專利名稱：：心臟組織來源細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用人心臟組織來源細(xì)胞修復(fù)受損心肌的方法和組合物。具體地講，本發(fā)明提供使用不表達(dá)端粒酶的擴(kuò)增的人心臟組織來源細(xì)胞修復(fù)受損心肌的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：在美國，急性心肌梗塞(AMI)是死亡的主要原因。AMI由心臟區(qū)域突發(fā)持久地缺乏血流導(dǎo)致，通常是冠狀動脈變窄而引發(fā)的。供血不足時，組織會出現(xiàn)缺血，從而導(dǎo)致肌細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)的死亡。該壞死組織區(qū)域稱為梗死部位，并將最終成為疤痕組織。剩余的心肌細(xì)胞不能再造壞死組織，心臟功能隨時間推移而惡化。惡化的形式可以是與受損心肌重塑相關(guān)的心肌功能的喪失。急性心肌梗塞的一些當(dāng)前療法主要做法是溶栓或者血管成形術(shù)，以打開凝塊血管，并恢復(fù)對梗死部位的供血。這些治療可有效地減小梗死部位面積,并改善心臟收縮功能，但不會逆轉(zhuǎn)與受損心肌重塑相關(guān)的心肌功能的喪失。其他療法，例如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和β-阻滯劑也可改善整體功能和存活率。然而，這些藥物的治療效果僅可使急性心肌梗塞后的患者的存活率提高不到5%。細(xì)胞移植可能是急性心肌梗塞的另一種潛在療法。例如，Orlic等人(Nature410:701-705(2001))報道了將Lin_c_kit+骨髓細(xì)胞注射至受損心肌。Orlic等人聲稱“我們的研究表明，局部遞送骨髓細(xì)胞可從頭生成心肌，從而改善冠狀動脈疾病的結(jié)局。(Ourstudiesindicatethatlocallydeliveredbonemarrowcellscangeneratedenovomyocardium,amelioratingtheoutcomeofcoronaryarterydisease·)，，。又如，Nygren等人(NatureMedicine10:494-501(2004))聲稱“我們證實，未分級的骨髓細(xì)胞及純化的造血干細(xì)胞和袓細(xì)胞群體可有效地移植到梗死的心肌內(nèi)。然而移植物移入是短暫行為，實際上是造血性質(zhì)的。相比之下，在梗死的心肌外部較少頻率地觀察到的骨髓來源的心肌細(xì)胞，這些細(xì)胞僅通過細(xì)胞融合而產(chǎn)生。(Weshowthatunfractionatedbonemarrowcellsandapurifiedpopulationofhematopoieticstemandprogenitorcellsefficientlyengraftwithintheinfarctedmyocardium.Engraftmentwastransient,however,andhematopoieticinnature.Incontrast,bonemarrow-derivedcardiomyocyteswereobservedoutsidetheinfarctedmyocardiumatalowfrequencyandwerederivedexclusivelythroughcellfusion·)，，。然而，骨髓來源的細(xì)胞治療AMI的機(jī)制仍不清楚。例如，Muiry等人(Nature428664-668(2004))聲稱“我們使用局限于心肌細(xì)胞的且遍在表達(dá)的報告轉(zhuǎn)基因來跟蹤145例移植入成年小鼠正常和受損心臟的造血干細(xì)胞的命運。當(dāng)使用這些遺傳技術(shù)跟蹤細(xì)胞命運時，未檢測到造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞，并且與未移植干細(xì)胞的心臟相比，移植干細(xì)胞的心臟未表現(xiàn)出明顯的心肌細(xì)胞增加。這些結(jié)果表明，造血干細(xì)胞不易獲得心臟表型，并對梗死修復(fù)的臨床研究提出了忠告。