專利名稱：多重核酸檢測(cè)方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于單分子克隆擴(kuò)增和核酸分子后續(xù)檢測(cè)的方法和系統(tǒng)，且本發(fā)明尤其涉及判斷單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms ;SNPs)、突變和診斷與這些核酸分子變化有關(guān)的疾病。
背景技術(shù)：
數(shù)十年來(lái),聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction ；PCR)已被廣泛地用于核酸分析的許多領(lǐng)域。單分子PCR(也稱為數(shù)字PCR)是PCR技術(shù)相對(duì)較新的發(fā)展。在單分子PCR中，樣品被稀釋且分配至許多單個(gè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，平均每一個(gè)反應(yīng)具有少于一個(gè)的拷貝模板。一些反應(yīng)沒有模板分子，一些反應(yīng)具有大于一個(gè)拷貝的模板分子，且一定百分比的反應(yīng)剛好具有一個(gè)拷貝的模板。所有反應(yīng)平行進(jìn)行。在這些反應(yīng)中，始于一個(gè)拷貝的模板分子的克隆擴(kuò)增子可使用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)到。關(guān)于樣品中是否具有特定的目標(biāo)分子，分析結(jié)果提供“是”或“否”二進(jìn)制信號(hào)，例如O或I的數(shù)字格式。數(shù)字PCR中所有反應(yīng)的結(jié)果，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行定量。數(shù)字PCR將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)換為線性關(guān)系，且數(shù)字PCR將傳統(tǒng)模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字格式。Vogelstein等人于1999年在Proc. NatlAcad. Sci. USA第96期第9236-9241頁(yè)和美國(guó)專利第6，143，496號(hào)對(duì)于數(shù)字PCR有更詳細(xì)說(shuō)明，所述論文和美國(guó)專利列為本文的參考文獻(xiàn)。數(shù)字PCR的應(yīng)用包括早期癌癥診斷的基因突變檢測(cè)、評(píng)估等位基因不平衡、產(chǎn)前基因測(cè)試、基因表達(dá)的定量分析和DNA甲基化狀態(tài)分析。Pohl等人Expert Rev. Mol. Diagn，2004,4(1) :41-47 ；Blow, Nature Methods,2007,4(10) :869-875 ;Diel 等人 Curr OpinOncol, 2007,19 :36-42 ；Dressman 等人 PNAS,2003,100(15) :8817-8822 ；ffeisenberger 等人Nucleic Acids Res.，2008，36 (14) :4689-4698 ;所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。數(shù)字PCR所基于的單分子擴(kuò)增原理還用于當(dāng)前的第二代DNA測(cè)序技術(shù)中，諸如，Roche LifeSciences 的 DNA 焦憐酸測(cè)序技術(shù),Life Technologies 的 SOLiD DNA 測(cè)序技術(shù)和 Illumina的DNA邊合成邊測(cè)序技術(shù)，用于測(cè)序模板制備。
數(shù)字PCR的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為數(shù)字PCR在類似模板分子的較大背景下仍能檢測(cè)和定量罕見序列變化(諸如，突變)的能力。這是因?yàn)槊恳粋€(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可獨(dú)立于樣品中的其他目標(biāo)分子，因?yàn)橥ㄟ^(guò)限制稀釋模板分子被分配至單個(gè)PCR反應(yīng)中。此種能力可用于對(duì)體液(諸如，來(lái)自結(jié)腸直腸癌患者的血漿樣品和大便樣品)進(jìn)行非侵入性早期癌癥檢測(cè)，如Diehl等人 PNAS，2005，102(45) :16368-16373 ；Diehl 等人 Gastroenterol.，2008，135 (2) :489-498中所描述，所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。本技術(shù)還能夠在母親DNA存在的情況下進(jìn)行非侵入性產(chǎn)前基因測(cè)試，如Lo等人PNAS，2007，104(32) :13116-13121中所描述，所述論文列為本文的參考文獻(xiàn)通過(guò)統(tǒng)計(jì)樣品中的陽(yáng)性PCR反應(yīng)，可使用數(shù)字PCR進(jìn)行定量。通過(guò)判斷所得擴(kuò)增子的標(biāo)識(shí)，可對(duì)變種DNA分子與野生型DNA分子之間的區(qū)別。根據(jù)這些結(jié)果統(tǒng)計(jì)計(jì)算變種DNA分子與野生型DNA分子的比率。數(shù)字PCR還可以用于目標(biāo)分子的絕對(duì)定量?？稍贒ube等人PLoS ONE, 2008, 3 (8), e2876 ;Warren 等人的“The Digital Array Response Curve”(未發(fā)表，見斯坦福大學(xué)網(wǎng)頁(yè) thebigone. Stanford, edu/quake/publications/DigResCurve. pdf)中發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR定量的更多細(xì)節(jié)，所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)?？赏ㄟ^(guò)增加被分析的目標(biāo)分子的數(shù)量(即對(duì)更多PCR反應(yīng)進(jìn)行平行篩選)，以改進(jìn)數(shù)字PCR的精確度和準(zhǔn)確性。