專利名稱：用于在流式細(xì)胞儀系統(tǒng)中測量來自多個(gè)并行流動(dòng)通道的多個(gè)發(fā)射的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及流式細(xì)胞儀系統(tǒng)，具體而言，涉及用于在流式細(xì)胞儀系統(tǒng)中測量來自多個(gè)并行流動(dòng)通道的多個(gè)發(fā)射的系統(tǒng)及方法。
背景技術(shù)：
二十多年前，基于流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選術(shù)被首次引入到研究領(lǐng)域。這是一種已經(jīng)被廣泛用于生命科學(xué)研究等諸多領(lǐng)域的技術(shù)，成為遺傳學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和環(huán)境學(xué)等領(lǐng)域工作人員的重要工具。與諸如免疫淘選(immuno-parming)和磁柱分離之類的體 (bulk)細(xì)胞分離技術(shù)不同，基于流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選設(shè)備以每秒幾千個(gè)細(xì)胞或者更高的速度對(duì)個(gè)別細(xì)胞或粒子連續(xù)地進(jìn)行測量、歸類并分選。這種對(duì)單個(gè)細(xì)胞“逐個(gè)”進(jìn)行的快速處理使得流式細(xì)胞儀成了從其它異質(zhì)細(xì)胞懸液中提取高純度細(xì)胞亞群的、獨(dú)特且極具價(jià)值的工具。用以分選的材料通常用熒光材料以某種方式標(biāo)記。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過聚焦集中、強(qiáng)度極高的光束(通常為激光光束)時(shí)，關(guān)聯(lián)于該細(xì)胞的熒光探測器便發(fā)出熒光。計(jì)算機(jī)記錄用于各細(xì)胞的發(fā)射強(qiáng)度。這些數(shù)據(jù)接著被用來對(duì)各細(xì)胞進(jìn)行歸類以用于具體的分選操作?；诹魇郊?xì)胞儀的細(xì)胞分選已經(jīng)被成功地應(yīng)用到上百種細(xì)胞類型、細(xì)胞成分和微生物，以及多種尺寸相當(dāng)?shù)臒o機(jī)粒子中。流式細(xì)胞儀也被廣泛地用來快速地分析異質(zhì)細(xì)胞懸液以識(shí)別成分亞群。其中發(fā)現(xiàn)使用了基于流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選的應(yīng)用示例包括用于AIDS研究的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的稀有群體的分離、用于癌癥研究的畸形細(xì)胞的基因分離、用于遺傳學(xué)研究的特定染色體的分離和用于環(huán)境學(xué)研究的各種微生物的分離。例如，被熒光標(biāo)記的單克隆抗體通常被用作識(shí)別免疫細(xì)胞諸如T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的“標(biāo)記”，臨床實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用該技術(shù)來對(duì)HIV 感染者的“CD4陽性”T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且他們還使用該技術(shù)來識(shí)別與各種白血病和淋巴瘤癌相關(guān)的細(xì)胞。最近，人們感興趣的兩個(gè)領(lǐng)域除了嚴(yán)格的研究應(yīng)用之外，便是讓細(xì)胞分選走近臨床和對(duì)病人的治療應(yīng)用。首先是從對(duì)化學(xué)制藥的研發(fā)轉(zhuǎn)向?qū)ι镏扑幍难邪l(fā)。例如，許多新的癌癥療法利用了生物材料。這些療法包括一類基于抗體的癌癥治療?；诹魇郊?xì)胞儀的細(xì)胞分選器可以在這些產(chǎn)品的識(shí)別、發(fā)展、凈化以及最終的生產(chǎn)過程中發(fā)揮重要的作用。與此相關(guān)的便是在護(hù)理病人過程中轉(zhuǎn)向使用細(xì)胞代替治療。目前關(guān)于干細(xì)胞的熱門研究均圍繞一個(gè)全新的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展開，其通常被稱為再生療法或再生醫(yī)學(xué)。這些療法可能往往要求從病人的組織中分離出大量的比較罕見的細(xì)胞。例如，可從骨髓中分離出成年干細(xì)胞，并且最終將其作為再注入物的一部分返回到分離了成年干細(xì)胞的病人體內(nèi)。流式細(xì)胞儀和細(xì)胞分選是能夠提供這種療法的重要組織處理工具。存在兩種目前正被廣泛使用基本類型的細(xì)胞分選器。他們分別是“液滴細(xì)胞分選器(droplet cell sorter) ”和“流體切換細(xì)胞分選”。液滴細(xì)胞分選器利用微液滴作為容納體來將所選擇的細(xì)胞輸送到收集器。通過將超聲波能量耦合到噴射流來形成該微液滴。 接著以靜電方式將該液滴引導(dǎo)到所期望的位置，其中該液體含有被選擇用以分選的細(xì)胞。 這是一個(gè)非常高效的處理，每秒鐘允許從單流中分選多達(dá)90，000個(gè)細(xì)胞，該處理主要受液滴生成頻率和照明所需時(shí)間的限制。Durack等人的美國公開專利申請(qǐng)No. 2005/0112541對(duì)現(xiàn)有的流式細(xì)胞儀系統(tǒng)進(jìn)行了詳細(xì)的描述。然而，液滴細(xì)胞分選器在生物安全(biosafe)方面并不十分優(yōu)異。在一部分液滴形成處理中所生成的氣溶膠會(huì)攜有生物危險(xiǎn)材料。由此，已經(jīng)發(fā)展了一種包含在生物安全柜中的生物安全液滴細(xì)胞分選器，其可以在基本封閉的環(huán)境中操作。不幸的是，這種類型的系統(tǒng)自身并不適用于臨床環(huán)境下患者樣本的常規(guī)分選所需求的無菌狀態(tài)和操作保護(hù)。基于流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選器的第二種類型為流體切換細(xì)胞分選器。大多數(shù)流體切換細(xì)胞分選器利用壓電裝置來驅(qū)動(dòng)機(jī)械系統(tǒng)，其中該機(jī)械系統(tǒng)會(huì)將一部分流動(dòng)樣品轉(zhuǎn)移到收集容器中。與液滴細(xì)胞分選器相比，流體切換細(xì)胞分選器因被用來轉(zhuǎn)移樣品流的機(jī)械系統(tǒng)的循環(huán)時(shí)間而具有較低的最大細(xì)胞分選率。該循環(huán)時(shí)間，即樣品的初始分流與恢復(fù)到穩(wěn)定的未分選的流動(dòng)之間的時(shí)間，通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液滴細(xì)胞分選器上液滴生成器的周期。而該較長的循環(huán)時(shí)間限制了流體切換細(xì)胞分選器每秒鐘處理細(xì)胞的速率。由于同樣的原因， 被流體細(xì)胞分選器所切割的流段通常至少是來自液滴發(fā)生器的單個(gè)微滴的體積的十倍。相應(yīng)地，這會(huì)導(dǎo)致流體切換分選器的收集容器與液滴分選器的收集容器相比，細(xì)胞濃度較低。新一代微流體技術(shù)極有希望提高流體切換裝置的效率并在概念上類似于電子集成電路的芯片上提供細(xì)胞分選功能。已經(jīng)證實(shí)許多微流體系統(tǒng)能夠成功地分選異質(zhì)細(xì)胞群中的細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)在于其完全地自我包含、易于消毒并且可以作為一次性部件被大規(guī)模制造(由此獲得足夠的生產(chǎn)效率)。圖1示出了普通的微流體裝置，總體上由標(biāo)號(hào)1表示。微流體裝置1包括基底2， 其中基底2具有通過本領(lǐng)域所公知的任何常規(guī)處理形成于其中的流體流通道3?；?可以由玻璃、塑料或任何其它常規(guī)材料形成，并且可以是大致透明的或者其一部分可以是大致透明的?；?