專利名稱：異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)及其用于產(chǎn)生變體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及美洲山楊(Populus tremuloides)異戍二烯合酶和銀白楊(Populusalba)異戊二烯合酶的結(jié)晶和三維結(jié)構(gòu)測定。本申請還提供了產(chǎn)生異戊二烯合酶的變體以增大微生物宿主細(xì)胞中的異戊二烯產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
類異戊二烯是異戊二烯聚合物，其可用于藥物、營養(yǎng)保健品、香料、香水、和橡膠產(chǎn)品。然而，由于生態(tài)學(xué)上的考慮，天然的類異戊二烯供應(yīng)是有限的。為此原因，以及為了提供具有較少雜質(zhì)和較高均一性的類異戊二烯成分，通常通過合成方式來產(chǎn)生類異戊二烯，例如橡膠。異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是揮發(fā)性的烴，其在水中不可溶，在醇中可溶?？梢酝ㄟ^直接從石油C5分解級分中分離或通過C5異烷烴或異烯烴脫水而獲得商業(yè)上可行的量的異戍二烯(Weissermel 和 Arpe, Industrial Organic Chemistry, 4th ed.，ffiley-VCH, pp. 11 7_122，2003)。也可以從較小的亞基合成C5骨架。然而，理想的是具有不依賴于非可再生資源的商業(yè)上可行的生產(chǎn)異戊二烯的方法。異戊二烯的生物合成產(chǎn)生是通過兩種不同的代謝途徑發(fā)生的(Julsing等人，ApplMicrobiol Biotechnol，75 :1377-1384，2007)。在真核生物和古生物中，異戊二烯是通過甲羥戊酸(MVA)途徑形成的，而一些真細(xì)菌和高等植物則通過甲基赤蘚醇磷酸(MEP)途徑產(chǎn)生異戊二烯。從植物中釋放的異戊二烯是光和溫度依賴性的，具有與葉發(fā)育關(guān)聯(lián)的增長。在
白楊(Aspen)樹中已經(jīng)鑒定了產(chǎn)生異戍二烯的酶-異戍二烯合酶(Silver和Fall,Plant
Physiol,97 :1588-1591,1991 ；以及 Silver 和 Fall，J Biol Chem，270 :13010-13016，1995)，并且認(rèn)為其負(fù)責(zé)在體內(nèi)從完整葉子中產(chǎn)生異戊二烯。也已經(jīng)描述了細(xì)菌的異戊二烯產(chǎn)生(Kuzma 等人，Curr Microbiol, 30 :97-103,1995 ;和 Wilkins, Chemosphere, 32 1427-1434，1996)，其數(shù)量隨著細(xì)菌的生長階段和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物含量而變化(Fall等人的美國專利 No. 5, 849, 970 ;和 Wagner 等人，J Bacteriol, 181 :4700_4703，1999，二者通過引用方式全文并入本文)。然而，通過現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)菌系統(tǒng)可以獲得的異戊二烯的水平不足以用于商業(yè)用途。多肽，例如異戊二烯合酶，具有由初級氨基酸序列和該多肽周圍的環(huán)境決定的三維結(jié)構(gòu)。該三維結(jié)構(gòu)實現(xiàn)該多肽的活性、穩(wěn)定性、結(jié)合親和性、結(jié)合特異性、和其它生化特性。因此，知曉蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)能夠在設(shè)計其生物學(xué)活性例如更大的催化活性、二聚體化和/或溶解性的改進(jìn)上提供更多指導(dǎo)。
多肽的三維結(jié)構(gòu)可以通過多種方式來確定。很多最精確的方法使用X-射線晶體學(xué)(見例如 Van Holde, (1971)Physical Biochemistry, Prentice-HalI, New Jersey,pp. 221-39)。該技術(shù)依賴于晶格衍射X-射線或其它形式的放射的能力。適合于測定大分子的三維結(jié)構(gòu)的衍射實驗通常需要高質(zhì)量的晶體。多肽的結(jié)晶性質(zhì)差異巨大(Dale，等人，J. Struct. Biol. 142 :88-97,2003 ；MacPherson, A.，Methods 34 :254-265,2004 ；和Slabinski，L等人，Protein Science 16 :2472-2482, 2007)。在一些情況下，多肽容易結(jié)晶，而在其它情況下，多肽晶體被證明是非常難以獲得的。沒有詳細(xì)理論來指導(dǎo)使大分子結(jié)晶的嘗試，因此，多數(shù)關(guān)于大分子晶體生長的嘗試在本質(zhì)上是經(jīng)驗性的(MacPherson，2004)。之前的應(yīng)用異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)以改進(jìn)異戊二烯產(chǎn)量的嘗試依賴于其它萜烯合酶的結(jié)構(gòu)，其中三維結(jié)構(gòu)是可獲得的，包括冰片基二磷酸合酶和5-表-倍半萜植保素合酶(見例如美國專利申請序列號12/429，143和WO 2008/137092)。需要異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)，以輔助設(shè)計異戊二烯合酶的變體，以允許類異戊二烯的商業(yè)規(guī)模的生物產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)相對于之前測定的合成酶例如冰片基二磷酸合酶和檸檬烯合酶具有結(jié)構(gòu)上的同源性折疊，包括參與所需的金屬離子輔因子的絡(luò)合的區(qū)域即活性和底物結(jié)合位點中的保守性。該結(jié)構(gòu)對于這些酶結(jié)合底物并催化協(xié)調(diào)的系列反應(yīng)所需的構(gòu)象變化具有重要意義。特別地，該結(jié)構(gòu)具有已鑒定的柔性區(qū)域，該區(qū)域可能被所有結(jié)構(gòu)上同源的合成酶共有，并且預(yù)期這些區(qū)域和鄰近區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的氨基酸修飾將使這些酶具有改進(jìn)的性能。異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)可以提供點的三維構(gòu)型，或反應(yīng)坐標(biāo)，代表用于將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化為異戊二烯的異戊二烯合酶的活性位點。此類點的構(gòu)型可以輔助設(shè)計用于將DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯的合成試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了通過利用異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)來產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法和組合物。在一個方面，本發(fā)明提供了 a)使用異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶中用于氨基酸置換的至少一個位置，所述至少一個位置能夠增加異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性；和b)在所述位置修飾異戊二烯合酶以產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體。在一個實施方式中，所述位置選自柔性環(huán)、二磷酸/金屬結(jié)合位點、活性位點、異戊二烯基結(jié)合位點、表面區(qū)域、帶負(fù)電的區(qū)域、鉸鏈區(qū)、和靜電補綴(electrostatic patch)區(qū)。在另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊(P.alba)異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶表面上的疏水性氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的表面氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定具有相對于SEQ ID NO 45的銀白楊異戊二烯合酶氨基酸序列改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的置換的變體。在一些實施方式中，所述疏水性表面氨基酸選自 128、V30、L130、G153、L303、L469 和 L494。在其它方面，本發(fā)明提供了通過本文公開的任意方法產(chǎn)生的異戊二烯合酶變體。在一些方面，異戊二烯合酶變體是分離的。在其它方面，異戊二烯合酶變體包含選自I28W、I28T、I28R、I28Y、V30K、L130W、L130K、L130S、L130Y、L130R、L130V、L130I、L130E、L130D、G153K、G153H、G153L、G153W、L303I、L469A、L469Q、L494P、L494C、L494I、L494V、L494S、L494G、和 L494D 的一個或多個置
換在其它方面，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶變體，其中所述變體包含選自128、V30、L130、G153、L303、L469和L494的疏水性表面氨基酸的一個或多個置換。在一些方面，突變選自 I28W、I28T、I28R、I28Y、V30K、L130W、L130K、L130S、L130Y、L130R、L130V、L130I、L130E、L130D、G153K、G153H、G153L、G153W、L303I、L469A、L469Q、L494P、L494C、L494I、L494V、L494S、L494G、和 L494D。在其它方面，本發(fā)明提供了包含編碼本文公開的任意異戊二烯合酶變體的核酸的任意宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了表達(dá)或能夠表達(dá)本文公開的任意異戊二烯合酶變體的宿主細(xì)胞。在其它方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶鉸鏈區(qū)中的殘基山)在異戊二烯合酶的鉸鏈區(qū)氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定具有相對于SEQ ID NO :45的銀白楊異戊二烯合酶氨基酸序列改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的置換的變體。在一些實施方式中，鉸鏈區(qū)氨基酸選自R198、I229和L260。在其它方面，本發(fā)明提供了分離的異戊二烯合酶變體，其中所述變體在選自R198、1229和L260的鉸鏈區(qū)氨基酸中包含一個或多個置換。在其它方面，本發(fā)明提供了包含選自I229V、I229L、I229C、I229T、I229P、I229N、L260N、L260M、和 L260I 的一個或多個置換的變體。在其它方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的帶負(fù)電的區(qū)域中的氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的帶負(fù)電的區(qū)域氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定具有相對于SEQ ID NO 45的銀白楊異戊二烯合酶氨基酸序列改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的置換的變體。在一些實施方式中，帶負(fù)電的區(qū)域氨基酸選自D311和D323。在一些實施方式中，變體包含選自D311M、D311F、D311L、D311G、D311I、D311A、D311T、D311R、D311V、D311E、D323M、D323W、D323Y、D323F、D323I、D323S、D323V、D323A、D323G、和D323Q的一個或多個置換。在其它方面，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶變體，其中所述變體在選自D311和D323的帶負(fù)電的區(qū)域氨基酸中包含一個或多個氨基酸置換。在其它方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的柔性環(huán)氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的柔性環(huán)氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；和c)鑒定具有相對于SEQ ID NO :45的銀白楊異戊二烯合酶氨基酸序列改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的置換的變體。在一些實施方式中，柔性環(huán)氨基酸選自A443、A453、N454、H515 和 A519。在其它實施方式中，變體包含選自 A443S、A443G、A443R、A443Q、A453L、A453N、A453I、A453V、H515M、H515Q、A519H、A519S、A519G、A519W 和 A519T 的一個或多個置換。在其它方面，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶變體，其中所述變體在選自A443、A453、N454、H515和A519的柔性環(huán)氨基酸中包含一個或多個置換。在一些實施方式中，所述變體在氨基酸T536發(fā)生置換。在其它實施方式中，所述變體包含選自T536F、T536Y、T536V、T536I、T536M、T536H、T536C、T536L、T536K、T536A、T536S 和 T536G 的一個或多個置換。在其它方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的二磷酸/金屬結(jié)合位點中的氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的二磷酸/金屬結(jié)合位點氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；和c)鑒定具有相對于SEQ ID NO 45的銀白楊異戊二烯合酶氨基酸序列改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的置換的變體。在其它方面，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶變體，其中所述變體在二磷酸/金屬結(jié)合位點氨基酸中包含一個或多個置換。在其它方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的異戊二烯基結(jié)合位點中的氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的異戊二烯基結(jié)合位點氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；和c)鑒定具有相對于SEQ ID NO 45的銀白楊異戊二烯合酶氨基酸序列改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的置換的變體。在其它方面，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶變體，其中所述變體在異戊二烯基結(jié)合位點氨基酸中包含一個或多個置換。在其它方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)異戊二烯的方法，包括(a)提供權(quán)利要求9、15、
21、27、30、34、和38任一項的宿主細(xì)胞；和(b)在適合于生產(chǎn)異戊二烯的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法，包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶表面上的氨基酸殘基；b)在異戊二烯合酶的表面氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于包含SEQ IDNO 18的氨基酸序列的銀白楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。在一些實施方式中，氨基酸置換包括下列一項或多項疏水性的至帶正電的、帶正電的至疏水性的、疏水性的至帶負(fù)電的、帶負(fù)電的至疏水性的、疏水性的至中性極性的、中性極性的至疏水性的、中性極性的至帶正電的、帶正電的至中性極性的、中性極性的至帶負(fù)電的、帶負(fù)電的至中性極性的、帶正電的至帶負(fù)電的、以及帶負(fù)電的至帶正電的。本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性的異戊二烯合酶變體的方法，包括a)鑒定美洲山楊(P. tremuloides)異戍二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)中在二磷酸/金屬結(jié)合位點中或在二磷酸/金屬結(jié)合位點附近的氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的二磷酸/金屬結(jié)合位點中或在二磷酸/金屬結(jié)合位點附近引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于包含SEQ ID NO=Il的氨基酸序列的美洲山楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性的突變。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了通過這些方法產(chǎn)生的分離的異戊二烯合酶變體。在一些實施方式中，二磷酸/金屬結(jié)合位點中的氨基酸選自D293、Y385、S392和D437。本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性的異戊二烯合酶變體的方法，包括a)鑒定美洲山楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)中在異戊二烯基結(jié)合位點中的氨基酸殘基山)在異戊二 烯合酶的異戊二烯基結(jié)合位點中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于包含SEQ IDNO 11的氨基酸序列的美洲山楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性的突變。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了通過該方法產(chǎn)生的分離的異戊二烯合酶變體。在一些實施方式中，異戊二烯基結(jié)合位點中的氨基酸選自S261、W264、F285、T289、S393、S394、F432和Y512。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性的異戊二烯合酶變體的方法，包括a)鑒定美洲山楊異戍二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)中在底物接近環(huán)(substrate access loop)中的氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的底物接近環(huán)中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于包含SEQ IDNO 11的氨基酸序列的美洲山楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性的突變。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了通過這些方法產(chǎn)生的分離的異戊二烯合酶變體。在一些實施方式中，底物接近環(huán)中的氨基酸選自S440、A441、S442、A443、E444、1445、A446、R447、G448、E449、T450、A451、N452、S453、Y512、H513、N514、G515、D516、A517、H518、T519、S520、P521、D522、E523、和 L524。本發(fā)明提供了母體合酶的變體，其在結(jié)構(gòu)上同源于異戊二烯合酶并具有對應(yīng)于或類似于柔性N-末端的下列殘基和/或鄰近殘基的修飾的殘基異戊二烯合酶的1_28、239、243、253-257、259、260、293、295-300、303、325、374。在一些實施方式中，合酶是異戊二烯合酶。