當(dāng)前，位于美國(guó)加利福尼亞州南圣弗朗西斯科(South San Francisco)的Fluidigm公司的384孔芯片或48X770數(shù)字陣列微流生物芯片(Digital ArrayNanofluidic Biochip)可用于數(shù)字PCR。這些應(yīng)用中的大部分應(yīng)用利用實(shí)時(shí)PCR來(lái)分析每一個(gè)反應(yīng)中的擴(kuò)增子。文獻(xiàn)中名稱為BEAMing的方法通過(guò)乳膠PCR在磁珠上產(chǎn)生克隆擴(kuò)增子且使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)檢測(cè)和計(jì)數(shù)那些具有擴(kuò)增子的小珠。然而，這些數(shù)字PCR方法因?yàn)槭芸捎脽晒馊緞┑墓鈱W(xué)分辨率的限制而具有有限的多重檢測(cè)能力。從單分子產(chǎn)生克隆擴(kuò)增子的其他方式包括滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circleamplification ；RCA)。RCA為等溫?cái)U(kuò)增方法,在所述方法中核酸探針經(jīng)雜交或連接到目標(biāo)核酸分子上，接著，使用引物多次復(fù)制所述目標(biāo)核酸分子的序列，所述引物與探針序列部分互補(bǔ)。可在 Eriksson 等人，J. Microbiol. Methods, 2009, 78,195-202 ;Baner 等人，NucI.Acids Res.,1998,26(22) :5073-5078 ；Baner 等人，Curr. Opinion Biotech. ,2001,12,11-15中發(fā)現(xiàn)RCA和RCA應(yīng)用的更多詳細(xì)說(shuō)明；所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。RCA還可用于第二代DNA測(cè)序技術(shù)的樣品制備中，Drmanac等人，Science, 2010, 327 :78-81,所述論文列為本文的參考文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于判斷多個(gè)標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽的編碼(ID碼)的方法，所述方法包含(a)在表面上固定多個(gè)分析物分子，其中每一個(gè)分析物分子包含一標(biāo)識(shí)序列標(biāo)簽(IS標(biāo)簽)，且所述標(biāo)識(shí)序列標(biāo)簽可與探針進(jìn)行雜交；(b)將來(lái)自標(biāo)記IS探針(設(shè)定LISP)探針庫(kù)的一對(duì)標(biāo)識(shí)序列標(biāo)記IS探針(LISP)與所述IS標(biāo)簽的堿基審視位置處進(jìn)行雜交，進(jìn)而并置所述一對(duì)LISP，其中所述的每一個(gè)LISP包含(i)與探針雜交的所述IS標(biāo)識(shí)簽序列互補(bǔ)的序列，以及(ii)與所述喊基審視位置處的指定喊基相關(guān)的標(biāo)記；(c)用DNA連接酶連接所述一對(duì)并置的LISP ； (d)在所述分析物分子的所述IS標(biāo)簽上檢測(cè)所述一對(duì)連接LISP上的所述標(biāo)記的存在，且根據(jù)所述一對(duì)連接的LISP的所述標(biāo)記組合，以判定所述IS標(biāo)簽的所述堿基審視位置處的堿基組成；(e)使所述一對(duì)連接的LISP變性而脫離所述分析物分子；(f)重復(fù)步驟(b)至步驟(e)，直到不重復(fù)地審視所述IS標(biāo)簽中的所有堿基位置，且判定所述IS標(biāo)簽的所有堿基組成為止；(g)通過(guò)所述IS標(biāo)簽堿基組成與預(yù)設(shè)ID碼的比較，判斷所述分析物分子上的所述IS標(biāo)簽的ID碼。在一些實(shí)施方式中，在每一個(gè)連接循環(huán)中，可判定所述IS標(biāo)簽上的兩個(gè)指定堿基位置，其中包括在所述配對(duì)LISP探針的每一側(cè)上的一個(gè)所述指定堿基位置。在一些實(shí)施方式中，在每一個(gè)LISP庫(kù)中存在兩組探針，其中一組為所述3'端標(biāo)記IS探針(3' -LISP),所述3'端標(biāo)記IS探針包含5'端磷酸基和3'端標(biāo)記，且另一組為所述5'端標(biāo)記IS探針(5' -LISP),所述5'端標(biāo)記IS探針包含5'端標(biāo)記和3'端輕基。在一些實(shí) 施方式中，在兩組LISP上存在四個(gè)不同的標(biāo)記，其中每一個(gè)標(biāo)記代表所述堿基審視位置處的一個(gè)指定堿基(A、C、G、T)。在每一個(gè)LISP庫(kù)中包含所有所述審視位置處可能堿基組合所需要的所有探針。在一些實(shí)施方式中，在每一個(gè)連接循環(huán)中使用不同LISP庫(kù)；且在每一個(gè)連接循環(huán)中依序?qū)徱曀鯥S標(biāo)簽上的不同堿基位置。在一些實(shí)施方式中，所述LISP上的所述標(biāo)記為熒光染劑、電化學(xué)標(biāo)記或納米顆粒。在一些實(shí)施方式中，所述堿基審視位置處在從每一個(gè)LISP的連接點(diǎn)起的5個(gè)堿基內(nèi)，且優(yōu)選地在3個(gè)堿基內(nèi)，以在所述成對(duì)探針連接步驟中保持所述堿基識(shí)別特異性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供分析樣品中的目標(biāo)核酸序列的方法，所述方法包含(a)從樣品中產(chǎn)生多個(gè)第一模板分子和多個(gè)第二模板分子，其中所述第一模板分子包含第一目標(biāo)核酸序列和第一標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽，且所述第二模板分子包含第二目標(biāo)核酸序列和第二 IS標(biāo)簽，且其中所述第一 IS標(biāo)簽構(gòu)成第一標(biāo)識(shí)(ID)碼且所述第二 IS標(biāo)簽構(gòu)成第二 ID碼；(b)利用克隆擴(kuò)增所述第一模板分子以產(chǎn)生第一群組克隆擴(kuò)增子，且利用克隆擴(kuò)增所述第二模板分子以產(chǎn)生第二群組克隆擴(kuò)增子，其中所述第一群組克隆擴(kuò)增子和所述第二群組克隆擴(kuò)增子在空間上分開定位；以及(c)識(shí)別所述克隆擴(kuò)增子的所述IS標(biāo)簽的所述ID碼，以判斷所述克隆擴(kuò)增子代表的所述目標(biāo)核酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含通過(guò)分析所述第一群組克隆擴(kuò)增子和所述第二群組克隆擴(kuò)增子的序列狀態(tài)，判斷所述目標(biāo)核酸序列的相應(yīng)序列狀態(tài)。