還具有三個(gè)耦合到該基底2的端口 4、5和6。端口 4是用于管狀流體的入口。端口 4具有流體連通到與流體流通道3結(jié)合的流體流通道7的中心軸通路，使得從外部供應(yīng)器(未示出)進(jìn)入端口 16的管狀流體可進(jìn)入流體流通道7中，并接著流入到流體流通道3中。該管狀流體供應(yīng)器可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任何常規(guī)耦合機(jī)構(gòu)連接到端口 4。端口 5也具有通過樣品注入管8流體連通到流體流通道3的中心軸通路。樣品注入管8被布置為與流體流通道3的水平軸同軸。在管狀流體被注入到端口 4中的同時(shí)，將細(xì)胞的液體樣品注入到端口 4中，因此這會(huì)導(dǎo)致流經(jīng)流體流通道3的細(xì)胞被管狀流體所包圍。流體流通道3和7，以及樣品注入管8的維度和構(gòu)造被選擇為使得當(dāng)管狀/樣品流體流經(jīng)該裝置1時(shí)，其呈現(xiàn)出本領(lǐng)域所公知的層流。端口 6被耦合到流體流通道3的末端，使得該管狀/樣品流體可以從該微流體裝置1中流出。當(dāng)管狀/樣品流體流經(jīng)流體流通道3時(shí)，可以在樣品注入管8與出口 6之間的一些位置處使光源透過基底2并照射到流體流通道3中，并通過細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。另夕卜，可以更改微流體裝置1，以用于本領(lǐng)域所公知的細(xì)胞分選操作。但是，這些微流體技術(shù)并未被廣泛地采用，主要是考慮到在這樣的裝置上達(dá)到最大細(xì)胞分選吞吐量的成本。最快的微流體細(xì)胞分選器以每秒1000至2000個(gè)細(xì)胞的速率工作，比目前可用的液滴細(xì)胞分選系統(tǒng)慢將近40倍。微流體的支持者建議可以將大量并行分選通道集成到一個(gè)一次性芯片上，以將總吞吐量增加至與液滴細(xì)胞分選系統(tǒng)相同的數(shù)量級(jí)。表面上，這是一個(gè)有吸引力的提議，直到有人分析了使用大量并行微流體芯片來提供使細(xì)胞分選器運(yùn)作所需要的所有組件的成本。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞分選通道而言，激光器、濾光器和光探測器以及數(shù)據(jù)獲取元件共計(jì)數(shù)千美元。當(dāng)40通道微流體分選系統(tǒng)能夠與基于單個(gè)液滴的細(xì)胞分選系統(tǒng)的吞吐量匹敵時(shí)，大多數(shù)潛在用戶都不愿意(或不能)為所需系統(tǒng)組件的其它組件支付40倍的費(fèi)用。例如，很容易計(jì)算出單細(xì)胞分選通道所需的激光器、濾光器、 光探測器和數(shù)據(jù)采集元件的一般價(jià)格為$15，000，所以制造40通道微流體分選系統(tǒng)將花費(fèi) $600，000以上，而當(dāng)零售時(shí)，制造商為了獲取利潤，還將抬高此價(jià)格。相比而言，基于單流動(dòng)通道液滴的常規(guī)細(xì)胞分選器的零售價(jià)為$350，000。因此，需要對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提供一種采用了多個(gè)并行流動(dòng)通道的流式細(xì)胞儀系統(tǒng)，以在系統(tǒng)成本與基于液滴的細(xì)胞分選器相比具有優(yōu)勢的情況下達(dá)到所需要的吞吐率。本發(fā)明意在滿足這種需要。

發(fā)明內(nèi)容
公開了用于在流式細(xì)胞儀系統(tǒng)中測量來自多個(gè)并行流動(dòng)通道的多個(gè)發(fā)射的系統(tǒng)及方法，其中利用不同的頻率來調(diào)制各個(gè)激發(fā)源。使用一個(gè)檢測器來收集由全部流動(dòng)通道中的全部源激發(fā)的熒光發(fā)射，并且通過使用傅里葉變換技術(shù)來分離此發(fā)射。該系統(tǒng)和方法非常適于微流體應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施例中，公開了用于測量來自粒子的發(fā)射的流式細(xì)胞儀，所述流式細(xì)胞儀包括第一流動(dòng)通道；第一激發(fā)電磁輻射源，所述第一激發(fā)電磁輻射源產(chǎn)生了以第一頻率調(diào)制的第一調(diào)制激發(fā)光束，所述第一調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第一流動(dòng)通道上；第二流動(dòng)通道；第二激發(fā)電磁輻射源，所述第二激發(fā)電磁輻射源產(chǎn)生了以第二頻率調(diào)制的第二調(diào)制激發(fā)光束，所述第二調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第二流動(dòng)通道上；檢測器，當(dāng)所述粒子位于所述第一流動(dòng)通道或所述第二流動(dòng)通道內(nèi)時(shí)，所述檢測器適于檢測來自所述粒子的任一者的發(fā)射，所述檢測器產(chǎn)生了檢測器輸出信號(hào)；以及信號(hào)處理器，所述信號(hào)處理器用于耦合到所述檢測器以接收所述檢測器輸出信號(hào)，所述信號(hào)處理器用來區(qū)分由所述第一調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的一者產(chǎn)生的發(fā)射所引起的所述檢測器輸出信號(hào)的第一部分和由所述第二調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的另一者產(chǎn)生的發(fā)射所引起的所述檢測器輸出信號(hào)的第二部分。在另一實(shí)施例中，公開了用于在流式細(xì)胞儀中測量來自粒子的發(fā)射的方法，其中所述流式細(xì)胞儀包括第一和第二流動(dòng)通道，所述方法包括以下步驟a)提供第一激發(fā)電磁輻射源；b)以第一頻率調(diào)制所述第一激發(fā)電磁輻射源以產(chǎn)生第一調(diào)制激發(fā)光束；c)使所述第一調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第一流動(dòng)通道上；d)提供第二激發(fā)電磁輻射源；e)以第二頻率調(diào)制所述第二激發(fā)電磁輻射源以產(chǎn)生第二調(diào)制激發(fā)光束；f)使所述第二調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第二流動(dòng)通道上；g)檢測來自所述第一和第二流動(dòng)通道的一者中的任一所述粒子的發(fā)射，并且產(chǎn)生單檢測器輸出信號(hào)；以及h)確定所述單檢測器輸出信號(hào)來自由所述第一調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的一者所引起的所述檢測發(fā)射的第一部分和由所述第二調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的另一者所引起的所述檢測發(fā)射的第二部分。也公開了其它實(shí)施例。


圖1是現(xiàn)有技術(shù)的微流體裝置的概要立體圖。圖2是現(xiàn)有技術(shù)的多通道流式細(xì)胞儀系統(tǒng)中的流體流動(dòng)路徑、激發(fā)激光器和熒光檢測器的概要視圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施例的多通道流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的概要視圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施例的多通道流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的概要視圖。圖5是根據(jù)本發(fā)明第三實(shí)施例的多通道流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的概要視圖。圖6是根據(jù)本發(fā)明第四實(shí)施例的多通道流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的概要視圖。圖7是用于實(shí)施本發(fā)明的多通道流式細(xì)胞儀的第一實(shí)施例方法的概要流程圖。
