198或GT198變異體活性的情況下，可以確定獲得GT198或GT198變異體活性半最大抑制的實(shí)驗(yàn)藥劑濃度。使用獲自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和其它動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)，可以確定適于人類受試者的劑量范圍。藥劑的治療有效劑量指的是引起受試者中癥狀改善或存活延長(zhǎng)的藥劑的量。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)方法，例如通過(guò)確定LD5tl (致死種群中50%的劑量)和ED5Q(種群中50%治療有效的劑量)可以確定這種分子的毒性和治療效力。毒性對(duì)治療效果的劑量比率是治療指數(shù)，其可以表示為比率LD5(i/ED5(i。顯示高治療指數(shù)的藥劑是優(yōu)選的。優(yōu)選劑量是在循環(huán)濃度的范圍內(nèi)沒(méi)有毒性或很小毒性的ED5tlt5根據(jù)所使用的劑量形式和所用的給藥途徑，劑量可以在該范圍內(nèi)變化。鑒于受試者條件的特異性，應(yīng)該根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法選擇精確的劑型、給藥途徑和劑量?？梢詡€(gè)體地調(diào)整劑量和間隔以提供如所期望的足以影響GT198或GT198變異體的表達(dá)或活性的活性組成成分的血漿水平或組織水平，即，最小有效濃度(MEC)。MEC將隨著每個(gè)藥劑而變化，但是可以由例如，體外數(shù)據(jù)，諸如使用這里所述的測(cè)定法獲得GT198或GT198變異體活性50-90%抑制必需的濃度來(lái)評(píng)估。獲得MEC所必需的劑量將依賴于給藥的個(gè)體特征和途徑。應(yīng)該使用治療方案給藥藥劑或其組合物，該治療方案將維持血漿水平在MEC以上約10-90%的治療期間，優(yōu)選地約30-90%的治療期間，最優(yōu)選地50-90%之間。在局部給藥或選擇性攝入的情況下，藥物的有效局部濃度可以與血漿濃度不相關(guān)。所給藥的藥劑或組合物的量將當(dāng)然地依賴于各種因素，包括待要治療的受試者的性別、年齡和體重，病痛的嚴(yán)重性，給藥方式以及處方醫(yī)師的判斷。如果期望，本組合物可以呈現(xiàn)包含一個(gè)或多個(gè)單位劑量形式的包裝或分配器裝置，該單位劑量形式包含活性組分。這種包裝或裝置可以，例如包括金屬或塑料箔，諸如起泡包裝。包裝或分配器裝置可以伴有用藥說(shuō)明書。也可以制備包含在相容性藥物學(xué)載體中所配制的本發(fā)明藥劑的組合物，將該組合物放置在合適的容器中，貼上用于標(biāo)明條件下治療的標(biāo)簽。標(biāo)簽上標(biāo)明的適合條件可以包括障礙或疾病，諸如乳腺癌和卵巢癌或其它癌癥的治療，以及與GT198的改變表達(dá)相關(guān)的條件。B.治療的方法一個(gè)實(shí)施方式是通過(guò)給有效量的藥并對(duì)編碼GT198變異體蛋白質(zhì)的核酸特異的抑制性核酸，以緩解與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀來(lái)治療癌癥癥狀的方法。抑制性核酸可以是反義DNA或siRNA。與癌癥相關(guān)的癥狀包括腫瘤尺寸大小和細(xì)胞增殖速度?？梢灾委煹拇硇园┌Y包括，但不限于卵巢癌、子宮癌，前列腺癌和乳腺癌。抑制性核酸可以是上面所公開(kāi)的一種或多種組合物。所公開(kāi)的GT198或GT198變異體拮抗劑組合物可以向所需的受試者單獨(dú)給藥，或者聯(lián)合一種或多種另外的治療劑，或者聯(lián)合至少兩種不同的GT198拮抗劑給藥。代表性的GT198或GT198變異體拮抗劑包括，但不限于抑制性核酸，諸如siRNA或反義DNA，以及其拮抗抗體或抗原結(jié)合部分。另外的治療藥劑基于待要治療的健康狀況、障礙或疾病來(lái)選擇。例如，GT198拮抗劑可以與具有抑制GT198生物學(xué)功能或生物可利用性功能的一種或多種另外的藥劑共給藥。GT198拮抗劑也可以聯(lián)合一種或多種另外的治療劑。代表性的治療劑包括，但不限于化療劑和預(yù)凋亡劑。代表性的化療劑包括，但不限于安吖啶、博來(lái)霉素、白消安、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯法拉濱、門冬酰胺酶、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、多西他賽、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、甲酰四氫葉酸、多柔比星脂質(zhì)體、柔紅霉素脂質(zhì)體、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉬、紫杉醇、培美曲塞、噴司他丁、丙卡巴胼、雷替曲塞、沙鉬、鏈佐星、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、塞替派、硫鳥嘌呤、托泊替康、曲奧舒凡、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱或它們的組合。代表性預(yù)凋亡劑包括，但不限于氟達(dá)拉濱?；擎咦铀?fludarabinetaurosporine)、環(huán)己酰亞胺、放線菌素D、乳糖基?；拾贝?