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了母體合酶的變體，其在結(jié)構(gòu)上同源于異戊二烯合酶并具有對應(yīng)于或類似于柔性環(huán)I的下列殘基和/或鄰近殘基的修飾的殘基異戊二烯合酶的438-453、293、295、297、370、371、373、374、378-380、382、385、386、433-437、454-458、469、472、476、512。在一些實施方式中，合酶是異戊二烯合酶。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了母體合酶的變體，其在結(jié)構(gòu)上同源于異戊二烯合酶并具有對應(yīng)于或類似于柔性環(huán)II的下列殘基和/或鄰近殘基的修飾的殘基異戊二烯合酶的512-526、187、188、255、257、270、271、273、274、285、288、439、440、442、508-512、和 528-532。合酶是異戊二烯合酶。本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性的母體萜烯合酶或萜烯合酶結(jié)構(gòu)同源物的變體的方法，包括a)鑒定萜烯合酶或萜烯合酶結(jié)構(gòu)同源物的三維結(jié)構(gòu)中的在一個或多個底物接近環(huán)中或在一個或多個底物接近環(huán)附近的氨基酸；b)在萜烯合酶或萜烯合酶結(jié)構(gòu)同源物的一個或多個底物接近環(huán)中或在一個或多個底物接近環(huán)附近引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于母體萜烯合酶或萜烯合酶結(jié)構(gòu)同源物改進(jìn)萜烯合酶或萜烯合酶結(jié)構(gòu)同源物變體的活性的置換。在一些實施方式中，萜烯合酶或萜烯合酶結(jié)構(gòu)同源物是異戊二烯合酶。在一些實施方式中，異戊二烯合酶是包含SEQ ID NO :11的美洲山楊異戊二烯合酶。在一些實施方式中，異戊二烯合酶是包含SEQ ID NO :18的銀白楊異戊二烯合酶。在一些實施方式中，變體包含一個或多個下列氨基酸殘基的置換L17、L18、S19、S20、S239、R243、F253、A254、R255、D256、R257、1259、E260、D293、Y295、D296、V297、Y298、G299、T300、E303、Y325、L374、Y375、V529、L530、T534、D293、Y295、V297、E370、A371、W373、L374、S378、T379、P380、F382、Y385、F386、R433、L434C435、N436、D437、V454、S455、C456、Y457、M458、T469、V472、1476、Y512、E187、L188、R255、R257、F270、E271、Q273、Y274、F285、V288、A439、S440、S442、S508、H509、C510、T511、Y512、R528、V529、L530、S531、和 V532。本發(fā)明提供了通過下述產(chǎn)生異戊二烯合酶變體的方法a)獲得包含異戊二烯合酶的晶體山)獲得該晶體的原子坐標(biāo)；c)將原子坐標(biāo)數(shù)據(jù)與一種或多種分子模擬技術(shù)相關(guān)聯(lián)；d)鑒定預(yù)測為影響異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的至少一個修飾；和e)基于該預(yù)測修飾異戊二烯合酶。在一些實施方式中，異戊二烯合酶是美洲山楊異戊二烯合酶。在一些實施方式中，異戊二烯合酶是銀白楊異戊二烯合酶。在 一些方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生異戍二烯合酶變體的方法，包括a)將表3-7的美洲山楊異戊二烯合成的原子坐標(biāo)數(shù)據(jù)與一種或多種分子模擬技術(shù)相關(guān)聯(lián)山)鑒定預(yù)測為影響異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的至少一個修飾；和(3)基于b)中獲得的預(yù)測修飾異戊二烯合酶。在一些方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生異戊二烯合酶變體的方法，包括a)將表4-2的銀白楊異戊二烯合成的原子坐標(biāo)數(shù)據(jù)與一種或多種分子模擬技術(shù)相關(guān)聯(lián)山)鑒定預(yù)測為影響異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的至少一個修飾；和(3)基于b)中獲得的預(yù)測修飾異戍二烯合酶。在其它方面，本發(fā)明提供了鑒定異戊二烯合酶的候選變體的方法，包括a)將不具有結(jié)合配體的異戊二烯合酶的原子結(jié)構(gòu)與具有結(jié)合配體的異戊二烯合酶的原子結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較；和b)就與該配體的結(jié)合能力以計算機方式鑒定異戊二烯合成的候選變體。本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法，包括a)基于美洲山楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶表面上的氨基酸殘基；
b)在異戊二烯合酶的表面氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于包含SEQID NO 11的氨基酸序列的美洲山楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。在一些實施方式中，氨基酸置換包括下列一項或多項疏水性的至帶正電的、帶正電的至疏水性的、疏水性的至帶負(fù)電的、帶負(fù)電的至疏水性的、疏水性的至中性極性的、中性極性的至疏水性的、中性極性的至帶正電的、帶正電的至中性極性的、中性極性的至帶負(fù)電的、帶負(fù)電的至中性極性的、帶正電的至帶負(fù)電的、以及帶負(fù)電的至帶正電的。本發(fā)明提供了通過下述產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶表面上的疏水性氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的表面氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于母體銀白楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。本發(fā)明提供了在一個或多個下列殘基處包含疏水性表面氨基酸的突變的分離的銀白楊異戊二烯合酶變體I28、V30、L130、G153、L303、L469和L494。在一些實施方式中，變體包含一個或多個下列突變I28W、I28T、I28R、I28Y、V30K、L130W、L130K、L130S、L130Y、L130R、L130V、L130I、L130E、L130D、G153K、G153H、G153L、G153W、L303I、L469A、L469Q、L494P、L494C、L494I、L494V、L494S、L494G 和 L494D。本發(fā)明提供了通過下述產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的母體異戊二烯合酶的變體方法a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶鉸鏈區(qū)中的殘基；
b)在異戊二烯合酶的鉸鏈區(qū)氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于母體銀白楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。在一些方面，本發(fā)明提供了在鉸鏈區(qū)中或鉸鏈區(qū)附近包含突變的分離的銀白楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體在一個或多個下列殘基處包含突變R198、1229和L260。在一些實施方式中，變體包含一個或多個下列突變1229V、I229L、I229C、I229T、I229P、I229N、L260N、L260M、和 L260I。本發(fā)明提供了通過下述產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶的變體方法a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的靜電補綴中的氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的靜電補綴氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于母體銀白楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。在一些方面，本發(fā)明提供了分離的銀白楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體在靜電補綴氨基酸中包含突變，所述靜電補綴氨基酸包括但不限于殘基D311和D323。在一些實施方式中，變體包含一個或多個下列突變D311M、D311F、D311L、D311G、D311I、D311A、D311T、D311R、D311V、D311E、D323M、D323W、D323Y、D323F、D323I、D323S、D323V、D323A、D323G、和 D323Q。本發(fā)明提供了通過下述產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的柔性環(huán)中的氨基酸殘基山)在異戊二烯合酶的柔性環(huán)氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于母體銀白楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。本發(fā)明提供了分離的銀白楊異戊二烯合酶變體，其在一個或多個下列殘基處在柔性環(huán)中包含突變A443、A453、N454、H515、A519和E525。在一些實施方式中，變體包含一個或多個下列突變A443S、A443G、A443R、A443Q、A453L、A453N、A453I、A453V、H515M、H515Q、A519H、A519S、A519G、A519W 和 A519T。在一些方面，本發(fā)明提供了在氨基酸T536處突變的分離的銀白楊異戊二烯合酶變體。在一些實施方式中，變體包含下列突變之一 T536F、T536Y、T536V、T536I、T536M、T536H、T536C、T536L、T536K、T536A、T536S 和 T536G。本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的二磷酸/金屬結(jié)合位點中的氨基酸殘基；b)在異戊二烯合酶的二磷酸/金屬結(jié)合位點氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于母體銀白楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。在一些方面，本發(fā)明提供了分離的異戊二烯合酶變體，其在銀白楊異戊二烯合酶的二磷酸/金屬結(jié)合位點殘基處包含突變。本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的異戊二烯合酶變體的方法；該方法包括a)基于銀白楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定異戊二烯合酶的異戊二烯基結(jié)合位點中的氨基酸殘基；b)在異戊二烯合酶的異戊二烯基結(jié)合位點氨基酸中引入一個或多個氨基酸置換；c)鑒定相對于母體銀白楊異戊二烯合酶改進(jìn)異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性的突變。在一些方面，本發(fā)明提供了分離的銀白楊異戊二烯合酶變體，其在異戊二烯基結(jié)合位點氨基酸中包含突變。在另一個方面，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的晶體形式。特別地，本發(fā)明提供了基于異戊二烯合酶的晶體形式改進(jìn)萜烯合酶的活性的方法。在一些實施方式中，異戊二烯合酶的晶體形式還包含配體，例如二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。在一些方面，美洲山楊異戊二烯合酶的晶體形式包括這樣的結(jié)構(gòu)其特征在于四邊形空間群對稱P432p和下列單胞尺寸a = 154. 2埃，b = 154. 2埃，c = 142. 7埃，其中a = ^ = Y = 90度。在一些實施方式中，單胞尺寸是a = 146. 5至161. 9埃，b = 146. 5至 161. 9 埃，c = 135. 6 至 149. 8 埃，其中 a = P = y = 90 度。在一些方面，銀白楊異戊二烯合酶的晶體形式包括這樣的結(jié)構(gòu)其特征在于四邊形空間群對稱P432,2和下列單胞尺寸a = 156. 8埃，b = 156. 8埃，c = 142. 5埃，其中a=^ = Y = 90度。在一些實施方式中，單胞尺寸是a = 148. 96至164. 6埃，b = 148. 96至 164. 6 埃，c = 135. 4 至 149. 6 埃，其中 a =旦=y = 90 度。本發(fā)明提供了多肽的晶體形式，所述多肽包含由根據(jù)表3-7的美洲山楊異戊二烯合酶氨基酸 Arg 255、Asp 292、Asp 296、Glu 370、Arg433 和 Asn436、Ser261、Trp264、Phe285、Thr289、Ser393、Phe432和Tyr512的一個或多個結(jié)構(gòu)坐標(biāo)確定的結(jié)構(gòu)，或者，當(dāng)重疊于表3-7的相應(yīng)的原子坐標(biāo)的非氫原子位置時，包含小于大約1.5人的均方根偏差的所述殘基的類似結(jié)構(gòu)坐標(biāo)確定的結(jié)構(gòu)。在一些實施方式中，當(dāng)重疊于表3-7的相應(yīng)的原子坐標(biāo)的非氫原子位置時，均方根偏差小于大約0.75 A■。在一些實施方式中，當(dāng)重疊于表3-7的相應(yīng)的原子坐標(biāo)的非氫原子位置時，均方根偏差小于大約0.35人。在本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明提供了美洲山楊異戊二烯合酶的晶體形式，其中氨基酸殘基 Arg 255、Asp 292、Asp 296、Glu 370、Arg 433 和 Asn 436 構(gòu)成異戊二烯合酶的二磷酸/金屬結(jié)合位點。在一些實施方式中，氨基酸殘基Ser 261、Trp 264、Phe285、Thr 289、Ser393、Ser 394、Phe 432、和Try 512構(gòu)成異戊二烯合酶的異戊二烯基結(jié)合位點。在一些實施方式中，具有序列SASAEIARGETANS的氨基酸殘基438-453和具有序列YHNGDAHTSPDEL的殘基512-526構(gòu)成異戊二烯合酶的底物接近環(huán)。在一些實施方式中，氨基酸1-16和17-28構(gòu)成被稱作N-末端環(huán)I和N-末端環(huán)II的N-末端環(huán)。本發(fā)明提供了多肽的晶體形式，所述多肽包含與SEQ ID NO :11具有至少75%同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，多肽包含與SEQ ID NO :11具有至少85%同一性的氨基酸序列。在其它實施方式中，多肽包含與SEQ ID NO: 11具有至少90%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明提供了多肽的晶體形式，所述多肽包含與SEQ ID NO: 18具有至少75%同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，多肽包含與SEQ ID NO :18具有至少85%同一性的氨基酸序列。在其它實施方式中，多肽包含與SEQ ID NO: 11具有至少90%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明提供了點的可放縮的(scalable)三維構(gòu)型，所述點的至少一部分源自表3-7中所列的美洲山楊異戊二烯合酶分子或分子復(fù)合體的至少一部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)并且相對于所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)具有小于大約1.5人的均方根偏差。在一些實施方式中，源自美洲山楊異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的至少一部分源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述多個氨基酸定義了至少一個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣二磷酸/金屬結(jié)合位點，其包括氨基酸Arg 255, Asp 292, Asp 296,Glu 370, Arg 433和Asn436。在一些實施方式中，源自美洲山楊異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的至少一部分源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述多個氨基酸定義了至少一個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣異戊二烯基結(jié)合位點，所述異戊二烯基結(jié)合位點包括氨基酸 Ser 261、Trp 264、Phe 285、Thr289、Ser 393、Ser 394、Phe 432 和 Tyr512。在其它實施方式中，點的至少一部分源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述多個氨基酸定義了至少一個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣柔性環(huán)，其包括但不限于包括序列SASAEIARGETANS的環(huán)I氨基酸殘基438-453，具有序列YHNGDAHTSTOEL的殘基512-526，形成N-末端環(huán)I的氨基酸1_16，形成N-末端環(huán)II的氨基酸17-28。在一些實施方式中，源自美洲山楊異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的至少一部分源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述多個氨基酸定義了至少一 個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣二磷酸/金屬結(jié)合位點，所述二磷酸/ 金屬結(jié)合位點包括氨基酸 Arg 255、Asp 292、Asp 296、Glu 370、Arg 433 和 Asn436 ;并且源自美洲山楊異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的至少一部分源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述多個氨基酸定義了至少一個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣異戊二烯基結(jié)合位點，所述異戊二烯基結(jié)合位點包括氨基酸Ser 261、Trp 264、Phe 285、Thr289、Ser 393、Ser 394、Phe 432、和 Try 512。本發(fā)明提供了機器可讀的介質(zhì)，其中嵌入了對應(yīng)于美洲山楊異戊二烯合酶或銀白楊異戊二烯合酶的晶體形式的三維結(jié)構(gòu)代表的信息。另外，本發(fā)明提供了計算機系統(tǒng)，其包括含有關(guān)于美洲山楊異戊二烯合酶或銀白楊異戊二烯合酶的晶體形式的三維結(jié)構(gòu)的信息的數(shù)據(jù)庫；和用于瀏覽所述信息的用戶界面。在圖64中以立體圖的形式展示了顯示所包括的兩個坐標(biāo)組之間的高度結(jié)構(gòu)同源性的圖。本發(fā)明提供了這樣的試劑，其特征在于點的三維構(gòu)型，所述點源自表3-7中所列的美洲山楊異戊二烯合酶分子或分子復(fù)合體的至少一部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)并且相對于所述結(jié) 構(gòu)坐標(biāo)具有小于大約1.5 A■的均方根偏差。在一些實施方式中，試劑的特征在于，源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的三維構(gòu)型，所述多個氨基酸定義了至少一個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣二磷酸/金屬結(jié)合位點，其包括氨基酸 Arg 255,Asp 292,Asp 296,Glu 370,Arg 433 和 Asn436。在一些實施方式中，試劑的特征在于，源自美洲山楊異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的至少一部分源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述多個氨基酸定義了至少一個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣異戊二烯基結(jié)合位點，所述異戊二烯基結(jié)合位點包括氨基酸Ser 261, Trp 264, Phe 285, Thr 289、Ser393、Ser 394, Phe 432、和 Try 512。在其它實施方式中，試劑的特征在于，源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的至少一部分，所述多個氨基酸定義了至少一個美洲山楊異戊二烯合酶或美洲山楊異戊二烯合酶樣柔性環(huán)，其包括但不限于包括序列SASAEIARGETANS的環(huán)I氨基酸殘基438-453，具有序列YHNGDAHTSTOEL的殘基512-526，形成N-末端環(huán)I的氨基酸1_16，形成N-末端環(huán)II的氨基酸17-28。本發(fā)明提供了點的可放縮的三維構(gòu)型，所述點的至少一部分源自表4-2中所列的銀白楊異戊二烯合酶分子或分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)并且相對于所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)具有小于大約1.5人的均方根偏差。在一些實施方式中，源自銀白楊異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的點的至少一部分源自代表多個氨基酸的至少骨架原子的位置的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述多個氨基酸定義了至少一個銀白楊異戊二烯合酶或銀白楊異戊二烯合酶樣位點，包括但不限于二磷酸/金屬結(jié)合位點、異戊二烯基結(jié)合位點、柔性環(huán)、靜電補綴和鉸鏈區(qū)。本發(fā)明提供了這樣的試劑，其特征在于點的三維構(gòu)型，所述點源自表4-2中所列的銀白楊異戊二烯合酶分子或分子復(fù)合體的至少一部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)并且相對于所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)具有小于大約1.5人的均方根偏差。在一些實施方式中，試劑的特征在于，源自代表多個氨基酸的至少骨架的位置的結(jié)構(gòu)反應(yīng)坐標(biāo)的點的三維構(gòu)型，所述多個氨基酸定義了至少一個銀白楊異戊二烯合酶或銀白楊異戊二烯合酶樣二磷酸/金屬結(jié)合位點、柔性環(huán)、靜電補綴和鉸鏈區(qū)。本發(fā)明提供了通過下述生產(chǎn)異戊二烯的方法(a)提供包含銀白楊異戊二烯合酶變體的宿主細(xì)胞；和(b)在適合于生產(chǎn)異戊二烯的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。