具體實(shí)施例方式為了提高對(duì)本發(fā)明原理的理解，現(xiàn)在將參考附圖中所示例的實(shí)施例，并且將使用特定的語言來描述相同的特征。然而，應(yīng)理解，由此并不意在限制本發(fā)明的范圍，而意在保護(hù)本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員通常能夠理解的、所示例裝置和方法的替代和進(jìn)一步修改以及所示例的本發(fā)明原理的進(jìn)一步應(yīng)用。通過下面的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本實(shí)施例可以利用任何并行的通道系統(tǒng)，而并不只適用于微流體系統(tǒng)，這樣做只是為了在方便的環(huán)境下描述本發(fā)明的概念。還應(yīng)理解，如本文所使用的術(shù)語“并行”意在包括任何數(shù)目的、并行操作的流動(dòng)通道，無論這些通道是物理地互相并行，或者甚至是物理地互相接近。本文所公開的實(shí)施例包括用于在許多微流體通道之間共享可選擇的檢測構(gòu)件、數(shù)據(jù)獲取通道和分選判定處理器的可擴(kuò)展方法。本文所公開實(shí)施例中的一些實(shí)施例，例如在具有相同的有效吞吐量的情況下，將實(shí)現(xiàn)將40并行通道微流體分選系統(tǒng)的成本縮減到與液滴細(xì)胞分選通道幾乎相同的成本。一些實(shí)施例闡明了利用激發(fā)激光器的方法，其中該激發(fā)激光器被分別調(diào)制為用于多個(gè)并行流動(dòng)流通道的每一者。所公開的技術(shù)可接著被用于通過單檢測通道來分離來自不同微流體流動(dòng)通道的發(fā)射。通過本文應(yīng)理解，本文所公開的技術(shù)可被施加到其中并行流動(dòng)通道共享同一樣品源的系統(tǒng)中和被設(shè)計(jì)為同時(shí)分選不同粒子樣品的系統(tǒng)中。還應(yīng)理解，本文所公開的技術(shù)可被施加到微流體系統(tǒng)中，其中該微流體系統(tǒng)包括并行分選和/或串行分選和/或檢測模塊的結(jié)合。被分選的部分可以收集在相同的收集容器中或者多個(gè)收集容器中。例如，微流體分選通道的體系可以被構(gòu)造并被配置為如同具有多個(gè)分選路徑、閘門和檢測點(diǎn)的決策樹來工作。此外，技術(shù)人員可以在不同檢測點(diǎn)處利用具有不同波長的激光或者可以利用現(xiàn)有技術(shù)來區(qū)分來自多個(gè)檢測點(diǎn)的發(fā)射，其中細(xì)胞連續(xù)經(jīng)過該多個(gè)檢測點(diǎn)。因此，本實(shí)施例使得單個(gè)光電檢測器、信號(hào)處理路徑和分選控制系統(tǒng)能夠與多個(gè)分選和/或檢測模塊相互作用， 其中該多個(gè)分選和/或檢測模塊的流動(dòng)通道，例如并行或串行流動(dòng)通道的結(jié)構(gòu)及配置和/ 或決策樹的流動(dòng)結(jié)構(gòu)是獨(dú)立的。本文所公開的技術(shù)也可具有液滴分選技術(shù)，其中細(xì)胞由流動(dòng)通道流體流中異步所產(chǎn)生的液滴通過任何期望的方法分選。圖2概要地闡明了如何利用現(xiàn)有技術(shù)中的多通道并行流動(dòng)配置來分選粒子，其中系統(tǒng)總體上由標(biāo)號(hào)10表示。所公開的實(shí)施例被用在高速細(xì)胞分選應(yīng)用中。如本文所使用的，術(shù)語“細(xì)胞”和“粒子”是可以互換的。盡管“細(xì)胞”是指生物材料，“粒子”是指非生物材料，但是本文所公開的系統(tǒng)和方法對(duì)細(xì)胞或者粒子都行得通，因此該術(shù)語在本發(fā)明和權(quán)利要求書中是可以互換的。源12供應(yīng)期望被分選的細(xì)胞。來自細(xì)胞源12的各個(gè)細(xì)胞14 向下流過供應(yīng)通道或路徑16，并且被隨機(jī)地引入到三個(gè)分選通道18(1)、18(幻和18(3)之一中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，出于解釋的目的，僅示出了三個(gè)分選通道，并且潛在的分選通道的數(shù)目并不受到限制。為了進(jìn)一步解釋，假設(shè)細(xì)胞14具有兩種類型1 和14b。其中期望細(xì)胞Ha被分選到被分選的細(xì)胞盛器20中，并且細(xì)胞14b被丟棄到廢棄物盛器22中。分選通道18的每一者分叉進(jìn)入到分選通道M和廢棄物通道沈中，其中分選通道 M耦合到被分選的細(xì)胞盛器20，廢棄物通道沈耦合到廢棄物盛器22。由分流器觀的位置來決定細(xì)胞的流動(dòng)是指向各分選通道18中的分選通道M或是廢棄物通道26。在一個(gè)實(shí)施例中，分流器觀是能夠通過電指令信號(hào)激發(fā)的壓電裝置，用以根據(jù)分流器觀的位置，將流經(jīng)分選通道18的流動(dòng)機(jī)械地分流到分選通道M和廢棄物通道沈中。在其它實(shí)施例中，分流器觀不是壓電裝置，而例如可以是從壁引入而使流動(dòng)轉(zhuǎn)向的氣泡，通過電場移動(dòng)或激發(fā)的流體導(dǎo)流板，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任何其它分流器或分選閘門。在細(xì)胞分選處理過程中，為了確定應(yīng)將分流器觀放置在任何點(diǎn)處哪個(gè)位置，流經(jīng)細(xì)胞分選通道18的細(xì)胞會(huì)受到來自激發(fā)光源30的電磁激發(fā)。激發(fā)光源30可以包括例如激光源，如激光器和激光發(fā)光二極管(LED)，但并不限于這兩個(gè)示例。各激光器30被放置為使得流經(jīng)分選通道18的細(xì)胞將經(jīng)過激光30的光束。相應(yīng)的檢測器32被放置在各個(gè)分選通道18處，以在細(xì)胞14經(jīng)過激發(fā)光源30的光束時(shí)接收可能由細(xì)胞14發(fā)出的任何熒光發(fā)射。此外，還可以檢測不同于熒光的發(fā)射，諸如Roman散射、磷光、冷光或散射，但并不限于這些示例?？商鎿Q地，可以使幾對(duì)激光路徑和檢測器與一個(gè)分選分流器相關(guān)聯(lián)。這樣的光束路徑/檢測對(duì)可以在到達(dá)分流器之前串聯(lián)排列在流動(dòng)路徑中。也可以具有直線排列的多個(gè)激光器，其中以不同的頻率調(diào)制該多個(gè)激光器每一者，以使得一個(gè)PMT能夠測量多個(gè)發(fā)射，如發(fā)明名稱為 “SYSTEM AND METHOD FOR MEASUREMENT OF MULTIPLE FLUORESCENT EMISSIONS IN A FLOW CYTOMETRY SYSTEM(用于在流式細(xì)胞儀系統(tǒng)中測量多個(gè)熒光發(fā)射的系統(tǒng)和方法)”的美國公開專利申請(qǐng)No. 2008/0213915A1所公開的，在此通過引用將其內(nèi)容結(jié)合在本說明書中。在一個(gè)實(shí)施例中，檢測器32包括諸如透鏡、帶通濾光器和光電倍增管之類的檢測光學(xué)系統(tǒng)，這些檢測光學(xué)系統(tǒng)將感應(yīng)由細(xì)胞14發(fā)出的濾光器的通帶內(nèi)的射線，并且產(chǎn)生隨被接收的射線密度變化的模擬電信號(hào)。該模擬信號(hào)可接著被轉(zhuǎn)換為能夠被數(shù)字信號(hào)處理器分析的數(shù)字信號(hào)，以確定隨時(shí)間變化的信號(hào)或脈沖中所表示的熒光發(fā)射特性是否與先前所建立的、用以分選的特性設(shè)置匹配。如果特性匹配，則適當(dāng)?shù)貥?biāo)記細(xì)胞14，并將其分選到被分選的細(xì)胞盛器20中。因此，依據(jù)檢測器32所檢測到的射線布置分流器觀以將細(xì)胞14 引入到合適的盛器中。因?yàn)楦鞣诌x通道18具有激光30、檢測器32和相關(guān)聯(lián)的分流器觀， 所以期望盡可能多的分選通道18能夠并行操作，以實(shí)現(xiàn)所期望的系統(tǒng)10的吞吐量。