([W]eusedbothcardiomyocyte-restrictedandubiquitouslyexpressedreportertransgenestotrackthefateofhaematopoieticstemcellsafter145transplantsintonormalandinjuredadultmousehearts.Notransdifferentiationintocardiomyocyteswasdetectablewhenusingthesegenetictechniquestofollowcellfate，andstem-cell-engraftedheartsshowednoovertincreaseincardiomyocytescomparedtosham-engraftedhearts.Theseresultsindicatethathaematopoieticstemcellsdonotreadilyacquireacardiacphenotype,andraiseacautionarynoteforclinicalstudiesofinfarctrepair.)，，。又如，Werner等人(NatureClinicalPracticeCardiovascularMedicine5:78-79(2008))聲稱“然而，關(guān)于最有效的袓細(xì)胞亞群、袓細(xì)胞加強(qiáng)的最好技術(shù)、潛在的作用機(jī)制以及本方法的長期安全性和有效性，仍然有很多問題需要解答。此外，釆用[骨髓細(xì)胞]療法治療AMI患者的數(shù)個試驗產(chǎn)生了陰性結(jié)果，可能是因為AMI后[骨髓細(xì)胞]施用時間安排不一，所使用的袓細(xì)胞制備方法有差異，或二者兼有。(Therearemanyquestions，however,stilltobeansweredwithregardtothemosteffectiveprogenitorcellsubpopulation，thebesttechniqueforprogenitorcellaugmentation，theunderlyingmechanismsofaction，andthelong-termsafetyandeffectivenessofthemethod.Moreover,severaltrialsof[bonemarrowcell]therapyinpatientswithAMIhaveproducednegativeresults，possiblybecauseofvariationinthetimingof[bonemarrowcell]administrationafterAMI，differencesinthemethodsofprogenitorcellpreparationused，orboth.)，，。又如，Balsam等人(Nature428:668-673(2004))聲稱“我們的數(shù)據(jù)表明，即使在受損心臟的微環(huán)境中，富含c-kit的BM細(xì)胞、Lin—c-kit+BM細(xì)胞和c-kit+Thyl.IloLin-Sca-I+長期重建造血干細(xì)胞只經(jīng)歷傳統(tǒng)的造血命運。(Ourdatasuggestthateveninthemicroenvironmentoftheinjuredheart，c—kit—enrichedBMcells，Lin—c_kit+BMcellsandc_kit+ThyI.lloLin-Sca_l+long-termreconstitutinghaematopoieticstemcellsadoptonlytraditionalhaematopoieticfates.)，，。另一種可能的細(xì)胞來源是胚胎干細(xì)胞。例如，Gold等人(W02005090558)公開了從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞系細(xì)胞以用于再生醫(yī)學(xué)的方法。又如，Gold和HassanipouHW02007002136)公開了靈長類多能干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞系細(xì)胞的方法。另一種可能的細(xì)胞來源是心臟袓細(xì)胞。心臟袓細(xì)胞已在人和大鼠心臟中得以鑒定。心臟袓細(xì)胞能自我更新并且具有專能性(multipotent)，可產(chǎn)生所有心肌譜系。例如，美國專利申請US20040126879A1公開了CD31+、CD38+和c_kit—心臟干細(xì)胞治療受損心肌的用途。