專利名稱：營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品用質(zhì)量控制生物測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實施方案大體上涉及食品、營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品對人類或動物健康有益的特性的測定。本發(fā)明的實施方案進一步包括食品、營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品的制造方法，當通過改進的測定方法來定量測定時，所述食品、營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品可以調(diào)節(jié)某核酸或蛋白質(zhì)生物標記物的水平，所述核酸或蛋白質(zhì)生物標記物與疾病預(yù)防或治療相關(guān)或者處于指示疾病預(yù)防或治療的形式。
背景技術(shù)：
信使RNA(mRNA)的翻譯起始在調(diào)控細胞生長和惡性轉(zhuǎn)化中起決定性的作用，這是因為大多數(shù)致癌和細胞生長調(diào)控蛋白是在翻譯上調(diào)控的(Flyrm等人，1996，Cancer Surv. 27 293 ；Sonenberg等人，1998，Curr. Opin. Cell Biol. 10 268)。由于該原因，翻譯起始是嚴密調(diào)控的細胞進程。翻譯起始負調(diào)控的失敗可導(dǎo)致癌癥的誘發(fā)、發(fā)作和發(fā)展(Donze 等)κ, 1995, Embo J. 14 :3828 ；Rosenwald, 1996, Bioessays 18 :243-50 ；De Benedetti 等人，2004，Oncogene 23 :3189-99 ；和 Rosenwald，2004，Oncogene 23:3230)。弱調(diào)控的翻譯起始的抑制也可引起轉(zhuǎn)化表型的逆轉(zhuǎn)(Jiang等人，2003，Cancer Cell Int. 3 :2，Graff 等人，1995，Int. J. Cancer 60 :255)。eIF2 · GTP · Met-tRNAi 復(fù)合體(也稱為三元復(fù)合體) 是翻譯起始的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)因子。限制其有效性削減了蛋白質(zhì)翻譯新一輪的起始。雖然許多致癌蛋白和其它細胞生長因子的翻譯在很大程度上于依賴所述三元復(fù)合體，但持家基因的翻譯卻不同，由于該原因，有助于限制所述三元復(fù)合體的量、有效性或活性的食品、營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品可能提供預(yù)防和治療疾病的安全的手段。此外，在三元復(fù)合體或更一般來講翻譯起始的抑制劑的存在下，某些腫瘤抑制劑以及前凋亡基因和/或蛋白質(zhì)的表達事實上增加。致癌蛋白翻譯的減少，特別是連同腫瘤抑制劑和前凋亡基因的上調(diào)，傾向于全面阻止和/或抑制惡性表型。在源于魚類、特別是原產(chǎn)自寒冷海水的野生種群的那些的油中發(fā)現(xiàn)大量二十碳五烯酸(EPA)，一種n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)。養(yǎng)殖魚類與野生魚類相比典型地包含相當?shù)退降膎-3PUFA。已觀察到當用海洋魚油對人類前列腺癌患者給藥時，eIF2 α被磷酸化，表明功能性eIF2對三元復(fù)合體的有效性已降低，這與在動物模型或基于細胞的實驗體系中使用EPA和三元復(fù)合體的合成抑制劑的發(fā)現(xiàn)相一致。因此，包含翻譯起始抑制劑的飲食補充劑(dietary supplements)代表對治療和/或預(yù)防癌癥和/或增殖性疾病(其中異常細胞增殖為特征性的病理異常)具有吸引力的商品。此類飲食補充劑也可用作翻譯起始調(diào)節(jié)劑，并代表對治療和/或預(yù)防代謝疾病如肥胖癥和糖尿病具有吸引力的商品。對于消費者可廣泛地得到各種來源的魚油來作為食品或營養(yǎng)補充劑 (nutritional supplement)。包含于產(chǎn)品的不同生產(chǎn)小批(lot)、大批(batch)、樣品或劑量的油或源于油的餾分或組分可在質(zhì)量或效價上有所變化，這取決于其來源(例如，氣候、 魚種類或生長條件、供應(yīng)商)或加工條件。產(chǎn)品的單一小批、大批、樣品或劑量的含量甚至可為同樣的情況。包含翻譯起始的自然或合成抑制劑的其它食品、營養(yǎng)制品或醫(yī)藥產(chǎn)品可在質(zhì)量或效價上因類似的原因而變化。對于產(chǎn)品對潛在消費者的生理效應(yīng)或藥效需要質(zhì)量控制和/或保證。

