專利名稱：：用酶處理底物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用酶水解水溶液或懸液中的植物材料的方法。
背景技術(shù)：
：對(duì)水溶液或懸液中的植物材料的酶水解受廣泛應(yīng)用，且其可涉及添加單一酶或同時(shí)添加兩種或更多種酶。一個(gè)實(shí)例是用淀粉水解酶如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶處理含淀粉原材料以供產(chǎn)生第一代生物乙醇。另一個(gè)實(shí)例是用酶如纖維素酶和半纖維素酶處理木素纖維素生物質(zhì)以供產(chǎn)生第二代生物乙醇。通常，在一個(gè)位置產(chǎn)生酶，而植物材料的處理發(fā)生在不同位置，因此需要運(yùn)輸所述酶，并將其維持一定時(shí)間。若酶為液體形式，通常需要添加穩(wěn)定劑如多元醇，從而增加了生產(chǎn)成本，且水和穩(wěn)定劑的重量增加了運(yùn)輸和處理成本。使用固體產(chǎn)物是有吸引力的，因?yàn)檫@賦予了較佳的穩(wěn)定性，并包含很少或不包含水，從而具有減少的運(yùn)輸成本，而且固體形式的酶可以以較低成本產(chǎn)生，例如，通過(guò)噴霧干燥和/或流化床干燥。然而，噴霧干燥粉末在處理的安全性和粘合粉末的可流動(dòng)性(flowability)方面具有一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)。此外，制備均一的粘合粉末的共混物是困難和昂貴的?；蛘?，可將酶提供為低粉化顆粒(low-dustinggranulate)，但顆粒化增加成本。
發(fā)明內(nèi)容上述提及的缺點(diǎn)可通過(guò)將酶以封閉容器(如紙袋或紙板盒)中的固體形式(例如，作為噴霧干燥粉末)遞送來(lái)克服，在方法中，將其直接添加至植物材料的溶液或懸液(即，添加整個(gè)盒/袋)。該酶在與所述水溶液或懸液接觸后即溶解，且所述容器在潮濕形式下可變得可滲透，或其可由于潤(rùn)濕而溶解或崩解(例如，PVA或紙袋或紙板盒)，或由于攪拌器的機(jī)械作用而溶解或崩解。同樣，所述容器的材料(例如紙板中的纖維素)可通過(guò)酶(例如纖維素酶)的作用而降解。封閉容器的添加會(huì)盡可能降低處理過(guò)程中粉塵的形成，且可以用不同的酶粉末填充所述容器，而無(wú)需將粉末均一化。因此，本發(fā)明提供了水解植物材料的方法，包括a)制備植物材料的水溶液或懸液，b)添加一個(gè)或多個(gè)封裝了大量顆粒的容器，所述顆粒包含一種或多種對(duì)植物材料具有水解活性的酶，容器的添加使得酶釋放至所述溶液或懸液，和c)溫育所述溶液或懸液從而水解植物材料。此外，本發(fā)明提供了用于本方法的容器，其包含大量具有葡糖淀粉酶活性的顆粒。具體實(shí)施例方式植物材料的水解本發(fā)明特別適于產(chǎn)生第一或第二代生物乙醇。因此，所述植物材料可具體地包含木素纖維素生物質(zhì)，或其可包含含淀粉材料。任選地，可發(fā)酵水解的植物材料，即添加發(fā)酵生物(如酵母)，并進(jìn)行溫育從而在水解步驟過(guò)程中或之后形成發(fā)酵產(chǎn)物。所述發(fā)酵產(chǎn)物可具體為生物燃料產(chǎn)物如乙醇和丁醇。所述發(fā)酵可在常規(guī)使用的條件下進(jìn)行。優(yōu)選的發(fā)酵方法是厭氧方法。對(duì)于乙醇產(chǎn)生，發(fā)酵可在一個(gè)實(shí)施方案中持續(xù)6至120小時(shí)，特別是M至96小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵在25至40°C的溫度進(jìn)行，優(yōu)選28至35°C，如30至34°C，且特別是32°C左右。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始發(fā)酵時(shí)的pH是在pH3至6的范圍，優(yōu)選pH4至5左右。在發(fā)酵之后，可從發(fā)酵漿料分離發(fā)酵生物，并將其再循環(huán)至發(fā)酵介質(zhì)。在發(fā)酵之后，可從發(fā)酵介質(zhì)分離發(fā)酵產(chǎn)物?？烧麴s發(fā)酵溶液或漿料以提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物，或可從發(fā)酵介質(zhì)通過(guò)微過(guò)濾或膜過(guò)濾技術(shù)提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物?；蛘撸霭l(fā)酵產(chǎn)物可通過(guò)汽提(stripping)回收。用于回收的方法在本領(lǐng)域是公知的。底物溶液或懸液可具有至少lm3，特別是至少5m3，至少IOm3或至少25m3的體積。因此所述底物溶液或懸液可納入具有所述體積的罐或容器中。酶顆粒所述酶顆粒通常包括通過(guò)發(fā)酵微生物制備的酶，且它們可通過(guò)噴霧干燥和/或流化床干燥來(lái)產(chǎn)生。在干燥之前，可對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行滅菌以殺滅活微生物細(xì)胞，和/或純化發(fā)酵液以去除生物質(zhì)，例如，通過(guò)過(guò)濾、離心和/或絮凝來(lái)進(jìn)行。