又如，Oh等人(PNAS100:12313-12318(2003))公開了存在成體心臟來源的心臟袓細(xì)胞，其表達(dá)Sca-UCD31和CD38，并且不表達(dá)CD4、CD8、B220、Gr-UMac-1.TER119、c_kit、Flk-1>e-隹丐粘蛋白、vonWillebrand因子、CD45和CD34。又如，美國專利申請US20080241111A1公開了制備哺乳動物心臟組織來源的細(xì)胞的方法，該細(xì)胞通過以下步驟制備(i)酶法處理來自哺乳動物的心臟組織片段來制得細(xì)胞懸浮液；(ii)通過密度梯度法從所述細(xì)胞懸浮液分離一群心臟組織來源的細(xì)胞；以及(iii)在含有成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)所得的心臟組織來源的細(xì)胞群，然后選擇并分離形成懸浮細(xì)胞球的細(xì)胞。又如，美國專利申請US20080213231A1公開了由來源于人或小鼠骨骼肌組織的多能干細(xì)胞組成的多能干細(xì)胞群；這些多能干細(xì)胞是c-met陰性、Pax-7陰性、Myf_5陰性、MyoD陰性、肌細(xì)胞生成素陰性、M-鈣粘蛋白陰性、⑶105陽性、⑶90陽性、c_kit陰性和⑶45陰性的；在人來源干細(xì)胞的情況下，這些多能干細(xì)胞是CD34陰性的，而在小鼠來源干細(xì)胞的情況下是CD34陽性的；并且這些多能干細(xì)胞群通過單個細(xì)胞的增殖獲得。又如，Laugwitz等人(Nature433:647-653(2005))公開了產(chǎn)后大鼠、小鼠和人心肌中的isll-Γ心臟祖細(xì)胞。又如，Messina等人(CirculationResearch95:911-921,(2004))公開了“從出生后心房或心室人活檢標(biāo)本的傳代培養(yǎng)物以及從鼠心臟中分離生長為自貼壁細(xì)胞團(tuán)(我們稱為“心球”)的未分化細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞具有克隆形成性的(clonogenic)，表達(dá)了干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞抗原/標(biāo)記物，并且顯示具有成體心臟干細(xì)胞的性質(zhì)(isolationofundifferentiatedcellsthatgrowasself-adherentclusters(thatwehavetermed“cardiospheres，，)fromsubculturesofpostnatalatrialorventricularhumanbiopsyspecimensandfrommurinehearts.Thesecellsareclonogenic,expressstemandendothelialprogenitorcellantigens/markers,andappeartohavethepropertiesofadultcardiacstemcells)，，。Messina等人聲稱“新發(fā)育的人和小鼠心肌球顯示表達(dá)了內(nèi)皮標(biāo)記物(KDR(人)/flk-l[小鼠]、⑶-31)和干細(xì)胞標(biāo)記物(CD-34、c-kit、sca-Ι)([N]ewlydevelopinghumanandmousecardiospheresrevealedexpressionofendothelial(KDR(human)/flk-l[mouse],CD-31)andstemcell(CD-34,c-kit,sca-1)markers)”。又如，Smith等人(Circulation115(7):896-908(2007))聲稱“生長在原代培養(yǎng)物中的經(jīng)皮穿刺心內(nèi)膜心肌活檢標(biāo)本可發(fā)育為稱為心球的多細(xì)胞團(tuán)，該心球接種后可產(chǎn)生心球來源的細(xì)胞(CDC)(Percutaneousendomyocardialbiopsyspecimensgrowninprimaryculturedevelopedmulticellularclustersknownascardiospheres,whichwereplatedtoyieldcardiosphere-derivedcells(CDCs))，，。