發(fā)明內(nèi)容
對人類疾病具有治療/預(yù)防作用的飲食補充劑代表了世界范圍內(nèi)快速發(fā)展、擁有數(shù)十億美金的產(chǎn)業(yè)。然而，該產(chǎn)業(yè)中主要的未解決的問題是缺少對提取于自然資源的產(chǎn)品的質(zhì)量控制以保證特定的生物學活性和效價、在提取/生產(chǎn)自相同植物/動物來源的不同制劑中生物學活性上的均質(zhì)性、以及在提取自相同植物或動物物種但源于不同地理區(qū)域和 /或工業(yè)來源的制劑中相當?shù)男r。翻譯起始的抑制劑、上調(diào)劑或其它調(diào)節(jié)劑具有廣譜抗癌、抗細胞增殖的效果以及對能量平衡的廣譜效果。包含翻譯起始的抑制劑、上調(diào)劑或其它調(diào)節(jié)劑的營養(yǎng)制品包括但不限于魚油制劑，其可用于預(yù)防特征為包括癌癥的異常細胞增殖的人類疾病。然而，目前確定該種營養(yǎng)制品生物學活性的生物測定的缺失，使其無法控制不同品牌或來源中或來自單一品牌或來源的不同大批或產(chǎn)品中的其質(zhì)量、效價和/或均質(zhì)性。因此，在某些示例性實施方案中，提供食品、營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品在該產(chǎn)品調(diào)節(jié) mRNA翻譯起始的能力方面的質(zhì)量控制和/或保證方法，從而著手滿足向消費者提供關(guān)于該產(chǎn)品潛在健康益處的準確信息的需求。提供翻譯起始特異的生物測定，其可用于定量評價化合物，如包含翻譯起始抑制齊U、上調(diào)劑或調(diào)節(jié)劑的營養(yǎng)制品的生物學活性。本文所提供的翻譯起始特異的測定對營養(yǎng)制品的質(zhì)量(如，生物學活性)、效價和大批均質(zhì)性(batch homogeneity)進行評價，所述營養(yǎng)制品包含產(chǎn)品，例如用作翻譯起始抑制劑、上調(diào)劑或其它調(diào)節(jié)劑的內(nèi)源產(chǎn)品或添加劑。這些測定方法提供精確而快速的手段來確定食品、營養(yǎng)制品或醫(yī)藥產(chǎn)品的給定樣品可調(diào)節(jié)翻譯起始的程度，并從而對消耗此類產(chǎn)品或?qū)ζ涫┯么祟惍a(chǎn)品的人類或動物有益。這些測定方法通常允許對此類產(chǎn)品的樣品抑制mRNA翻譯起始的能力進行測驗。本文所描述的示例性測定能夠檢測樣品抑制三元復(fù)合體的形成、有效性或活性的能力，而不管三元復(fù)合體是否經(jīng)歷eIF2a的磷酸化或其它方式。在某些示例性實施方案中，可對產(chǎn)品樣品上調(diào)翻譯某些mRNA轉(zhuǎn)錄本的能力進行測驗。此類轉(zhuǎn)錄本的翻譯的上調(diào)可表明包含于此類樣品中的EPA或其它3-n PUFA的存在、 水平、有效性和/或活性。在某些實施方案中，可檢測到樣品增加某些mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯的能力，所述mRNA轉(zhuǎn)錄本的5'非翻譯區(qū)(5' UTRs)包含兩個以上開放閱讀框(ORFs)。在某些實施方案中，樣品使ATF-4、BRCAl mRNAb、⑶59、TCTP和GCN4中的一種或多種的翻譯增加的能力可作為此樣品的效價和/或給予消耗相關(guān)產(chǎn)品或施用相關(guān)產(chǎn)品的人類或動物健康益處的能力的量度來試驗。此類測定可檢測由于這些mRNA上調(diào)翻譯所致的蛋白質(zhì)增加的量、有效性或活性。標記蛋白翻譯增加、上調(diào)或其它方面被調(diào)節(jié)的程度可通過與對照比較試驗結(jié)果來確定。不希望受任何具體理論的約束，此增加的翻譯可被eIF2 α的磷酸化和/ 或三元復(fù)合體的抑制所促進。