、15d_PGJ(2)和它們的組合。IV.試劑盒這里也提供了制作帶有盛裝探針的容器的試劑盒的方法，該探針特異地結(jié)合GT198或GT198變異體蛋白質(zhì)或核酸。試劑盒可用于檢測(cè)表示癌癥的GT198中突變的存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，探針是對(duì)GT198或GT198變異體蛋白質(zhì)特異的抗體?？贵w可以是單克隆、多克隆、單鏈、人源化和嵌合的或者其抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，探針是特異地結(jié)合編碼GT198或其變異體的核酸的核酸探針，優(yōu)選地至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。試劑盒可選地包括用于檢測(cè)癌癥的一種或多種生物標(biāo)記的探針。可以與GT198標(biāo)記聯(lián)合在癌癥中優(yōu)先使用的生物標(biāo)記包括BRCAl和BRCA2中突變。因此，特異地與BRCAl和BRCA2中突變雜交的核酸探針可以包括在試劑盒中。用于檢測(cè)雜交的試劑，諸如緩沖液和材料也可以包括在試劑盒中。除非另外地限定，這里所用的所有科技和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與所公開(kāi)的發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。這里所引用的文獻(xiàn)和引用它們的材料特別地并入為參考文獻(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠識(shí)別并能夠確定使用這些不超過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，這里所述的本發(fā)明特定的實(shí)施方式也是如此。這種等同意欲也包含在后面的權(quán)利要求書中。實(shí)施例方法和材料GT198變異體的克降最初用RT-PCR，接著用測(cè)序分析首次檢測(cè)出組織中人GT198剪接變異體的存在。通過(guò)5’ RACE(Invitrogen)方法獲得了含有與野生型相似的含長(zhǎng)5’末端的全長(zhǎng)GT198-1到-4變異體cDNAs。從人BGOl細(xì)胞和小鼠P19干細(xì)胞分別地檢測(cè)出人和小鼠GT198a變異體cDNAs，兩者都保留有內(nèi)含子1。進(jìn)而使用內(nèi)含子1引物的5’ RACE揭示了在人和小鼠序列中相同核苷酸位置上存在另一轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)含短5’末端，幾乎與它們的起始密碼子緊鄰。使用內(nèi)含子1特異性引物在組織中又鑒定出了人GT198a-4。P19干細(xì)胞的表達(dá)模式分析則依賴于野生型GT198的5’特異性引物和變異體GT198a特異的內(nèi)含子1引物。鑒定的cDNA序列已經(jīng)存入并且在GenBank中發(fā)布，登錄號(hào)如下hGT198，F(xiàn)J952179 ；hGT198_l，F(xiàn)J952180 ；hGT198-2, FJ952181 ；hGT198_3，F(xiàn)J952182 ；hGT198_4，F(xiàn)J952183 ；hGT198a,GQ851964 ；hGT198a_4，GQ851965 ；mGT198, FJ937966 ；和 mGT198a，F(xiàn)J937967。RT-PCR和定量PCR分析使用來(lái)自于多個(gè)正常人組織和癌細(xì)胞系的第一條鏈cDNAs分析了內(nèi)源GT198和其變異體(MTC panels, Clontech)。在干細(xì)胞中，使用iTrizol試劑(Invitrogen)分離每個(gè)分化階段的總RNA，用DNase I處理，使用SuperScriptIII (Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并在RT-PCR前標(biāo)準(zhǔn)化它們的濃度用以RT-PCR分析。定量PCR分析使用STOR綠色染料一式二份重復(fù)在25 μ 1反應(yīng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(iCycler，BioRad)。結(jié)果用GAPDH來(lái)校準(zhǔn)。干細(xì)胞分化以前我們的報(bào)道描述過(guò)來(lái)自于小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞或胚胎癌(EC)P19細(xì)胞的胚胎體形成方法 Brooks，Y. S.，et al.，J Biol Chem, 284 =18033-46(2009) 簡(jiǎn)而言之，用500nM全反式視黃酸誘導(dǎo)未分化的P19細(xì)胞(EC)分化4天，以形成胚胎體(EB2-4)。在P19分化的每個(gè)階段都分離總RNA進(jìn)行RT-PCR分析。鼠ES細(xì)胞生長(zhǎng)在Y _輻射的飼養(yǎng)成纖維細(xì)胞上，并且通過(guò)除去血清分化成胚胎體。石蠟包埋ES來(lái)源的胚胎體以進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。熒光素酶測(cè)定法在補(bǔ)加有2. 5%胎兒牛血清和7. 