又如，美國專利申請US20070020758公開了分離、擴(kuò)增和保存來自人或動物組織活檢標(biāo)本的心臟干細(xì)胞的方法，以用于心肌或其他器官的細(xì)胞移植和功能修復(fù)。又如，Beltrami等人(Cell114(6):763-776(2003))公開了“存在具有心臟干細(xì)胞性質(zhì)的Lin-c-kitPOS細(xì)胞。它們能自我更新、具有克隆形成性和專能性，從而可產(chǎn)生肌細(xì)胞、平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞(theexistenceofLin-c_kitPOScellswiththepropertiesofcardiacstemcells.Theyareself-renewing,clonogenic,andmultipotent,givingrisetomyocytes,smoothmuscle,andendothelialcells)”。又如，WO2008054819公開了標(biāo)記物isll+/Nkx2.5+/flkl+陽性的心血管干細(xì)胞，以及可沿內(nèi)皮、心臟和平滑肌細(xì)胞系分化的心血管干細(xì)胞。又如，WO2008109839A1公開了包含CXCR4多肽和FIk-I多肽的干細(xì)胞的富集群，其中所述干細(xì)胞能夠分化為表達(dá)Mef2C、GATA-4、心肌蛋白(Myocardin)和Nkx2.5多肽的細(xì)胞。又如，WO2008081457A2公開了分離心臟干細(xì)胞的方法，該方法包括使包含心臟干細(xì)胞的組織與包含分散酶Ii的組合物在足以誘導(dǎo)細(xì)胞解離的條件下接觸，從而分離心臟干細(xì)胞。又如，WO2008058273A2公開了從心房或心室心臟組織獲得哺乳動物干細(xì)胞樣肌源細(xì)胞(MDC)的方法，該方法包括以下步驟從心房或心室心臟組織分離細(xì)胞，形成細(xì)胞懸浮液；并且在包含促分裂原的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，從而形成包含MDC的組合物。又如，WO2008054819A2公開了分離心血管干細(xì)胞的方法，該方法包括使細(xì)胞群與對Isletl、Nkx2.5和flkl有反應(yīng)性的試劑接觸，以及從非反應(yīng)性細(xì)胞分離出反應(yīng)性陽性細(xì)胞。又如，美國專利申請US20070212423A1公開了分離肌源的c-kit_/c-met_心肌細(xì)胞前體細(xì)胞的方法，該方法包括從肌肉細(xì)胞懸浮液分離直徑小于40μm的細(xì)胞；在固體基底上的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞；以及在培養(yǎng)基的懸浮液中分離細(xì)胞；從而分離肌源的c-kit7c-met_心肌細(xì)胞前體細(xì)胞。又如，美國專利申請US20050058633公開了分離的哺乳動物肌源c-kit-/c_met心肌細(xì)胞前體細(xì)胞。又如，WO2004019767公開了分離的具有c_kitneg/CD31+/CD38+并表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的哺乳動物心肌細(xì)胞干細(xì)胞。又如，WO2008083962A1公開了心肌細(xì)胞祖細(xì)胞(CMPC)，其特征在于它們的細(xì)胞表面上具有Sca-I或類Sca-I表位和⑶31。又如，美國專利申請20080213230A1公開了制備富含干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分離細(xì)胞群的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)組織樣品；(b)在所述培養(yǎng)期間，獲得在貼壁成纖維細(xì)胞上遷移的細(xì)胞；(C)對(b)中獲得的一種或多種細(xì)胞進(jìn)行克隆，以產(chǎn)生一種或多種克隆形成性細(xì)胞群；(d)鑒定一種或多種具有所需表型的克隆形成性細(xì)胞群；(e)使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞表面或內(nèi)部標(biāo)記物，通過細(xì)胞分選，從一種或多種步驟(d)中鑒定的克隆形成性細(xì)胞群分離干細(xì)胞或祖細(xì)胞；以及(f)在不含飼養(yǎng)細(xì)胞的調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離的干細(xì)胞或祖細(xì)胞；從而獲得富含干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分離細(xì)胞群。