本發(fā)明能夠通過檢測基因的核酸產(chǎn)物對食品、營養(yǎng)制品或醫(yī)藥產(chǎn)品的樣品的有益活性來進行測定，在包含于此樣品中的EPA或其它3-n PUFA的存在下，所述基因的轉(zhuǎn)錄增力口、上調(diào)或其它方面被調(diào)節(jié)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供在EPA、其它3-n PUFA或其它有益試劑的存在下增加、上調(diào)或其它方面被調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄本的檢測。此轉(zhuǎn)錄本以非限定方式可包括編碼 ATF-4、BiP, CHOP、Xpb-I和氨基酸合成酶的那些轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明的某些實施方案提供編碼此類蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄本的檢測，例如憑借逆轉(zhuǎn)錄、核酸擴增(如，本領(lǐng)域已知的PCR或等溫擴增)或核酸雜交方法。增加、上調(diào)或其它方面被調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄的檢測也可使用報告基因測定來進行，例如在允許DNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生的體系中，在接觸試驗或?qū)φ諛悠非皩⒛繕嘶虻膯幼涌刹僮鞯剡B接到報告基因上。通過將試驗樣品中觀察到的轉(zhuǎn)錄水平或報告基因活性與外部或內(nèi)部(如，雙重報道)標準或?qū)φ账^察到的那些進行比較來確定轉(zhuǎn)錄增加、上調(diào)或其它方面被調(diào)節(jié)的程度。某些示例性實施方案提供通過檢測在EPA、其它3-n PUFA或其它有益試劑的存在下由增加、上調(diào)或其它方面被調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)從而對食品、營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品的測定。此類蛋白質(zhì)以不限定的方法可包括ATF-4、BiP、CH0P、Xpb-l和氨基酸合成酶。在試驗樣品存在下觀察到的此類蛋白質(zhì)的水平可與標準或其它對照樣品存在下所觀察到的那些進行比較來確定試驗樣品的效價。在另一實施方案中，提供確定許多個體組合物的大批均質(zhì)性的方法，其包括以下步驟檢測所述個體組合物至少之一的翻譯起始抑制、上調(diào)或其它調(diào)節(jié)的活性，并將個體組合物至少之一的翻譯起始抑制、上調(diào)或其它調(diào)節(jié)的活性與標準進行比較來確定大批均質(zhì)性。因此，在某些示例性實施方案中，提供確定物質(zhì)(如，源于魚油的物質(zhì)和/或包含 EPA的物質(zhì))是否具有一種或多種有益的生物學、營養(yǎng)或醫(yī)藥特性的方法。所述方法包括以下步驟提供第二樣品，其包括在其5' UTR具有至少兩個開放閱讀框的第二 mRNA序列，其中所述第二 mRNA序列編碼第二生物標記物蛋白，使第二樣品與該物質(zhì)相接觸，并檢測第一和第二生物標記物蛋白的翻譯水平，其中如果該物質(zhì)具有一種或多種有益的生物學、營養(yǎng)或醫(yī)藥特性，則所述第二生物標記物蛋白的翻譯水平大于第一生物標記物的翻譯水平。在某些方面，第一樣品與標準物或?qū)φ瘴锵嘟佑|。在另外的方面，第一 mRNA和第二 mRNA具有相同的序列。在其它方面，第一生物標記物蛋白和第二生物標記物蛋白為相同的蛋白。在某些方面，第一和第二生物標記物蛋白選自由乳腺癌易感性基因I(BRCAl)轉(zhuǎn)錄本b產(chǎn)物、 轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF-4)、翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)、保護素(CD59)和通用控制非去阻遏蛋白(nonder印reSSible)4(GCN4)組成的組。在其它方面，檢測翻譯水平的步驟通過蛋白質(zhì)分析(Western analysis)、ELISA和免疫細胞化學的一種或多種來進行。在某些方面，樣品為其中可適當?shù)匕l(fā)生DNA轉(zhuǎn)錄和/或mRNA翻譯的動物、細胞或無細胞系統(tǒng)(如，兔網(wǎng)織紅細胞裂解液系統(tǒng))。細胞可源于人類、其它哺乳動物(包括但不限于小鼠和大鼠)、雞或其它鳥類或者酵母。無細胞系統(tǒng)包括兔網(wǎng)織紅細胞、小麥胚芽或哺乳動物細胞胞質(zhì)提取物例