如上所述，圖2的配置受到與需要操作各個(gè)分選通道18的電子系統(tǒng)相關(guān)的成本的影響。為了實(shí)現(xiàn)所期望的分選吞吐量，隨著分選通道數(shù)目的增加，需要的電子系統(tǒng)的數(shù)目則會(huì)同步增加，這會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)10十分不經(jīng)濟(jì)。為了消除此缺點(diǎn)，本文所公開的實(shí)施例包括如圖3概要示出的系統(tǒng)10的修改例，并且總體由標(biāo)號(hào)100表示。使用相同的標(biāo)號(hào)來表示系統(tǒng) 10和100的相同部分。在系統(tǒng)100中，在一個(gè)實(shí)施例中，利用合適的函數(shù)(諸如正弦函數(shù)(sin或sin2)， 但并不限于此示例)以特定的公知頻率來調(diào)制(例如，通過振幅調(diào)制)激發(fā)每一個(gè)激光器 30。本發(fā)明也提出可以通過任何調(diào)制方案，諸如振幅調(diào)制、頻率調(diào)制或相位調(diào)制來調(diào)制激光器30，但并不限于這些示例?？梢酝ㄟ^晶體管-晶體管邏輯(TTL)門來調(diào)制許多二極管激光(該激光器的一個(gè)示例是來自 Coherent，he.，5100Patrick Henry Drive, Santa Clara, CA 950 的CUBE 激光器系列)或者通過將周期信號(hào)(正弦波、矩形波)引入到電子裝置中來驅(qū)動(dòng)該二極管激光器。許多激光器因其物理腔室設(shè)計(jì)會(huì)產(chǎn)生高度周期性脈沖序列。 1 ^!!的歹 11 (Newport Corporation, 1791Deere Avenue, Irvine CA 92606 dj^g 的)VANGUARD 350-HMD 355激光器，其以約80MHz的頻率產(chǎn)生脈沖?？梢酝ㄟ^電光調(diào)制器(electro-optic modulator, E0M)或聲光調(diào)制器(acousto-optic modulator, A0M)來實(shí)現(xiàn)低頻率調(diào)制。EOM和AOM被用來將振幅、相位或頻率調(diào)制引入到連續(xù)波(CW)激光光束上。另外，可以通過使安裝在電流計(jì)上或者旋轉(zhuǎn)鏡面上的反射鏡快速地掃描橫跨通道的光束來執(zhí)行調(diào)制，其中該旋轉(zhuǎn)鏡面具有多個(gè)平坦側(cè)面。應(yīng)理解，本文所公開的各種實(shí)施例可以使用振幅、相位或頻率調(diào)制，或者這些技術(shù)的結(jié)合。在光源中產(chǎn)生周期性激發(fā)的任何方法將通過熒光標(biāo)記來產(chǎn)生周期性熒光發(fā)射，其中該熒光標(biāo)記能夠通過本文所述的系統(tǒng)和方法來分析。在利用微流體技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選的情況下，細(xì)胞通常以0. 1至5m/s (取決于所采用的流體壓力)的速度流經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)。此外，如果在單閘門開關(guān)中被分選的多個(gè)細(xì)胞來可以接收，則可以實(shí)現(xiàn)壓力高達(dá)90psi的高壓微流體系統(tǒng)。這會(huì)在光學(xué)測量區(qū)域中產(chǎn)生10至 100微秒的駐留時(shí)間(粒子經(jīng)過測量區(qū)域或穿過激光光束焦距所需要的時(shí)間)，對(duì)于高壓系統(tǒng)來說，會(huì)產(chǎn)生0. 5至10毫秒的駐留時(shí)間。也可以采用可能導(dǎo)致500納秒至10毫秒的駐留時(shí)間的高速系統(tǒng)和低速系統(tǒng)。因?yàn)槠谕隈v留時(shí)間期間完成多于兩個(gè)周期的調(diào)制，所以調(diào)制頻率可以優(yōu)選在約IOKHz與IGHz之間。在本文所公開的微流體細(xì)胞分選器的一些實(shí)施例中，調(diào)制頻率在20KHz與500KHz之間。在一個(gè)實(shí)施例中，可以通過被調(diào)制的電源102(1)至102C3)來完成上述調(diào)制，其中被調(diào)制的電源102(1)至102C3)用來驅(qū)動(dòng)激發(fā)激光器30(1)至30 (3)。在另一實(shí)施例中， 如圖4概要地所示，可以使用電光調(diào)制器(EOM)來調(diào)制從各個(gè)激發(fā)激光器發(fā)出的光。電光調(diào)制器是其中信號(hào)控制的元件被用來調(diào)制光束的光學(xué)裝置。其以線性電光效應(yīng)(也被稱作 Pockel效應(yīng))，即通過電場對(duì)非線性晶體的折射率的調(diào)制與場強(qiáng)呈正比為基礎(chǔ)?？梢詫⒃撜{(diào)制強(qiáng)加在被調(diào)制光束的相位、頻率、振幅或方向上。通過使用合適的調(diào)制器可以使調(diào)制帶寬擴(kuò)展至千兆赫茲的范圍。當(dāng)使用EOM時(shí)，如圖4的第二實(shí)施例流式細(xì)胞儀系統(tǒng)200所示， E0M104(1)至104(3)被放置為接收各個(gè)相應(yīng)激發(fā)激光器30的輸出。在另一配置中，以不同的頻率和/或以不同的方式對(duì)各個(gè)激發(fā)光源30進(jìn)行振幅調(diào)制。在另一實(shí)施例中，可以使用聲光調(diào)制器(AOM)來調(diào)制從各個(gè)激發(fā)激光器射出的光。Α0Μ，也被稱作布拉格盒，通過聲波利用聲光效應(yīng)來衍射并改變光的頻率。AOM比通常的機(jī)械裝置(如有時(shí)被用來調(diào)制光束的機(jī)械截波器)更快，這是因?yàn)锳OM改變離開光束所需要的時(shí)間大致被限制為聲波橫跨光束的渡越時(shí)間，通常為5至100內(nèi)秒?？梢栽诟哌_(dá)IMHz的頻率下使用Α0Μ。當(dāng)需要更快速的控制時(shí)，可以使用Ε0Μ。但是，這需要高達(dá)10千伏的超高電壓，而AOM則可以提供較大的反射范圍、簡化的設(shè)計(jì)和較低的功率消耗。來自激光器30(1)至30(3)的個(gè)別被調(diào)制的激發(fā)光束在其相應(yīng)的分選通道18內(nèi)集中在一點(diǎn)(檢測容積)處，其中當(dāng)它們穿過分選通道18時(shí)，流式細(xì)胞儀中的細(xì)胞14流經(jīng)該分選通道18。來自激光30的激發(fā)光束與細(xì)胞14的相互作用可以導(dǎo)致熒光發(fā)射。除了被放置在各分選通道18附近的檢測器32，為了接收上述熒光發(fā)射，圖3的實(shí)施例利用光纖電纜106捕獲該發(fā)射。光纖電纜106(1)至106 C3)將其接收的發(fā)射全部傳送到檢測光學(xué)系統(tǒng) 108。檢測光學(xué)系統(tǒng)108因此同時(shí)接收可能存在于所有分選通道18處的任何發(fā)射信號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以采用任何裝置將來自各種分選通道的發(fā)射傳送到檢測光學(xué)系統(tǒng)，諸如反射通道、波導(dǎo)管、光管和線性光學(xué)系統(tǒng)。此外，如果分選通道物理地充分接近，則可以將檢測光學(xué)系統(tǒng)放置為使得分選通道均位于該檢測光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)，在此情況下， 該檢測光學(xué)系統(tǒng)直接接收發(fā)射。應(yīng)考慮到，檢測光學(xué)系統(tǒng)108可以包括單個(gè)光學(xué)系統(tǒng)或多個(gè)光學(xué)系統(tǒng)。檢測光學(xué)系統(tǒng)108使所有分選通道18的組合熒光發(fā)射聚焦到光檢測器(未示出)，諸如在模擬模式(非光子計(jì)數(shù))下工作的光電倍增管(PMT)上。區(qū)分感興趣的個(gè)別光譜帶(即，由標(biāo)注熒光分子發(fā)出的期望熒光帶)的濾光器優(yōu)選位于PMT前方。