然而，使用心臟祖細(xì)胞的一個障礙是缺乏分離或擴(kuò)增細(xì)胞的有效方法。因此，仍然需要有效分離和擴(kuò)增心臟祖細(xì)胞，以便它們能夠有效治療要評估的受損心肌。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了分離和擴(kuò)增來源于人心臟組織的細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法分離和擴(kuò)增的細(xì)胞不表達(dá)端粒酶，并且可用于治療或修復(fù)受損心肌。本發(fā)明提供了不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞的純化群體。本發(fā)明提供了產(chǎn)生不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a.獲得心臟組織，b.解離心臟組織，c.消化心臟組織以釋放細(xì)胞，d.從釋放的細(xì)胞除去心肌細(xì)胞，以及e.培養(yǎng)剩余的細(xì)胞。在一個實施例中，本發(fā)明提供了治療或修復(fù)患者的受損心肌的方法，該方法包括以下步驟a.獲得不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞群，以及b.以足以治療或修復(fù)受損心肌的量給患者施用人心臟組織來源細(xì)胞群。在一個實施例中，用于治療患者的人心臟組織來源細(xì)胞經(jīng)低溫冷藏。圖I概述了本發(fā)明細(xì)胞的分離程序。獲得細(xì)胞群的方法的細(xì)節(jié)在實例I中進(jìn)行了描述。圖2概述了本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的分離。獲得細(xì)胞初始群體的方法的細(xì)節(jié)在實例I中進(jìn)行了描述。圖3概述了本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的備選分離方法。圖4示出了本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞(hCTC)的形態(tài)。除非另外指明，否則所有圖像均在100倍放大倍數(shù)下示出。分圖a:是示出從預(yù)接種細(xì)胞獲得的細(xì)胞懸浮液的圖像，該細(xì)胞從初始消化獲得。黑色箭頭示出了相亮非貼壁S細(xì)胞；分圖b:黑色箭頭示出了相亮S細(xì)胞團(tuán)。白色箭頭示出了從初始接種獲得的貼壁細(xì)胞(圖像在200倍放大倍數(shù)下示出)；圖c示出了賺接S細(xì)胞培養(yǎng)物而獲得的A2細(xì)胞；圖(1示出了A2細(xì)胞培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)接的相亮S細(xì)胞。圖5示出了接種密度對hCTC生長潛力的影響。X軸表示在來自冷凍瓶的hCTC(Al)和hCTC(S)細(xì)胞混合物接種后培養(yǎng)的天數(shù)。y軸表示hCTC(A3)細(xì)胞的累計總?cè)后w倍增數(shù)。圖6示出了降低的氧水平對hCTC(A3)細(xì)胞生長潛力的影響。圖7示出了大鼠心臟組織來源rCTCA2細(xì)胞(rCTC(A2))的生長潛力。x軸表示在轉(zhuǎn)接來自冷凍瓶的rCTC(S)細(xì)胞后培養(yǎng)的天數(shù)。y軸表示rCTC(A2)細(xì)胞的累計總?cè)后w倍增數(shù)。圖8示出了hCTC(A3)細(xì)胞在低溫冷藏和用潛在施用裝置(由30號注射針組成)進(jìn)行模擬遞送后的回收率和存活率?；厥盏幕罴?xì)胞數(shù)示于左邊的y軸。細(xì)胞存活率示于右邊的y軸。實心菱形描述細(xì)胞存活率；空心正方形描述細(xì)胞回收率。細(xì)節(jié)在實例6中進(jìn)行了描述。