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含定量來(lái)自每一個(gè)模板分子的克隆擴(kuò)增子的群組數(shù)量，以推斷所述樣品中的每一個(gè)目標(biāo)核酸序列的量。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含在表面上固定所述第一群組克隆擴(kuò)增子和第二群組克隆擴(kuò)增子。在一些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)核酸序列選自由以下組成的群組基因體DNA、cDNA和 RNA。在一些實(shí)施方式中，使用引物通過(guò)酶促反應(yīng)，以產(chǎn)生所述第一和第二模板分子，其中所述引物包含所述IS標(biāo)簽和序列，所述序列與所述目標(biāo)核酸序列中的至少一部分為互補(bǔ)的序列，且其中維持所述樣品中的所述兩個(gè)目標(biāo)核酸序列的數(shù)量比。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)酶促擴(kuò)增或復(fù)制，在所述表面上產(chǎn)生所述第一和第二群組克隆擴(kuò)增子，其中用于克隆擴(kuò)增或復(fù)制的至少兩個(gè)引物接合于所述表面上且在空間上分開。在一些實(shí)施方式中，在多個(gè)水性液滴中進(jìn)行所述克隆擴(kuò)增，每一個(gè)水性液滴包含DNA擴(kuò)增試劑，所述DNA擴(kuò)增試劑包括多個(gè)引物；以及微粒，其中至少一個(gè)引物接合于所述微粒的表面上。在一些實(shí)施方式中，所述水性液滴由油包水型乳膠形成，且所述水性液滴含于反應(yīng)容器中，其中所述反應(yīng)容器含有油相，且所述油相包含與水不混溶的液體。在一些實(shí)施方式中，所述DNA擴(kuò)增為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，且在所述克隆擴(kuò)增期間所述反應(yīng)容器為熱循環(huán)的。在一些實(shí)施方式中，在親水反應(yīng)點(diǎn)上進(jìn)行模板分子的所述克隆擴(kuò)增，而所述親水反應(yīng)點(diǎn)在疏水表面上形成圖案化，其中每一個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)包含所述水性液滴。在一些實(shí)施方式中，所述親水反應(yīng)點(diǎn)由所述與水不混溶的液體覆蓋，以在所述克隆擴(kuò)增期間防止水相蒸發(fā)且隔離各單個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述DNA擴(kuò)增為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，且在所述克隆擴(kuò)增期間所述表面為熱循環(huán)的。在一些實(shí)施方式中，所述克隆擴(kuò)增通過(guò)所述單鏈模板分子的環(huán)化，且由DNA聚合酶在延伸寡核苷酸上進(jìn)行后續(xù)的等溫滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5'末端接合于所述表面上且其3'末端處與所述環(huán)化模板分子互補(bǔ)，且所述延伸寡核苷酸包含用 于酶促延伸的3'端羥基(3' -OH基)。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)酶促延伸產(chǎn)生至少兩個(gè)拷貝的所述環(huán)化模板分子序列。在一些實(shí)施方式中，所述DNA聚合酶包含Φ29 ΝΑ聚合酶。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)在所述延伸寡核苷酸上連接所述模板分子的兩個(gè)末端，進(jìn)行所述模板分子的所述環(huán)化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述核酸序列為從目標(biāo)核酸序列制備所述模板分子時(shí)所用引物序列中的一部分。在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)化模板分子的長(zhǎng)度介于40個(gè)堿基與400個(gè)堿基之間，且長(zhǎng)度優(yōu)選地介于60個(gè)堿基與200個(gè)堿基之間。在一些實(shí)施方式中，對(duì)所述不同模板分子中的至少兩個(gè)模板分子來(lái)說(shuō)，所述兩個(gè)末端處的所述特定的核酸序列為相同的或不同的。在一些實(shí)施方式中,所述微粒為磁性微粒。在一些實(shí)施方式中，所述微粒的所述表面包含二氧化硅或聚苯乙烯。在一些實(shí)施方式中，所述克隆擴(kuò)增子直接連合至磁性微粒的所述表面。在一些實(shí)施方式中，所述克隆擴(kuò)增子通過(guò)物理力或通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)，在所述表面上固定所述磁性微粒。在一些實(shí)施方式中，其中所述物理力為磁場(chǎng)。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)標(biāo)記探針的依序連接循環(huán)或通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)，同時(shí)判斷所述克隆擴(kuò)增子的所述ID碼，且其中所述ID碼顯示出每一群組克隆擴(kuò)增子所代表的所述目標(biāo)核酸序列。在一些實(shí)施方式中，每一群組克隆擴(kuò)增子的所述序列狀態(tài)包括但不限于單核苷酸多態(tài)、突變或甲基化狀態(tài)，可由本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行判斷。