在一些實(shí)施例中，諸如當(dāng)系統(tǒng)100被用來感應(yīng)通過不同熒光標(biāo)記所標(biāo)出的多個(gè)細(xì)胞類型時(shí)，單個(gè)光學(xué)系統(tǒng)將發(fā)射傳送到多個(gè)PMT，其多個(gè)PMT的每一者具有使所期望的發(fā)射頻率的一個(gè)范圍通過PMT的關(guān)聯(lián)帶通濾光器。可以使用長帶和短帶分色濾光器的網(wǎng)絡(luò)來分割發(fā)射光譜的一部分，并且將適當(dāng)?shù)牟糠忠轿挥赑MT前方的光纖系統(tǒng)中。例如，可以將該發(fā)射耦合到光纖系統(tǒng)中，并接著將其輸入到多個(gè)PMT中?？梢圆捎冒ㄕ瓗莶V波器的光學(xué)濾波器來阻擋來自分選通道流或粒子的、強(qiáng)烈的激光散射。在一個(gè)實(shí)施例中，PMT和相關(guān)聯(lián)的放大系統(tǒng)具有約45MHz (. 5_45MHz)的帶寬。該帶寬被選擇為使得其包括所采用的全部調(diào)制頻率，但是最高通過頻率優(yōu)選小于被用來獲取數(shù)據(jù)的數(shù)字采樣頻率的2. 5倍。Nyquist定理指出，為了避免數(shù)字采樣數(shù)據(jù)中的調(diào)和偽像 (harmonic artifacts)，信號(hào)的頻率內(nèi)容必須被限制為小于采樣頻率的兩倍。通過模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換(ADC) 112以大于Nyquist頻率的速率對(duì)檢測光學(xué)系統(tǒng)108中的模擬信號(hào)110進(jìn)行連續(xù)采樣，以產(chǎn)生被檢測信號(hào)110的數(shù)字化版本114。在一個(gè)實(shí)施例中，ADC112通過使用14 比特ADC而采用了 105MHz的采樣速率。在另一實(shí)施例中，ADCl 12通過使用16比特聲音ADC而采用了 200MHz的采樣速率。在本實(shí)施例中，PMT和相關(guān)聯(lián)的放大系統(tǒng)具有約80MHz的帶寬。在一些使用了多個(gè)MPT 的實(shí)施例中，優(yōu)選使用單獨(dú)的ADC對(duì)各MPT中的模擬輸出進(jìn)行采樣。在合適的數(shù)據(jù)處理器(例如使用了適當(dāng)軟件的數(shù)字信號(hào)處理系統(tǒng)(DSP)116)中，對(duì)該數(shù)字化數(shù)據(jù)流114進(jìn)行分析。在其它使用了多個(gè)PMT的實(shí)施例中，使來自所有MPT的輸出混合在一起以產(chǎn)生由來自全部檢測器的信號(hào)組成的單一信號(hào)。接著可以使用單個(gè)ADC對(duì)全部PMT的模擬信號(hào)進(jìn)行采樣。例如，該系統(tǒng)可以包括40個(gè)通道和三個(gè)發(fā)射帶。PMT可被用于三個(gè)發(fā)射帶的一者，然而只有一個(gè)ADC被用來對(duì)來自這三個(gè)PMT的組合輸出進(jìn)行分析。由此與現(xiàn)有方法相比大大節(jié)省了資源，其中在現(xiàn)有方法中，40通道的每一者均需要三個(gè)檢測器，即需求120個(gè)單獨(dú)的 ADC0如在現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)施例中，在合適的數(shù)據(jù)處理器，諸如使用了適當(dāng)軟件的數(shù)字信號(hào)處理系統(tǒng)(DSP)116中，對(duì)來自單一 ADC的數(shù)字化數(shù)據(jù)流114進(jìn)行分析。在另一實(shí)施例中，除了使用數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)之外，使用一系列無源或有源電子帶通濾波器來為每個(gè)通道提取被調(diào)制的發(fā)射強(qiáng)度。接著，使用ADC來測量經(jīng)過上述各個(gè)濾波器的功率。該軟件對(duì)被記錄在數(shù)據(jù)中的粒子發(fā)射進(jìn)行分析并檢測，從而產(chǎn)生由來自PMT的電脈沖產(chǎn)生的數(shù)字化波形，其中來自PMT的電脈沖導(dǎo)致了細(xì)胞14中的熒光分子的熒光發(fā)射。 熒光發(fā)射由經(jīng)過激光器30(1)至30 C3)之一所產(chǎn)生的激發(fā)光束的熒光標(biāo)記細(xì)胞14產(chǎn)生。熒光分子的正弦激發(fā)光束從這些分子中產(chǎn)生大致為正弦的熒光發(fā)射強(qiáng)度。調(diào)制發(fā)射相移和調(diào)制發(fā)射的調(diào)制深度與發(fā)射衰變的壽命有關(guān)。調(diào)制發(fā)射頻率將與激發(fā)源的頻率匹配。在分選通道18的全部檢測容積中，任何細(xì)胞14的組合熒光發(fā)射由檢測光學(xué)系統(tǒng)觀檢測，并且因此可以表示為關(guān)于用于各個(gè)單獨(dú)激發(fā)激光器30的一個(gè)頻率的正弦函數(shù)之和，其中該激發(fā)激光器30導(dǎo)致了來自細(xì)胞14之一的熒光發(fā)射。DSPl 16以激發(fā)激光器30的已知調(diào)制頻率，通過對(duì)來自PMT的電信號(hào)110進(jìn)行采樣所獲得的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)114計(jì)算離散時(shí)間傅里葉變換(DTFT)，來確定在各個(gè)調(diào)制頻率處存在于信號(hào)中的功率。該功率與熒光材料因受到各個(gè)光源30的激發(fā)而產(chǎn)生的總發(fā)射成正比，其中以上述頻率調(diào)制各個(gè)光源30。即使這些發(fā)射具有重合的光譜特性，該DTFT計(jì)算也可被用來使組合多通道發(fā)射信號(hào)不與各激光30的各個(gè)構(gòu)件混合，并且得到各個(gè)單獨(dú)發(fā)射成分的密度?？商鎿Q地，尤其在較慢的微流體系統(tǒng)中，可以計(jì)算快速傅里葉變換(FFT)。在其他實(shí)施例中，可以使用不同的數(shù)學(xué)算法來提取所需的信息。期望將調(diào)制頻率選擇為使得調(diào)和不會(huì)與測量相互干擾。例如，如果使用了 10kHz， 則應(yīng)該避免NX IOkHz (例如，20kHz、30kHz、40kHz，等等)。因此，為了避免調(diào)和，可以為各個(gè)通道智能地選擇頻率。在為任何特殊的分選通道18確定單獨(dú)的發(fā)射密度時(shí)，DSP116可以使用此信息通過將適當(dāng)?shù)目刂菩盘?hào)施加到控制線路118(1)至118C3)來確定如何歸類和分選細(xì)胞，其中控制線路118(1)至118 C3)被耦合到相應(yīng)的分流器觀(1)至觀(3)。應(yīng)該注意，該系統(tǒng)也可用來分析樣品但并不對(duì)其進(jìn)行分選。換言之，該系統(tǒng)可以對(duì)粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)以統(tǒng)計(jì)識(shí)別和量化整個(gè)樣本中的顯著群體，但并不將這些群體分選到單獨(dú)的物理收集器中。與現(xiàn)有技術(shù)裝置相比，目前所公開的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)的另一顯著優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在于校準(zhǔn)方面。各個(gè)光檢測器元件會(huì)表現(xiàn)出獨(dú)特的響應(yīng)度(進(jìn)入到光檢測器中的光子數(shù)量與從該光檢測器中出來的光子數(shù)量之間的關(guān)系)。當(dāng)在系統(tǒng)中例如使用40個(gè)光檢測器時(shí)，為了確保所有的測量通道產(chǎn)生相同的響應(yīng)，則需要復(fù)雜的校準(zhǔn)方案。否則，它將需要對(duì)40個(gè)通道的每一者上的數(shù)據(jù)進(jìn)行采樣，并且鑒于該通道的響應(yīng)度，為各個(gè)通道設(shè)定獨(dú)特的分選標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)槟壳八_的實(shí)施例共享用于所有通道的同一光檢測器和ADC，從而保證了所有通道都表現(xiàn)出相同的響應(yīng)度。