圖9示出了rCTC(A2)細(xì)胞在低溫冷藏和用潛在施用裝置(由30號注射針組成)進(jìn)行模擬遞送后的回收率和存活率?；厥盏幕罴?xì)胞數(shù)示于左邊的y軸。細(xì)胞存活率示于右邊的y軸。實心正方形描述通過注射針前的細(xì)胞回收率；實心三角形描述通過注射針前的細(xì)胞存活率；空心正方形描述通過注射針后的細(xì)胞存活率；空心三角形描述通過注射針后的細(xì)胞回收率。細(xì)節(jié)在實例6中進(jìn)行了描述。圖10示出了流式細(xì)胞術(shù)確定的hCTC(A3)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。在每個柱狀圖中，虛線是同種型抗體對照。實線是抗原染色結(jié)果。抗原在各圖中示出。X軸是對數(shù)標(biāo)度的藻紅蛋白(PE)強(qiáng)度。y軸是細(xì)胞計數(shù)。圖11示出了hCTC(A3)細(xì)胞(上面的分圖)和成人真皮成纖維細(xì)胞-NHDF(產(chǎn)品目錄號CC-2511，Lonza，下面的分圖)之間細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的比較。在每個柱狀圖中，X軸是對數(shù)標(biāo)度的PE強(qiáng)度。y軸是細(xì)胞計數(shù)。虛線描述抗體同種型對照。實線是抗原染色結(jié)果。陽性群體的門控基于同種型對照中1%陽性群體進(jìn)行。各個標(biāo)記物在每個柱狀圖中顯不O圖12示出了流式細(xì)胞術(shù)確定的rCTC(A2)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。虛線描述同種型對照。實線是CD31(左邊的分圖)和CD90(右邊的分圖)的抗原染色結(jié)果。圖13示出了定量實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)確定的hCTC(A3)細(xì)胞中心臟特異性基因的基因表達(dá)。細(xì)節(jié)在實例8中進(jìn)行了描述。y軸表示GAPDH的百分比，并且分為下標(biāo)度和上標(biāo)度。下標(biāo)度的范圍是從O至O.01%，上標(biāo)度的范圍是從O.05%至O.15%?？s寫的含義如下=MHC意指肌球蛋白重鏈；心臟TF意指轉(zhuǎn)錄因子；NHDF意指人新生兒真皮成纖維細(xì)胞；h_心臟意指人心臟。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η=3)表示。圖14示出了小鼠心臟組織來源(Α2)細(xì)胞(mCTC(A2))與新生大鼠心肌細(xì)胞(產(chǎn)品目錄號為R357-6W，CellApplication(Austin,TX))的共培養(yǎng)物中小鼠特異性肌球蛋白重鏈(MHC)的表達(dá)上調(diào)。每個樣品中小鼠MHC基因表達(dá)水平以小鼠GAPDH百分比來表示。Y軸表示小鼠GAPDH的百分比?？s寫的含義如下如實例9中所描述，mCTC意指分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的mCTC(A2)細(xì)胞；CM意指心肌細(xì)胞；mCTC+CM意指mCTC與大鼠心肌細(xì)胞CM在分化培養(yǎng)基中的共培養(yǎng)物。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η=3)表示。圖15示出了豬心臟組織來源(A3)細(xì)胞(pCTC(A3))觀察到的生長曲線，該細(xì)胞根據(jù)實例10中描述的方法培養(yǎng)。X軸表示接種后培養(yǎng)的時間。y軸表示累計總?cè)后w倍增數(shù)。圖16示出了流式細(xì)胞術(shù)檢測的pCTC(A3)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。虛線描述同種型對照。實線是⑶90(左上分圖)、⑶105(右上分圖)、豬內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(左下分圖)、CD16(中下分圖)、CD45(右下分圖)的抗原染色結(jié)果。圖17示出了急性心肌梗塞后心臟重塑的示意圖。該示意圖復(fù)制自PfefferM.的AtlasofHeartFailure(《心力衰竭圖集》，ColucciW編輯，1999年)。