出于節(jié)約成本的原因，可將含有微生物細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片的培養(yǎng)液直接干燥，例如WOOlAMll中所述。所述酶顆粒(例如噴霧干燥粉末)通常具有低于2mm的平均顆粒大小(重均)，例如在5-200μm的范圍。酶顆粒通常具有低于lg，特別是低于lOOmg，低于IOmg或低于Img的平均質(zhì)量。所述具有針對(duì)植物材料的水解活性的酶是類型EC3.-.-.-的水解酶。EC編號(hào)在來(lái)自NC-IUBMB，1992的酶命名法EnzymeNomenclature的手冊(cè)或互聯(lián)網(wǎng)上的ENZYME站點(diǎn)http//www,expasy.ch/enzyme/中定義。容器用于酶顆粒的容器可為從水溶性或可分散型包裝材料例如紙、紙板、聚乙烯醇或水溶性纖維素或淀粉衍生物制成的袋或盒?？墒褂秒p重容器，例如紙板盒中的紙袋。將容器以封閉形式添加至底物溶液或懸液，以避免粉塵形成。每個(gè)用酶顆粒填充的容器通常會(huì)具有至少1kg，例如至少^g，至少10kg，至少15kg,至少20kg，至少25kg，至少100kg或至少500kg的質(zhì)量。所述容器包含含酶顆粒，并任選地，其還可含有對(duì)于酶為惰性的顆粒，例如其他可用于所述方法的組分，例如酶輔因子如鈣或其他二價(jià)陽(yáng)離子，例如，其量按重量計(jì)低于75%，特別是低于50%或低于25%。所述酶顆?？砂辽賥/w，特別是至少5%，至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少75%，至少80%或至少90%的酶蛋白。淀粉水解在植物材料包含淀粉的情況下，所述水解酶可選自糖酶，例如糖苷酶(EC3.2)，如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)和葡聚糖1，4_α-葡糖苷酶(葡糖淀粉酶；淀粉葡糖苷酶，EC3.2.1.3)。具體而言，所述酶顆?？梢砸灾辽?.lAGU/g的活性包含葡糖淀粉酶和/或以至少0.02FAU-F/g的活性包含α-淀粉酶。AGU單位定義于W004/080923，而FAU-F單位定義于W02009/094614。所述α-淀粉酶可為細(xì)菌的或真菌的。含淀粉材料的液化和糖化含淀粉植物材料可通過(guò)用α-淀粉酶的液化繼以用葡糖淀粉酶的糖化和任選地用發(fā)酵生物(如酵母)的發(fā)酵來(lái)處理，例如，如1096/^28567中所述。糖化和發(fā)酵可順次進(jìn)行，其中對(duì)于糖化有單獨(dú)的保持階段，或它們可同時(shí)進(jìn)行，意味著糖化酶和發(fā)酵生物可同時(shí)添加。當(dāng)發(fā)酵與水解/糖化同時(shí)進(jìn)行時(shí)，溫度優(yōu)選為25至40°C，優(yōu)選28至35°C如30至;M°C，特別是當(dāng)發(fā)酵生物是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株而所需發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇時(shí)，溫度為32°C左右。其他發(fā)酵產(chǎn)物可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適于所述發(fā)酵生物的溫度進(jìn)行發(fā)酵。所述發(fā)酵產(chǎn)物，如特別是乙醇，可任選地在發(fā)酵之后回收，例如通過(guò)蒸餾回收。液化優(yōu)選在α-淀粉酶，優(yōu)選細(xì)菌α-淀粉酶或酸性真菌α-淀粉酶的存在下進(jìn)行。發(fā)酵生物優(yōu)選為酵母，優(yōu)選為酵母屬(Saccharomyces)菌株。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法在步驟(i)之前還包括下述步驟χ)減少含淀粉材料的顆粒大小，優(yōu)選通過(guò)磨制。y)形成漿料，其包含含淀粉材料和水。所述水性漿料可含有10-55Wt%干固體，優(yōu)選25-45wt%干固體(DS)，更優(yōu)選30-40%干固體的含淀粉材料。將所述漿料加熱至糊化溫度以上，并可添加α-淀粉酶，優(yōu)選細(xì)菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(稀化(thinning))。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)中進(jìn)行α-淀粉酶處理之前可噴射蒸煮(jet-cook)所述漿料以進(jìn)一步糊化漿料。來(lái)自未經(jīng)糊化的含淀粉材料的發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生可從含淀粉材料不經(jīng)該含淀粉材料的糊化(常常稱作“烹制(cook)”)來(lái)產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，例如，如US4316956中所述。