5%小牛血清的0-|^11中維持？19細(xì)胞。在對(duì)孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，并且使用帶有MMTV熒光素酶報(bào)道基因(IOOng)、糖皮質(zhì)激素受體(IOng)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑2000 (Invitrogen)和各種量的GT198表達(dá)質(zhì)粒一式三份轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞與配體地塞米松(IOOnM)溫育在收獲前誘導(dǎo)MMTV熒光素酶報(bào)道基因16小時(shí)。通過(guò)Dynex發(fā)光計(jì)測(cè)量相對(duì)的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)表示為三次轉(zhuǎn)染的平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤差。免疫組織化學(xué)和免疫熒光先前從兔子制備了多克隆抗GT198的抗體(Covance) (Ko, L.，et al.，Mol CellBiol, 22 :357-69 (2002)。重組GT198蛋白或其作為抗原的部分蛋白片段與親和膠10樹脂(Bio-Rad)交聯(lián)進(jìn)行親和純化。樣品為石蠟包埋的陣列形式的腫瘤組織來(lái)自于hgenex和US Biomax, Inc.。免疫組化法利用生物素?；目雇肐gG F (ab) 2 二抗，接著通過(guò)檢測(cè)試劑(DAKO)來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合。并且切片用蘇木精復(fù)染色。免疫熒光法使用兔抗GT198抗體和鼠抗Flag抗體(Sigma)進(jìn)行免疫熒光雙染色。以1 200的稀釋度應(yīng)用Cy3_和FITC-綴合的二抗(Jackson Immuno-Research Laboratory Inc. )。GFP_Rad51 質(zhì)粒含有 pEGFP_C3 載體(Clontech)和小鼠全長(zhǎng)Rad51基因。對(duì)于TUNEL細(xì)胞調(diào)亡的測(cè)定，是在使用原位細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)試劑盒(Roche)的TUNEL測(cè)定前，進(jìn)行免疫熒光抗體結(jié)合。Western 印跡分析使用來(lái)自于過(guò)表達(dá)的293細(xì)胞或來(lái)自于內(nèi)源P19干細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞裂解液，通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)內(nèi)源或過(guò)表達(dá)的GT198和其剪接變異體蛋白。使用抗Flag M2瓊脂糖小球(Sigma)與1 10稀釋的來(lái)自于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞提取物在結(jié)合緩沖液中溫育，進(jìn)行免疫沉淀。沖洗沉淀物，和使用抗GT198抗體對(duì)該沉淀物進(jìn)行Western印跡分析。用1 200稀釋度的抗GT198探測(cè)印跡，并且用ECL系統(tǒng)(Amersham Pharmacia)進(jìn)行檢測(cè)。原位雜交的整裝制片E8. 5、E9. 5和E10. 5時(shí)間的小鼠胚胎，在4°C，在帶有0. 吐溫的PBS中4%低聚甲醛中固定過(guò)夜，通過(guò)在25^^50^^75%和100%的系列甲醇脫水。在與變性的核糖探針雜交前，用無(wú)RNase的DNase I (50U/ml)處理脫水的胚胎。在地高辛配基-UTP(RocheDiagnostics)存在的情況下，使用pcDNA3載體中全長(zhǎng)GT198 cDNA，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義和有義核糖探針。固定染色的胚胎，并且對(duì)其進(jìn)行制片。受試者和材料從來(lái)源于家族乳腺癌患者的EB病毒(EBV)無(wú)限增殖化的B淋巴母細(xì)胞系分離基因組DNA或RNA。這些患者在40歲之前被診斷為患乳腺癌，并且不攜帶有BRCAl和BRCA2的突變。同時(shí)可得到從患者全血分離的基因組DNA，用于確認(rèn)細(xì)胞系中鑒定的突變。使用患者樣品前以經(jīng)根據(jù)大學(xué)機(jī)構(gòu)的準(zhǔn)則獲得了個(gè)體患者的知情同意。Southern 印跡分析從乳腺癌患者的B淋巴母細(xì)胞系分離的基因組DNA(IOug)，用限制酶I^st I過(guò)夜消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠分離，轉(zhuǎn)移到正電荷的尼龍膜上，用隨機(jī)引物32P標(biāo)記的探針(Stratagene)來(lái)探測(cè)。由外顯子1_3探針?biāo)綔y(cè)的印跡尼龍膜被洗凈后，用外顯子4_5探針重新探測(cè)分別取得結(jié)果。兩種探針都包含如圖如中所示的小內(nèi)含子。