圖18示出了在已誘導(dǎo)急性心肌梗塞的動物體內(nèi)施用本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞對縮短分?jǐn)?shù)(FS)的影響，如超聲心動描記術(shù)所測定的?？s短分?jǐn)?shù)是每個心動周期中由舒張變?yōu)槭湛s的百分比變化(FS%)，可反映心臟的整體功能。所示數(shù)據(jù)是AMI誘導(dǎo)后5天(D5)或28天(D28)的各個動物中記錄的縮短分?jǐn)?shù)。以X軸上顯示的劑量給動物施用rCTC(A2)細(xì)胞或hCTC(A3)細(xì)胞。圖19示出了在已誘導(dǎo)急性心肌梗塞的動物體內(nèi)施用本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞對局部室壁運動評分(RWMS)的影響，如超聲心動描記術(shù)所測定的。每個被垂直實線分開的分圖是研究中的實驗組。和28D分別反映AMI誘導(dǎo)后5天和28天。RWMS是在以為基線，28D為隨訪情況下測定的。以X軸上顯示的劑量給動物施用rCTC(A2)或hCTC(A3)細(xì)胞。圖20示出了在已誘導(dǎo)急性心肌梗塞的動物體內(nèi)施用本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞對左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)的影響。LVEDD是舒張末期左心室內(nèi)徑的量度。LEVDD在心肌梗塞誘導(dǎo)后5天(5D)和28天(28D)測定。所示數(shù)據(jù)是各個動物的相對變化[(28D-5D)/5D]。以x軸上顯示的劑量給動物施用rCTC(A2)或hCTC(A3)細(xì)胞。圖21示出了對各實驗組中LVEDD相對變化進(jìn)行比較的統(tǒng)計分析。使用單向方差分析(ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗。第I組溶媒；第2組rCTC(A2)細(xì)胞IXIO6個細(xì)胞(目標(biāo)劑量);第3組hCTC(A3)細(xì)胞IXIO4個細(xì)胞(目標(biāo)劑量);第4組hCTC(A3)細(xì)胞IXIO5個細(xì)胞(目標(biāo)劑量);第5組hCTC(A3)細(xì)胞IXIO6個細(xì)胞(目標(biāo)劑量)。圖22示出了施用人心臟組織來源細(xì)胞對左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)的影響。LVESD是每個心動周期中收縮末期心室內(nèi)徑的量度。每個被垂直實線分開的分圖是研究中的實驗組。LVESD在心肌梗塞誘導(dǎo)后5天(5D)和28天(28D)測定。所示數(shù)據(jù)是單個動物在每個時間點的記錄。以X軸上顯示的劑量給動物施用rCTC(A2)或hCTC(A3)細(xì)胞。圖23示出了在出現(xiàn)心肌梗塞的各個動物體內(nèi)施用人心臟組織來源細(xì)胞后第5天和第28天的心臟功能，用超聲心動描記術(shù)測定的四個參數(shù)(FS、RWMS、LVESD、LVEDD)表示。每個黑點描述X軸所示時間點的各個動物的心臟功能。黑色實線示出了每個動物中從至28D的變化趨勢。每個圖描述通過超聲心動描記術(shù)測定的一個參數(shù)。圖24示出了縮短分?jǐn)?shù)和心臟組織來源細(xì)胞劑量之間的相關(guān)性。Y軸是在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第28天相對于第5天的絕對變化(28D-5D)。X軸是線性標(biāo)度的hCTC(A3)劑量。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η=35)表示。圖25示出了LVEDD變化和本發(fā)明的人心臟來源組織劑量之間的相關(guān)性。y軸描述在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第28天相對于第5天的絕對變化(28D-5D)。x軸描述了線性標(biāo)度的hCTC(A3)細(xì)胞劑量。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η=35)表示。