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種用于多重核酸分析的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含可移動(dòng)的流動(dòng)室，所述流動(dòng)室包含第一反應(yīng)表面和第二表面，其中在所述第一反應(yīng)表面中實(shí)施生物反應(yīng)，而所述第二表面包含檢測(cè)窗口，通過(guò)所述檢測(cè)窗口檢測(cè)所述流動(dòng)室內(nèi)部的所述生物反應(yīng)；溫度控制單元，所述溫度控制單元包含導(dǎo)熱層和相關(guān)的加熱元件和冷卻元件，所述相關(guān)的加熱元件和冷卻元件連接到所述導(dǎo)熱層上；和永磁體，所述永磁體施加磁場(chǎng)穿過(guò)所述導(dǎo)熱層；以及任選地，絕熱層，所述絕熱層介于所述導(dǎo)熱層與所述磁體之間，其中所述流動(dòng)室定位于所述導(dǎo)熱層上，以調(diào)節(jié)所述第一反應(yīng)表面的溫度，且所述流動(dòng)室受所述磁場(chǎng)的影響，所述磁場(chǎng)由所述磁體提供；流體控制單元，所述流體控制單元連接至所述流動(dòng)室，以控制試劑傳輸至所述流動(dòng)室且控制試劑從所述流動(dòng)室去除；檢測(cè)單元，所述檢測(cè)單元用于檢測(cè)所述流動(dòng)室的所述第一表面上的適當(dāng)標(biāo)記的存在且判斷所述流動(dòng)室的所述第一表面上的適當(dāng)標(biāo)記的位置；和電子控制單元，所述電子控制單元用于控制且協(xié)調(diào)所述系統(tǒng)的元件，且執(zhí)行資料分析。在一些實(shí)施方式中，所述可移動(dòng)的流動(dòng)室能夠與所述溫度控制單元分開，以在必要時(shí)最小化所述磁場(chǎng)對(duì)所述流動(dòng)室的所述第一反應(yīng)表面的效應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)熱電冷卻器、電阻加熱器以及冷卻風(fēng)扇或熱水和冷水的循環(huán)，執(zhí)行所述溫度調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方式中，所述磁性單元包含永磁體。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)單元包含光學(xué)器件和檢測(cè)器，以通過(guò)所述流動(dòng)室的檢測(cè)窗口進(jìn)行熒光檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包含多個(gè)流動(dòng)室。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種用于涵蓋多重核酸分析的試劑盒。所述試劑盒的一實(shí)施方式包含引物，所述引物含有各種IS標(biāo)簽，以在模板分子制備中進(jìn)行基因特異性預(yù)擴(kuò)增；LISP探針，用熒光染色標(biāo)記所述LISP探針，所述熒光染色的光譜與檢測(cè)器的能力和其他所需試劑兼容。


圖Ia為將IS標(biāo)簽嵌入模板分子和克隆擴(kuò)增的方法示意圖。圖Ib為將IS標(biāo)簽嵌入模板分子和克隆擴(kuò)增的另一個(gè)方法示意圖。圖Ic為通過(guò)單分子滾環(huán)擴(kuò)增將IS標(biāo)簽嵌入模板分子和克隆擴(kuò)增的方法示意圖。圖2為流動(dòng)室和流動(dòng)室內(nèi)部磁性微粒分布的示意圖。圖3圖示一系列單個(gè)PCR反應(yīng)液滴，該等反應(yīng)液滴在圖案化表面上含有磁性微粒，所述圖案化表面由油層覆蓋，在過(guò)度去除油后由外部磁力將這些磁性微粒維持于表面上。圖4示出用于IS標(biāo)簽測(cè)定的依序成對(duì)探針連接化學(xué)作用的原理。圖5a :表I顯示來(lái)自IS標(biāo)簽的可能ID碼的色碼和相應(yīng)的堿基組成的實(shí)例。圖5b 表2顯示特定的堿基碼。表3顯示同義的堿基碼。圖6示出轉(zhuǎn)移ID窗口以供依序成對(duì)探針連接的原理。圖7圖示系統(tǒng)的實(shí)例。圖8圖示使用多重核酸分析進(jìn)行非侵入性癌癥早期檢測(cè)的實(shí)例。圖9示出本發(fā)明的示范性實(shí)施方式。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供用于同時(shí)分析多個(gè)目標(biāo)核酸序列的方法和系統(tǒng)，諸如用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證以及臨床診斷的多個(gè)生物標(biāo)記檢測(cè)。A.由標(biāo)識(shí)序列標(biāo)簽進(jìn)行多重核酸分析在一個(gè)方面，本發(fā)明提供分析樣品中的目標(biāo)核酸序列的方法。本文中，用“核酸”或“寡核苷酸”或者語(yǔ)法上的等效物表示至少兩個(gè)共價(jià)連接在一起的核苷酸。通常，本發(fā)明的核酸將含有磷酸二酯鍵，但是在一些情況下，例如在引物含有標(biāo)記時(shí)，可使用核酸類似物。核酸可為DNA (基因組DNA和cDNA)、RNA或雜合體，其中核酸含有去氧核醣核苷酸與核糖核苷酸的任意組合和堿基的任意組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核苷”包括核苷酸和核苷和核苷酸類似物，以及修飾核苷，諸如標(biāo)記修飾核苷。
本文中，用“目標(biāo)核酸序列”或“目標(biāo)序列”或者語(yǔ)法上的等效物表示單鏈核酸上的核酸序列。目標(biāo)序列可為基因、調(diào)控序列、基因組DNA、cDNA、RNA (包括mRNA和rRNA)或其他序列中的一部分。目標(biāo)序列可為任意長(zhǎng)度，同時(shí)應(yīng)了解較長(zhǎng)序列更具有特異性。在一些實(shí)施方式中，可能理想的為，將樣品核酸裂解或切割成100個(gè)堿基對(duì)至10，000個(gè)堿基對(duì)的片段，在一些實(shí)施方式中優(yōu)選大致500個(gè)堿基對(duì)的片段。如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)，互補(bǔ)的目標(biāo)序列可采用許多形式。例如，目標(biāo)序列可含于較大核酸序列內(nèi)，即，基因或mRNA中的全部或一部分、質(zhì)粒DNA或基因組DNA中的一限制性片段及其他基因序列。如本文中所概述，在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)序列包含需要序列信息的位置，在本文中通常稱為“檢測(cè)位置”或“檢測(cè)位點(diǎn)”。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)位置為單核苷酸，但是在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)位置可包含 多個(gè)核苷酸，既可彼此接近也可由一或更多個(gè)核苷酸分離開來(lái)。