實(shí)施例1 :GT198和BRCA2中BRC重復(fù)之間的蛋白質(zhì)序列同源性GT198由亮氨酸拉鏈連接的N末端功能區(qū)和C末端DNA結(jié)合功能區(qū)(DBD)。由于存在下面所述的GT198、BRCA1和BRCA2之間功能的相似性，我們使用ClustalW蛋白質(zhì)同源性分析軟件進(jìn)行BRCAl、BRCA2和GT198的多序列對(duì)齊，鑒定出GT198的C末端DBD與BRCA2中BRC重復(fù)序列同源(圖1)。特別是，GT198的C末端區(qū)域與BRCA2中第三、第四BRC重復(fù)對(duì)齊同源性很高。這三個(gè)序列同源解釋了它們與Rad51結(jié)合的活性同時(shí)也對(duì)GT198中存在潛在的BRC重復(fù)提供了功能性支持。GT198的N末端只顯示了與BRC重復(fù)有限的同源性。它們序列同源性的功能性含義是GT198可以與BRCA2通過(guò)如圖Ic中所示的BRC重復(fù)區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Rad51從而顯示GT198與已知乳腺癌基因功能上相關(guān)。實(shí)施例2 GT198與BRCAl和BRCA2共表達(dá)GT198的內(nèi)源核表達(dá)模式與小鼠中BRCAl和BRCA2表達(dá)極其相似或幾乎沒(méi)有區(qū)別(Chodosh, L. A. , J Mammary Gland Biol Neoplasia，3 :389-402 (1998))。在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的胚胎體的第4天，原始外胚層中GT198蛋白質(zhì)表達(dá)增加。與以前的Northern印跡分析一致(Ko，L.，et al.，Mol Cell Biol，22 :357-69 Q002))，原位雜交顯示在來(lái)自于 E8. 5到E10. 5的神經(jīng)管中GT198 mRNA表達(dá)的增加(未示出數(shù)據(jù))。在所有三個(gè)胚層中在E12. 5表達(dá)出現(xiàn)了峰值，并且在E18. 5中表達(dá)下調(diào)。在成年鼠類中，通過(guò)Western印跡分析分析，GT198蛋白質(zhì)主要在睪丸中被發(fā)現(xiàn)，在胸腺、脾臟和卵巢中限制性表達(dá)(Ko，L.，et al,.MolCell Biol, 22 :357-69 Q002))。與BRCAl類似，也可以在不同組織中檢測(cè)GT198 mRNA表達(dá)。在細(xì)胞水平，GT198蛋白質(zhì)在睪丸的精母細(xì)胞和卵巢的卵母細(xì)胞表達(dá)，這與它在睪丸和卵巢中基本功能一致，因?yàn)樾坌院痛菩訥T198敲除鼠都是不育的(Petulih0Va，G.V. , et al. ,DevCell，5 :927-36 (2003))。在卵巢中，GT198在次級(jí)和Graafian卵泡的粒層細(xì)胞中，而不是在原始卵泡或黃體中高水平核表達(dá)。泡膜細(xì)胞具有低水平的核表達(dá)。該模式與循環(huán)的類固醇激素作用潛在地相關(guān)聯(lián)，因?yàn)镚T198與類固醇受體相互作用，并且刺激受體介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)(Ko，L.，et al，.Mol Cell Biol，22 :357-69 Q002))。GT198、BRCA1 和 BRCA2 表達(dá)之間極其相似的模式(Lane,T. F. , et al. ,Genes Dev，9 :2712-22 (1995) ； Sharan, S. K. &Bradley,Α. , Genomics,40 :234-41 (1997) ；Durocher, F. , et al. , J Histochem Cytochem,45 1173-88(1997) ；Blackshear，P. Ε. , et al.，Oncogene，16 :61-8 (1998))，表明它們?cè)谙嗤陌l(fā)育途徑中可以具有密切的功能性關(guān)系。實(shí)施例3 可變剪接的GT198變異體抑制野生型GT198在人GT198 mRNA表達(dá)的RT-PCR分析期間，鑒定了大量的GT198可變剪接變異體。GT198的可變剪接是組織特異的，在胚胎組織中或在癌細(xì)胞中比在正常成人組織中發(fā)現(xiàn)了更多種類的剪接變異體。測(cè)序結(jié)果表明所有可變剪接事件均嚴(yán)格地出現(xiàn)在GT-AG共有位點(diǎn)，其中一些GT-AG共有位點(diǎn)被NCBI EST證據(jù)所支持。有趣的是，可變剪接的變化總是出現(xiàn)在基因5’的一半個(gè)基因處，并且都產(chǎn)生翻譯提前終止的提前終止密碼子(圖加)。所有變異體轉(zhuǎn)錄物都包含開(kāi)放編碼讀框，該開(kāi)放讀框編碼帶有BRC重復(fù)同源性的DBD(氨基酸126-217)。一些變異體也含有編碼N末端。這些截短形式的潛在蛋白質(zhì)在氨基酸89-117沒(méi)有亮氨酸拉鏈(Ko，L.，et al. ,Mol Cell Biol，22 :357-69 Q002))，因此不會(huì)形成與野生型相似的二聚體。此外，通過(guò)5’ RACE已經(jīng)鑒定了在5’第一外顯子不同的兩種可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。5’末端的較長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物編碼野生型及命名為GT198 1-4的變異體。