圖I顯示了異戍二烯的MVA和DXP代謝途徑(基于F. Bouvier等人，Progressin Lipid Res. 44 :357-429, 2005)。以下描述包括該途徑中的每種多肽的備選名稱和公開了用于測定所指明的多肽的活性的檢驗法的參考文獻(xiàn)(這些參考文獻(xiàn)中的每一篇通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于MVA和DXP途徑中的多肽的多肽活性的檢驗法)。甲羥戊酸途徑AACT :乙酰-輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶，MvaE, EC 2. 3. I. 9.檢驗法J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ;HMGS :羥甲基戊二酰-輔酶 A 合酶，MvaS，EC 2. 3. 3. 10.檢驗法J. Bacteriol.，184 =4065-4070, 2002 ；HMGR :3_ 羥基-3-甲基戊二酰-輔酶 A 還原酶，MvaE, EC I. I. I. 34.檢驗法:J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；MVK 甲羥戊酸激酶，ERG12, EC 2. 7. I. 36.檢驗法Curr Genet 19 :9_14，1991。PMK :磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8, EC 2. 7. 4. 2，檢驗法Mol Cell Biol.，11 :620_631，1991 ;DPMDC :二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVDI, EC 4. I. I. 33.檢驗法 biochemistry, 33 :13355-13362，1994 ；IDI :異戊二烯基-二磷酸 6 -異構(gòu)酶，IDI1, EC 5. 3. 3. 2.檢驗法:J. Biol. Chem. 264 :19169-19175， 1989。DXP途徑DXS :1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC 2.2.1.7.檢驗法PNAS，94:12857-62,1997 ；DXR :1_脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶，dxr，EC2. 2. I. 7.檢驗法Eur.J. Biochem. 269 :4446-4457, 2002 ；MCT :4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合酶，IspD, EC
2.7. 7. 60.測定法PNAS,97 :6451-6456,2000 ；CMK :4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶，IspE, EC 2. 7. I. 148.測定法PNAS,97 :1062-1067，2000 ；MCS 2C-甲基-D-赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶，IspF, EC 4. 6. I. 12.測定法PNAS，96 :11758-11763，1999 ;HDS:1_ 羥基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基 4- 二磷酸合酶，ispG，EC I. 17. 4. 3.測定法J. Org. Chem.，70 :9168-9174,2005 ;HDR:1_ 羥基-2-甲基-2_(E)-丁烯基 4-二磷酸還原酶，IspH, ECI. 17. I. 2.測定法 JACS, 126 :12847-12855，2004。圖2提供了質(zhì)粒p9795的圖譜。圖3 (3A，B)提供了質(zhì)粒p9795的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)。圖4提供了質(zhì)粒pTrcKudzu的圖譜。圖5 (5A，B，C)提供了質(zhì)粒 pTrcKudzu 的核苷酸序列(SEQ IDNO 2)。圖6提供了質(zhì)粒pMAL-C4X的圖譜。圖7 (Jk, B，C)提供了質(zhì)粒 pMAL-C4X 的核苷酸序列(SEQ IDNO 3)。圖8提供了質(zhì)粒pMAL-C4X_Kudzu的圖譜。圖9 (9A, B，C，D)提供了 pMAL-C4X_Kudzu 的核苷酸序列(SEQ IDNO 4)。圖10 提供了 pET24P. tremuloides 和 pET24P. trichocarpa 的圖譜。圖11提供了 P. tremuloides pET24a中的美洲山楊I(lǐng)spS的氨基酸序列(SEQ IDNO 5)。圖12(12A，B，C)提供了質(zhì)粒 P. tremuloides pET24 的核苷酸序列(SEQ ID NO 6)。圖13 提供了 P. trichocarpa pET24a 中的毛果楊(P. trichocarpa) IspS 的氨基酸序列(SEQ ID NO :7)。圖14(14A,B,C)提供了質(zhì)粒P. trichocarpa pET24 的核苷酸序列(SEQ ID NO :8)。圖15A提供了質(zhì)粒pDu30的圖譜。圖15B提供了質(zhì)粒pDu31的圖譜。
圖15C提供了質(zhì)粒pDu32的圖譜。圖16提供了 pDu30中的銀白楊I(lǐng)spS變體的氨基酸序列(SEQ IDNO 9)。圖17(17A，B，C)提供了質(zhì)粒 pDu30 的核苷酸序列(SEQ IDNO 10)。圖18提供了 pDu31中的美洲山楊I(lǐng)spS變體的氨基酸序列(SEQ IDNO 11)。為了描述異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的目的，編號規(guī)則為含有標(biāo)簽的完整序列的第一個編號為-35，IspS的前三個殘基是MRR(帶下劃線的)。圖19(19A，B，C)提供了質(zhì)粒 pDu31 的核苷酸序列(SEQ ID NO 12)。圖20提供了 pDu32中的毛果楊I(lǐng)spS變體的氨基酸序列(SEQ IDNO 13)。圖21 (21A，B，C)提供了質(zhì)粒 pDu32 的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)。 圖22 (22A，B，C)提供了質(zhì)粒 pDu27 的核苷酸序列(SEQ ID NO 15)。圖23提供了銀白楊pET24a中的全長銀白楊I(lǐng)spS的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。圖24(24A，B，C)提供了銀白楊 pET24a 的核苷酸序列(SEQ ID NO 17)。圖25提供了質(zhì)粒MD09-161和MD09-163的圖譜。圖26提供了 MD09-163中的銀白楊MEA(+)TEV的氨基酸序列(SEQ ID NO 18)。圖27(27A，B，C)提供了質(zhì)粒MD09-163的核苷酸序列(SEQ ID NO 19)。以下劃線標(biāo)示出了 CDS,以加粗標(biāo)示出了 TEV蛋白酶位點。圖28提供了 MD09-161中的銀白楊FL(+)TEV的氨基酸序列(SEQID NO 20)。圖29(29A，B，C)提供了 MD09-161的核苷酸序列(SEQ ID NO 21)。以下劃線標(biāo)示出了 CDS，以加粗標(biāo)示出了 TEV蛋白酶位點。圖30提供了顯示為二聚體的美洲山楊I(lǐng)spS的三維結(jié)構(gòu)。鏈A為深灰色，鏈B為中等灰色，存在于每個活性位點中的單一的鎂離子為淺灰色。圖31提供了美洲山楊I(lǐng)spS的結(jié)構(gòu)的單體示意圖。鎂顯示為淺灰色球體，標(biāo)示出了 N-末端和C-末端。圖32顯示了 (A)BdpS和LS、(B)BdpS和美洲山楊I(lǐng)spS, (C)LS和美洲山楊I(lǐng)spS,(D)TEAS和美洲山楊I(lǐng)spS之間的結(jié)構(gòu)比對。在每種情況下，第一個結(jié)構(gòu)為淺灰色，第二個結(jié)構(gòu)為深灰色。二價陽離子顯示為球體。圖33顯示了 BdpS和LS中的環(huán)的三維結(jié)構(gòu)。圖板A以淺灰色顯示了 Ls的N-末端環(huán)，以深灰色顯示了 BdpS的N-末端環(huán)。圖板B顯示環(huán)I和環(huán)II在結(jié)構(gòu)上是同源的。圖34顯示BdpS (深灰色)和美洲山楊I(lǐng)spS (淺灰色)的N-末端環(huán)在結(jié)構(gòu)上是不同的。圖板A顯示了 N-末端環(huán)，圖板B顯示了環(huán)I和環(huán)II。圖35顯示LS(淺灰色)和美洲山楊I(lǐng)spS (深灰色)的N-末端環(huán)在結(jié)構(gòu)上是不同的。圖板A顯示了 N-末端環(huán)，圖板B顯示了環(huán)I和環(huán)II。圖36顯示TEAS(淺灰色)和美洲山楊I(lǐng)spS (深灰色)的N-末端環(huán)在結(jié)構(gòu)上是不同的。圖板A顯示了 N-末端環(huán)，圖板B顯示了環(huán)I和環(huán)II。環(huán)I在TEAS中是混亂的。圖37提供了野葛異戊二烯合酶的氨基酸序列。圖38提供了白楊(Populus)[銀白楊(alba)X歐洲山楊(tremuloides)]異戍二烯合酶的氨基酸序列。圖39 提供了質(zhì)粒 pCL201 (pET24a P. alba IspS (MEA 發(fā)夾破壞)的圖譜。圖40(40A，B，C)提供了 pCL201的核苷酸序列(SEQ ID NO 44)。以下劃線標(biāo)示出了 IspS CDS。圖41提供了銀白楊I(lǐng)spS殘基I至544的氨基酸序列(SEQ IDNO 45)。圖42提供了顯示為二聚體的銀白楊I(lǐng)spS的三維結(jié)構(gòu)。鏈A為深灰色，鏈B為淺灰色。圖43提供了銀白楊I(lǐng)spS的結(jié)構(gòu)的單體示意圖。圖44提供了 25個位點的結(jié)構(gòu)示意圖，所述位點選擇用于銀白楊I(lǐng)spS單體的帶狀圖骨架上的棍狀圖中的SEL。圖45顯示了含有4個完整文庫(就異戊二烯產(chǎn)生和蛋白濃度待篩選)的典型的
96孔板的布局圖。圖46提供了銀白楊I(lǐng)spS的表面疏水性殘基位點469和494的位置。圖47提供了銀白楊I(lǐng)spS的柔性環(huán)殘基位點443、453和515的位置。圖48提供了銀白楊I(lǐng)spS 二聚體的帶負(fù)電的殘基位點323的位置。圖49提供了銀白楊I(lǐng)spS的鉸鏈殘基位點229的位置。圖50提供了銀白楊I(lǐng)spS的位點536的位置。圖51顯示了 SDS-PAGE凝膠，其顯示了不同純化階段的IspS_L494P。泳道I :分子量標(biāo)準(zhǔn)物；泳道2 :以TurboTEV處理之前的IspS_L494P ;泳道3 :以TurboTEV處理的IspS-L494P ;泳道4-6 :在不同的稀釋水平，在最后一次緩沖液交換之后的IspS_L494P。圖52顯示了在I-E成形的殘基494處的2F<r2Fc電子密度圖。圖板A顯示了494L,圖板B顯示了 494P。圖53圖示了含有殘基494的環(huán)的比對。野生型IspS為淺灰色，IspS_L494P為深灰色。L494P突變產(chǎn)生交替的環(huán)結(jié)構(gòu)。圖54圖示了 SDS-PAGE凝膠，其顯示了不同稀釋度的純化的IspS_T536F(泳道2-4)和分子量標(biāo)準(zhǔn)物(泳道I)。圖55圖示了 SDS-PAGE凝膠，其分別顯示了野生型IspS、IspS_L494P和IspS-T536F的總細(xì)胞裂解物(泳道2、5、8)、上清液(泳道3、6、9)、和純化的蛋白(泳道4、
7、10)。分子量標(biāo)準(zhǔn)物在泳道I。圖56圖示了僅以緩沖液溫育的野生型IspS、IspS-L494P、和IspS_T536F的熱解折疊曲線。標(biāo)示出了每個變體的Tm值。圖57圖示了以5mM焦磷酸鈉溫育的野生型IspS、IspS_L494P、和IspS_T536F的熱解折疊曲線。標(biāo)示出了每個變體的Tm值。圖58 圖示了野生型(WT)、IspS-L494P(LP)、和 IspS_T536F(TF)的溫度活性比率曲線。數(shù)據(jù)作圖為在給定溫度下蛋白的比活性(nmol/mg/分鐘)與35°C下比活性之比。圖59圖示了銀白楊異戊二烯合酶和相關(guān)的萜烯合酶的局部比對。圖60 圖示了具有 A453N、G491S、L494P、和 T536C/F 突變的質(zhì)粒 MD09-163 的圖譜。圖61圖示了凝膠，其顯示了就速率相對于[DMAPP]測定的連續(xù)稀釋的異戊二烯合酶。圖62的圖顯示了以4mM DMAPP在30°C下測定的每種變體的比活性。黑柱表示野生型異戊二烯合酶的比活性。圖63的圖顯示異戊二烯合酶的P、SP和SPC變體以及野生型異戊二烯合酶的速率相對于[DMAPP]。該圖上的每個數(shù)據(jù)點是三次獨立進(jìn)行的動力學(xué)測定的平均值。誤差條報告為數(shù)據(jù)點以上和以下的一個標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖64圖示了美洲山楊(黑色)和銀白楊(灰色)結(jié)構(gòu)的比對，顯示出高水平的結(jié)構(gòu)同源性
具體實施例方式本發(fā)明提供了方法和包含具有改進(jìn)的活性(例如催化活性)和/或溶解性的至少一種合酶的組合物，合酶的變體和試劑，所述合酶的變體和試劑的特征在于兩個柔性環(huán)和/或N-末端和/或它們的鄰近區(qū)域中的氨基酸殘基的修飾。特別地，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)中的這些區(qū)段的選擇性修飾。本發(fā)明涉及的異戊二烯合酶包括但不限于植物異戊二烯合酶，例如白楊異戊二烯合酶、野葛異戊二烯合酶、橡樹異戊二烯合酶等。白楊異戊二烯合酶包括但不限于來自美洲山楊、銀白楊、銀白楊X美洲山楊、毛果楊等的異戊二烯合酶?；谌S結(jié)構(gòu)衍生出了用于增加微生物宿主細(xì)胞中的異戊二烯合酶產(chǎn)量的異戊二烯合酶變體。也可以使用本文提供的異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)模擬能夠增加異戊二烯產(chǎn)量的試劑。本發(fā)明的通過生物合成方式產(chǎn)生的異戊二烯用于制備橡膠和彈性體。除非另有指明，否則本發(fā)明的實施包括本領(lǐng)域技能內(nèi)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、和重組DNA中通常使用的常規(guī)技術(shù)。此類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，描述于很多文章和參考文獻(xiàn)中(見，例如 Sambrook 等人，"Molecular Cloning A LaboratoryManual, " Third Edition, Cold Spring Harbor, 2001 ;和 Ausubel 等人，"CurrentProtocols in Molecular Biology, " 1987)。本文提及的，上文和下文中的所有專利、專利申請、文章和出版物在此明確通過引用方式并入本文。定義如本文使用的術(shù)語“異戍二烯”是指2_甲基-I, 3_ 丁二烯(CAS#78_79_5)。異戍二烯可作為從3，3_ 二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消除焦磷酸而產(chǎn)生的直接的和最終的揮發(fā)性C5烴產(chǎn)物而產(chǎn)生，并且不包括IPP分子與DMAPP分子的連接或聚合。如本文使用的術(shù)語“異戊二烯合酶”和“IspS”是指催化從二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消除焦磷酸以形成異戊二烯的酶。在一些優(yōu)選的實施方式中，IspS是獲自植物例如野葛、白楊或紅橡的酶。在一些實施方式中，術(shù)語“IspS”是指天然存在的成熟酶或其部分。如本文使用的術(shù)語“變體蛋白”是指與母體蛋白(例如SEQ ID N0:42所示的野葛IspS和SEQ ID NO 16或圖23所示的銀白楊I(lǐng)spS)彼此相差少數(shù)幾個氨基酸殘基的蛋白。差別氨基酸殘基的數(shù)目可以是一個或多個，優(yōu)選1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、20、30、40、50、或更多個氨基酸殘基。在一些優(yōu)選的實施方式中，變體之間不同的氨基酸的數(shù)目為I至10。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，相關(guān)的蛋白、特別是變體蛋白具有至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%的氨基酸同一性。相關(guān)(和衍生的)蛋白可以包括“變體蛋白”。另外，如本文使用的相關(guān)蛋白或變體蛋白是指與另一個相關(guān)蛋白或母體蛋白在主要區(qū)域的數(shù)目上存在差異的蛋白。例如，在一些實施方式中，變體蛋白具有1、2、3、4、5、或10個不同于母體蛋白的對應(yīng)的主要區(qū)域。