如本文所用的“多個(gè)”表示至少兩個(gè)。如本文所用，與雜合體中的檢測(cè)位置堿基進(jìn)行堿基配對(duì)的堿基稱為“讀出位置”或“審視位置”；因此本發(fā)明的許多探針包含審視位置。在一些實(shí)施方式中，如本文中所概述，目標(biāo)序列可能不是樣品目標(biāo)序列而是擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，在本文中有時(shí)稱為“衍生”目標(biāo)序列、“模板分子”或擴(kuò)增子。本文中，用“擴(kuò)增子”表示核酸分子，所述核酸分子通過(guò)擴(kuò)增方法生成。通常，由PCR方法(包括多重PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增子可能為雙鏈DNA分子或單鏈DNA分子。如下所述，可使用能增加其中一鏈的擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的擴(kuò)增子包括目標(biāo)核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò)增子含有核酸目標(biāo)鏈和第二核酸目標(biāo)鏈，所述核酸目標(biāo)鏈由本文所述的方法擴(kuò)增，所述核酸目標(biāo)鏈含有如下文所述的兩個(gè)或兩個(gè)以上目標(biāo)域，所述第二核酸目標(biāo)鏈與第一核酸鏈互補(bǔ)。用“單鏈目標(biāo)核酸”、“單鏈目標(biāo)”、“單鏈目標(biāo)序列”或所述術(shù)語(yǔ)語(yǔ)法上的等效物表示用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法的起始材料。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的目標(biāo)序列含有與探針序列大體上互補(bǔ)的區(qū)域，如本文中所定義。包含目標(biāo)序列的樣品可實(shí)際上來(lái)自任意有機(jī)體和任意源，所述有機(jī)體和源包括但不限于體液(包括但不限于，實(shí)際上任意有機(jī)體樣品的血液、骨髓、尿、排泄物、淚液、血清、淋巴液、唾液、肛門和陰道分泌物、汗液、精液和其他體液，任意有機(jī)體諸如包括人類的哺乳動(dòng)物)；細(xì)菌和病菌(包括病毒)的細(xì)胞裂解物；硬組織(例如器官，諸如肝臟、脾臟、腎、心臟、肺等)；環(huán)境樣品(包括但不限于，空氣樣品、農(nóng)業(yè)樣品、水樣品和土壤樣品)；生物戰(zhàn)劑樣品；研究樣品(即，樣品可為擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括諸如PCR擴(kuò)增反應(yīng)的目標(biāo)擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增，如通常在W099/037819中所描述，所述專利列為本文的參考文獻(xiàn))；純化樣品，諸如純化基因體DNA、RNA、蛋白質(zhì)等；原樣(細(xì)菌、病毒、基因體DNA等)；如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)知，可對(duì)樣品進(jìn)行任意實(shí)驗(yàn)操作。如果需要的話，那么使用已知的技術(shù)來(lái)制備目標(biāo)序列。例如，可使用已知的裂解液、電穿孔等，處理樣品以溶解細(xì)胞，其中根據(jù)需要進(jìn)行純化和/或擴(kuò)增，如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供基因特異性預(yù)擴(kuò)增的方法，將設(shè)定的IS標(biāo)簽和IS碼嵌入基于目標(biāo)核酸序列所產(chǎn)生的擴(kuò)增子?；蛱禺愋灶A(yù)擴(kuò)增已廣泛用于核酸分析，諸如，基因分型、基因表達(dá)分析和臨床診斷中的樣品制備。Li 等人，Nucleic Acids Res. , 1996, 24 :538-539 ;Mengual 等人,BMCResearch Notes, 2008 年 6 月，I :21 ;Xia 等人，Genet. Mol. Biol. ；2009 :20-24 ；Arneson等人，Cold Spring Harb. Protoc, “Whole-Genome Amplification by Improved PrimerExtension Preamplification PCR(I-PEP-PCR) ”，2008 ;所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包含從樣品中產(chǎn)生多個(gè)第一模板分子和多個(gè)第二模板分子，第一模板分子包含第一目標(biāo)核酸序列和第一標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽，且第二模板分子包含第二目標(biāo)核酸序列和第二 IS標(biāo)簽，并且第一 IS標(biāo)簽構(gòu)成第一 ID碼且第二 IS標(biāo)簽構(gòu)成第二 ID碼。
在一些實(shí)施方式中，使用引物，通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)生第一和第二模板分子，所述引物包含IS標(biāo)簽和序列，所述序列與目標(biāo)核酸序列中的至少一部分互補(bǔ)，其中保留樣品中的兩個(gè)目標(biāo)核酸序列的數(shù)量比。本文中，用“標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽”表示較短人造DNA序列，所述較短人造DNA序列用于樣品分析物間識(shí)別特定目標(biāo)分子的編碼。在一些實(shí)施方式中，IS的長(zhǎng)度小于6個(gè)堿基或小于10個(gè)堿基。IS標(biāo)簽還可包含額外的核酸序列，所述額外的核酸序列在解碼處理期間為探針雜交所需要。通常，將IS標(biāo)簽設(shè)計(jì)為不同于核酸分析中目標(biāo)基因體序列。在一些實(shí)施方式中，引入這些IS標(biāo)簽作為樣品制備中的一部分。本文中，用“標(biāo)識(shí)(ID)碼”表示分配給IS標(biāo)簽的代碼。每一個(gè)IS標(biāo)簽的堿基組成對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定的ID碼。在一些實(shí)施方式中，第一和第二目標(biāo)核酸序列的豐度類似。在一些實(shí)施方式中，第一目標(biāo)核酸序列比第二目標(biāo)核酸序列豐富至少100倍、1000倍或10，000倍。