5’末端的較短轉(zhuǎn)錄物總是保留第一內(nèi)含子，并且編碼命名為GT198a和GT198a-4的變異體。在人和小鼠中均存在雙轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)表明野生型和變異體的啟動(dòng)子的差異使用。值得注意地是，也已知人BRCAl 具有相似的雙轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(hodosh，L. A.，J Mammary Gland Biol Neoplasia^ 389-402(1998))，由于它們較大的尺寸，BRCAl雙轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與每個(gè)變異體的連鎖還沒(méi)有被研究。然后，我們研究了干細(xì)胞分化系統(tǒng)中GT198可變剪接的功能重要性。在人和小鼠干細(xì)胞中，具有內(nèi)含子1保留的變異體GT198a鑒定為主要變異體形式。在視黃酸誘導(dǎo)的小鼠P19干細(xì)胞分化期間，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了明顯減少的GT198a和增加的野生型GT198mRNA,并且通過(guò)定量進(jìn)行了驗(yàn)證(圖2d-e)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)BRCAl和其變異體BRCAl Δ lib具有與GT198和GT198a相似的遞增和遞減轉(zhuǎn)換表達(dá)模式(圖2b_c)，這與以前報(bào)道的小鼠胚胎中 BRCAl 的 Northern 印跡分析一致(Hakem, R. et al.，Cell，85 :1009-23 (1996))。數(shù)據(jù)表明在胚胎體形成期間，調(diào)節(jié)兩個(gè)基因中的雙啟動(dòng)子來(lái)差異地表達(dá)野生型和變異型。通過(guò)使用通用引物同時(shí)檢測(cè)兩者所推斷，變異型GT198a mRNA比野生型GT198 mRNA更多。然而，在蛋白質(zhì)水平，當(dāng)使用GT198蛋白質(zhì)片段作為對(duì)照，通過(guò)Western印跡檢測(cè)時(shí)，GT198a或GT198-4變異體只產(chǎn)生少量的變異體蛋白質(zhì)。甚至當(dāng)存在豐富的變異體mRNA時(shí)，當(dāng)在四3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，只通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)免疫熒光染色可以檢測(cè)到僅痕量的對(duì)應(yīng)于帶有BRC重復(fù)同源性的GT198 DBD的變異體蛋白質(zhì)，這可能是由于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡。因此，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色在正常組織中所檢測(cè)到的核蛋白質(zhì)應(yīng)該主要是野生型GT198蛋白質(zhì)。令人驚奇地，當(dāng)使用小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道基因系統(tǒng)，檢測(cè)P19干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，變異體GT198a和GT198-4顯示了極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄刺激，而野生型GT198反而抑制MMTV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(圖3a-b)。帶有BRC重復(fù)同源性的DBD和防止GT198 二聚化的亮氨酸拉鏈缺失突變體也都顯示了轉(zhuǎn)錄刺激活性。N末端沒(méi)有顯著的活性。與GT198活性需要 DBD 的報(bào)道一致(Enomoto, R. et al.，J Biol Chem, 279 :35沈3_72 Q004))，數(shù)據(jù)表明由所有變異體mRNA編碼的帶有BRC重復(fù)同源性的GT198 DBD與野生型GT198競(jìng)爭(zhēng)，并且抵消野生型的活性。盡管需要進(jìn)一步闡明詳細(xì)的機(jī)理，GT198剪接變異體可以用作天然顯性失活來(lái)拮抗是可信的。除了在蛋白質(zhì)水平的競(jìng)爭(zhēng)，變異體通過(guò)可變剪接mRNA的競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)或通過(guò)已知的下游的RNA干擾，可以阻止野生型mRNA表達(dá)。重要的是，對(duì)于BRCAl或BRCA2，如果可以透徹地研究它們的抑制性變異體，它們很可能存在相似的調(diào)節(jié)。因此，通過(guò)潛在的多個(gè)機(jī)理，GT198的可變剪接變異體可抑制野生型。實(shí)施例4 :GT198剪接變異體的過(guò)表達(dá)阻斷Rad51聚集灶形成，誘導(dǎo)野生型GT198的細(xì)胞調(diào)亡和促進(jìn)其胞漿轉(zhuǎn)位γ -電離輻射后，可檢測(cè)GT198變異體對(duì)Rad51聚集灶形成的作用。