8如HeLa SlOO提取物。在某些方面，5' UTR為天然產(chǎn)生或合成的。在其它方面，5' UTR可操作地連接到編碼報告蛋白的編碼序列上。在某些方面，翻譯水平由測定報告蛋白的一種或多種活性來確定。在其它方面，第二生物標記物蛋白的翻譯水平至少為第一生物標記物的翻譯水平的150%。在某些方面，該物質(zhì)將進行n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)(如，二十碳五烯酸(EPA))活性的測定。在某些方面，該物質(zhì)為食品樣品、營養(yǎng)制品樣品或藥物制品樣
P
ΡΠ O在某些示例性實施方案中，提供確定物質(zhì)(如，源于魚油的物質(zhì)和/或包含EPA的物質(zhì))是否具有一種或多種有益的生物學、營養(yǎng)或醫(yī)藥特性的方法。所述方法包括以下步驟提供包括在其5' UTR具有至少兩個開放閱讀框的mRNA序列的樣品，其中所述mRNA序列編碼生物標記物蛋白，使樣品與該物質(zhì)相接觸，檢測生物標記物蛋白的翻譯水平，并檢測內(nèi)標蛋白的翻譯水平，其中如果該物質(zhì)具有一種或多種有益的生物學、營養(yǎng)或醫(yī)藥特性，則所述生物標記物蛋白的翻譯水平大于內(nèi)標蛋白的翻譯水平。在某些方面，內(nèi)標蛋白由在其 5' UTR具有一個或無開放閱讀框的mRNA序列編碼。在其它方面，生物標記物蛋白選自由 BRCAl轉(zhuǎn)錄本b產(chǎn)物、ATF-4、TCTP、⑶59和GCN4組成的組。在其它方面，檢測翻譯水平的步驟通過蛋白質(zhì)分析、ELISA和免疫細胞化學的一種或多種來進行。在另一方面，5' UTR為天然產(chǎn)生或合成的。在其它方面，5' UTR可操作地連接到編碼報告蛋白的編碼序列上。在其它方面，翻譯水平由測定報告蛋白的一種或多種活性來確定。在其它方面，生物標記物蛋白的翻譯水平至少為內(nèi)標的翻譯水平的150%。在某些方面，該物質(zhì)將進行ri-3PUFA(如， EPA)活性的測定。在某些方面，該物質(zhì)為食品樣品、營養(yǎng)制品樣品或藥物制品樣品。在某些示例性實施方案中，提供檢測物質(zhì)(如，源于魚油的物質(zhì)和/或包含EPA 的物質(zhì))是否調(diào)節(jié)生物標記物基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)的方法。所述方法包括以下步驟提供第一試驗系統(tǒng)，其包括具有可操作地連接到第一生物標記物啟動子上的第一報告蛋白編碼區(qū)的 mRNA序列，提供第二試驗系統(tǒng)，其包括具有可操作地連接到第二生物標記物啟動子上的第二報告蛋白編碼區(qū)的mRNA序列，使第二試驗系統(tǒng)與該物質(zhì)相接觸，并檢測第一和第二 mRNA 序列的轉(zhuǎn)錄水平，其中如果該物質(zhì)調(diào)節(jié)生物標記物基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，則第二 mRNA序列的轉(zhuǎn)錄水平大于第一 mRNA序列的轉(zhuǎn)錄水平。在某些方面，第一和第二試驗系統(tǒng)為動物試驗、基于細胞的試驗或無細胞試驗。在某些方面，第一試驗系統(tǒng)與標準物或?qū)φ瘴锵嘟佑|。在其它方面，第一 mRNA和第二 mRNA具有相同序列和/或第一報告蛋白和第二報告蛋白為相同蛋白。在某些方面，通過實時PCR確定轉(zhuǎn)錄水平(如，體外或體內(nèi)(如，細胞內(nèi)))。在某些方面，通過檢測一種或多種報告蛋白活性來確定轉(zhuǎn)錄活性。在其它方面，生物標記物基因編碼前凋亡蛋白或腫瘤抑制蛋白(如，CH0P、BiP、ATF-4、)(bp-l或氨基酸合成酶等)。在某些方面，第二 mRNA序列的轉(zhuǎn)錄至少為第一 mRNA序列轉(zhuǎn)錄水平的150%。在某些方面，該物質(zhì)進行n-3PUFA(如，EPA)活性測定。在某些方面，該物質(zhì)為食品樣品、營養(yǎng)制品樣品或藥物制品樣品。在某些示例性實施方案中，提供制造質(zhì)量控制的魚油產(chǎn)品的方法。所述方法包括以下步驟提供第一樣品，其包括在第一 mRNA序列的5'非翻譯區(qū)具有至少兩個開放閱讀框的第一 mRNA序列，其中所述第一 mRNA序列編碼第一生物標記物蛋白；提供第二樣品，其包括在第二mRNA序列的5 ‘非翻譯區(qū)(UTR)具有至少兩個開放閱讀框的第二 mRNA序列，其中所述第二 mRNA序列編碼第二生物標記物蛋白；使第二樣品與魚油產(chǎn)品相接觸；檢測第一