所需的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇，可不經(jīng)對(duì)含有含淀粉材料的水性漿料的液化來(lái)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括在低于初始糊化溫度下糖化(例如，磨制)含淀粉材料，例如顆粒淀粉，優(yōu)選存在α-淀粉酶和/或糖原生成酶，以產(chǎn)生可由合適的發(fā)酵生物發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物的糖。在該實(shí)施方案中，所需發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇，是從未經(jīng)糊化的(即，未烹制的)優(yōu)選磨制的玉米產(chǎn)生的。因此，該方面涉及從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括下述步驟(a)在低于含淀粉材料的初始糊化溫度的溫度糖化所述含淀粉材料，(b)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。步驟(a)和(b)可同時(shí)進(jìn)行(即，單步發(fā)酵)或順次進(jìn)行。所述方法可作為分批或作為連續(xù)方法進(jìn)行。所述發(fā)酵方法可在超濾系統(tǒng)中進(jìn)行，其中使?jié)B余物在固體、水和發(fā)酵生物的存在下進(jìn)行再循環(huán)，且其中滲透物為含有所需發(fā)酵產(chǎn)物的液體。同樣涵蓋了下述情況在具有超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中進(jìn)行所述方法，且其中使?jié)B余物在固體、水和發(fā)酵生物的存在下保持再循環(huán)，且其中滲透物為含有所需發(fā)酵產(chǎn)物的液體。細(xì)菌α-淀粉酶所述細(xì)菌α-淀粉酶可來(lái)源于芽孢桿菌屬(Bacillus)，例如來(lái)源于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)。具體5實(shí)例包括W099/19467中示于SEQIDNO4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，W099/19467中示于SEQIDNO5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶和W099/19467中示于SEQIDNO3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(所有序列通過(guò)提述并入本文)。真菌α-淀粉酶真菌α-淀粉酶包括來(lái)源于曲霉屬(Aspergillus)菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)禾口川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。優(yōu)選的酸性真菌α-淀粉酶是Fimgamyl樣α-淀粉酶，其來(lái)源于顯示與1096/^23874中示于SEQIDNO10的氨基酸序列的成熟部分具有高同一性，即至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性的米曲霉菌株。另一個(gè)優(yōu)選的酸性α-淀粉酶來(lái)源于黑曲霉的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶為來(lái)自黑曲霉的α-淀粉酶，其作為“AMYA_ASPNG”以原始登錄號(hào)P56271公開(kāi)于Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中，并描述于W089/01969(實(shí)施例3-通過(guò)提述并入本文)。來(lái)源于黑曲霉的商業(yè)上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP^8(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。其他涵蓋的野生型α-淀粉酶包括來(lái)源于根毛霉屬(lihizomucor)和多孔菌屬(Meripilus)的菌株，優(yōu)選微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178通過(guò)提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilusgiganteus)菌株的那些α-淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶來(lái)源于川地曲霉，由Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298"Molecular-cloninganddeterminationofthenucIeotide-sequenceofageneencodinganacid-stableα-amylasefromAspergilluskawachii”公開(kāi)，并進(jìn)一步作為EMBL:#AB008370公開(kāi)。