調(diào)制頻率可以使響應(yīng)度發(fā)生一些變化，但是為了使用檢測電子裝置來檢測標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)曲線，掃描貫穿調(diào)制頻率的整個(gè)范圍的單個(gè)通道相對(duì)而言并不麻煩。由于變化的主要來源是檢測器和單檢測路徑中的信噪比之差，所以除了上述節(jié)約成本之外，在單檢測路徑中實(shí)施從許多通道接收的測量大大簡化了校準(zhǔn)?，F(xiàn)在參考圖5，概要地示出了本發(fā)明的第三實(shí)施例，總體由標(biāo)號(hào)300表示，其中并行的分選通道18被并入到離散的封裝中。如圖3所示的全部流動(dòng)通道均通過粒子體領(lǐng)域所公知的方法，如相對(duì)于圖1等所討論的那些方法形成在集成基底302中。使用相同的標(biāo)號(hào)來指代相同的組件。在圖5的實(shí)施例中，基底302被概要的示為包含η個(gè)分選通道18，其中η為任何整數(shù)。耦合到基板302的通道內(nèi)部被耦合到基底302的外部，以使其能夠連接細(xì)胞源12、被分選的細(xì)胞盛器20和廢棄物盛器22。透明視窗304(1)至304 (η)形成在各個(gè)分選通道18上方的基底302中，以允許光從外部激發(fā)源30(1)至30 (η)經(jīng)由任何合適的諸如相應(yīng)的光纖電纜306(1)至306 (η)的裝置被引導(dǎo)到各個(gè)相應(yīng)的分選通道18(1)到18(η) 內(nèi)的檢測容積。在某些實(shí)施例中，整個(gè)基底302是透明的。激發(fā)源30被示例為通過調(diào)制源 102驅(qū)動(dòng)；然而，本發(fā)明還包括使用其他手段如本文上述的Ε0Μ104或AOM來調(diào)制激發(fā)源。透明視窗304(1)至304 (η)也使來自分選通道18中的任何細(xì)胞的熒光發(fā)射能夠被相應(yīng)的光纖電纜106(1)至106 (η)捕獲，并且將其傳送到檢測光學(xué)系統(tǒng)108。參考圖3如上所述，實(shí)施熒光發(fā)射信號(hào)的處理。將由此產(chǎn)生的、用于分流器觀(1)至觀(11)的指令信號(hào)通過線路118(1)至118(η)提供給基底302上的適當(dāng)連接器。在集成基底302內(nèi)制造流動(dòng)通道使得能夠保護(hù)基底302的容積，從而降低其成本并且增加其使用的便利性。在一些實(shí)施例中，基底302是一次性的，即在使用之后，允許使用新的基底302來分選細(xì)胞的各個(gè)新樣品。這大大地簡化了分選設(shè)備的處理，并且降低了清潔該設(shè)備的難度，以避免分選序列之間的交叉污染，這是因?yàn)闃悠匪鹘?jīng)的大部分硬件易于處理。也很適合在處理之前對(duì)基底302(如通過γ輻射)進(jìn)行滅菌。為了方便更換新基底302，一些實(shí)施例包括一個(gè)勵(lì)磁/讀頭402，如圖6的實(shí)施例所概要地示出，其中該實(shí)施例總體由標(biāo)號(hào)400表示。勵(lì)磁/讀頭402只不過是將激發(fā)光纖電纜306和發(fā)射光纖電纜106相對(duì)于透明視窗304保持為期望取向的集成組件。勵(lì)磁/讀頭402可通過夾持機(jī)構(gòu) 404或者其他任何確保將其放置在相對(duì)于透明視窗304的適當(dāng)位置處的連接機(jī)構(gòu)安裝到基底302。當(dāng)切換到不同的基底302時(shí)，可以斷開所有的光纖電纜，并接著將其作為獨(dú)立的單元重新連接，從而大大簡化了操作。應(yīng)理解，通過目前所公開的實(shí)施例，消除用于各個(gè)分選通道18的、單獨(dú)的檢測器將顯著減少價(jià)格昂貴的光學(xué)系統(tǒng)、PMT和ADC的數(shù)量，其中如果向各個(gè)分選通道18供應(yīng)冗余的系統(tǒng)，則將需要這些價(jià)格昂貴的光學(xué)系統(tǒng)、PMT和ADC。對(duì)本文所公開的調(diào)制光源的使用允許將單檢測部分使用于所有的分選通道。然而，將單個(gè)數(shù)字信號(hào)處理器用于全部分選通道比將處理器專用于分選通道之一需要更多的計(jì)算能力。對(duì)于使用了多個(gè)并行分選通道 (例如，四十個(gè)這樣的通道)的高速流式細(xì)胞儀來說，細(xì)胞以每秒鐘高達(dá)100，000個(gè)細(xì)胞或者更高的平均速率隨機(jī)間歇到達(dá)。通過本文所述的調(diào)制激發(fā)測量，必須在幾百微秒內(nèi)完成對(duì)每個(gè)細(xì)胞的歸類和分選決定。為了將每個(gè)分選通道18中的細(xì)胞分選到適當(dāng)?shù)氖占⑵髦?，必須?shí)時(shí)地執(zhí)行計(jì)算。對(duì)本文所公開的DTFT算法和高速處理結(jié)構(gòu)的使用使得能夠在這些速率下為細(xì)胞分選實(shí)現(xiàn)切實(shí)可行的解決方案。
圖7闡明了用于檢測并行流動(dòng)通道中的熒光發(fā)射的概要處理流程圖，其中該并行流動(dòng)通道使用了系統(tǒng)100、200、300和400。處理開始于步驟500，其中在步驟500處，將單個(gè)或多個(gè)染料施加到細(xì)胞或其他粒子群。所使用的各個(gè)特定染料具有激發(fā)光譜或吸收光譜，以及所產(chǎn)生的熒光發(fā)射光譜。由于熒光的物理性能(被稱為斯托克斯位移)，熒光發(fā)射將總是出現(xiàn)在較長的波長處。來自各種染料的一些或所有發(fā)射波長可能重疊。該染料可以由一個(gè)或多個(gè)激發(fā)源激發(fā)。在步驟502處，以不同于其它激發(fā)光源的方式來調(diào)制具有與至少一種染料的激發(fā)光譜相對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長的激發(fā)光源。例如，可以利用正弦函數(shù)對(duì)各個(gè)激發(fā)光源進(jìn)行振幅調(diào)制，其中該正弦函數(shù)具有不同于所有其它激發(fā)頻率的頻率。在步驟504處，將各個(gè)激發(fā)光源的調(diào)制輸出施加到相應(yīng)的分選通道。在步驟506 處，使來自正被研究的細(xì)胞/粒子群流經(jīng)調(diào)制激發(fā)光束的檢測容積，從而使與各染料相對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射存在于該細(xì)胞/粒子上。在步驟508處，將來自全部分選通道的熒光發(fā)射(如果有的話)組合到復(fù)合熒光發(fā)射中。在步驟510處，通過該系統(tǒng)的檢測光學(xué)系統(tǒng)傳送該熒光發(fā)射，產(chǎn)生與該組合發(fā)射脈沖的、隨時(shí)間變化的強(qiáng)度相對(duì)應(yīng)的模擬電信號(hào)。在步驟512處，數(shù)字化該電信號(hào)，使得能夠通過使用數(shù)字信號(hào)處理設(shè)備對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在步驟514處，為了至少獲取各個(gè)激發(fā)光源的調(diào)制頻率，對(duì)該數(shù)字化脈沖信號(hào)執(zhí)行DTFT。以這些調(diào)制頻率的每一者所計(jì)算的DTFT的數(shù)值與由各個(gè)激發(fā)光源的每一者所引起的發(fā)射產(chǎn)生的總輸出信號(hào)的一部分相對(duì)應(yīng)。接著在步驟516處，對(duì)這些DTFT數(shù)值進(jìn)行檢查，以確定各激發(fā)源是否有助于總熒光發(fā)射。系統(tǒng)通過確定各調(diào)制頻率處的DTFT數(shù)值是否落在預(yù)定范圍內(nèi)，可以確定剛剛經(jīng)過對(duì)應(yīng)分選通道的檢測容積的細(xì)胞/粒子是否被特定數(shù)量的對(duì)應(yīng)染料標(biāo)記，并且執(zhí)行合適的動(dòng)作以分選該細(xì)胞/粒子。例如，在步驟518處，可以將該細(xì)胞/粒子分選到被分離的群體中?？