如本文更詳細(xì)地討論，本領(lǐng)域已知有數(shù)種方法適合于產(chǎn)生本發(fā)明的酶的變體，包括但不限于位點飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、隨機誘變、定點誘變、和定向進(jìn)化、以及多種其它重組方法。除非另有指明，否則如本文使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”、和“該”包括復(fù)數(shù)指稱。如本文使用的術(shù)語“試劑”可以指任何類型的物質(zhì)組成，包括但不限于，多肽、核苷酸、小分子、和合成的化合物。如本文使用的術(shù)語“基因”是指編碼多肽的多核苷酸(例如DNA區(qū)段)并包括編 碼區(qū)域之前和之后的區(qū)域以及各個編碼區(qū)段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。如本文使用的術(shù)語“起始基因”和“母體基因”是指，編碼待被改進(jìn)和/或改變(使用本發(fā)明)的目標(biāo)蛋白的目標(biāo)基因。類似地，術(shù)語“起始蛋白”和“母體蛋白”是指待被改進(jìn)和/或改變(使用本發(fā)明)的目標(biāo)蛋白。如本文使用的術(shù)語“同源基因”是指來自不同、但通常相關(guān)的物種的一對基因，它們彼此對應(yīng)并且彼此相同或十分相似。該術(shù)語包括通過物種形成(即新物種的產(chǎn)生)而被分離的基因(例如直系同源基因)，以及通過遺傳復(fù)制而被分離的基因(例如旁系同源基因)。如本文使用的“直系物”和“直系同源基因”是指，通過物種形成由共同的祖先基因(即同源基因)進(jìn)化而來的不同物種中的基因。通常而言，直系物在進(jìn)化過程中保留相同的功能。直系物的鑒定用于可靠地預(yù)測新測序的基因組中的基因的功能。如本文使用的“旁系物”和“旁系同源基因”是指由于基因組內(nèi)的復(fù)制而相關(guān)的基因。雖然直系物在進(jìn)化過程中保留相同的功能，但旁系物進(jìn)化出新的功能，雖然一些功能與最初的功能通常是相關(guān)的。如本文使用的“同源性”是指序列相似性或同一性，優(yōu)選同一性。這種同源性是使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定的(見例如Smith和Waterman, Adv Appl Math, 2 :482,1981 ;Needleman和Wunsch, J Mol Biol,48 :443,1970 ;Pearson和Lipman,Proc Natl AcadSci USA, 85 :2444,1988 ;程序，例如 Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA、和 TFASTA ;以及 Devereux 等人，Nucl Acid Res，12 :387-395,1984)。如本文使用的異戊二烯合酶上的“類似序列”是指基因的功能與基于野葛異戊二烯合酶的基因功能基本上是相同的。另外，類似基因包括與野葛異戊二烯合酶的序列的至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在另外的實施方式中，一種以上的上述性質(zhì)適用于序列。類似序列是通過序列比對的已知方法確定的。通常使用的比對方法是BLAST，雖然如上文和下文所述，還有其它方法可用于比對序列。就兩個氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(視情況)而言的“序列同一性百分比”、“氨基酸序列同一性百分比”、“基因序列同一性百分比”和/或“核酸/多核苷酸序列同一性百分比”是指當(dāng)序列進(jìn)行優(yōu)化比對時，在兩個序列中相同的殘基的百分比。因此，80%的氨基酸序列同一性意思是在兩個優(yōu)化比對的多肽序列中，80 %的氨基酸是相同的。因此，在兩個核酸或多肽的上下文中，詞語“基本上相同”是指使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，使用程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)，相對于參考序列包含至少70%序列同一性的多核苷酸或多肽，優(yōu)選至少75%，優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少90%，優(yōu)選至少95 %，優(yōu)選至少97 %，優(yōu)選至少98 %，和優(yōu)選至少99 %序列同一性的多核苷酸或多肽。當(dāng)表述“兩個多肽基本上相同”時，是指第一個多肽與第二個多肽有免疫學(xué)上的交叉反應(yīng)活性。通常而言，區(qū)別在于保守性氨基酸置換的多肽有免疫學(xué)上的交叉反應(yīng)活性。因此，例如，當(dāng)兩個多肽的差別僅在于保守性置換時，一個多肽與另一個多肽基本上相同。另一種表述“兩個核酸序列基本上相同”是指，兩個分子在嚴(yán)格條件下(例如，在中等至高度嚴(yán)格性范圍內(nèi))彼此雜交。如本文使用的術(shù)語“晶格”意思是由堆積的單胞的頂點確定的點的陣列。如本文使用的術(shù)語“單胞”意思是基本的平行六面體形狀的塊。晶體的整個體積可以由此類塊的規(guī)則排列構(gòu)建。每個單胞包含模式單元的完整代表，其重復(fù)構(gòu)成晶體。因此，術(shù)語“單胞”意思是晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)部分，其通過三維上的平移無限地重復(fù)。單胞通過不位于一個平面內(nèi)的3個矢量a、b、和c表征，它們構(gòu)成平行六面體的邊緣。角度a、P、和Y 定義了矢量之間的角度角度a是矢量b和c之間的角度；角度P是矢量a和c之間的角度；角度Y是矢量a和b之間的角度。晶體的整個體積可以通過單胞的規(guī)則排列構(gòu)建；每個單胞包含模式單元的完整代表，其重復(fù)構(gòu)成晶體。術(shù)語“結(jié)構(gòu)坐標(biāo)”是指源自數(shù)學(xué)等式的笛卡爾坐標(biāo)，所述數(shù)學(xué)等式與通過晶體形式的異戊二烯合酶復(fù)合體的原子(散射中心)的單色X-射線束的衍射獲得的模式相關(guān)。衍射數(shù)據(jù)用于計算晶體的重復(fù)單元的電子密度圖。然后，電子密度圖用于建立異戊二烯合酶蛋白或蛋白/配體復(fù)合體的單獨原子的位置。如本文使用的術(shù)語“活性位點”、“結(jié)合位點”或“結(jié)合袋”是指這樣的多肽區(qū)域或包含多肽的分子復(fù)合體由于多肽的初級氨基酸序列和/或其三維形狀的緣故，促進(jìn)與另一化學(xué)實體或化合物包括配體或抑制劑的結(jié)合。因此，活性位點可以包括這樣的特征或由其組成例如，結(jié)構(gòu)域之間的界面。可以與活性位點結(jié)合的化學(xué)實體或化合物包括但不限于，化合物、配體、輔因子、底物、抑制劑、激動劑、拮抗劑等。“結(jié)構(gòu)反應(yīng)殘基”是指參與酶反應(yīng)的原子的三維集合。例如，這些將包括形成活性位點的那些，絡(luò)合金屬離子的那些，以及形成底物結(jié)合區(qū)的那些。尤其是，當(dāng)結(jié)合底物時，形成柔性環(huán)和N-末端的那些以及穩(wěn)定化柔性區(qū)段的鄰近殘基。結(jié)構(gòu)上等同的合酶是指這樣的合酶它們的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，其原子坐標(biāo)可以通過公眾可獲得的軟件包例如PYMOL(DeLano Scientific LLC)比對，從而可以在0. 2nm的rms偏差內(nèi)比對主鏈a碳原子的優(yōu)勢。為此目的，優(yōu)勢將定義為異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)的總a 碳的 50%、60%或 70%。術(shù)語“均方根偏差”意思是偏差的平方的算術(shù)平均數(shù)的平方根。其是表述距離某趨勢或目標(biāo)的偏差或差異的方式。為了本發(fā)明的目的，“均方根偏差”定義某蛋白的骨架與美洲山楊異戊二烯合酶、銀白楊異戊二烯合酶的骨架或其活性位點部分的差異，如本文描述的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所定義?！熬哂谢旧舷嗤娜S結(jié)構(gòu)”是指當(dāng)重疊于異戊二烯合酶的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)、例如表3-7或表4-2的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)時，當(dāng)重疊中包括坐標(biāo)的至少大約50%至100%的Ca原子時，由具有小于或等于大約1.5人的均方根偏差(r.m. s. d.)的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的組表征的多肽。如本文使用的“同源區(qū)段”是指相關(guān)酶模型中的具有小于大約1.5人的均方根偏差的酶的區(qū)段。例如，表3-7中所列的美洲山楊異戊二烯合酶分子或分子復(fù)合體的模型可用于鑒定相關(guān)的異戊二烯合酶模型中的具有小于大約1.5人的均方根偏差的同源區(qū)段?？梢酝ㄟ^以數(shù)學(xué)方式操作本文提供的異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)坐標(biāo)中的微小差異。例如，可以通過下列方式操作表3-7或表4-2中所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的晶體學(xué)變換、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的細(xì)分、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的組的整數(shù)加入或減除、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的倒置或上述的任意組合。備選地，由于氨基酸的突變、添加、置換、和/或缺失、或構(gòu)成晶體的任意成分的其它變化所引起的晶體結(jié)構(gòu)的改變也可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的差異。單獨坐標(biāo)中的此類微小差異對總體形狀具有的影響極小。如果相對于原始坐標(biāo)，此類差異在可接受的標(biāo)準(zhǔn)誤差內(nèi)，則得到的三維形狀被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)上等同的。因此，為了本文提供的結(jié)構(gòu)的目的，當(dāng)重疊于表3-7或表4-2的相應(yīng)的原子坐標(biāo)的非氫原子位置上時，來自具有小于大約1.5人的非氫原子的 均方根偏差的任意來源的多肽或多肽同源物的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的組定義的任何活性位點、結(jié)合位點或結(jié)合袋被認(rèn)為是基本上相同或同源的。如本文使用的“等同或同源的殘基”是指共有特定氨基酸殘基的蛋白?？梢酝ㄟ^確定萜烯合酶(例如異戊二烯合酶，其三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過X-射線晶體學(xué)確定)的三級結(jié)構(gòu)水平上的同源性來鑒定等同殘基。等同殘基定義為這樣的殘基具有推定的等同殘基的萜烯合酶及目標(biāo)底物的特定氨基酸殘基的兩個⑵或更多個主鏈原子(例如，N上的N，CA上的CA，C上的C，和0上的0)的原子坐標(biāo)比對后在0. 2nm之內(nèi)，優(yōu)選0. 15nm之內(nèi)。在定向并定位最佳模型以產(chǎn)生所分析的萜烯合酶和底物的非氫蛋白原子的原子坐標(biāo)的最大重疊時，實現(xiàn)比對。優(yōu)選的模型是在最高的可獲得的分辨率時產(chǎn)生實驗衍射數(shù)據(jù)的最低R因子的晶體學(xué)模型，其使用晶體學(xué)和蛋白質(zhì)表征/分析領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來確定。例如，與異戊二烯合酶的特定殘基在功能上類似的等同殘基定義為結(jié)構(gòu)上同源的合酶中的這樣的氨基酸其可以采納如此的構(gòu)型以致于它們以確定或歸因于異戊二烯合酶的特定殘基的方式改變、修飾、或促成蛋白結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或催化。異戊二烯合酶異戊二烯單體用于生產(chǎn)聚異戊二烯和多種共聚物(與異丁烯、丁二烯、苯乙烯、或其它單體的共聚物)。為了建立能夠產(chǎn)生商業(yè)上可行的水平的異戊二烯的菌株(原核或真核)，需要整個途徑即MVA至異戊二烯或DXP至異戊二烯的優(yōu)化。途徑中的關(guān)鍵酶是異戊二烯合酶(IspS)，其將前體DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯。目前鑒定的唯一的異戊二烯合酶(IspS)是來自植物例如白楊、英國櫟和葛藤的那些。雖然一些細(xì)菌例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)也產(chǎn)生異戊二烯，但是原核的IspS仍待鑒定，并且芽孢桿菌屬中的天然IspS活性不足以用于商業(yè)過程。目前鑒定的植物IspS酶已經(jīng)進(jìn)行了部分表征，部分是通過在大腸桿菌中的表達(dá)，并且已經(jīng)在體外使用純化的蛋白測定了這些酶的一些動力學(xué)參數(shù)。然而，天然IspS酶的動力學(xué)參數(shù)(Km、速率等)不足以用于在生物宿主中商業(yè)地生產(chǎn)異戊二烯。為了解決本文描述的這個問題，在細(xì)菌宿主中表達(dá)了異戊二烯合酶。此外，就目標(biāo)性質(zhì)的變化對異戊二烯合酶進(jìn)行了工程化。本發(fā)明提供了三維結(jié)構(gòu)，其可輔助設(shè)計具有類似于本文提供的三維結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)和/或反應(yīng)坐標(biāo)的異戊二烯合酶變體和試劑。這些變體和試劑對于在生物宿主中商業(yè)地生產(chǎn)異戊二烯是有用的。
通過任何合適的方式或“測試”完成野生型和突變體異戊二烯合酶的表征，優(yōu)選基于目標(biāo)性質(zhì)的測定。目標(biāo)性質(zhì)包括但不限于最適pH、溫度穩(wěn)定性(例如Tm值)、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外溶解性、Km值、kMt值、或比活性，以及對于潛在的抑制劑包括底物或產(chǎn)物抑制的敏感性。氧化和蛋白水解穩(wěn)定性也是受關(guān)注的。此外，由于金屬離子的效應(yīng)和離子強度而造成的激活或抑制也是受關(guān)注的?？梢酝ㄟ^使用純化的或部分純化的異戊二烯合酶在體外將DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯來測定這些性質(zhì)和參數(shù)，或者，在表達(dá)DXP途徑、MVA途徑、或二者的宿主生物例如大腸桿菌的情況下，在體內(nèi)測定。預(yù)期在一個或多個測試條件下具有多種程度的穩(wěn)定性、溶解性、活性、和/或表達(dá)水平的酶將可用于本發(fā)明中以在多種宿主中生產(chǎn)異戊二烯。本發(fā)明的特征在于用于生產(chǎn)增加的量的異戊二烯的組合物和方法。特別地，這些組合物和方法增大異戊二烯的生產(chǎn)速率并增大所產(chǎn)生的異戊二烯的總量。本文描述的異戊二烯生產(chǎn)的生物合成過程是使用天然橡膠的理想備選。如下文進(jìn)一步討論，可以通過向細(xì)胞中導(dǎo)入編碼異戊二烯合酶(IspS)多肽的異源核酸而極大地增加由細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯 的量。異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化為異戊二烯。另外，可以通過增加細(xì)胞表達(dá)的I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽和/或異戊二烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)多肽的量來增強包含異源異戊二烯合酶核酸的細(xì)胞所額外產(chǎn)生的異戊二烯。例如，可以將DXS核酸和/或IDI核酸導(dǎo)入細(xì)胞。DXS核酸可以是異源核酸或內(nèi)源核酸的重復(fù)拷貝。類似地，IDI核酸可以是異源核酸或內(nèi)源核酸的重復(fù)拷貝。在一些實施方式中，通過將內(nèi)源DXS和/或IDI啟動子或調(diào)節(jié)區(qū)替換為引起更大的DXS和/或IDI核酸的轉(zhuǎn)錄的其它啟動子和/或調(diào)節(jié)區(qū)來增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些實施方式中，細(xì)胞含有編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸(例如植物異戊二烯合酶核酸)和編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸的重復(fù)拷貝。所編碼的DXS和IDI多肽是用于生物合成異戊二烯的DXP途徑的一部分(圖I)。DXS多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。不被任何特定理論所限，相信增加DXS多肽的量會增大通過DXP途徑的碳流，從而引起更大的異戊二烯產(chǎn)量。IDI多肽催化異戊二烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互轉(zhuǎn)化。不被任何特定理論所限，相信增加細(xì)胞中IDI多肽的量會增加被轉(zhuǎn)化為DMAPP的IPP的量，DMAPP繼而被轉(zhuǎn)化為異戊二烯。在一些實施方式中，通過增加細(xì)胞中一個或多個MVA多肽的表達(dá)而提高包含異源異戊二烯合酶核酸的細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯(圖I)。示例性的MVA途徑多肽包括任意下列多肽乙?；?輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(AA-輔酶A硫解酶)多肽，3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽，3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)多肽，甲羥戊酸激酶(MVK)多肽，磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽，IDI多肽，和具有兩個或更多個MVA途徑多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。例如，可以將一個或多個MVA途徑核酸導(dǎo)入細(xì)胞中。在一些實施方式中，細(xì)胞包含上部MVA途徑，其包括AA-輔酶A硫解酶、HMG-輔酶A合酶、和HMG-輔酶A還原酶核酸。在一些實施方式中，細(xì)胞包含下部MVA途徑，其包括MVK、PMK、MVDjP IDI核酸。在一些實施方式中，細(xì)胞包含整個MVA途徑，其包括AA-輔酶A硫解酶、HMG-輔酶A合酶、HMG-輔酶A還原酶、MVK、PMK、MVD、和IDI核酸。MVA途徑核酸可以是異源核酸或內(nèi)源核酸的重復(fù)拷貝。在一些實施方式中，通過將MVA途徑核酸的內(nèi)源啟動子或調(diào)節(jié)區(qū)替換為引起MVA途徑核酸的更大的轉(zhuǎn)錄的其它啟動子和/或調(diào)節(jié)區(qū)來增加一種或多種MVA途徑多肽的量。在一些實施方式中，細(xì)胞包含編碼異戊二烯合酶多肽(例如植物異戊二烯合酶多肽)的異源核酸和編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸的重復(fù)拷貝。在一些實施方式中，細(xì)胞的至少一部分在持續(xù)培養(yǎng)(例如不稀釋的持續(xù)培養(yǎng))中保持異源異戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途徑核酸至少大約5、10、20、50、75、100、200、300、或更多次細(xì)胞分裂。在本發(fā)明的任意方面的一些實施方式中，包含異源或內(nèi)源異戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途徑核酸的重復(fù)拷貝的核酸還包含選擇性標(biāo)志物，例如卡那霉素、氨比西林、羧芐西林、慶大霉素、潮霉素、腐草霉素、博來霉素、新霉素、或氯霉素抗生素抗性核酸。異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化為異戊二烯。示例性的異戊二烯合酶多肽包括具有異戊二烯合酶多肽的至少一項活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽?？梢酝ㄟ^在體外、在細(xì)胞提取物中、或在體內(nèi)測定多肽將DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯的能力，使用標(biāo)準(zhǔn)方法來測定該多肽是否具有異戊二烯合酶多肽活性?？梢园凑绽鏢ilver等 人，J. Biol. Chem. 270 :13010-13016，1995及其中的參考文獻(xiàn)(其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于異戊二烯合酶多肽活性的測定法的部分)的描述來測定細(xì)胞提取物中異戊二烯合酶多肽的活性。在一個實施方式中，在氮氣流下，使DMAPP(Sigma)蒸發(fā)至干燥，并在pH8. 2的IOOmM磷酸鉀緩沖液中重新水化至IOOmM的濃度，并儲存于_20°C。為了進(jìn)行測定，將5 y LIM MgCl2，lmM(250iig/ml)DMAPP，65iiL 植物提取物緩沖液(PEB) (50mM Tris-HCl, pH8. 0，20mM MgCl2, 5%甘油，和2mM DTT)的溶液加入到20ml的具有金屬螺絲蓋和特氟隆包被的硅隔膜的頂空瓶(Agilent Technologies)中的25 y L細(xì)胞提取物中，并在37°C下?lián)u動培養(yǎng)15分鐘。通過加入200 u L 250mM EDTA或通過熱滅活使反應(yīng)猝滅，通過GC/MS進(jìn)行異戊二烯的定量。示例性的異戊二烯合酶核酸包括編碼具有異戊二烯合酶多肽的至少一項活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自本文描述的任意生物體來源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物體來源的突變體多肽和核酸。在一些實施方式中，異戊二烯合酶多肽或核酸來自豆科(Fabaceae)，楊柳科(Salicaceae)、或殼斗科(Fagaceae)。在一些實施方式中，異戍二烯合酶多肽或核酸是來自下列的天然存在的多肽或核酸越南葛藤(Pueraria montana)(野葛)(Sharkey等人，Plant Physiologyl37 :700-712, 2005)，白楊(例如銀白楊 x 歐洲山楊(CAC35696)Miller 等人，Planta 213 :483-487, 2001)，或銀白楊 aspen (例如美洲山楊)Silver 等人，JBC 270(22) : 13010-1316,1995),或英國櫟(夏櫟(Quercus robur)) (Zimmer 等人,WO 98/02550)，其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于異戊二烯合酶核酸和異戊二烯合酶多肽的表達(dá)的內(nèi)容。適宜的異戊二烯合酶包括但不限于Genbank登記號AY341431、AY316691、AB198180、AJ294819. I、EU693027. I、EF638224. I、AM410988. I、EF147555. I、AY279379、AJ457070、和AY182241 (其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于異戊二烯合酶核酸和多肽的序列的內(nèi)容)中記載的那些。在一些實施方式中，異戊二烯合酶多肽或核酸不是來自夏櫟的天然存在的多肽或核酸(即，異戊二烯合酶多肽或核酸是除了來自夏櫟的天然存在的多肽或核酸以外的異戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些實施方式中，異戊二烯合酶核酸或多肽不是來自白楊(例如銀白楊X歐洲山楊CAC35696)的天然存在的多肽或核酸。三維結(jié)構(gòu)和/或結(jié)晶多肽，例如異戊二烯合酶，具有由初級氨基酸序列和該多肽周圍的環(huán)境確定的三維結(jié)構(gòu)。該三維結(jié)構(gòu)實現(xiàn)該多肽的活性、穩(wěn)定性、結(jié)合親和性、結(jié)合特異性、和其它生化特性。因此，知曉多肽的三維結(jié)構(gòu)能夠在設(shè)計其生物學(xué)活性例如更大的催化活性和/或溶解性的改進(jìn)上提供更多指導(dǎo)。多肽的三維結(jié)構(gòu)可以通過多種方式來確定。很多最精確的方法使用X-射線晶