所述真菌α-淀粉酶也可為包含淀粉結(jié)合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非雜合體)，或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述野生型α-淀粉酶來(lái)源于川地曲霉的菌株。葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶可來(lái)源于任何合適的來(lái)源，例如來(lái)源于微生物或植物。優(yōu)選的葡糖淀粉酶是真菌或細(xì)菌來(lái)源的，例如選自下組曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBOJ.3(5):1097-1102)，或其變體，如公開(kāi)于W012/00381，W000/04136和W001/04273(來(lái)自Novozymes，Denmark)的那些；公開(kāi)于W084/(^921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55(4)941-949)，或其變體或片段。其他曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的變體G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8，575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301:275-281)；二硫鍵、A246C(Fierobe等，1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置導(dǎo)入Pro殘基(Li等，1997，ProteinEng.10:1199-1204)。其他的葡糖淀粉酶包括羅耳阿太菌(之前表示為羅耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(參見(jiàn)美國(guó)專利4，727，026號(hào)和Nagasaka等，1998,"Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticiumrolfsii,ApplMicrobiolBiotechnol50:323-330)，以及踝節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特別是來(lái)源于埃莫森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(WO99/28448),TalaromycesIeycettanus(美國(guó)專利Re.32，153號(hào))、杜邦踝節(jié)菌(Talaromycesduponti)和嗜熱踝節(jié)菌(Talaromycesthermophilus)(美國(guó)專利4，587，215號(hào))的。涵蓋的細(xì)菌葡糖淀粉酶包括來(lái)自梭菌屬(Clostridium)，特別是熱解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)禾口熱it化S梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(W086/01831)以及瓣環(huán)栓菌(Trametescingulata)，紙質(zhì)大紋飾孢菌(Pachykytosporapapyracea)，以及大白樁菇(Leucopaxillusgiganteus)的葡糖淀粉酶，其均披露于W02006/06^89；或?yàn)閬?lái)自W02007/1M^5中公開(kāi)的紅邊隔孢伏革菌(Peniphorarufomarginata)的葡糖淀粉酶，或其混合物。涵蓋的還有雜合葡糖淀粉酶。所述雜合葡糖淀粉酶的實(shí)例公開(kāi)于W02005/045018。具體實(shí)例包括實(shí)施例1表1和4中公開(kāi)的雜合葡糖淀粉酶(該雜合體通過(guò)提述并入本文)。木素纖維素生物質(zhì)的水解將含木素纖維素材料轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇，具有下述優(yōu)點(diǎn)大量原材料現(xiàn)成可得，包括木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物、城市固體廢物等。含木素纖維素材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，并常常稱作“生物質(zhì)”。木素纖維素的結(jié)構(gòu)并不直接易受(accessible)酶水解。因此，優(yōu)選預(yù)處理所述含木素纖維素材料，例如，通過(guò)在充分的壓力和溫度條件下進(jìn)行酸水解，以打斷木質(zhì)素封閉(seal)并擾亂纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，以導(dǎo)致半纖維素和纖維素級(jí)分的溶解。然后可通過(guò)酶法水解纖維素和半纖維素，例如通過(guò)纖維素分解酶進(jìn)行水解，以將糖聚合物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖，其可發(fā)酵為所需的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇。任選地，所述發(fā)酵產(chǎn)物可通過(guò)例如蒸餾來(lái)回收。因此，從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法可包括下述步驟(a)預(yù)處理含木素纖維素材料；(b)水解所述材料；(c)用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。水解步驟(b)和發(fā)酵步驟(C)可順次進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟作為SHF或HHF工藝步驟進(jìn)行，其在下文中進(jìn)一步描述。預(yù)處理可在水解和/或發(fā)酵之前對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在發(fā)酵之前和/或過(guò)程中水解經(jīng)預(yù)處理的材料，優(yōu)選通過(guò)酶法水解。預(yù)處理的目的是分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，且這種方式改進(jìn)了酶法水解的速率。預(yù)處理步驟(a)可為本領(lǐng)域中已知的常規(guī)的預(yù)處理步驟。預(yù)處理可在水性漿料中進(jìn)行。在預(yù)處理過(guò)程中，所述含木素纖維素材料可以以IO-SOwt%的量，優(yōu)選20-50wt%的量存在。水解和發(fā)酵水解和發(fā)酵可作為同時(shí)水解和發(fā)酵步驟(SSF)進(jìn)行。一般而言這意味著在適于，優(yōu)選最適于所述發(fā)酵生物的條件(例如溫度和/或PH)下進(jìn)行組合的/同時(shí)水解和發(fā)酵。水解和發(fā)酵亦可作為混合的水解和發(fā)酵來(lái)進(jìn)行。HHF通常起始于單獨(dú)的部分水解步驟，并終止于同時(shí)水解和發(fā)酵步驟。單獨(dú)的部分水解步驟是酶法纖維素糖化步驟，通常在適于，優(yōu)選最適于所述水解酶的條件下(例如在更高溫度)進(jìn)行。后續(xù)的同時(shí)水解和發(fā)酵步驟通常是在適于所述發(fā)酵生物的條件下(在常常為比單獨(dú)的水解步驟更低的溫度)進(jìn)行的。水解和發(fā)酵亦可作為單獨(dú)的水解和發(fā)酵進(jìn)行，其中在起始發(fā)酵之前將水解進(jìn)行完全。這常常稱作“SHF”。纖維素酶當(dāng)植物材料包含木素纖維素生物質(zhì)時(shí)，酶可包含纖維素酶和/或半纖維素酶。所述纖維素酶可包含纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)，例如纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，特別是內(nèi)切葡聚糖酶I和/或II(EG-IjEG-II)、纖維二糖水解酶I和/或II(CBH-I，CBH-II)和/或β-葡糖苷酶。為了有效地消化纖維素和半纖維素，應(yīng)使用幾種類型的酶協(xié)同作用，所述酶一般包括至少三類酶以將纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，其隨機(jī)切割纖維素鏈；纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)，其從纖維素鏈末端剪切纖維二糖基單元；和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，其將纖維二糖和可溶性纖維糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在這三類涉及纖維素生物降解的酶中，纖維二糖水解酶是用于降解天然微晶纖維素的關(guān)鍵酶。術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶I”是纖維素1，4-β-纖維二糖苷酶(亦稱作外切葡聚糖酶，外切纖維二糖水解酶或1，4-β-纖維二糖水解酶)活性，如定義于酶分類EC3.2.1.91，其催化纖維素和纖維四糖中1，4-β-D-糖苷鍵的水解，即從鏈的非還原端釋放纖維二糖。術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶II活性”的定義是相同的，但纖維二糖水解酶II從鏈的還原端攻擊。內(nèi)切葡聚糖酶(ECNo.3.2.1.4)催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉中的l，4-i3-D-糖苷鍵，混合β_1，3葡聚糖如谷物β-D葡聚糖或木葡聚糖和其他含有纖維素部分的植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解。正式名稱為內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，但縮略術(shù)語(yǔ)內(nèi)切葡聚糖酶用于本說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述淀粉酶活性可來(lái)源于真菌來(lái)源，如木霉屬(Trichoderma)菌株，優(yōu)選里氏木霉(Trichodermareesei)菌株；腐質(zhì)霉屬(Humicola)菌株，如特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)菌株；或金孢子菌屬(Chrysosporium)的菌株，優(yōu)選ChrysosporiumIucknowense的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素酶制備物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A)，優(yōu)選為W02005074656中所公開(kāi)的。