9和第二生物標記物蛋白的翻譯水平，其中如果該魚油產(chǎn)品可向受試者提供一種或多種有益的生物學、營養(yǎng)或醫(yī)藥特性，則第二生物標記物蛋白的翻譯水平大于第一生物標記物的翻譯水平；以及選擇具有較大翻譯水平的魚油產(chǎn)品作為質(zhì)量控制的魚油產(chǎn)品。在某些方面，第一樣品與標準物或?qū)φ瘴锵嘟佑|。在其它方面，第一 mRNA和第二 mRNA具有相同序列。在另一方面，第一生物標記物蛋白和第二生物標記物蛋白為相同蛋白(如，BRCAl轉(zhuǎn)錄本b產(chǎn)物、ATF-4、TCTP、CD59 和 GCN4)。在某些示例性實施方案中，提供制造質(zhì)量控制的魚油產(chǎn)品的方法。所述方法包括以下步驟提供樣品，其包括在mRNA序列的5'非翻譯區(qū)具有至少兩個開放閱讀框的mRNA 序列，其中所述mRNA序列編碼生物標記物蛋白；使該樣品與魚油產(chǎn)品相接觸；檢測生物標記物蛋白的翻譯水平，檢測內(nèi)標蛋白的翻譯水平，其中如果該魚油產(chǎn)品可向受試者提供一種或多種有益的生物學、營養(yǎng)或醫(yī)藥特性，則生物標記物蛋白的翻譯水平大于內(nèi)標蛋白的翻譯水平；以及選擇具有較大翻譯水平的魚油產(chǎn)品作為質(zhì)量控制的魚油產(chǎn)品。在某些方面， 生物標記物蛋白選自由BRCAl轉(zhuǎn)錄本b產(chǎn)物、ATF-4、TCTP,⑶59和GCN4組成的組。在某些示例性實施方案中，提供制造質(zhì)量控制的魚油產(chǎn)品的方法。所述方法包括以下步驟提供第一試驗系統(tǒng)，其包括具有可操作地連接到第一生物標記物啟動子上的第一報告蛋白編碼區(qū)的mRNA序列；提供第二試驗系統(tǒng)，其包括具有可操作地連接到第二生物標記物啟動子上的第二報告蛋白編碼區(qū)的mRNA序列；使第二試驗系統(tǒng)與魚油產(chǎn)品相接觸； 檢測第一和第二 mRNA序列的轉(zhuǎn)錄水平，其中如果該魚油產(chǎn)品可向受試者提供一種或多種有益的生物學、營養(yǎng)或醫(yī)藥特性，則第二 mRNA序列的轉(zhuǎn)錄水平大于第一 mRNA序列的轉(zhuǎn)錄水平；以及選擇具有較大翻譯水平的魚油產(chǎn)品作為質(zhì)量控制魚油產(chǎn)品。在某些方面，生物標記物啟動子為選自由CHOP啟動子、BiP啟動子、ATF-4啟動子、Xbp-I啟動子或氨基酸合成酶啟動子等或者受翻譯起始的抑制誘導(dǎo)的其它類似的啟動子組成的組。在本發(fā)明某些另外的示例性實施方案中，提供使用核酸檢測法，例如實時PCR來檢測樣品中由于Ω-3脂肪酸活性而增加的轉(zhuǎn)錄本的方法。進一步提供通過檢測在由Ω-3 脂肪酸轉(zhuǎn)錄上調(diào)的啟動子的影響下的基因所編碼的報告蛋白活性來檢測樣品中由于Ω-3 脂肪酸活性而增加的轉(zhuǎn)錄本的方法。進一步提供檢測在其5' UTR具有兩個以上開放閱讀框的轉(zhuǎn)錄本的翻譯增加的方法。仍進一步提供使用檢測樣品中由于Ω-3脂肪酸活性而增加的轉(zhuǎn)錄本的方法來制造質(zhì)量控制的食品、營養(yǎng)制品和醫(yī)藥產(chǎn)品的方法。


從說明性實施方案連同附圖的以下詳細描述將更全面的理解本發(fā)明的前述以及其它特性和優(yōu)勢，在所述附圖中圖1圖解地描述了當擴增編碼CHOP的mRNA轉(zhuǎn)錄本時所獲得的結(jié)果。
具體實施例方式已得到了相互矛盾的意見，S卩，某些mRNA的翻譯在三元復(fù)合體缺乏時比其豐富時更加有效(Aktas 等人，2004，Journal of Nutrition 134(9) :2487S_2491S ;Halperin 和 Aktas,國際專利申請
發(fā)明者喬斯·A·霍爾珀林, 胡賽因·阿克塔斯 申請人:哈佛大學