體學(xué)(見例如 Van Holde, (1971)Physical Biochemistry, Prentice-HalI, New Jersey,pp. 221-39)。該技術(shù)依賴于晶格衍射X-射線或其它形式的放射的能力。適合于測定大分子的三維結(jié)構(gòu)的衍射實驗通常需要高質(zhì)量的晶體。多肽的結(jié)晶性質(zhì)差異巨大(Dale等人，J. Struct. Biol. 142 :88-97,2003 ；MacPherson, A.，Methods 34 :254-265,2004 ；和Slabinski，L等人，Protein Science 16 :2472-2482, 2007)。在一些情況下，多肽容易結(jié)晶，而在其它情況下，多肽晶體被證明是非常難以獲得的。沒有詳細(xì)理論來指導(dǎo)使大分子結(jié)晶的嘗試，因此，多數(shù)關(guān)于大分子晶體生長的嘗試在本質(zhì)上是經(jīng)驗性的(MacPherson，2004)。能夠影響晶體的產(chǎn)生的因素包括物理的、化學(xué)的和生化的因素。這些因素包括多肽的純度、pH、鹽、和其它沉淀物的濃度。產(chǎn)生多肽的晶體中的另一個關(guān)鍵變量是多肽本身。一些多肽非常容易結(jié)晶，而同源蛋白被證明是非常難以結(jié)晶的(Dale等人2003)。一般認(rèn)識到相對于內(nèi)部柔性或具有動態(tài)表面的蛋白，剛性的、穩(wěn)定的蛋白更容易結(jié)晶。溶解性是影響大分子結(jié)晶的另一個因素。不可溶的多肽不容易形成晶體，因為它們傾向于聚集。另一方面，高度可溶的多肽不容易形成晶體，因為難以獲得超飽和態(tài)。糖基化的多肽也不容易形成晶體，因為它們傾向于高度可溶的。因此，翻譯后修飾可能對多肽的結(jié)晶具有大的影響。開發(fā)多肽的三維結(jié)構(gòu)中的另一個阻礙是“相問題”。晶體的行為類似于三維衍射柵欄，其對于衍射模式產(chǎn)生構(gòu)建性和破壞性干擾效應(yīng)，從而其在檢測器上顯示為一系列不連續(xù)的斑點，這些斑點被稱作反射。每個反射含有關(guān)于結(jié)構(gòu)中的所有原子的信息，反過來，每個原子促成每個反射的強度。如同所有形式的電磁輻射一樣，X-射線具有波特征，換言之，其具有幅度和相。為了重組衍射模式，對于每個反射，這些參數(shù)都是需要的。不幸的是，僅有幅度可以通過實驗記錄，因此，所有的相信息被丟失。解決“相問題”的一個方法通過被稱作分子替換(Molecular Replacement)的方法是將分子坐標(biāo)與相似蛋白的坐標(biāo)進(jìn)行比較。"分子替換"是指通過將結(jié)構(gòu)坐標(biāo)已知的多肽取向并定位于新晶體的單胞內(nèi)來計算結(jié)構(gòu)坐標(biāo)未知的多肽的新晶體的最初相，從而最好地解釋所觀察到的新晶體的衍射模式的方法。然后從取向和定位的多肽計算相并與觀察到的幅度組合，以提供包含新晶體的多肽的結(jié)構(gòu)的大概的 Fourier 合成(Jones 等人，1991, Acta Crystallogr. 47 :753-70 ；Brunger 等人，1998, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 54 :905-21)。預(yù)期植物的異戊二烯合酶與萜烯合酶是同源的。之前的應(yīng)用異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)以改進(jìn)異戊二烯產(chǎn)量的嘗試依賴于其它萜烯合酶的結(jié)構(gòu)，其中三維結(jié)構(gòu)是可獲得的，包括冰片基二磷酸合酶和5-表-倍半萜植保素合酶(見例如美國臨時專利申請序列號12/429，143 和 W02008/137092)。通過X-射線晶體學(xué)測定的坐標(biāo)組不是沒有標(biāo)準(zhǔn)誤差的。一般地，坐標(biāo)中的誤差傾向于隨著分辨率的增大而降低，因為可以獲得更多的實驗衍射數(shù)據(jù)以用于模型擬合和精制。因此，例如，相對于衍射至較低的分辨率例如3. 5埃的晶體而言，可以從衍射至3. 0埃的分辨率的晶體收集更多的衍射數(shù)據(jù)。因此，當(dāng)使用來自衍射至更高分辨率的晶體的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和精制時，精制的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)通常將更精確。如果坐標(biāo)不夠精確，則設(shè)計過程將是無效的。在多數(shù)情況下，當(dāng)晶體衍射至僅3. 5?；蚋畹姆直媛蕰r，極難以或不可能收集足以精確定義原子坐標(biāo)的衍射數(shù)據(jù)。因此，在多數(shù)情況下，當(dāng)X-射線結(jié)構(gòu)是基于衍射至僅3. 5?；蚋畹姆直媛实木w時，難以在基于結(jié)構(gòu)的配體設(shè)計中使用X-射線結(jié)構(gòu)。然而，通常的經(jīng)驗已經(jīng)證明，衍射至3. 0?；蚋叩木w能夠產(chǎn)生具有足以大大促進(jìn)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的精確性的X-射線結(jié)構(gòu)。分辨率的進(jìn)一步改善能夠進(jìn)一步促進(jìn)基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計，但是在3. 0埃的分辨率獲得的坐標(biāo)一般足以應(yīng)對多數(shù)目的。本發(fā)明提供的異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)乃是分辨至3. 05埃(見實施例3)。IspS的三維結(jié)構(gòu)和/或結(jié)晶產(chǎn)生了多種不同的表達(dá)不同異戊二烯合酶的構(gòu)建體以獲得該酶的三維結(jié)構(gòu)。一個構(gòu)建體含有連接于麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的片段的野葛異戊二烯，以促進(jìn)純化。純化的MBD-野葛異戍二烯合酶經(jīng)歷商業(yè)上可獲得的結(jié)晶篩選,包括Crystal Screen (HamptonResearch)和JCSG+Suite (Qiagen)。檢查了不少于1536種不同的條件,包括pH的范圍、蛋白濃度和結(jié)晶試劑。在多數(shù)情況下，MBP-野葛異戊二烯合酶融合蛋白從溶液中沉淀出來，未獲得晶體。使異戊二烯合酶結(jié)晶的第二種嘗試著眼于來自銀白楊的異戊二烯合酶。將蛋白連接于組氨酸標(biāo)簽以易于純化。篩選了超過288種條件，制備了 9種最佳的晶體以進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，但是晶體要么不發(fā)生衍射，要么是鹽晶體。同樣地，源自全長未標(biāo)記的銀白楊異戊二烯合酶和N-末端截短的美洲山楊異戊二烯合酶的晶體也不發(fā)生衍射。從含有銀白楊異戊二烯合酶的19個殘基的N-末端截短并連接于組氨酸標(biāo)簽的構(gòu)建體獲得了晶體。晶體結(jié)構(gòu)的分辨率從16人改善為5人。如上文所討論，優(yōu)選的是，在晶體分辨率為3.5人或更精細(xì)的情況下測定三維結(jié)構(gòu)。在篩選了 pH、沉淀劑、濃度和抑制劑的528種變化之后，從第二種N-末端截短的銀白楊異戊二烯合酶獲得了晶體。為了改善衍射，測試了多種晶體冷凍條件，但是衍射限值僅從10人改善為6.5人。進(jìn)一步優(yōu)化了結(jié)晶條件，并獲得了 2.7人的晶體分辨率。從美洲山楊產(chǎn)生了異戊二烯合酶，其具有N-末端截短和組氨酸標(biāo)簽，并用于商業(yè)上可獲得的篩選。觀察到桿狀和板狀晶體，通過改變pH、濃度和結(jié)晶試劑進(jìn)行了另外120個實驗。此處，最佳晶體具有5人的分辨率。冷凍條件的修改產(chǎn)生了在3.3人衍射的晶體，最終達(dá)到了3.05 人，其中使用了 Stanford Synchroton Radiation Laboratory 的光束線 11-1。使用檸檬烯合酶的單體作為起始模型，通過分子替換解決了相問題。類似于異戊二烯合酶，檸檬烯合酶是萜烯合酶，其與美洲山楊異戊二烯合酶具有41. 4%的序列同一性。
本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的晶體形式。在一些方面，本發(fā)明提供了美洲山楊異戊二烯合酶的晶體形式。所述晶體屬于四邊形空間群P432:2，并具有下列單胞尺寸a是大約154.2人，b是大約154.2人，C是大約142.7A，其中a = p = Y = 90°。單胞尺寸可以變化，例如，變化5%。在一些方面，本發(fā)明提供了銀白楊異戊二烯合酶的晶體形式。該晶體屬于四邊形空間群P4&2，并具有下列單胞尺寸a是大約156.8人,b是大約156.8人，c是大約142.5人，其中a = P = Y = 90。。發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)與其它已知的合酶結(jié)構(gòu)尤其是冰片基二磷酸合酶、5-表-倍半萜植保素合酶和4S-檸檬烯合酶在結(jié)構(gòu)上是同源的。全部都具有共同的總體三級折疊，如通過比對后主鏈a碳原子的優(yōu)勢的小于2. 0埃(0. 2nm)標(biāo)準(zhǔn)偏差所測。異戊二烯合酶具有541個氨基酸殘基，每個具有I個a碳原子這些中的433個能夠以0. 12nm的均方根偏差(rms)與朽1檬烯合酶比對；這些中的418個能夠以0. 12nm的rms與冰片基二磷酸合酶比對；這些中的395個能夠以0. 14nm的rms與5-表-倍半職植保素合酶比對。本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的活性位點的三維結(jié)構(gòu)。金屬離子和磷酸識別區(qū)包 含美洲山楊異戊二烯合酶的氨基酸殘基Arg 255、Asp 292、Asp 296、Glu 370、Arg 433和Asn436。因此，本發(fā)明提供了這樣的位點其中二甲基烯丙基焦磷酸可以結(jié)合異戊二烯合酶并與之反應(yīng)以產(chǎn)生異戊二烯。發(fā)現(xiàn)與金屬和二磷酸結(jié)合位點鏈鄰近的美洲山楊I(lǐng)spS中的側(cè)鏈氨基酸殘基包括Asp 293、Tyr 385、Ser 392、和Asp 437。本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的底物接近環(huán)。美洲山楊I(lǐng)spS的底物接近環(huán)在偏離冰片基二磷酸合酶(BdpS)結(jié)構(gòu)的區(qū)域內(nèi)。在BdpS結(jié)構(gòu)中，殘基在活性位點上產(chǎn)生覆蓋。在底物結(jié)合之后，美洲山楊I(lǐng)spS的結(jié)構(gòu)可以形成類似的結(jié)構(gòu)。在美洲山楊I(lǐng)spS酶中，具有序列 SASAEIARGETANS (SEQ ID NO :40)的殘基 440-453，以及具有序列 YHNGDAHTSPDEL (SEQ IDNO :41)的殘基512-526形成底物接近環(huán)。本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的異戊二烯基結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)。這些是美洲山楊I(lǐng)spS結(jié)構(gòu)中的可以與產(chǎn)物異戊二烯結(jié)合的殘基。這些殘基包括Ser 261、Trp 264、Phe285、Thr 289、Ser 393、Ser 394、Phe432、和 Tyr 512。在一些方面，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包含配體的異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)；所述配體例如二甲基烯丙基焦磷酸。在一些情況下，將不含配體的異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)與具有結(jié)合的配體的異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。含有或不含配體的異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的這種比較可以揭示底物結(jié)合之后該酶的結(jié)構(gòu)變化。分子模擬可以為設(shè)計具有改進(jìn)活性的異戊二烯合酶變體提供線索。本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)上等同的試劑，其模擬異戊二烯合酶或其一部分的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)上等同的試劑就其三維結(jié)構(gòu)而言是相關(guān)的。在一些情況下，結(jié)構(gòu)上等同的試劑模擬異戊二烯合酶或異戊二烯合酶的結(jié)構(gòu)上等同的部分的活性(例如催化活性)。例如，結(jié)構(gòu)上等同的試劑可以在結(jié)構(gòu)上同源于異戊二烯合酶的活性位點。異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的用途結(jié)構(gòu)信息，通常是原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的形式，可用于多種計算機或基于計算機的方法，以便，例如，就改進(jìn)的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性來設(shè)計、篩選和/或鑒定異戊二烯合酶變體。可以使用通過實驗確定的源自X-射線衍射模式的坐標(biāo)，例如表3-7和表4-2中所示的那些，來進(jìn)行三維模擬，例如，其中此類模擬包括但不限于使用所述坐標(biāo)，繪制實際結(jié)構(gòu)圖，建立實際結(jié)構(gòu)的物理模型，和確定相關(guān)亞基和/或配體以及亞基/配體復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。此類分子模擬可以使用已知的X-射線衍射分子模擬算法或分子模擬軟件以產(chǎn)生對應(yīng)于異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)。表3-7所示的為美洲山楊異戊二烯合酶或其活性位點之一產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，表4-2所示的為銀白楊異戍二烯合酶或其活性位點之一產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)坐標(biāo),或由美洲山楊或銀白楊異戊二烯合酶/配體復(fù)合體產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，定義了空間中點的獨特構(gòu)型。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，蛋白或蛋白/配體復(fù)合體或其一部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的組定義了點的相對組，點的相對組繼而又定義了三維上的構(gòu)型?？梢酝ㄟ^坐標(biāo)的完全不同的組來定義相似或相同的構(gòu)型，條件是坐標(biāo)之間的距離和角度保持基本上相同。此外，可以通過將坐標(biāo)之間的距離增大或縮小某個標(biāo)量因子但保持角度基本上相同來定義點的可放縮的構(gòu)型。本發(fā)明提供了通過增加宿主細(xì)胞中的異戊二烯合酶的活性、表達(dá)或穩(wěn)定性來增大宿主細(xì)胞中的異戊二烯產(chǎn)量的方法?；诋愇於┖厦傅娜S結(jié)構(gòu)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用計算機的方法來修改異戊二烯合酶的性質(zhì)，包括但不限于該酶的最適ρΗ、κΜ值、kMt值、 和比活性。在本發(fā)明的其它方面，異戊二烯合酶或具有類似的三維結(jié)構(gòu)的試劑的三維結(jié)構(gòu)可用作改善異戊二烯合酶的氧化和/或蛋白水解穩(wěn)定性的指導(dǎo)。異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)可用于評價其酶促活性的抑制劑，包括但不限于，底物和產(chǎn)物抑制。在本發(fā)明的其它方面，三維結(jié)構(gòu)可用于就改善的表達(dá)設(shè)計具有相似的三維結(jié)構(gòu)的異戊二烯合酶變體試劑；例如，通過在異戊二烯合酶蛋白中進(jìn)行氨基酸置換來進(jìn)行，所述氨基酸置換不改變該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，但是允許給定宿主細(xì)胞更好地表達(dá)。在本發(fā)明的一些方面，異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的一部分可用作設(shè)計異戊二烯合酶變體或設(shè)計模擬異戊二烯合酶的至少一部分的試劑的指導(dǎo)。因此，本發(fā)明提供了表3-7或表4-2或表8-2所示的點的一部分的點的三維構(gòu)型。異戍二烯合酶的一部分的實例包括但不限于活性位點、二磷酸/金屬結(jié)合位點、異戊二烯基結(jié)合位點、柔性環(huán)、鉸鏈區(qū)、和靜電補綴區(qū)。在一些方面，本發(fā)明提供了類似于表3-7或表4-2或表8_2所示的點的三維構(gòu)型或其一部分的點的三維構(gòu)型。類似的點的三維構(gòu)型與表3-7或表4-2所示的點的三維構(gòu)型或其一部分、例如活性位點、二磷酸/金屬結(jié)合位點、異戊二烯基結(jié)合位點、柔性環(huán)、鉸鏈區(qū)或靜電補綴區(qū)至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或 100%相同。美洲山楊I(lǐng)spS的三維結(jié)構(gòu)提供了美洲山楊I(lǐng)spS和其它白楊異戍二烯合酶(例如銀白楊I(lǐng)spS)中的用于誘變以產(chǎn)生具有改進(jìn)的性能的異戊二烯合酶變體的位點的鑒定。本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的下列位點，其可能改變金屬結(jié)合的相互作用、二磷酸識別、DMAPP鏈結(jié)合、異戊二烯基結(jié)合和/或接近活性位點。設(shè)計了異戊二烯合酶變體以在宿主細(xì)胞中更多地產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改進(jìn)的酶動力學(xué)的異戊二烯合酶變體的方法。改進(jìn)的酶動力學(xué)可以通過酶促檢驗法來測定。kMt相對于野生型異戊二烯合酶的升高和/或Ki或Km相對于野生型異戊二烯合酶的降低指示變體的比活性的增大。