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包含通過(guò)第一模板分子的克隆擴(kuò)增產(chǎn)生第一群組克隆擴(kuò)增子，且通過(guò)第二模板分子的克隆擴(kuò)增產(chǎn)生第二群組克隆擴(kuò)增子，其中第一群組克隆擴(kuò)增子和第二群組克隆擴(kuò)增子在空間上分離定位。本文中，用“克隆擴(kuò)增子”或“擴(kuò)增子克隆”表示擴(kuò)增子群組，擴(kuò)增子群組可直接或間接地追溯到分離的多核苷酸。本文中，用“克隆擴(kuò)增”表示分離且擴(kuò)增多核苷酸以產(chǎn)生“擴(kuò)增子克隆”或“克隆擴(kuò)增子”的方法。本文中，用“在空間上分離定位”表示兩個(gè)或兩個(gè)以上群組擴(kuò)增子在空間上定位不同。例如，不同群組擴(kuò)增子可定位于相同表面上的不同點(diǎn)上、或定位于不同表面上，諸如本文所述的不同微粒表面上。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)酶促擴(kuò)增或復(fù)制，在表面上產(chǎn)生第一和第二群組克隆擴(kuò)增子，其中在克隆擴(kuò)增期間，用于擴(kuò)增或復(fù)制的至少兩個(gè)引物連接至表面且在空間上分離開來(lái)。在一些實(shí)施方式中，多簇克隆擴(kuò)增子接合至表面上?？寺U(kuò)增子直接或間接地連接至表面。在一些實(shí)施方式中，克隆擴(kuò)增子接合至磁性微粒的表面，且通過(guò)本文所述或本領(lǐng)域已知的物理力(例如，磁場(chǎng))或通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)，在表面上固定磁性微粒。在一些實(shí)施方式中，識(shí)別所述克隆擴(kuò)增子的IS標(biāo)簽的ID5馬，以判定由本文所述的克隆擴(kuò)增子代表的目標(biāo)核酸序列。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)分析克隆擴(kuò)增子的所述群組序列狀態(tài)，判斷目標(biāo)核酸序列的相應(yīng)序列狀態(tài)。本文中，用“序列狀態(tài)”表示序列特征，諸如單核苷酸多態(tài)、突變或甲基化。序列狀態(tài)可由本領(lǐng)域已知或本文中所公開的方法進(jìn)行判斷，方法包括但不限于標(biāo)記探針連接、單堿基延伸、DNA測(cè)序和熔解曲線分析。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含通過(guò)累加含有同一 IS標(biāo)簽的克隆擴(kuò)增子群組數(shù)，定量來(lái)自每一個(gè)模板分子的克隆擴(kuò)增子的簇組數(shù)量，根據(jù)已知的用于樣品制備中的稀釋倍率，以推斷樣品中的每一個(gè)目標(biāo)核酸序列的量。通常，單分子克隆擴(kuò)增中的模板分子的隨機(jī)分布遵循泊桑(Poisson)分布。C反應(yīng)腔室中的M模板分子的隨機(jī)分布遵循泊桑分布。在給定反應(yīng)腔室中具有至少一個(gè)模板分子的概率表示為P，
權(quán)利要求
1.一種用于判斷多個(gè)標(biāo)識(shí)序列標(biāo)簽的標(biāo)識(shí)碼的方法，所述方法包含以下步驟 (a)在一表面上固定多個(gè)分析物分子,其中每一個(gè)分析物分子包含一標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽，且所述標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽可與探針進(jìn)行雜交； (b)將來(lái)自標(biāo)記IS探針(LISP)庫(kù)的一對(duì)LISP與所述IS標(biāo)簽在堿基審視位置處進(jìn)行雜交，進(jìn)而并置所述一對(duì)LISP，其中每一個(gè)所述LISP包含(i)與所述探針雜交的所述IS標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列，以及(ii)與所述喊基審視位置處的指定喊基相關(guān)的標(biāo)記； (c)連接所述一對(duì)并置的LISP； (d)在所述分析物分子的所述IS標(biāo)簽上檢測(cè)所述一對(duì)連接的LISP上所述標(biāo)記的存在，且根據(jù)所述一對(duì)連接的LISP的所述標(biāo)記組合，判定所述IS標(biāo)簽的所述堿基審視位置處的喊基組成； (e)使所述一對(duì)連接的LISP變性而脫離所述分析物分子； (f)重復(fù)步驟(b)至步驟(e)，直到不重復(fù)地審視所述IS標(biāo)簽中的所有堿基位置，且判定所述IS標(biāo)簽的所有喊基組成為止；和 (g)通過(guò)比較所述堿基組成與預(yù)定ID碼，判斷所述分析物分子上的所述IS標(biāo)簽的所述ID碼。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中審視所述IS標(biāo)簽上的兩個(gè)指定堿基位置，包括在所述一對(duì)連接的LISP的每一側(cè)上的一個(gè)所述指定堿基位置。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中在每一個(gè)LISP庫(kù)中存在兩組探針，其中一組為3'端標(biāo)記的IS探針(3' -LISP),所述3'端標(biāo)記的IS探針包含5'端磷酸基和3’端標(biāo)記，且另一組為5'端標(biāo)記的IS探針(5' -LISP),所述5'端標(biāo)記IS探針包含5'端標(biāo)記和3'端羥基。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中在兩組LISP上存在四個(gè)不同的標(biāo)記，其中每一個(gè)標(biāo)記代表所述審視位置處的一個(gè)指定堿基(A、C、G、T)，且其中在每一個(gè)LISP庫(kù)中包含所述審視位置處的所有可能堿基組合所需要的所有探針。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中在每一個(gè)連接循環(huán)中使用不同LISP庫(kù)，且其中在每一個(gè)連接循環(huán)中依序?qū)徱曀鯥S標(biāo)簽上的不同堿基位置。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述LISP上的所述標(biāo)記包含熒光染劑、電化學(xué)標(biāo)記或納米顆粒。