所述纖維素酶制備物還可包含β_葡糖苷酶，如US60/832，511中公開(kāi)的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素酶制備物還包含CBHII，優(yōu)選土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纖維二糖水解酶IICEL6A。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素酶制備物還包含來(lái)源于里氏木霉的纖維素酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素酶制備物是用于實(shí)施例1中的纖維素酶制備物A，并公開(kāi)于W02008/151079。可添加纖維素水解酶以供水解經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料。纖維素水解酶可以以0.1-100FPU每克總固體(TS)，優(yōu)選0.5-50FPU每克TS,特別是1-20FPU每克TS的范圍施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將至少0.Img纖維素水解酶每克總固體(TS)，優(yōu)選至少3mg纖維素水解酶每克TS，如5至IOmg纖維素水解酶每克TS用于水解。FPU單位定義于W02009/052500。半纖維素酶可使用任何適用于水解半纖維素，優(yōu)選水解為木糖的半纖維素酶。優(yōu)選的半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶或其中兩個(gè)或更多個(gè)的混合物。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的半纖維素酶是外作用的半纖維素酶，且更優(yōu)選地，所述半纖維素酶是在低于PH7，優(yōu)選PH3-7的酸性條件下具有水解半纖維素的能力的外作用的半纖維素酶。適用于本發(fā)明的半纖維素酶的實(shí)例包括VISC0ZYME(可從NovozymesA/S，Denmark獲得)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述半纖維素酶是木聚糖酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述木聚糖酶可優(yōu)選為微生物來(lái)源，如真菌來(lái)源(例如，木霉屬、多孔菌屬(Meripilus)、腐質(zhì)霉屬、曲霉屬、鐮孢屬(Fusarium))或來(lái)自細(xì)菌(例如，芽孢桿菌屬(Bacillus))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述木聚糖酶來(lái)源于絲狀真菌，優(yōu)選來(lái)源于曲霉屬，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的菌株，或腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可優(yōu)選為內(nèi)-I，4-β-木聚糖酶，更優(yōu)選GHlO或GHl1的內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶。商業(yè)木聚糖酶的實(shí)例包括來(lái)自NovozymesA/S,Denmark的SHEARZYME和BIOFEEDWHEAT。所述半纖維素酶可以以有效水解半纖維素的量添加，如，以約0.001到0.5wt%總固體(TQ，更優(yōu)選約0.05到0.5wt%TS的量添加。木聚糖酶可以以0.001-1.Og/kg干物質(zhì)(DM)底物的量，優(yōu)選以0.005-0.5g/kgDM底物的量，且最優(yōu)選以0.05-0.10g/kgDM底物的量添加。實(shí)施例實(shí)施例1在此實(shí)施例中，如W02008/141133實(shí)施例1中所述施用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。將1.5kg包含lAGU/g和0.1625FAU-F/g或包含30-50%酶蛋白的噴霧干燥酶組合物包裝于紙袋中，并將其密封。AGU和FAU-F測(cè)定法描述于W02008/141133。通過(guò)將10000kg粉碎的黃色臼齒型玉米(具有約0.5mm的平均顆粒大小)在40m3發(fā)酵容器(配置有攪拌葉片)中添加至15000kg自來(lái)水來(lái)形成漿料。對(duì)該混合物補(bǔ)充75Llg/L青霉素和25kg尿素。用NaOH將該漿料的pH調(diào)整至4.5(在調(diào)整之前的初始pH為約3.8)。該漿料的干固體(DS)為35%wt。