要理解的是，本文的用于使用異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生變體的公開內(nèi)容同樣適用于具有基本上相同的三維結(jié)構(gòu)的其它酶類。這可以意指這樣的多肽當(dāng)重疊于異戊二烯合酶的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)例如表3-7或表4-2或表8-2的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)時，當(dāng)重疊中包括坐標(biāo)的至少大約50%至100%的Ca原子時，由具有小于或等于大約1.5 Λ的均方根偏差(r. m. s. d.)的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的組表征的多肽。本發(fā)明還涉及使用如本文公開的異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的同源區(qū)段產(chǎn)生變體。這是指相關(guān)酶模型中的具有小于大約1.5 Λ的均方根偏差的酶的區(qū)段。例如，表3-7、表4-2或表8-2中所列的美洲山楊異戊二烯合酶分子或分子復(fù)合體的模型可用于鑒定相關(guān)的異戊二烯合酶模型中的具有小于大約1.5 Λ的均方根偏差的同源區(qū)段。
可以通過數(shù)學(xué)方式操作本文提供的異戊二烯合酶結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)坐標(biāo)中的微小差異。例如，可以通過下列方式操作表3-7或表4-2或表8-2中所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的晶體學(xué)變換、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的細(xì)分、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的組的整數(shù)加入或減除，結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的倒置、或上述的任意組合。備選地，由于氨基酸的突變、添加、置換、和/或缺失、或構(gòu)成晶體的任意成分的其它變化所引起的晶體結(jié)構(gòu)的改變也可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的差異。單獨坐標(biāo)中的此類微小差異對總體形狀具有的影響極小。如果相對于原始坐標(biāo)，此類差異在可接受的標(biāo)準(zhǔn)誤差內(nèi)，則得到的三維形狀被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)上等同的。因此，為了本文提供的結(jié)構(gòu)的目的，當(dāng)重疊于表3-7或表4-2或表8-2的相應(yīng)的原子坐標(biāo)的非氫原子位置上時，來自具有小于大約1.5 Λ的非氫原子的均方根偏差的任意來源的多肽或多肽同源物的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的組定義的任何活性位點、結(jié)合位點或結(jié)合袋被認(rèn)為是基本上相同或同源的。因此，具有等同或同源殘基的所有變體在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不管其是否具有相同的氨基酸或不同的氨基酸。如上文所述，本發(fā)明提供了異戊二烯合酶的活性位點(二磷酸/金屬結(jié)合位點)的三維結(jié)構(gòu)?；钚晕稽c包括美洲山楊異戊二烯合酶的氨基酸殘基Arg 255、Asp 292、Asp296,Glu 370、Arg 433和Asn436。此外，基于美洲山楊異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)，鑒定了接近于二磷酸/金屬結(jié)合位點的側(cè)鏈氨基酸殘基。這些殘基包括但不限于美洲山楊異戊二烯合酶的Asp 293、Tyr 385、Ser 392、和Asp 437。這些位點的工程化可以產(chǎn)生增大的酶活性。在一些情況下，活性位點殘基中的突變可以降低或完全消除異戊二烯合酶的活性。異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)也可用于鑒定結(jié)合異戊二烯合酶的底物例如DMAPP的殘基。所述殘基可用作產(chǎn)生異戊二烯合酶變體的基礎(chǔ)，所述變體可用于調(diào)節(jié)底物特異性和/或反應(yīng)速率(改變底物和產(chǎn)物的on和off速率)。這些殘基包括但不限于美洲山楊異戊二烯合酶的 Ser261、Trp 264、Phe 285、Thr 289、Ser 393、Ser 394、Phe 432、和 Try512。異戊二烯合酶的三維結(jié)構(gòu)揭示形成活性位點的數(shù)個環(huán)是柔性的?？梢岳眠@種柔性來增強酶的性能通過在形成這些區(qū)段的氨基酸中進(jìn)行置換以促進(jìn)結(jié)合底物的步驟中酶必須進(jìn)行的轉(zhuǎn)變，并允許在酶促去磷酸化過程中假定的不同動力學(xué)步驟中的底物的重排，以及為了進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移以將DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯。已經(jīng)鑒定了三個區(qū)段，它們形成底物結(jié)合袋的相當(dāng)可觀的部分，特別是截短的N-末端，以及由殘基438-453 (環(huán)I)和殘基512-527(環(huán)II)構(gòu)成的兩個環(huán)(圖33-36)。這些環(huán)可以以至少兩種構(gòu)型存在在不存在底物的情況下是“開放”形式，當(dāng)結(jié)合底物時是“閉合”或活性形式。這些殘基提供用于產(chǎn)生具有改進(jìn)的活性的異戊二烯合酶變體的靶標(biāo)。例如，美洲山楊異戊二烯合酶的這些環(huán)中的殘基，包括殘基 440-453 (SASAEIARGETANS (SEQ ID NO 40))和 512-524 (YHNGDAHTSPDEL (SEQID NO :41))，可以在用于改變異戊二烯合酶活性的位置上。異戍二烯合酶的柔性環(huán)殘基可以是位點評價文庫(Site Evaluation Library)分析的靶標(biāo)?？梢援a(chǎn)生這樣的文庫使特定氨基酸殘基突變?yōu)椴煌陌被嶂脫Q，然后在合適的宿主細(xì)胞中測定其活性(例如DMAPP活性)。如以下實施例5所例示，使銀白楊I(lǐng)spS(SEQ ID NO 41)的殘基 A443、A453、N545、H515、A519 和 E525 發(fā)生突變，并分析其 DMAPP活性。通過該分析鑒定的具有改進(jìn)活性的銀白楊I(lǐng)spS變體包括但不限于A453N、H515M、A453I和A443S。因此，可以按照本文描述的方式發(fā)現(xiàn)柔性環(huán)中的其它突變或影響柔性環(huán)的突變，所述突變增加異戊ニ烯合酶的活性。例如，可以進(jìn)行保守性置換，其引起異戊ニ烯合酶活性的増加。異戊ニ烯合酶的三維結(jié)構(gòu)掲示了酶表面上的氨基酸。例如，表面的疏水性殘基可能影響蛋白折疊、溶解性或活性。為了增強異戊ニ烯合酶的溶解性，可以使疏水性表面殘基突變以降低酶發(fā)生聚集的傾向。在一些情況下，可以使疏水性表面殘基突變?yōu)橛H水性中性殘基，以增強異戊ニ烯合酶分子的溶解性和/或降低其聚集。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解疏水性殘基、中性殘基和親水性殘基。表面疏水性殘基的實例包括但不限于銀白楊I(lǐng)spS (SEQ ID
NO 41)的 I28、V30、L130、G153、V299、L303、L469 和 L494。具有改進(jìn)的活性的銀白楊 IspS變體包括但不限于L494P、L494C、L494V、L494G、L494I和L469A。因此，可以按照本文描述的方式發(fā)現(xiàn)表面疏水性殘基中的其它突變，所述突變增加異戊ニ烯合酶的活性。例如，可以進(jìn)行引起異戊ニ烯合酶活性増加的保守性置換。應(yīng)該理解本文中描述的所有突變和/或置換是指一個突變本身或突變的組合(例如2、3、4、5、或更多個)。例如，具有L494P的異戊ニ烯合酶變體也被認(rèn)為是具有L494P和T536F的異戊ニ烯合酶變體。異戊ニ烯合酶的三維結(jié)構(gòu)具有“鉸鏈區(qū)”，其位于跨N-末端和C-末端的螺旋中。在ー個方面，異戊ニ烯合酶的三維結(jié)構(gòu)具有位于跨蛋白単體的N-末端和C-末端的螺旋中的“鉸鏈區(qū)”。不被理論所限，鉸鏈區(qū)可以決定酶的這兩個半部分如何彼此相互作用。鉸鏈區(qū)包括殘基216-244。鉸鏈區(qū)中的氨基酸殘基或者可能與鉸鏈區(qū)相互作用的氨基酸殘基的實例包括但不限于銀白楊I(lǐng)spS(SEQ ID NO 41)的R198、1229和L260。具有改進(jìn)的活性的鉸鏈區(qū)中的變體包括但不限于I229C、I229T、I229P、I229N、L260N、L260M、和L260I。因此，可以按照本文描述的方式發(fā)現(xiàn)鉸鏈殘基中的其它突變，所述突變增大異戊ニ烯合酶的活性。例如，可以進(jìn)行引起異戊ニ烯合酶活性増大的保守性置換。通過高密度酸性殘基的存在，通過異戊ニ烯合酶的三維結(jié)構(gòu)鑒定了靜電補綴。靜電補綴中的殘基包括D304、E307、D311、E314和D323。不被理論所限，該區(qū)域可以調(diào)節(jié)異戊ニ烯合酶的活性。靜電補綴中的氨基酸殘基的實例包括但不限于銀白楊I(lǐng)spS(SEQ ID NO41)的D311和D323。具有改進(jìn)的活性的變體包括但不限于D311M、D311F、D311L、D311G、D311I、D311A、D311T、D311R、D311V、D311E、D323W、D323Y、D323F、D323I、D323S、D323V、D323A、D323G、和D323Q。因此，可以按照本文描述的方式發(fā)現(xiàn)靜電補綴殘基中的其它突變或影響靜電補綴的其它突變，所述突變增大異戊ニ烯合酶的活性。例如，可以進(jìn)行引起異戊ニ烯合酶活性増大的保守性置換。異戊ニ烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的分析掲示了用于靶向變體的其它區(qū)域。例如，變體可以被靶向至蛋白的環(huán)區(qū)，其相對于螺旋而言可以更大程度地吸收結(jié)構(gòu)的變異。如實施例5中所述，銀白楊I(lǐng)spS (SEQ ID NO 41)的殘基D345、R528和T536是SEL分析的靶標(biāo)。不被理論所限，D345可能參與異戊ニ烯合酶的ニ聚體化。R528鄰近如上文描述的柔性環(huán)。殘基T536位于異戊ニ烯合酶的C-末端的最后ー個螺旋的C末端殘基。具有改進(jìn)的異戊ニ烯合酶活性的變體包括但不限于 T536C、T536I、T536F、T536Y、T536A、T536K、T536L、T536R、T536V 和 T536M。 在本發(fā)明的ー些方面，異戊ニ烯合酶變體在對應(yīng)于野葛異戊ニ烯合酶中的ー個或多個下列殘基的同源殘基處不包含突變A20、N21、Y22、Q23、P24、N25、L26、E30、F31、Q33、L35、E36、N37、L39、K40、V41、K43、L44、C57、R61、V62、D63、Q65、K87、E94、N95、L99、D100、N105、K137、E138、G143、E144、N182、L184、K185、G187、N189、T190、P225、H226、K247、T257、E258、M259、D266、R271、W278、C291、F299、V302、Y309、D310、N334、D353、S357、I358I、E361、L377、F381、E384、N389、1392、1393、K398、Y399、E401、N402、A403、S406、S407、S408、G409、A411、L413、C421、Q423、Q424、E425、D426、H430、L432、R433、S434、D437、R443、C446、F449、A456、T457、S458、A459、A460、E461、L462、E463、R464、G465、E466、T467、T468、N469、H476、N478、D479、Q485、D508、P513、A515、M523、S527、Y531、Q532、Y533、L537、G538、R539、Y542、A543、和 P557 (基于圖 37 ；SEQ ID NO :42)。在本發(fā)明的其它方面，異戊ニ烯合酶變體在對應(yīng)于銀白楊V美洲山楊異戊ニ烯合酶中的一個或多個下列突變的同源殘基處不包含突變K272、R274、W281、F302、V305、Y312、 D313、L380、F384、E387、Y402、N404、A406、S409、S410、S411、G412、L414、Q415、L416、F449、N453、L454、A455、S456、A457、S4548、A459、E460、1461、A462、R463、G464、E465、T466、N469、〇497、し521、5525、5537』540、和殘基22至27(基于圖 38 ；SEQID NO :43)。在本發(fā)明的其它方面，異戊ニ烯合酶變體在對應(yīng)于銀白楊異戊ニ烯合酶中的ー個或多個下列突變的同源殘基處不包含突變V10M、F12S、T15A、E18G、V58I、V58F、L70Q、L70V、L70T、T71P、V79L、E89D、G94A、S119F、F120L、G127R、E175V、T212I、S257A、R262G、A266G、F280L、N297K、F305L、L319M、E323K、A328T、D342E、A359T、K366N、E368D、L374M、S396T、V418S、K438N、H440R、T442I、T442A、I449V、A469S、K500R、K505Q、G507S、S509N、F511Y、和N532K (基于 SEQ IDNO 16)。在本發(fā)明的ー些方面，異戊ニ烯合酶變體在對應(yīng)于單ー的銀白楊異戊ニ烯合酶中的ー個或多個下列組合突變的同源殘基處不包含突變的組合G127R/F511Y、L70Q/G94A/R262G/F305L、F12S/T15A/E18G/N297K、S396T/T442I、V10M/E323K、F120L/A266G、K438N/K500R、V79L/S509N、E175V/S257A/E368D/A469S、T71P/L374M、F280L/H440R、E89D/H440R、V58F/A328T/N532K、S119F/D342E/I449V、和 K366N/G507S (基于 SEQ ID NO 16)。已經(jīng)證明了蛋白酶表面上的氨基酸殘基的突變能夠改善它們的活性、表達(dá)、和穩(wěn)定性(W02008/153925、W02008/153934、W02008/153935)。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)，一種完全不同的酶，異戊ニ烯合酶，其表面上的氨基酸殘基的突變能夠增強其表達(dá)、溶解性、和活性。L70R是此類有益的表面突變的實例。酶的三級結(jié)構(gòu)的闡釋對于精確鑒定其表面上的氨基酸殘基是不必可少的。使用與異戊ニ烯合酶具有大約40%同一性的序列的結(jié)構(gòu)(例如，冰片基合酶和檸檬烯合酶，已知與異戊ニ烯合酶具有最接近的結(jié)構(gòu)的酶)的同源性模擬能夠掲示模擬的酶結(jié)構(gòu)的多個方面，但不足以精確鑒定表面暴露的殘基并定量它們的表面暴露程度。通過其側(cè)鏈的溶劑可接近表面積的百分率定量了氨基酸殘基的表面暴露。通過靶向大約> 50%溶劑暴露的、在一些情況下大約> 65%溶劑暴露的、和在其它情況下>85%溶劑暴露的氨基酸殘基，異戊ニ烯合酶中的下列突變類別可以改進(jìn)酶的溶解性疏水性的一帶正電的，反之亦可疏水性的一帶負(fù)電的，反之亦可疏水性的一中性極性的，反之亦可中性極性的一帶正電的，反之亦可中性極性的一帶負(fù)電的，反之亦可帶正電的一帶負(fù)電的，反之亦可這些突變類別還可用于改進(jìn)異戊ニ烯合酶的活性、底物穩(wěn)定性、ニ聚體化。 異戊ニ烯合酶的三維結(jié)構(gòu)掲示了異戊ニ烯合成的結(jié)構(gòu)反應(yīng)坐標(biāo)。因此，本發(fā)明提供了參與DMAPP向異戊ニ烯的催化轉(zhuǎn)化的原子的三維構(gòu)型。在ー些方面，本發(fā)明提供了包含用于將DMAPP催化轉(zhuǎn)化為異戊ニ烯的原子的三維構(gòu)型的試劑。試劑的實例包括但不限于合成的分子，包括合成的多肽以及重工程化的多肽。例如，萜烯合酶家族的其它成員可以被改變，以包含用于將DMAPP催化轉(zhuǎn)化為異戊ニ烯的原子的三維構(gòu)型。機器可讀的存儲介質(zhì)可以通過使用商業(yè)上可獲得的軟件，方便地實現(xiàn)美洲山楊異戊ニ烯合酶或異戊ニ烯合酶/配體復(fù)合體或其ー個活性位點的全部或部分、結(jié)構(gòu)上同源的分子、或如上文定義的任意這些分子或分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)等同物的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)向分子或復(fù)合體的三維示意圖的轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明還提供了機器客服的存儲介質(zhì)，其包括以機器可讀的數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲物質(zhì)，當(dāng)使用以使用所述數(shù)據(jù)的指令編程的機器時，其顯示出如上文描述的本發(fā)明的任意分子或分子復(fù)合體的三維示意圖。在優(yōu)選的實施方式中，機器可讀的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)包括，以機器可讀的數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲物質(zhì)，當(dāng)使用以使用所述數(shù)據(jù)的指令編程的機器時，其顯示出分子或分子復(fù)合體的三維示意圖，所述分子或分子復(fù)合體包括美洲山楊異戊ニ烯合酶活性位點或美洲山楊樣活性位點的全部或任意部分；例如，來自白楊異戊ニ烯合酶，包括但不限于銀白楊異戊ニ烯合酶，如上文所定義。在另ー個方面，機器可讀的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)顯示出由表3-7中的所有氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)土不超過1.5人的偏離所述氨基酸的骨架原子的均方根偏差定義的分子或分子復(fù)合體的三維示意圖。在另ー個方面，機器可讀的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)顯示出由表4-2中的所有氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)土不超過1.5人的偏離所述氨基酸的骨架原子的均方根偏差定義的分子或分子復(fù)合體的三維示意圖。在本發(fā)明的備選實施方式中，機器可讀的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)包括第一組機器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲物質(zhì)，所述第一組機器可讀數(shù)據(jù)包括表3-7或4-2中所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的傅立葉轉(zhuǎn)換，并且，當(dāng)使用以使用所述數(shù)據(jù)的指令編程的機器吋，所述第一組機器可讀數(shù)據(jù)可以與第二組機器可讀數(shù)據(jù)組合以測定對應(yīng)于第二組機器可讀數(shù)據(jù)的至少一部分結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，所述第二組機器可讀數(shù)據(jù)包括分子或分子復(fù)合體的X-射線衍射模式。例如，用于讀取數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)的系統(tǒng)可以包括計算機，其包括中央處理器("CPU")，工作內(nèi)存(其可以是例如RAM(隨機存取內(nèi)存)或"核心"內(nèi)存)，大容量存儲內(nèi)存(例如一個或多個磁盤驅(qū)動器或CD-ROM驅(qū)動器)，一個或多個顯示裝置(例如，陰極射線管("CRT")顯示器、發(fā)光二極管("LED")顯示器、液晶顯示器("IXD")、電致發(fā)光顯示器、真空熒光顯示器、場致發(fā)射顯示器("FED")、等離子體顯示器、投影面板等)，ー個或多個使用者輸入裝置(例如，鍵盤、麥克風(fēng)、鼠標(biāo)、觸摸屏等)，ー個或多個輸入線，以及ー個或多個輸出線，所有這些通過常規(guī)的雙向總線相互連接起來。該系統(tǒng)可以是單獨的計算機，或者可以是與其它系統(tǒng)(例如計算機，主機、服務(wù)器等)聯(lián)網(wǎng)的(例如通過本地局域網(wǎng)、寬域網(wǎng)、內(nèi)部網(wǎng)、外部網(wǎng)、或互聯(lián)網(wǎng))。該系統(tǒng)還可以包括另外的計算機控制的設(shè)備，例如消費性電子產(chǎn)品和附件。輸入硬件可以通過輸入線聯(lián)接于計算機，并且可以按照多種方式運行。本發(fā)明的機器可讀的數(shù)據(jù)可以通過使用通過電話線或?qū)Ｓ脭?shù)據(jù)線連接的調(diào)制解調(diào)器來輸入。