用GFP標(biāo)記的Rad51和用Flag標(biāo)記的編碼GT198、或變異體GT198a、GT198_4、或N末端結(jié)構(gòu)域、或帶有BRC重復(fù)同源性的DBD或亮氨酸拉鏈缺失突變體的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。通過(guò)免疫熒光染色分析前，Y-輻射細(xì)胞以誘導(dǎo)Rad51聚集灶。與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照比較，GT198或N末端中沒(méi)有一個(gè)擾亂Rad51聚集灶，而帶有BRC重復(fù)同源性的所有編碼DBD的蛋白質(zhì)，包括兩個(gè)GT198變異體都阻斷了聚集灶形成。聚集灶擾亂引起Rad51不僅在核中均勻表達(dá)，并且也擴(kuò)散到胞質(zhì)中因而喪失功能。有趣的是，盡管野生型GT198是專門地在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，但是所有它的片段、突變體或變異體都成為胞漿表達(dá)。這是因?yàn)樽儺愺w們不能二聚化而二聚化對(duì)于它們的亞細(xì)胞表達(dá)分布是重要的，并且GT198 二聚體參與Rad51相關(guān)的結(jié)合功能(Pezza，R. J.，et al·，Genes Dev，21 :1758-66 (2007))。大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的詳細(xì)檢查表明具有擾亂Rad51聚集灶的細(xì)胞也具有帶皺縮的核的改變的形態(tài)學(xué)。TUNEL測(cè)定證實(shí)含DBD的單體蛋白質(zhì)包含剪接變異體誘導(dǎo)的明顯的細(xì)胞調(diào)亡，伴隨著DNA片段化，表明野生型GT198是培養(yǎng)中細(xì)胞存活必需的。N末端表明胞質(zhì)表達(dá)沒(méi)有細(xì)胞調(diào)亡的誘導(dǎo)或Rad51聚集灶的擾亂，可能因?yàn)镚T198必需的功能單元需要其帶有BRC重復(fù)同源性的DBD。這些數(shù)據(jù)表明BRC重復(fù)區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)或阻斷野生型GT198的正?；钚?。野生型功能的損失觸發(fā)了細(xì)胞調(diào)亡。這個(gè)結(jié)論與上述的轉(zhuǎn)錄研究一致，并且也與報(bào)道的GT198的DBD所需的DNA結(jié)合活性一致(Enomoto，R. et al.，J Biol Chem，279 :35263-72 (2004))。通過(guò)使用抗N或C末端的非重疊抗體，檢查變異體過(guò)表達(dá)以確定是否影響內(nèi)源野生型GT198表達(dá)。結(jié)果揭示內(nèi)源GT198的表達(dá)隨細(xì)胞周期循環(huán)改變。正如已知的BRCAl隨細(xì)胞周期循環(huán)改變被調(diào)節(jié)一樣。當(dāng)用C末端標(biāo)記的變異體分析抗GT198 N末端的抗體時(shí)，在變異體活性的誘導(dǎo)下，內(nèi)源GT198變成胞漿表達(dá)。使用抗GT198 C末端的抗體也觀察到了胞漿表達(dá)。總之，GT198剪接變異體的過(guò)表達(dá)促進(jìn)野生型GT198胞漿轉(zhuǎn)位而抑制野生型，損害Rad51聚集灶的正常形成而抑制修復(fù)路徑，并且如很多癌基因一樣誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。實(shí)施例5 人乳腺癌和卵巢癌及小鼠腫瘤模型中GT198變異體的細(xì)胞漿過(guò)表達(dá)BRCAl是腫瘤抑制基因，并且它的功能缺失易患乳腺癌，卵巢癌和女性生殖系統(tǒng)癌。以前報(bào)道過(guò)高百分比的病例中乳腺癌中胞漿BRCAl過(guò)表達(dá)(Al-Mulla，F(xiàn).，et al.，JHistochem Cytochem, 53 :621-9 Q005))，表明增加的變異體和野生型缺陷之間的聯(lián)系。實(shí)際上，許多鑒定的BRCAl突變改變了其剪接。這一現(xiàn)象在最初促進(jìn)了原發(fā)乳腺癌和卵巢癌中GT198表達(dá)的免疫組織化學(xué)的分析。使用抗全長(zhǎng)GT198的抗體，在組織測(cè)定中，我們用正常對(duì)照篩了選238名卵巢子宮癌病例和114名乳腺癌病例。在卵巢子宮癌病例中，在13. 4%基質(zhì)細(xì)胞和四.8%上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 GT198的胞漿表達(dá)(表1)。正常的人類成人卵巢沒(méi)有胞漿GT198，染色表明胞漿表達(dá)與癌癥有關(guān)。除了良性的纖維瘤和纖維泡膜細(xì)胞瘤外，大多數(shù)卵巢癌沒(méi)有顯示GT198的核染色(未示出)。在卵巢子宮癌的大多數(shù)上皮亞型，包括漿液性的、粘液性的、子宮內(nèi)膜的、透明細(xì)胞的癌中以及在粒泡膜細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了特異的基質(zhì)細(xì)胞中特征性高水平胞漿表達(dá)。