將密封紙袋中的1.5kg噴霧干燥的酶(等于0.4AGU+0.065FAU每gDS)施用于該漿料，即將所述袋直接添加入所述漿料。將所述漿料攪拌120分鐘以允許紙袋崩解和酶作用于底物。將500L酵母繁殖物添加至漿料。在32°C進(jìn)行同時(shí)糖化和發(fā)酵70小時(shí)，接著使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適方法回收乙醇。實(shí)施例2在此實(shí)施例中，如W02009/003167實(shí)施例1中所述施用纖維素酶制備物。將1000kg包含W02009/003167中所述的纖維素酶制備物A的噴霧干燥的酶粉末包裝于密封的紙板盒中，每盒含有25kg酶粉末。所述噴霧干燥的粉末包含大約50-80%w/w酶蛋白。在依照NREL(TP-510_3M38，2002年6月)的過(guò)程中預(yù)處理玉米秸稈。由經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCQ和水形成了具有20%干固體的3000噸漿料。將漿料加熱至50°C，并進(jìn)料于3596m3配置有攪拌器的糖化容器。將IOOOkg的噴霧干燥的纖維素酶粉末包裝于密封的25kg紙板盒，并將紙板盒直接添加至漿料。相對(duì)于底物干固體(此)的酶劑量是在1-20FPU每克DS或l-2500mgEP(酶蛋白)/kgDS的范圍。FPU測(cè)定法描述于W02009/003167。盒在PCS中崩解。允許酶在50°C水解PCS36小時(shí)。然后將漿料冷卻并進(jìn)料于發(fā)酵罐。添加酵母，并在32°C進(jìn)行發(fā)酵72小時(shí)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適方法回收乙醇。權(quán)利要求1.一種水解植物材料的方法，包括a)制備植物材料的水溶液或懸液，b)添加一個(gè)或多個(gè)封裝了大量顆粒的容器，所述顆粒包含一種或多種對(duì)植物材料具有水解活性的酶，容器的添加使得酶釋放至所述溶液或懸液，和c)溫育所述溶液或懸液從而水解所述植物材料。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述容器材料包含水溶性或可分散的包裝材料。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述容器材料包含紙、紙板、聚乙烯醇或水溶性纖維素或淀粉衍生物。4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述酶顆粒通過(guò)噴霧干燥和/或流化床干燥制備。5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在其中裝有酶顆粒的容器具有超過(guò)Ikg的質(zhì)量。6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中酶顆粒具有低于Ig的平均質(zhì)量。7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述容器裝有至少兩種包含不同酶的顆粒。8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中溫育發(fā)生于配備有攪拌的罐中。9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述植物材料包含淀粉，且所述酶具有α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶活性。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述酶顆粒包含至少0.lAGU/g活性的α-淀粉酶和/或至少0.02FAU-F/g活性的葡糖淀粉酶。11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物材料包含木素纖維素生物質(zhì)，且所述酶包含纖維素酶和/或半纖維素酶。12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述顆粒按重量計(jì)包含至少酶蛋白。13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其還包括在步驟c)過(guò)程中或之后添加發(fā)酵生物并進(jìn)行溫育以形成發(fā)酵產(chǎn)物。14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。15.用于權(quán)利要求1-10或12-14中任一項(xiàng)的方法的容器，其包含大量具有葡糖淀粉酶活性的顆粒。全文摘要在用酶水解水溶液或懸液中的植物材料的方法中，酶以封閉容器(如紙袋或紙板盒)中的固體形式(例如作為噴霧干燥粉末)遞送，該酶在該方法中直接添加(即，添加整個(gè)盒/袋)。本發(fā)明特別適于產(chǎn)生第一或第二代生物乙醇。文檔編號(hào)C12P7/06GK102471784SQ201080030540公開(kāi)日2012年5月23日申請(qǐng)日期2010年7月7日優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日發(fā)明者O.西蒙森申請(qǐng)人:諾維信公司