備選地或另外，輸入硬件可以包括CD-ROM驅(qū)動器或磁盤驅(qū)動器。與顯示終端相聯(lián)，鍵盤也可以用作輸入設(shè)備。輸出硬件可以通過輸出線聯(lián)接于計算機，并且可以類似地通過常規(guī)設(shè)備運行。舉例而言，輸出硬件可以包括用于顯示本發(fā)明的活性位點的示意圖的顯示設(shè)備，其中使用程序例如QUANTA。輸出硬件還可以包括打印機，從而可以產(chǎn)生紙件輸出或磁盤驅(qū)動器以儲存系統(tǒng)輸出用于后續(xù)應(yīng)用。 在運行吋，CPU協(xié)調(diào)多種輸入和輸出設(shè)備的使用，協(xié)調(diào)數(shù)據(jù)從大容量存儲設(shè)備的讀取，從工作內(nèi)存的存取，并決定數(shù)據(jù)處理步驟的次序?？梢允褂枚喾N程序來處理本發(fā)明的機器可讀的數(shù)據(jù)。此類程序通過參考如本文描述的藥物發(fā)現(xiàn)的計算機化方法來討論。在以下關(guān)于數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)的描述中視需要包括了關(guān)于硬件系統(tǒng)的組件的內(nèi)容。用于本發(fā)明中的機器可讀的存儲設(shè)備包括但不限于磁設(shè)備、電設(shè)備、光設(shè)備、及其組合。此類數(shù)據(jù)存儲設(shè)備的實例包括但不限于硬盤設(shè)備、CD設(shè)備、數(shù)字視頻磁盤設(shè)備、軟盤設(shè)備、可拆卸硬盤設(shè)備、磁光盤設(shè)備、磁帶設(shè)備、閃存設(shè)備、磁泡存儲器設(shè)備、全息存儲設(shè)備、以及任何其它大容量外圍設(shè)備。應(yīng)該理解，這些存儲設(shè)備包括必要的硬件(例如，驅(qū)動器、控制器、電源等)以及任何必要的介質(zhì)(例如盤、閃卡等)以進(jìn)行數(shù)據(jù)存儲。異戊ニ烯合酶變體、具有相似的三維結(jié)構(gòu)的試劑、及其用途本文提供了用于制備和使用源自異戊ニ烯合酶和具有類似于異戊ニ烯合酶的三維結(jié)構(gòu)的試劑的三維結(jié)構(gòu)的變體的組合物和方法。本發(fā)明提供了基于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的評價來產(chǎn)生和測試異戊ニ烯合成的候選變體的方法。通過就變體的一個或多個所需的特性計算機化分析三維結(jié)構(gòu)來衍生用于改變的候選殘基；所述特性是，例如，増加的比活性、増加的穩(wěn)定性、増加的表達(dá)等。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生候選變體?？梢曰谒璧慕Y(jié)果測定變體。例如，可以在體外使用純化或部分純化的異戊ニ烯合酶變體，或者，在宿主生物例如大腸桿菌的情況下在體內(nèi)，就DMAPP向異戊ニ烯的轉(zhuǎn)化來測試就增大的比活性工程化的異戊ニ烯合酶變體。在一些情況下，大腸桿菌也可以表達(dá)DXP途徑、MVA途徑、或二者。將改進(jìn)的活性相對于其它異戊ニ烯合酶來測定；例如，野生型異戊ニ烯合酶。預(yù)期在一個或多個測試條件下具有多種程度的穩(wěn)定性、溶解性、活性、和/或表達(dá)水平的酶將可用于本發(fā)明中以在多種宿主中生產(chǎn)異戊ニ烯。高通量方法可以以經(jīng)濟的方式提供這些性質(zhì)的研究。本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生増大的量的異戊ニ烯的方法。具體地，這些組合物和方法增大異戊ニ烯的生產(chǎn)速率并增大所產(chǎn)生的異戊ニ烯的總量。在本發(fā)明的ー些方面，可以通過向細(xì)胞中導(dǎo)入編碼異戊ニ烯合酶變體多肽的異源核酸來增大細(xì)胞所產(chǎn)生的異戊ニ烯的量。
示例性多肽和核酸本發(fā)明的組合物和方法中可以使用多種異戊ニ烯合酶多肽和核酸。如本文使用的“多肽”包括多肽、蛋白、肽、多肽片段、和融合多肽，所述融合多肽包括部分或全部的第一多肽(例如，異戊ニ烯合酶)以及部分或全部的第二多肽(例如，促進(jìn)融合多肽的純化或檢測的多肽，例如His標(biāo)簽)。在多個實施方式中，多肽具有至少或大約50、100、150、175、200、250、300、350、400、或更多個氨基酸。在一些實施方式中，多肽片段包含來自全長多肽的至少或大約25、50、75、100、150、200、300、或更多個連續(xù)氨基酸并且具有至少或大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 或大于 100% 的對應(yīng)的全長多肽的活性。在具體的實施方式中，多肽包括任意天然存在的異戊ニ烯合酶的氨基酸序列區(qū)段或整個氨基酸序列。在一些實施方式中，相對于野生型(即天然存在的序列)異戊ニ烯合酶的序列，多肽具有ー個或多個突變在一些實施方式中，多肽是異源多肽。“異源多肽”意指這樣的多肽其氨基酸序列與天然表達(dá)于相同的宿主細(xì)胞中的另ー多肽是不同的。在多個實施方式中，核酸是重組核酸。例如，在一些實施方式中，異戊ニ烯合酶核酸可操作地連接于編碼全部或部分的另ー多肽的另一核酸，從而重組核酸編碼包括異戊ニ烯合酶和全部或部分另ー多肽(例如促進(jìn)融合多肽的純化或檢測的肽，例如His-標(biāo)簽)的融合多肽。在一些實施方式中，部分或全部的重組核酸是化學(xué)合成的。在一些實施方式中，核酸是異源核酸?！爱愒春怂帷币庵高@樣的核酸其核酸序列與天然發(fā)現(xiàn)于相同的宿主細(xì)胞中的另ー核酸是不同的。在具體的實施方式中，核酸包括任意天然存在的異戊ニ烯合酶核酸的核酸序列區(qū)段或整個核酸序列。在一些實施方式中，核酸包括來自天然存在的異戊ニ烯合酶核酸的至少或大約50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、或更多個連續(xù)核苷酸。在一些實施方式中，相對于野生型(即天然存在的序列)異戊ニ烯合酶核酸的序列，核酸具有一個或多個突變。在一些實施方式中，核酸具有增加異戊ニ烯合酶核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯的ー個或多個突變(例如沉默突變)。在一些實施方式中，核酸是編碼異戊ニ烯合酶多肽的任意核酸的簡并變體。可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, 2001,其通過引用方式全文并入本文,尤其是關(guān)于合適的DNA序列的篩選和載體構(gòu)建的內(nèi)容)將異戊ニ烯合酶核酸摻入載體中，例如表達(dá)載體。用于連接包含目標(biāo)核酸例如異戊ニ烯合酶的DNA構(gòu)建體、啟動子、終止子、和其它序列并將它們插入至合適的載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。另外，可以使用已知的重組技術(shù)(例如Invitrogen LifeTechnologies、Gateway Technology)構(gòu)建載體。在一些實施方式中，理想的是在遠(yuǎn)高于天然存在的細(xì)胞中目前發(fā)現(xiàn)的水平過表達(dá)異戊ニ烯合酶核酸。可以通過將編碼那些多肽的核酸選擇性克隆進(jìn)入多拷貝質(zhì)?；?qū)⒛切┖怂嶂糜趶娬T導(dǎo)型或組成型啟動子之下來實現(xiàn)該結(jié)果。用于過表達(dá)所需的多肽的方法是常見的和分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)熟知的，實例可以見Sambrook等人，Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor, 2001,其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于克隆技術(shù)的內(nèi)容。以下資源包括用于本發(fā)明中的另外的一般的方法學(xué)的描述Kreigler，GeneTransfer and Expression ；A Laboratory Manual, 1990 ；和 Ausubel 等人編.CurrentProtocols in Molecular Biology, 1994,各自通過引用方式全文并入本文,尤其是關(guān)于分子生物學(xué)和克隆技術(shù)的內(nèi)容。示例性的宿主細(xì)胞多種宿主細(xì)胞可用于在要求保護(hù)的發(fā)明的方法中表達(dá)異戊ニ烯合酶井生產(chǎn)異戊ニ烯。宿主細(xì)胞可以是天然產(chǎn)生異戊ニ烯的細(xì)胞，或者是不天然產(chǎn)生異戊ニ烯的細(xì)胞。在一些實施方式中，宿主細(xì)胞使用DXP途徑天然產(chǎn)生異戊ニ烯，并且加入異戊ニ烯合酶、DXS、和/或IDI核酸以增加使用該途徑產(chǎn)生的異戊ニ烯。在一些實施方式中，宿主細(xì)胞使用MVA途徑天然產(chǎn)生異戊ニ烯，并且加入異戊ニ烯合酶和/或ー種或多種MVA途徑核酸以增加使用該途徑產(chǎn)生的異戊ニ烯。在一些實施方式中，宿主細(xì)胞使用DXP途徑天然產(chǎn)生異戊ニ烯，并且加入ー種或多種MVA途徑核酸以使用部分或全部MVA途徑以及DXP途徑產(chǎn)生異戊ニ烯。在一些實施方式中，宿主細(xì)胞使用DXP和MVA途徑天然產(chǎn)生異戊ニ烯，并且加入ー種或多種異戊ニ烯合酶、DXS、IDI、或MVA途徑核酸以增加通過這些途徑之一或二者產(chǎn)生的異戊ニ烯?？墒褂玫钠渌纠运拗骷?xì)胞描述于美國公開2009/0203102、W02009/076676、WO 2010/003007,WO 2009/132220、WO 2010/031062,WO 2010/031068、WO 2010/031076,WO2010/031077、和 W02010/031079。示例性的轉(zhuǎn)化方法可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將異戊ニ烯合酶、DXS、101、和/或MVA途徑核酸或包含它們的載體插入至宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)中以表達(dá)所編碼的異戊ニ烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途徑多肽?？梢允褂美缦铝屑夹g(shù)將DNA構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化、電穿孔、細(xì)胞核微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染(例如脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的或DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或使用重組噬菌體病毒轉(zhuǎn)染)、以磷酸鈣DNA沉淀溫育、以DNA包被的微粒高速轟擊、和原生質(zhì)體融合。一般性的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(見，例如，Current Protocols in MolecularBiology (F. M. Ausubel 等人(編)Chapter 9、1987 ;Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rd ed. , Cold Spring,2011 ;和 Campbell 等人，Curr. Genet. 16 53-56，1989，其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于轉(zhuǎn)化方法的內(nèi)容)。導(dǎo)入的核酸可以整合進(jìn)入染色體DNA或者可以維持為染色體外的復(fù)制序列?？墒褂玫钠渌纠缘霓D(zhuǎn)化方法描述于美國公開2009/0203102、WO2009/076676、WO 2010/003007、WO 2009/132220、W02010/031062、WO 2010/031068、WO2010/031076、TO 2010/031077、和 WO 2010/031079。示例性的細(xì)胞培養(yǎng)基可以使用任意碳源來培養(yǎng)宿主細(xì)胞。術(shù)語“碳源”是指能夠被宿主細(xì)胞或生物體代謝的ー種或多種含碳化合物。例如，用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含適合于維 持宿主細(xì)胞存活或生長的任意碳源。在一些實施方式中，碳源是碳水化合物(例如單糖、ニ糖、寡糖、或多糖)、轉(zhuǎn)化糖(例如，酶處理的蔗糖糖漿)、丙三醇、甘油(例如，生產(chǎn)生物柴油或肥皂的エ藝的甘油副產(chǎn)物)、ニ羥基丙酮、ー碳源、脂肪酸(例如，飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、或多不飽和脂肪酸)、脂質(zhì)、磷脂、甘油脂、甘油單酯、甘油ニ酷、甘油三酷、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物質(zhì)碳源，例如水解的生物質(zhì)碳源；甜菜糖或蔗糖糖蜜)、酵母提取物、來自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、こ酸、こ醇、或前述中的兩項或更多項的任意組合。在一些實施方式中，碳源是光合作用的產(chǎn)物，包括但不限干葡萄糖。示例性的單糖包括葡萄糖和果糖；示例性的寡糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纖 維素。示例性的碳水化合物包括C6糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(例如，木糖或阿拉伯糖)。在一些實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包括碳水化合物以及除了碳水化合物之外的碳源(例如，丙三醇、甘油、ニ羥基丙酮、ー碳源、脂肪酸、脂質(zhì)、磷月旨、甘油脂、甘油單酯、甘油ニ酷、甘油三酷、可再生碳源、或來自酵母提取物的成分)。在一些實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含碳水化合物以及多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)。在一些實施方式中，微生物多肽是來自酵母或細(xì)菌的多肽。在一些實施方式中，植物多肽是來自大豆、玉米、油菜、麻風(fēng)樹、棕櫚、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻、或亞麻仁的多肽。在一些實施方式中，碳水化合物的濃度是至少或大約5g/升培養(yǎng)液(g/L，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞培養(yǎng)基的體積和細(xì)胞的體積二者)，例如至少或大約10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些實施方式中，碳水化合物的濃度是大約50至大約400g/L，例如大約100至大約360g/L，大約120至大約360g/L，或大約200至大約300g/L。在一些實施方式中，碳水化合物的該濃度包括在培養(yǎng)宿主細(xì)胞之前和/或過程中加入的碳水化合物的總量。示例性的脂質(zhì)是包含ー種或多種C4和以上的脂肪酸的脂肪酸的任意物質(zhì)，所述脂肪酸可以是飽和、不飽和、或分支的。示例性的脂肪酸包括式R-COOH的化合物，其中“R”是烴。示例性的不飽和脂肪酸包括這樣的化合物其中“R”包括至少ー個碳-碳雙鍵。示例性的不飽和脂肪酸包括但不限于油酸、異油酸、亞油酸、棕櫚反油酸、和花生四烯酸。示例性的多不飽和脂肪酸包括這樣的化合物其中“R”包括多個碳-碳雙鍵。示例性的飽和脂肪酸包括這樣的化合物其中“R”是飽和的脂肪族基團。在一些實施方式中，碳源包括ー種或多種C12-C22脂肪酸，例如C12飽和脂肪酸、C14飽和脂肪酸、C16飽和脂肪酸、C18飽和脂肪酸、C20飽和脂肪酸、或C22飽和脂肪酸。在示例性的實施方式中，脂肪酸是棕櫚酸。在一些實施方式中，碳源是脂肪酸(例如，不飽和脂肪酸)的鹽、脂肪酸(例如，不飽和脂肪酸)的衍生物、或脂肪酸(例如，不飽和脂肪酸)的衍生物的鹽。合適的鹽包括但不限干鋰鹽、鉀鹽、鈉鹽等。甘油ニ酯和甘油三酯是甘油的脂肪酸酷。在一些實施方式中，脂質(zhì)、脂肪酸、甘油單酯、甘油ニ酷、或甘油三酯的濃度是至少或大約Ig/升培養(yǎng)液(g/L，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞培養(yǎng)基的體積和細(xì)胞的體積二者)，例如至少或大約 5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多 g/L。在ー些實施方式中，脂質(zhì)、脂肪酸、甘油單酯、甘油ニ酷、或甘油三酯的濃度是大約10至大約400g/L，例如大約25至大約300g/L，大約60至大約180g/L，或大約75至大約150g/L。在ー些實施方式中，該濃度包括在培養(yǎng)宿主細(xì)胞之前和/或過程中加入的脂質(zhì)、脂肪酸、甘油単酷、甘油ニ酷、或甘油三酯的總量。在一些實施方式中，碳源包括(I)脂質(zhì)、脂肪酸、甘油単酷、甘油ニ酷、或甘油三酯和(ii)碳水化合物，例如葡萄糖。在一些實施方式中，脂質(zhì)、脂肪酸、甘油單酯、甘油ニ酷、或甘油三酯與碳水化合物的比是大約I : 1(基于碳)(即，脂質(zhì)、脂肪酸、甘油單酯、甘油ニ酷、或甘油三酯中的ー個碳/碳水化合物的碳)。在具體的實施方式中，脂質(zhì)、脂肪酸、甘油單酯、甘油ニ酷、或甘油三酯的量是大約60至180g/L，并且碳水化合物的量是大約120至360g/L。示例性的微生物多肽碳源包括來自酵母或細(xì)菌的ー種或多種多肽。示例性的植物多肽碳源包括來自大豆、玉米、油菜、麻風(fēng)樹、棕櫚、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻、或亞麻仁的ー種或多種多肽。示例性的可再生的碳源包括干酪乳清滲透物、玉米浸液、甜菜糖蜜、大麥芽、和來自前述任意項的成分。示例性的可再生碳源還包括存在于生物質(zhì)中的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，所述生物質(zhì)例如玉米、柳枝稷、甘蔗、發(fā)酵過程的細(xì)胞廢物、以及來自大豆、玉米、或小麥的研磨的蛋白質(zhì)副產(chǎn)物。在一些實施方式中，生物質(zhì)碳源是木質(zhì)纖維素、半纖維素、或纖維質(zhì)材料，例如但不限于草、小麥、麥稻、甘鹿洛(bagasse)、甘鹿洛(sugar cane bagasse)、