7.如權(quán)利要求I至6中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述堿基審視位置處在距每一個(gè)LISP的連接點(diǎn)起的5個(gè)堿基內(nèi)，且優(yōu)選地在3個(gè)堿基內(nèi)，以在所述成對(duì)探針連接步驟中保持堿基識(shí)別特異性。
8.—種分析樣品中的目標(biāo)核酸序列的方法，所述方法包含 (a)從樣品中產(chǎn)生多個(gè)第一模板分子和多個(gè)第二模板分子，其中所述第一模板分子包含第一目標(biāo)核酸序列和第一標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽，且所述第二模板分子包含第二目標(biāo)核酸序列和第二 IS標(biāo)簽，并且其中所述第一 IS標(biāo)簽構(gòu)成第一標(biāo)識(shí)(ID)碼且所述第二 IS標(biāo)簽構(gòu)成第二 ID碼； (b)利用克隆擴(kuò)增所述第一模板分子以產(chǎn)生第一群組克隆擴(kuò)增子，且利用克隆擴(kuò)增所述第二模板分子以產(chǎn)生第二群組克隆擴(kuò)增子，其中所述第一群組克隆擴(kuò)增子和所述第二群組克隆擴(kuò)增子在空間上分開定位；和(C)識(shí)別所述克隆擴(kuò)增子的所述IS標(biāo)簽的所述ID碼，以判斷所述克隆擴(kuò)增子代表的所述目標(biāo)核酸序列。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含通過(guò)分析所述群組克隆擴(kuò)增子的序列狀態(tài)，判斷所述目標(biāo)核酸序列的相應(yīng)序列狀態(tài)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含定量來(lái)自每一個(gè)模板分子的克隆擴(kuò)增子的群組數(shù)量，以推斷所述樣品中的每一個(gè)目標(biāo)核酸序列的量，且任選地定量所述樣品中的所述參考序列。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含在表面上固定所述第一群組克隆擴(kuò)增子和第二群組克隆擴(kuò)增子。
12.如權(quán)利要求8至12中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一目標(biāo)核酸序列和第二目標(biāo)核酸序列可為相同的或可為不同的，且可以存在更多所述第一和第二目標(biāo)核酸序列。
13.如權(quán)利要求8至12中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述目標(biāo)核酸序列選自由以下組成的群組基因體DNA、cDNA和RNA。
14.如權(quán)利要求8至12中的任一項(xiàng)所述的方法，其中使用引物通過(guò)酶促反應(yīng)，以產(chǎn)生所述第一模板分子和第二模板分子，所述引物包含所述IS標(biāo)簽和序列，所述序列與所述目標(biāo)核酸序列中的至少一部分為互補(bǔ)，且其中維持所述樣品中的所述兩個(gè)目標(biāo)核酸序列的數(shù)量比。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中通過(guò)酶促擴(kuò)增或復(fù)制，在所述表面上產(chǎn)生所述第一和第二群組克隆擴(kuò)增子，其中在所述克隆擴(kuò)增期間，用于所述擴(kuò)增或復(fù)制的至少兩個(gè)所述引物是接合于所述表面且在空間上分開的。
16.如權(quán)利要求8至15中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述克隆擴(kuò)增在多個(gè)水性液滴中進(jìn)行，且每一個(gè)水性液滴包含 DNA擴(kuò)增試劑，所述DNA擴(kuò)增試劑包括多個(gè)引物；和 微粒，其中至少一個(gè)所述引物是接合于所述微粒的表面上。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述水性液滴由油包水型乳膠形成，且所述油包水型乳膠置于反應(yīng)容器中，其中所述反應(yīng)容器含有與水不混溶的液體。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述DNA擴(kuò)增為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，且在所述克隆擴(kuò)增期間所述反應(yīng)容器為熱循環(huán)的。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中在親水反應(yīng)點(diǎn)上進(jìn)行模板分子的所述克隆擴(kuò)增，而所述親水反應(yīng)點(diǎn)在疏水表面上形成圖案化，且其中每一個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)包含所述水性液滴。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述親水反應(yīng)點(diǎn)由與水不混溶的液體覆蓋，以在所述克隆擴(kuò)增期間防止水相蒸發(fā)且隔離各單個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)。
21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述DNA擴(kuò)增是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，且在所述克隆擴(kuò)增期間所述表面為熱循環(huán)的。
22.如權(quán)利要求8至17、19和20中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述克隆擴(kuò)增通過(guò)所述單鏈模板分子的環(huán)化由DNA聚合酶在延伸寡核苷酸上進(jìn)行后續(xù)的等溫滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5'末端接合于所述表面或微粒上，且其3'末端處與所述環(huán)化模板分子互補(bǔ)，且所述延伸寡核苷酸包含用于酶促延伸的自由3'端羥基。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中通過(guò)所述酶促延伸產(chǎn)生至少兩個(gè)拷貝的所述環(huán)化模板分子序列。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述DNA聚合酶包含O29DNA聚合酶。