梢允褂镁哂腥魏螖?shù)量的激發(fā)光源30的流式細(xì)胞儀系統(tǒng)100、200、300和400。通過上述應(yīng)理解，本文所公開的并行通道流式細(xì)胞儀系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)的并行通道系統(tǒng)相比， 具有顯著的進(jìn)步。無論使用了多少激發(fā)光源30，只需要一個(gè)檢測器108和相關(guān)聯(lián)的信號(hào)處理回路。同時(shí)，可以通過使用相同的光學(xué)元件和光檢測器，對(duì)來自每個(gè)激發(fā)源的熒光進(jìn)行定量的測量，從而消除由現(xiàn)有的多光路徑和多檢測器實(shí)施所帶來的變化。此外，由于只使用了一個(gè)探測器，所以可以增加該系統(tǒng)中通道的數(shù)目，以在沒有顯著增加系統(tǒng)成本和沒有顯著增加校準(zhǔn)該系統(tǒng)的復(fù)雜性的情況下，實(shí)現(xiàn)所以期望的細(xì)胞處理速率。應(yīng)理解，所有這些改進(jìn)與現(xiàn)有技術(shù)流式細(xì)胞儀系統(tǒng)相比，提供了顯著的性能優(yōu)勢。檢測器的動(dòng)態(tài)范圍在一些情況下，可能存在兩個(gè)與上述調(diào)制技術(shù)相關(guān)的潛在問題。首先，當(dāng)使用具有多個(gè)分選通道的多個(gè)激發(fā)激光器時(shí)，來自一個(gè)以上樣品的熒光發(fā)射可以同時(shí)發(fā)生。這是因?yàn)樵趯?shí)踐中，探測器具有有限的測量范圍(即，響應(yīng)的動(dòng)態(tài)范圍)，可用于測量由各個(gè)激光器所激發(fā)的發(fā)射的動(dòng)態(tài)范圍的數(shù)量不總是恒定的，并且總是小于單個(gè)激光發(fā)射情況下的數(shù)量。此外，在一些情況下，當(dāng)沒有區(qū)分不同的激發(fā)激光器時(shí)，通過使用基于調(diào)制的測量系統(tǒng)所能夠?qū)崿F(xiàn)的任何頻率下的熒光發(fā)射的最小檢測點(diǎn)可能高于(低)于通過直接測量總熒光發(fā)射(典型的流式細(xì)胞儀的參數(shù))所能夠?qū)崿F(xiàn)的最小檢測點(diǎn)。在較低的頻率下，可以通過使用高分辨率的ADC來改善這些問題。例如，通過使用22比特的ADC分辨率，可以限制由各通道所產(chǎn)生的最大信號(hào)，使其不會(huì)到達(dá)該動(dòng)態(tài)范圍的限制。本文所公開的分析方法適合在任何流式細(xì)胞儀DSP系統(tǒng)中實(shí)施。為了高效地進(jìn)行傅里葉分析，特別設(shè)計(jì)了 DSP硬件，如上所述。此外，應(yīng)該注意，沒有必要計(jì)算所有頻率(高于Nyquist速率)下的能級(jí)，其中所需要的能級(jí)是在感興趣的特定激發(fā)激光器調(diào)制頻率處的傅里葉變換的數(shù)量級(jí)。因此，除了執(zhí)行計(jì)算速度快的離散傅里葉變換(DFT)或更有效地實(shí)施被稱為快速傅里葉變換(FFT)這種算法之外，可以計(jì)算各個(gè)頻率下的、計(jì)算速度更快的離散時(shí)間傅里葉變換(DTFT)，使其可以在最多幾微秒的時(shí)間內(nèi)獲得所需的信息。這意味著可以將該處理用在實(shí)時(shí)細(xì)胞分選應(yīng)用中。如上所述，目前所公開的實(shí)施例允許使用一個(gè)光檢測器/信號(hào)處理路徑和與多個(gè)檢測/分選模塊相互作用的分選控制系統(tǒng)，無論它們是否位于并行、串行、邏輯樹結(jié)構(gòu)或這些機(jī)構(gòu)的組合體中。例如，如果技術(shù)人員期望在非常小的概率下進(jìn)行分選，如 1 1，000，000事件，則可以使用這樣的系統(tǒng)，其中第一分選閘門以高吞吐量的方式操作， 并且同時(shí)(例如)分選十個(gè)細(xì)胞。換言之，第一分選門將同時(shí)看到十個(gè)細(xì)胞，并且當(dāng)檢測熒光發(fā)射時(shí)對(duì)其進(jìn)行選擇(表示這些細(xì)胞之一是所搜尋的粒子)。這意味著，對(duì)于每個(gè)要選擇的細(xì)胞來說，其中可能存在幾個(gè)不符合分類標(biāo)準(zhǔn)的被分選細(xì)胞。對(duì)于小概率事件，通過該閘門使樣品群體比例高達(dá)1 10將是令人滿意的結(jié)果，并且允許該閘門同時(shí)有效地分選多個(gè)細(xì)胞則增加了該分選處理的前端吞吐量。第二分選間門或平行設(shè)置的間門接著可以接收該富集分選閘門的輸出。即使在最壞情況下，如輸入樣品純度至少為10 %時(shí)，這些第二閘門也可以接著完成分選處理。鑒于上述，盡管在附圖和上面的描述中已經(jīng)詳細(xì)闡明并描述了本發(fā)明，但其特性同樣被視為示例性而非限制性的，應(yīng)理解，只示出并描述了示例性實(shí)施例，并且期望保護(hù)在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)所作出的所有改變和修改。
權(quán)利要求
1.一種用于測量來自粒子的發(fā)射的流式細(xì)胞儀，所述流式細(xì)胞儀包括第一流動(dòng)通道；第一激發(fā)電磁輻射源，所述第一激發(fā)電磁輻射源產(chǎn)生了以第一頻率調(diào)制的第一調(diào)制激發(fā)光束，所述第一調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第一流動(dòng)通道上； 第二流動(dòng)通道；第二激發(fā)電磁輻射源，所述第二激發(fā)電磁輻射源產(chǎn)生了以第二頻率調(diào)制的第二調(diào)制激發(fā)光束，所述第二調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第二流動(dòng)通道上；檢測器，其中當(dāng)所述粒子位于所述第一流動(dòng)通道或所述第二流動(dòng)通道內(nèi)時(shí)，所述檢測器適于檢測來自所述粒子的任一者的發(fā)射，所述檢測器產(chǎn)生了檢測器輸出信號(hào)；以及信號(hào)處理器，所述信號(hào)處理器用于耦合到所述檢測器以接收所述檢測器輸出信號(hào)，所述信號(hào)處理器用來區(qū)分由所述第一調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的一者產(chǎn)生的發(fā)射所引起的所述檢測器輸出信號(hào)的第一部分和由所述第二調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的另一者產(chǎn)生的發(fā)射所引起的所述檢測器輸出信號(hào)的第二部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，還包括第一分流器，所述第一分流器與所述第一流動(dòng)通道相關(guān)聯(lián)并且用于耦合到所述信號(hào)處理器；以及第二分流器，所述第二分流器與所述第二流動(dòng)通道相關(guān)聯(lián)并且用于耦合到所述信號(hào)處理器；其中所述信號(hào)處理器基于所述檢測器輸出信號(hào)的被區(qū)分的所述第一部分來控制所述第一分流器；以及其中所述信號(hào)處理器基于所述檢測器輸出信號(hào)的被區(qū)分的所述第二部分來控制所述第二分流器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的流式細(xì)胞儀，其中所述第一和第二分流器從由壓電裝置、氣泡引入機(jī)構(gòu)和磁動(dòng)導(dǎo)流板構(gòu)成的分組中選擇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，其中所述粒子包括生物細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，其中所述第一和第二激發(fā)電磁輻射源包括激光ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，其中所述發(fā)射包括從由熒光發(fā)射、Roman散射、 磷光、冷光或散射構(gòu)成的分組中所選擇的發(fā)射。