在卵巢癌中也可以檢測(cè)到GT198變異體mRNA，并且抗GT198的N和C末端的抗體可以識(shí)別胞漿蛋白質(zhì)，表明在腫瘤中存在變異體表達(dá)或野生型胞漿轉(zhuǎn)位。在一個(gè)病例中，在早期，GT198陽(yáng)性細(xì)胞位于圍繞著卵泡的泡膜細(xì)胞區(qū)域中，而卵泡繼續(xù)變長(zhǎng)，破裂成索狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)檢查大量病例時(shí)，看到在癌癥發(fā)展的較晚期，所積累的粒層細(xì)胞經(jīng)歷了上皮轉(zhuǎn)換以演變成上皮類型。GT198陽(yáng)性細(xì)胞最常在上皮細(xì)胞下發(fā)現(xiàn)，并且在較晚期，當(dāng)腫瘤塊變得明顯時(shí)，它們被擠壓在基質(zhì)區(qū)的通道里。GT198陽(yáng)性細(xì)胞不存在于起源于其它組織位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移腫瘤中，表明卵巢癌發(fā)育中GT198的特異性參與(表1)。還不知道是否這些GT198陽(yáng)性基質(zhì)細(xì)胞與泡膜細(xì)胞有關(guān)。然而，在發(fā)育的癌癥組織中它們的分布模式暗示來(lái)自于每個(gè)上皮亞型的這些陽(yáng)性細(xì)胞可能具有相同的來(lái)源。支持這一發(fā)現(xiàn)的是，相當(dāng)多的證據(jù)以前已經(jīng)證明卵巢表面上皮，也稱作胚上皮和卵泡共有相同的來(lái)源，并且卵子發(fā)生出現(xiàn)在卵巢表面上皮中(Nishida，T. & Nishida，N.，R印rod Biol Endocrinol,4 42(2006) ；Bukovsky，A.，et al.，Endocrine, 26 :301-16 (2005)) 利用 GT198 作為標(biāo)記的觀察資料與激素應(yīng)答的粒層細(xì)胞和泡膜細(xì)胞可以演變成上皮類型的卵巢癌的證據(jù)一致。在114例人乳腺癌病例的分析中，在17. 5%的基質(zhì)細(xì)胞，48. 2%的上皮細(xì)胞或肌上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了胞漿GT198的表達(dá)(表1)。正常乳腺組織除了極少細(xì)胞外，GT198表達(dá)是陰性的。在增生或擾亂的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)中常常發(fā)現(xiàn)胞漿GT198的肌上皮表達(dá)。因?yàn)镚T198調(diào)節(jié)激素刺激的核受體信號(hào)，在肌上皮細(xì)胞中它的改變支持了肌上皮層的激素應(yīng)答(Strum，J. Μ. , Cell Tissue Res，193 :155-61 (1978))現(xiàn)有證據(jù)也證實(shí)在乳腺癌發(fā)育中肌上皮層起至關(guān)重要的作用(Gudjonsson，T.，et al.，J Mammary Gland Biol Neoplasia, 10 261-72(2005)).而且，在帶有MMTV-Ras或多瘤病毒中間T抗原轉(zhuǎn)基因的小鼠腫瘤模型中，與非轉(zhuǎn)基因的正常組織比較，甚至在形態(tài)學(xué)增生出現(xiàn)前，GT198在乳腺腫瘤的基質(zhì)中有大量的胞漿表達(dá)。該數(shù)據(jù)表明病毒癌基因活化誘導(dǎo)了 GT198變異體的過(guò)表達(dá)。因?yàn)镚T198變異體刺激MMTV啟動(dòng)子(圖3a-b)，癌基因MMTV-Ras和GT198變異體表達(dá)之間的正反饋可以有利于腫瘤的起始。當(dāng)轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞累積時(shí)，胞質(zhì)向核GT198轉(zhuǎn)換僅出現(xiàn)在較晚期。
總之，乳腺癌和卵巢癌包含帶有胞漿表達(dá)的GT198陽(yáng)性細(xì)胞。增加的GT198變異體活性會(huì)引起野生型功能的缺陷，并且擾亂從細(xì)胞調(diào)亡所存活下來(lái)細(xì)胞的分化。為了進(jìn)一步確認(rèn)這種觀點(diǎn)，用野生型GT198或變異體GT198a穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的小鼠P19干細(xì)胞注射裸小鼠乳腺。數(shù)據(jù)表明變異體GT198a，而不是野生型GT198轉(zhuǎn)染的細(xì)胞誘導(dǎo)顯著的小鼠乳腺腫瘤生長(zhǎng)。在人卵巢癌和乳腺癌和小鼠腫瘤模型中共同的證據(jù)表明GT198變異體過(guò)表達(dá)是腫瘤發(fā)育期間的早期事件，這反映了 GT198和BRCAl之間緊密的功能性關(guān)系。表1 人乳腺癌和卵巢癌中GT198的胞質(zhì)表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)或幫助癌癥診斷的方法，該方法包括通過(guò)用探針接觸樣品，確定獲自受試者的生物樣品中GT198基因的一個(gè)或多個(gè)突變、改變或重排的存在，該探針對(duì)GT198基因的突變、改變或重排的一個(gè)或多個(gè)改變特異或者對(duì)GT198基因產(chǎn)物特異，以在探針和GT198基因突變、改變或重排或基因產(chǎn)物之間形成可檢測(cè)的復(fù)合物，其中生物樣品中可檢測(cè)的復(fù)合物的存在表示癌癥。