25.如權(quán)利要求22至24中的任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)在所述延伸寡核苷酸上連接所述單鏈模板分子的所述兩個(gè)末端，進(jìn)行所述模板分子的環(huán)化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述特定核酸序列為產(chǎn)生所述模板分子所用的引物序列中的一部分。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中對(duì)至少兩個(gè)所述不同的模板分子來(lái)說(shuō)，所述兩個(gè) 末端處的所述特定的核酸序列為相同的或不同的。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述環(huán)化模板分子的長(zhǎng)度介于40個(gè)堿基與400個(gè)堿基之間，且長(zhǎng)度優(yōu)選地介于60個(gè)堿基與200個(gè)堿基之間。
28.如權(quán)利要求16至27中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微粒為磁性微粒。
29.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述微粒的所述表面包含二氧化硅或聚苯乙烯。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述克隆擴(kuò)增子接合于磁性微粒的所述表面，且其中通過(guò)物理力或通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)，在所述表面上固定所述磁性微粒。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述物理力為磁場(chǎng)。
32.如權(quán)利要求8所述的方法，其中通過(guò)標(biāo)記探針的依序連接循環(huán)或通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)，同時(shí)判斷所述克隆擴(kuò)增子的所述ID碼，且所述每一群組克隆擴(kuò)增子的ID碼顯示出每一群組克隆擴(kuò)增子所代表的所述目標(biāo)核酸序列。
33.一種用于多重核酸分析的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含 可移動(dòng)的流動(dòng)室，所述流動(dòng)室包含第一反應(yīng)表面和第二表面，其中在所述第一反應(yīng)表面中實(shí)施生物反應(yīng)，而所述第二表面包含檢測(cè)窗口，通過(guò)所述檢測(cè)窗口檢測(cè)所述流動(dòng)室內(nèi)部的所述生物反應(yīng)； 溫度控制單元，所述溫度控制單元包含導(dǎo)熱層和相關(guān)的加熱元件和冷卻元件，所述相關(guān)的加熱元件和冷卻元件連接到所述導(dǎo)熱層上；和永磁體，所述永磁體施加磁場(chǎng)穿過(guò)所述導(dǎo)熱層；以及任選地，絕熱層，所述絕熱層介于所述導(dǎo)熱層與所述磁體之間，其中所述流動(dòng)室定位于所述導(dǎo)熱層上，以調(diào)節(jié)所述第一反應(yīng)表面的溫度，且所述流動(dòng)室受所述磁場(chǎng)的影響，所述磁場(chǎng)由所述磁體提供； 流體控制單元，所述流體控制單元連接至所述流動(dòng)室，以控制試劑傳輸至所述流動(dòng)室且控制試劑從所述流動(dòng)室去除； 檢測(cè)單元，所述檢測(cè)單元用于檢測(cè)所述流動(dòng)室的所述第一表面上的適當(dāng)標(biāo)記的存在且判斷所述流動(dòng)室的所述第一表面上的適當(dāng)標(biāo)記的位置；和 電子控制單元，所述電子控制單元用于控制且協(xié)調(diào)所述系統(tǒng)的元件，且執(zhí)行資料分析。
34.如權(quán)利要求33所述的系統(tǒng)，其中所述可移動(dòng)的流動(dòng)室能夠與所述溫度控制單元分開，以在必要時(shí)最小化所述磁場(chǎng)對(duì)所述流動(dòng)室的所述第一反應(yīng)表面的效應(yīng)。
35.如權(quán)利要求33所述的系統(tǒng)，其中通過(guò)熱電冷卻器、電阻加熱器以及冷卻風(fēng)扇或熱水和冷水的循環(huán)，執(zhí)行所述溫度調(diào)節(jié)。
36.如權(quán)利要求33所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包含多個(gè)流動(dòng)室，以在所述流動(dòng)室中同時(shí)執(zhí)行不同操作或反應(yīng)。
37.一種用于多重核酸分析的試劑盒，所述試劑盒包含酶促反應(yīng)引物，其中一些所述引物包含標(biāo)識(shí)序列(IS)標(biāo)簽；以及 標(biāo)記探針庫(kù)，其中所述標(biāo)記探針庫(kù)包含多個(gè)標(biāo)記IS探針(LISP)。
38.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中每一個(gè)標(biāo)記探針庫(kù)包含兩組LISP，一組為3' -LISP，而另一組為5' -LISP，且其中每一組LISP包含的所有探針含有一指定堿基審視位置處。
39.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中在每一組LISP上存在四個(gè)不同的標(biāo)記，每一個(gè)標(biāo)記代表所述審視位置處的一指定堿基(A、C、G、T)，且其中在每一個(gè)LISP庫(kù)中包括所述審視位置處所有可能堿基組合所需要的所有探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于單分子克隆擴(kuò)增和后續(xù)檢測(cè)核酸分子的方法和系統(tǒng)，且本發(fā)明尤其涉及判斷單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、突變和診斷與這些核酸分子變化有關(guān)的疾病。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102625850SQ201080024654
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者蒂莫西·Z·劉 申請(qǐng)人:蒂莫西·Z·劉