軟木漿、玉米、玉米芯或稻殼、玉米仁、來自玉米仁的纖維、玉米秸桿、柳枝稷、稻殼產(chǎn)物、或從谷物(如玉米、高粱、黑麥、triticate、大麥、小麥、和/或蒸懼谷物)的濕或干研磨生產(chǎn)的副產(chǎn)物。示例性的纖維質(zhì)材料包括木材、紙和漿廢液、草本植物、及果肉。在一些實施方式中，碳源包括任意植物部分，如莖、谷粒、根、或塊莖。在一些實施方式中，任意以下植物的全部或部分用作碳源玉米、小麥、黑麥、高粱、triticate、水稻、粟、大麥、木薯、豆類如大豆和豌豆、馬鈴薯、蕃薯、香蕉、甘蔗、和/或木薯。在一些實施方式中，碳源是生物質(zhì)水解物，如包含木糖和葡萄糖或包含蔗糖和葡萄糖的生物質(zhì)水解物。在一些實施方式中，在添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中之前預(yù)處理可再生碳源(例如生物質(zhì))。在一些實施方式中，預(yù)處理包括酶預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理、或酶和化學(xué)預(yù)處理的組合(見，例如，F(xiàn)arzaneh 等人、Bioresource Technology 96(18) :2014-2018, 2005 ;美國專利No. 6，176，176 ;美國專利No. 6，106, 888 ;其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于可再生碳源的預(yù)處理的內(nèi)容)。在一些實施方式中，在添加到細(xì)胞培養(yǎng)基之前，將可再生碳源部分或全部水解。在一些實施方式中，在添加到細(xì)胞培養(yǎng)基之前，可再生碳源(例如玉米秸桿)經(jīng)歷氨纖維瀑破法(AFEX)預(yù)處理(見,例如,Farzaneh等人、Bioresource Technology 96(18)2014-2018,2005)。在AFEX預(yù)處理過程中，在中等溫度(例如大約60°C至大約100°C )和高壓(例如大約250psi至大約300psi)以液態(tài)無水氨將可再生碳源處理大約5分鐘。然后，迅速釋放壓力。在該過程中，木質(zhì)素溶解、半纖維素水解、纖維素的解晶作用、和増加的表面積的化學(xué)和物理的組合效應(yīng)使得纖維素和半纖維素幾乎能夠完全酶促轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖。AFEX預(yù)處理具有以下優(yōu)點幾乎所有的氨都可以被回收和再利用，剰余的則作為下游過程中的微生物的氮源。另外，AFEX預(yù)處理無需洗滌流。因此，AFEX處理之后的干物質(zhì)回收基本上是100%。AFEX基本上是干-干的過程。經(jīng)處理的可再生碳源在長時間內(nèi)是穩(wěn)定的，并且可以以非常高的固體載量進(jìn)料到酶促水解或發(fā)酵過程中。纖維素和半纖維素在AFEX過程中被良好保存，甚少降解或無降解。對于經(jīng)歷了 AFEX預(yù)處理的可再生碳源而言，在酶促水解之前，無需中和。AFEX處理的碳源的酶促水解為隨后的發(fā)酵用途產(chǎn)生清潔的糖流。在一些實施方式中，碳源(例如可再生碳源)的濃度相當(dāng)于至少或大約0. 1%、0. 5%、1%、1. 5%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、或 50%葡萄糖(w/v)?？梢酝ㄟ^使用標(biāo)準(zhǔn)的HPLC方法，使用葡萄糖作為參照物來測定葡萄糖的當(dāng)量，以測定從碳源生產(chǎn)的葡萄糖的量。在一些實施方式中，碳源(例如可再生碳源)的濃度相當(dāng)于大約0. 1%至大約20%葡萄糖，例如大約0. 1%至大約10%葡萄糖，大約0. 5%至大約10%葡萄糖，大約1%至大約10%葡萄糖，大約I %至大約5%葡萄糖，或大約I %至大約2%葡萄糖。在一些實施方式中，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的ー種或多種成分。在一些實施方式中，酵母提取物的濃度是至少I克酵母提取物/升培養(yǎng)液(g/L，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞培養(yǎng)基的體積和細(xì)胞的體積二者)，例如至少或大約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、或更多§/し在一些實施方式中，酵母提取物的濃度是大約I至大約300g/L，例如大約I至大約200g/L，大約5至大約200g/L，大約5至大約100g/L，或大約5至大約60g/L。在一些實施方式中，該濃度包括在培養(yǎng)宿主細(xì)胞之前和/或過程中加入的酵母提取物的總量。在一些實施方式中，碳源包括酵母提取物(或其ー種或多種成分)和另ー種碳源，例如葡萄糖。在一些實施方式中，酵母提取物與其它碳源的比率是大約I : 5，大約 I 10，或 I 20 (w/w) o 另外，碳源也可以是ー碳底物，例如ニ氧化碳或甲醇。已經(jīng)報道了在甲基營養(yǎng)酵母(Yamada等人，Agric. Biol. Chem. , 53 (2) 541-543,1989,其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于碳源的內(nèi)容)和細(xì)菌(Hunter等人，Bochemistry, 24,4148-4155,1985,其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于碳源的內(nèi)容)從單ー碳源(例如，甲醇、甲醛、或甲酸)生產(chǎn)甘油。這些生物體可以同化單ー碳化合物從甲烷氧化態(tài)至甲酸，并且生產(chǎn)甘油。碳同化的途徑可以經(jīng)由核酮糖ー磷酸、經(jīng)由絲氨酸、或經(jīng)由木酮糖ー磷酸(Gottschalk, BacterialMetabolism, Second Edition, Springer-Verlag New York, 1986,其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于碳源的內(nèi)容)。核酮糖ー磷酸途徑包括甲酸與核酮糖-5-磷酸縮合以形成6碳糖，該6碳糖變?yōu)楣?，并最終變?yōu)?碳產(chǎn)物甘油醛-3-磷酸。類似地，絲氨酸途徑使ー碳化合物通過亞甲基四氫葉酸同化進(jìn)入糖酵解途徑。除了ー碳和ニ碳底物，還已知甲基營養(yǎng)生物體利用多種其它含碳化合物，例如甲胺、葡萄糖胺和多種氨基酸以用于代謝活性。例如，已知甲基營養(yǎng)酵母利用來自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion 等人，Microb. Growth Cl Compd. , Int. Symp, 7th ed.,415-32. Editors Murrell 等人，Publisher !Intercept, Andover, UK, 1993,其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于碳源的內(nèi)容)。類似地，假絲酵母屬的多個種代謝丙氨酸或油酸(Suiter等人，Arch. Microbiol. 153 (5), 485-9,1990,其通過引用方式全文并入本文,尤其是關(guān)于碳源的內(nèi)容)。在一些實施方式中，在含有生理鹽和營養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(見，例如，Pourquie,J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation,eds. Aubert等人，Academic Press, pp. 71-86,1988 ；和 Ilmen 等人，AppI. Environ. Microbiol. 63 1298-1306，1997，其通過引用方式并入本文，尤其是關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)基的內(nèi)容)。示例性的生長培養(yǎng)基是通常商業(yè)上制備的培養(yǎng)基，例如Luria Bertani (LB)培養(yǎng)基、SabouraudDextrose(SD)培養(yǎng)基，或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。微生物或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉也可以使用的其它的確定的或合成的生長培養(yǎng)基，以及用于特定宿主細(xì)胞的生長的合適的培養(yǎng)基。
除了合適的碳源之外，細(xì)胞培養(yǎng)基合乎需要地包含合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液、和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合于培養(yǎng)物生長或增加異戊ニ烯產(chǎn)量的其它成分(見，例如，WO 2004/033646及其中引用的參考文獻(xiàn)，以及WO 96/35796及其中引用的參考文獻(xiàn)，其各自通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)條件的內(nèi)容)。在一些實施方式中，當(dāng)異戊ニ烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途徑核酸處于可誘導(dǎo)啟動子控制下時，向培養(yǎng)基中合乎需要地加入有效誘導(dǎo)異戊ニ烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途徑多肽的表達(dá)的濃度的誘導(dǎo)劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)。在一些實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基具有對應(yīng)于載體(其具有ー種或多種DXS、IDI、或MVA途徑核酸)上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)的抗生素(例如卡那霉素)?？墒褂玫钠渌纠缘募?xì)胞培養(yǎng)基描述于美國公開2009/0203102、WO2009/076676、WO 2010/003007、WO 2009/132220、W02010/031062、WO 2010/031068、WO2010/031076、TO 2010/031077、和 WO 2010/031079。示例性的異戊ニ烯的生產(chǎn)在一些實施方式中，在允許細(xì)胞生產(chǎn)異戊ニ烯的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實施方式中，培養(yǎng)物中的細(xì)胞生產(chǎn)大于或大約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1,250,1,500,1,750,2,000,2,500,3,000,4,000、5，000、或更多nmole的異戍ニ烯/克細(xì)胞的濕細(xì)胞重/小時(nmole/gwail/hr)的異戍ニ烯。在一些實施方式中，異戊ニ烯的量是大約2至大約5，OOOnmoIe/gw。ンhr，例如大約2至大約100nmole/gwem/hr、大約 100 至大約 500nmole/gwem/hr、大約 150 至大約 500nmole/gwem/hr、大約 500 至大約 1，000nmole/gwc;m/hr、大約 1，000 至大約 2，OOOnmoIe/gwail/hr、或大約 2 ，000至大約5，OOOnmoIe/gwem/h?？梢园凑杖缑绹鴮＠鸑o. 5，849，970中公開的內(nèi)容測定異戍ニ烯的量，單位是nmole/g^/hr，該文獻(xiàn)通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于測定異戊ニ烯產(chǎn)量的內(nèi)容。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜系統(tǒng)，例如等溫(85°C )操作的具有正辛烷/多孔娃C柱(Alltech Associates, Inc.，Deerfield, IL)并偶聯(lián)于RGD2氧化萊還原氣體檢測器(Trace Analytical, Menlo Park, CA)的系統(tǒng)分析2mL頂空(例如，來自例如在32°C以200rpm振蕩培養(yǎng)大約3小時的密封瓶中培養(yǎng)的2mL培養(yǎng)物的培養(yǎng)物的頂空)中的異戊ニ烯(見，例如，Greenberg 等人，Atmos. Environ. 27A :2689-2692,1993 ；Silver 等人，PlantPhysiol. 97 :1588-1591,1991，其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于測定異戊ニ烯產(chǎn)量的內(nèi)容)。通過標(biāo)準(zhǔn)的異戊ニ烯濃度校正曲線將氣相色譜面積単位轉(zhuǎn)化為nmol異戊ニ烯。在一些實施方式中，通過獲得細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品的A6tltl值、然后基于具有已知的A6tltl值的細(xì)胞培養(yǎng)物的濕重的校正曲線將A6tltl值轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的克數(shù)，來計算濕細(xì)胞重的細(xì)胞的克數(shù)。在一些實施方式中，通過假設(shè)ム_值為I的I升培養(yǎng)液(包括細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞)具有I克濕細(xì)胞重來估計細(xì)胞的克數(shù)。還將該值除以培養(yǎng)物已被溫育的小時數(shù)，例如3個小時。在一些實施方式中，培養(yǎng)物中的細(xì)胞生產(chǎn)大于或大約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1,250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000、4，000,5, 000、10，000、100，000、或更多ng的異戊ニ烯/克細(xì)胞的濕細(xì)胞重/小時(ng/gwcm/h)的異戊ニ烯。在一些實施方式中，異戊ニ烯的量是大約2至大約5，000ng/gw。ノh，例如大約 2 至大約 100ng/gwem/h、大約 100 至大約 500ng/gwem/h、大約 5OO 至大約 1，000ng/gwcm/h>大約1，OOO至大約2，000ng/gra/h、或大約2，000至大約5，000ng/gwcm/ho可以通過將如上討論的單位為nmole/gw /hr的異戍ニ烯的產(chǎn)量值乘以68. I來計算以ng/gw /h表示的異戍ニ烯的量(如以下等式5所描述)。在一些實施方式中，培養(yǎng)物中的細(xì)胞生產(chǎn)大于或大約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1,250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000、4，000,5, 000、10，000,50, 000、100，000、或更多毫克的異戊ニ烯/L培養(yǎng)液(mg/L培養(yǎng)液，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的體積)的異戊ニ烯的累積效價(總量)。在ー些實施方式中，異戊ニ烯的量是大約2至大約5，000mg/L培，例如大約2至大約100mg/L培養(yǎng)液、大約100至大約500mg/L培養(yǎng)液、大約500至大約1，000mg/L培養(yǎng)液、大約1，000至大約2，OOOmg/
、或大約2，000至大約5，000mg/L培養(yǎng)液。以毫克異戊ニ烯/升頂空(來自搖瓶或類似培養(yǎng)物)表示的異戊ニ烯的比生產(chǎn)率可以這樣測定從0D_值為大約I. 0的細(xì)胞培養(yǎng)物中取出Iml樣品，將其置于20ml的瓶中，溫育30分鐘，然后測定頂空中的異戊ニ烯的量。如果0D_值不是1.0，則可以通過除以0D_值來將測定值校正為1.0的0D_值?？梢酝ㄟ^乘以因子38而將毫克異戊ニ烯/升頂空的值轉(zhuǎn)化為mg/L##w/hr/培養(yǎng)液的0D_?？梢詫?單位為mg/L_a/hr/0D_的值乘以小時數(shù)和0D_值來獲得單位為毫克異戊ニ烯/升培養(yǎng)液的累積效價。發(fā)酵器中的以mg/L##w/hr表示的瞬時異戊ニ烯生產(chǎn)速率可以這樣測定取出發(fā)酵器廢氣的樣品，分析其異戊ニ烯的量(單位是例如毫克異戊ニ烯/L氣體)，并將該數(shù)值乘以廢氣通過每升培養(yǎng)液的速率(例如，在Ivvm (空氣體積/培養(yǎng)液體積/分鐘)時，這是60Ln#/小時)。因此,lmg/Ln#的廢氣水平對應(yīng)于氣流為Ivvm時60mg/L_a/hr的瞬時生產(chǎn)速率。如果需要，可以將單位為mg/L培養(yǎng)液/hr的數(shù)值除以0D_值以獲得單位為mg/L培#a/hr/0D的比速率?？梢酝ㄟ^將此平均廢氣異戊ニ烯濃度乘以發(fā)酵過程中每升發(fā)酵液鼓泡的廢氣的總量而將以毫克異戊ニ烯/Ln#表示的平均值轉(zhuǎn)化為總產(chǎn)物生產(chǎn)率(異戊ニ烯克數(shù)/升發(fā)酵液，mg/L培養(yǎng)液)。因此,在Ivvm經(jīng)10小時的0. 5mg/L培養(yǎng)液/hr的平均廢氣異戍ニ烯濃度對應(yīng)于300毫克異戊ニ烯/L##w的總產(chǎn)物濃度。在一些實施方式中，培養(yǎng)物中的細(xì)胞將大于或大約0. 0015%,0. 002%,0. 005%,0. 01 %,0. 02 %,0. 05 %,0. I %,0. 12 %,0. 14 %,0. 16 %,0. 2 %,0. 3 %,0. 4 %,0. 5
0. 6%,0. 7%,0. 8%,0. 9%U. 0%U. 2%U. 4%、或I. 6%的細(xì)胞培養(yǎng)基中的碳轉(zhuǎn)化為異戊ニ烯。在一些實施方式中，碳至異戊ニ烯的轉(zhuǎn)化百分率是大約0.002%至大約1.6%，例如大約0. 002%至大約0. 005%、大約0. 005%至大約0. 01%、大約0. 01%至大約0. 05%、大約0. 05%至大約0. 15%,0. 15%至大約0. 2%、大約0. 2%至大約0. 3%、大約0. 3%至大約0.5%、大約0.5%至大約0.8%、大約0.8%至大約1.0%、或大約1.0%至大約1.6%。碳至異戊ニ烯的轉(zhuǎn)化百分率(也稱作“ ％碳產(chǎn)率”)可以這樣測定將所生產(chǎn)的異戊ニ烯中的摩爾碳除以碳源中的摩爾碳(例如批式和進(jìn)料的葡萄糖和酵母提取物中的摩爾碳)。將該數(shù)值乘以100%以得到百分率數(shù)值(如等式I所示)。等式I%碳產(chǎn)率=(所生產(chǎn)的異戊ニ烯中的摩爾碳)バ碳源中的摩爾碳)十100為了這個計算，可以假設(shè)酵母提取物包含50% w/w的碳。等式2
% 碳產(chǎn)率=(39. Ig 異戍ニ烯 * 1/68. lmol/g * 5C/mol)/[(181221g 葡萄糖*l/180mol/g * 6C/mol) + (17780g 酵母提取物* 0. 5 * l/12mol/g)] * 100 = 0. 042%本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地將異戊ニ烯的生產(chǎn)速率或異戊ニ烯的生產(chǎn)量轉(zhuǎn)化為任意其它單位。以下列出了用于在單位之間相互轉(zhuǎn)化的示例性的等式。用于異戊ニ烯生產(chǎn)速率(總速率和比速率)的単位等式3Ig異戍ニ烯/L培養(yǎng)液/hr = 14. 7mmol異戍ニ烯/L培養(yǎng)液/hr (總體積速率)等式4Inmol 異戍ニ烯 /gwcm/hr = Inmol 異戍ニ烯 /L培養(yǎng)液/hr/0D6(l(l(該轉(zhuǎn)化假設(shè) OD6tltl 值為I的I升培養(yǎng)液具有I克濕細(xì)胞重。)等式5Inmol異戍ニ烯/gwem/hr = 68. Ing異戍ニ烯/gwem/hr (給出異戍ニ烯的分子量)等式6Inmol 異戍ニ烯 /LnfrO2Ar = 90nmol 異戍ニ烯 /L培養(yǎng)液/hr (在 90L/hr 的 O2 流速姆升培養(yǎng)液)等式7廢氣中的Iiig異戊ニ烯/L^異戊ニ烯=在60Ln#每L_a(lvvm)的流速的60 u g異戍ニ烯/L培養(yǎng)液/hr效價的單位(總效價和比效價)等式8Inmol異戍ニ烯/mg細(xì)胞蛋白=150nmol異戍ニ烯/L培養(yǎng)液/OD6tltl (該轉(zhuǎn)化假設(shè)OD6tltl值為I的I升培養(yǎng)液具有總共大約150mg的細(xì)胞蛋白)(比生產(chǎn)率)等式9Ig異戊ニ烯/L培養(yǎng)液=14. 7mmol異戊ニ烯/L培養(yǎng)液(總效價)如果需要，等式10可用于將任何包括濕細(xì)胞重的単位轉(zhuǎn)化為包括干細(xì)胞重的對應(yīng)的單位。等式10干細(xì)胞重=(濕細(xì)胞重)/3. 3在本發(fā)明包括的一些實施方式中，包含編碼異戊ニ烯合酶多肽的異源核酸的細(xì)胞生產(chǎn)的異戊ニ烯的量是在基本上相同的條件下生長的不含編碼異戊ニ烯合酶多肽的異源核酸的相應(yīng)的細(xì)胞生產(chǎn)的異戊ニ烯的量的至少或大約2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。在本發(fā)明包括的一些實施方式中，包含編碼異戊ニ烯合酶多肽的異源核酸和編碼DXS、IDIJP /或MVA途徑多肽的ー種或多種異源核酸的細(xì)胞生產(chǎn)的異戊ニ烯的量是在基本上相同的條件下生長的不含異源核酸的相應(yīng)的細(xì)胞生產(chǎn)的異戊ニ烯的量的至少或大約2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。示例性的純化方法在一些實施方式中，本文描述的任意方法還包括回收異戊ニ烯。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)回收使用本發(fā)明的組合物和方法生產(chǎn)的異戊ニ烯，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如氣提、分餾、吸附/解吸附、滲透蒸發(fā)、從固相熱或真空解吸附異戊ニ烯、或使用溶劑提取固定至或吸附至固相的異戊ニ烯(見，例如，美國專利No. 4，703，007和No. 4，570，029，其通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于異戊ニ烯回收和純化方法的內(nèi)容)。在一些實施方式中，異戊ニ烯的回收包括分離液體形式的異戊ニ烯(例如異戊ニ烯的純?nèi)芤夯虍愇欹讼┰谌軇┲械娜芤?。氣提包括以持續(xù)方式從發(fā)酵廢氣流中獲取異戊ニ烯蒸氣。這種獲取可以通過數(shù)種不同方式進(jìn)行，包括但不限于吸附至固相、分入液相、或直接冷凝。在一些實施方式中，在蒸氣的露點以上對稀釋的異戊ニ烯蒸氣流進(jìn)行膜富集，從而引起液體異戊ニ烯的冷凝。異戊ニ烯的回收可以包括一個步驟或多個步驟。在一些實施方式中，從發(fā)酵廢氣中獲取異戊ニ烯蒸氣和將異戊ニ烯轉(zhuǎn)化為液相是同時進(jìn)行的。例如，可以從廢氣流中直接冷凝異戊ニ烯以形成液體。在一些實施方式中，從發(fā)酵廢氣中獲取異戊ニ烯蒸氣和將異戊ニ烯轉(zhuǎn)化為液相是依次進(jìn)行的。例如，可以使異戊ニ烯吸附至固相，然后使用溶劑從固相提取。在一些實施方式中，本文描述的任意方法還包括純化異戊ニ烯。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化使用本發(fā)明的組合物和方法生產(chǎn)的異戊ニ烯。純化是指這樣的過程通過該過 程將異戊ニ烯與生產(chǎn)異戊ニ烯時存在的ー種或多種成分分離開。在一些實施方式中，以基本上純的液體形式獲得異戊ニ烯。純化方法的實例包括(i)在液體提取劑中從溶液中蒸餾；和(ii)色譜。如本文使用的“純化的異戊ニ烯”意思是已經(jīng)與生產(chǎn)異戊ニ烯時存在的ー種或多種成分分離的異戊ニ烯。見例如，美國專利申請
發(fā)明者C·L·萊福, D·H·韋爾斯, J·V·米勒, R·R·博特, Z·Q·貝克 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司