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行直接DNA測(cè)序完成檢測(cè)GT198基因的一個(gè)或多個(gè)突變或改變的存在。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)完成檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)DNA拷貝數(shù)改變的存在。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)進(jìn)行凝膠電泳和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分析完成檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)DNA改變或重排的存在。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)進(jìn)行免疫組織化學(xué)完成檢測(cè)GT198和其變異體蛋白質(zhì)表達(dá)的存在。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中生物樣品選自血液、組織和細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中癌癥是卵巢癌。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中癌癥是乳腺癌。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中突變是GT198外顯子4中核苷酸的取代。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中突變是C到T。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中突變是外顯子4的核苷酸85。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中突變引起增加的GT198變異體mRNA的表達(dá)，但是減少的野生型GT198mRNA的表達(dá)。
13.一種用于診斷或幫助癌癥診斷的方法，該方法包括通過(guò)用探針接觸樣品，確定獲自受試者的樣品中GT198的胞漿表達(dá)水平，該探針對(duì)GT198特異以在探針和GT198基因產(chǎn)物之間形成可檢測(cè)的復(fù)合物，其中相對(duì)于對(duì)照升高的GT198胞質(zhì)表達(dá)水平表示癌癥。
14.一種治療癌癥的方法，該方法包括給受試者有效量的藥劑，該藥劑抑制GT198蛋白質(zhì)或含有氨基酸126-217的其顯性失活變異體蛋白質(zhì)或GT198變異體mRNA的生物活性或生物可利用性。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中顯性失活變異體蛋白質(zhì)是GT198a。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中藥劑包含在生理學(xué)條件下，特異性地結(jié)合GT198或其顯性失活變異體蛋白質(zhì)的抗體或其抗原結(jié)合片段。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中抗體選自單克隆、多克隆、單鏈、人源化和嵌合的抗體。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中藥劑選自siRNA、微小RNA、適體和肽核酸。
19.一種治療受試者中癌癥的方法，該方法包括給藥受試者有效量的GT198拮抗劑或GT198變異體拮抗劑以減少GT198或其變異體的生物活性或生物可利用性。
20.一種試劑盒，其包括裝有核酸探針的容器，該核酸探針包含在嚴(yán)格條件下與編碼GT198變異體蛋白質(zhì)的核酸雜交，而在嚴(yán)格條件下不與編碼野生型GT198的核酸雜交的至少10個(gè)核苷酸。
全文摘要
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在染色體17q21基因位點(diǎn)中的人GT198基因(基因符號(hào)PSMC31P)是一個(gè)腫瘤抑制基因。GT198基因突變引起其顯性失活的剪接變異體活性的增加，并且導(dǎo)致野生型GT198功能的喪失，從而誘導(dǎo)乳腺癌和卵巢癌。一個(gè)實(shí)施方式是利用GT198基因突變來(lái)確定方法或藥物用以治療或緩解由于GT198基因突變引起的一種或多種癌癥癥狀。另一個(gè)實(shí)施方式是利用GT198基因突變來(lái)檢測(cè)由GT198基因突變引起的癌癥。此發(fā)明還可進(jìn)一步用于鑒定藥品，藥品為治療由GT198基因突變所引起的癌癥的化合物、抗體和天然產(chǎn)物分子。使用拮抗或干擾GT198剪接變異體生物活性的藥物應(yīng)做為首選藥物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102575285SQ201080024146
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者柯藍(lán) 申請(qǐng)人:柯藍(lán)