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，其中所述檢測器包括 光學(xué)系統(tǒng)，所述光學(xué)系統(tǒng)適于接收所述發(fā)射并產(chǎn)生透鏡輸出；帶通濾光器，所述帶通濾光器適于接收所述透鏡輸出并產(chǎn)生所述濾波輸出；以及光電倍增管，所述光電倍增管適于接收所述濾波輸出并產(chǎn)生所述檢測器輸出信號(hào)，所述檢測器輸出信號(hào)包括虛擬的電信號(hào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的流式細(xì)胞儀，還包括模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器，所述模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器具有用于耦合到所述模擬電信號(hào)的轉(zhuǎn)換器輸入，并且還具有用于耦合到所述信號(hào)處理器的轉(zhuǎn)換器輸出。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，其中所述第一和第二激發(fā)電磁輻射源分別包括激光器；以及調(diào)制器，所述調(diào)制器用于耦合到所述激光器，用以產(chǎn)生所述調(diào)制激發(fā)光束。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的流式細(xì)胞儀，其中所述調(diào)制器從由TTL門裝置、驅(qū)動(dòng)所述激發(fā)電磁輻射源的周期性信號(hào)、電光調(diào)制器、聲光調(diào)制器、安裝在電流計(jì)上的反射鏡以及安裝在旋轉(zhuǎn)鏡面上的反射鏡構(gòu)成的分組中選擇，其中所述旋轉(zhuǎn)鏡面具有多個(gè)平面?zhèn)取?br> 11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，其中通過使用調(diào)制方案來調(diào)制所述第一和第二調(diào)制激發(fā)光束，所述調(diào)制方案是從由振幅調(diào)制、相位調(diào)制和頻率調(diào)制構(gòu)成的分組中選擇的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀，還包括光纖電纜，所述光線電纜具有第一輸入、第二輸入和輸出，所述第一輸入適于捕獲由所述第一調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的一者所產(chǎn)生的所述發(fā)射，所述第二輸入適于捕獲由所述第二調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的另一者所產(chǎn)生的所述發(fā)射，所述輸出適于向所述檢測器提供所述發(fā)射。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制冷機(jī)，還包括微流體基底，其中所述第一和第二流動(dòng)通道以及所述第一和第二分流器通過所述微流體基底形成。
14.一種用于在流式細(xì)胞儀中測量來自粒子的發(fā)射的方法，其中所述流式細(xì)胞儀包括第一和第二流動(dòng)通道，所述方法包括以下步驟a)提供第一激發(fā)電磁輻射源；b)以第一頻率調(diào)制所述第一激發(fā)電磁輻射源以產(chǎn)生第一調(diào)制激發(fā)光束；c)使所述第一調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第一流動(dòng)通道上；d)提供第二激發(fā)電磁輻射源；e)以第二頻率調(diào)制所述第二激發(fā)電磁輻射源以產(chǎn)生第二調(diào)制激發(fā)光束；f)使所述第二調(diào)制激發(fā)光束入射在所述第二流動(dòng)通道上；g)檢測來自所述第一和第二流動(dòng)通道的一者中的所述粒子的任一者的發(fā)射，并且產(chǎn)生單檢測器輸出信號(hào)；以及h)確定所述單檢測器輸出信號(hào)來自由所述第一調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的一者所引起的所述檢測發(fā)射的第一部分和由所述第二調(diào)制激發(fā)光束激發(fā)所述粒子的另一者所引起的所述檢測發(fā)射的第二部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟i)基于所述檢測發(fā)射的所述第一部分使所述第一流動(dòng)通道中的流動(dòng)分流；以及j)基于所述檢測發(fā)射的所述第二部分使所述第二流動(dòng)通道中的流動(dòng)分流。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中步驟i)和j)分別包括從由致動(dòng)壓電裝置、將氣泡引入所述各個(gè)流動(dòng)通道以及磁性致動(dòng)導(dǎo)流板構(gòu)成的分組中選擇的動(dòng)作。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述粒子包括生物細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中步驟b)和e)包括調(diào)制激光。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述發(fā)射包括從由熒光發(fā)射、Roman散射、磷光、 冷光或散射構(gòu)成的分組中所選擇的發(fā)射。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中步驟g)包括利用光電倍增管來感應(yīng)所述發(fā)射，所述光電倍增管產(chǎn)生所述單檢測器輸出信號(hào)。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中步驟h)包括對(duì)所述單檢測器輸出信號(hào)執(zhí)行傅里葉變換。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述傅里葉變換包括離散時(shí)間傅里葉變換。
23.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一和第二激發(fā)電磁輻射源分別包括激光器。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中步驟b)和e)分別包括從由引動(dòng)被耦合到激光二極管的TTL門裝置、將周期性信號(hào)引入到用以驅(qū)動(dòng)所述激發(fā)電磁輻射源的驅(qū)動(dòng)信號(hào)中、 操作電光調(diào)制器、操作聲光調(diào)制器、操作安裝在電流計(jì)上的反射鏡以及操作安裝在旋轉(zhuǎn)鏡面上的反射鏡構(gòu)成的分組中選擇的動(dòng)作，其中所述旋轉(zhuǎn)鏡面具有多個(gè)平面?zhèn)取?br> 25.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中步驟b)和e)包括通過使用調(diào)制方案來調(diào)制所述第一和第二調(diào)制激發(fā)光束，所述調(diào)制方案是從由振幅調(diào)制、相位調(diào)制和頻率調(diào)制構(gòu)成的分組中選擇的。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于在流式細(xì)胞儀系統(tǒng)中測量來自多個(gè)并行流動(dòng)通道的多個(gè)發(fā)射的系統(tǒng)及方法，其中利用不同的頻率來調(diào)制各個(gè)激發(fā)源。使用一個(gè)檢測器來收集由全部流動(dòng)通道中的全部源所激發(fā)的熒光發(fā)射，并且通過使用傅里葉變換技術(shù)來分離此發(fā)射。該系統(tǒng)和方法非常適于微流體應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102471752SQ201080027480
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者加里·杜拉克 申請(qǐng)人:索尼公司, 索尼美國公司