圖26示出了施用至患心肌梗塞的動物心臟的hCTC(A3)細(xì)胞的滯留量。滯留量由大鼠心臟中檢測到的β_微球蛋白的表達(dá)水平評估。圖“a”示出了以X軸上顯示的劑量施用后4周時的hCTC(A3)細(xì)胞滯留量。圖“b”示出了hCTC(A3)細(xì)胞滯留量的時間歷程，其中X軸描述細(xì)胞在大鼠MI心臟中施用后的天數(shù)，y軸表示目標(biāo)劑量的百分比。圖“c”示出了使用所檢測細(xì)胞的平均百分比表示的hCTC(A3)細(xì)胞隨著時間過去的滯留量，將細(xì)胞施用后立即檢測的人細(xì)胞數(shù)量設(shè)置為100%。X軸描述細(xì)胞在大鼠MI心臟中施用后的天數(shù)。圖27示出了大鼠MI中hCTC(A3)滯留量和重塑阻止之間的相關(guān)性。左分圖示出了相關(guān)性坐標(biāo)圖。X軸描述對數(shù)標(biāo)度的細(xì)胞數(shù)；y軸描述重塑變化(λLVEDD,28D-5D)。圖中繪制了每個動物施用后4周的細(xì)胞數(shù)及相應(yīng)的ALVEDD。右分圖示出了線性回歸的統(tǒng)計分析。圖28示出了人NuMA(核基質(zhì)抗原)在大鼠心肌中的定位，該心肌已用hCTC(A3)細(xì)胞(目標(biāo)劑量為IXIO6個細(xì)胞)處理。左分圖示出了目標(biāo)劑量為IXlO6的hCTC處理的大鼠心肌在400倍放大下觀察到的陽性人NuMA染色結(jié)果。右分圖示出了溶媒對照動物中的染色結(jié)果。圖29示出了人NuMA在另一個動物中的定位,該動物接受了目標(biāo)劑量為IXIO6的hCTC(A3)細(xì)胞。左上分圖示出了低倍圖像(100倍放大)，該圖示出了兩個NuMA陽性細(xì)胞團(tuán)。右上分圖是NuMA陽性細(xì)胞團(tuán)的高倍圖像(400倍放大)。左下分圖是NuMA陽性細(xì)胞團(tuán)的高倍圖像。右下分圖是示出具有類肌細(xì)胞形態(tài)的NuMA陽性細(xì)胞核的高倍圖像。圖30示出了人和大鼠心肌中觀察到的NuMA的抗體對照染色結(jié)果。上面兩張圖像示出了人心臟中具有高度核特異性(未使同種型對照染色，右分圖)的NuMA陽性染色結(jié)果(左分圖)。下面兩張圖像示出了大鼠心臟對照，表明NuMA抗體對人細(xì)胞具有特異性。圖31示出了hCTC(A3)處理組或溶媒處理組中心肌肥大的記分評估。目標(biāo)劑量示于y軸。接受hCTC(A3)細(xì)胞的動物接受了IX104、1XIO5或IXIO6個細(xì)胞的目標(biāo)劑量。淺灰色區(qū)域示出了整個心臟中非肥大切片的比例。深灰色區(qū)域示出了整個心臟中肥大切片的比例。圖32示出了梗死面積評估。左分圖示出了相對梗死面積(整個左心室區(qū)域中梗死面積的百分比)；右分圖示出了絕對梗死面積。黑點描述每個單獨的動物。組的梗死平均面積以黑色實線示出。圖33示出了hCTC(A3)細(xì)胞處理組或溶媒處理組中毛細(xì)血管密度的染色結(jié)果。接受hCTC(A3)細(xì)胞的動物接受了IX104、1XIO5或IXIO6個細(xì)胞的目標(biāo)劑量。分圖“a”示出了心肌中梗死邊界區(qū)域的毛細(xì)血管密度，如同工凝集素B4染色所檢測的。分圖“b”示出了邊界區(qū)域的毛細(xì)血管密度，如⑶31染色所檢測的。圖34示出了非梗死區(qū)域的肌細(xì)胞密度。分圖“a”示出了來自溶媒處理動物(左分圖)和IXIO5個hCTC(A3)細(xì)胞處理動物(右分圖)的心肌的H&E染色的代表性圖像。分圖“b”示出了心臟非梗死區(qū)域中觀察到的肌細(xì)胞密度，以肌細(xì)胞數(shù)/mm2表示。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η=6)表示；圖c示出了通過Ki-67和肌球蛋白重鏈的雙重染色觀察到的增殖肌細(xì)胞。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η=6)表示。圖35示出了大鼠心肌中響應(yīng)所有目標(biāo)劑量hCTC(A3)細(xì)胞處理的差異表達(dá)基因。圖36示出了hCTC和hMSC細(xì)胞施用對患急性MI的大鼠心臟組織的影響的定量。分圖“a”示出了左心室游離壁中梗死區(qū)域與健康組織的比率。分圖“b”示出了對所有組的動物的心臟中所觀察到的擴(kuò)張的評級。分圖“c”示出了存活心肌。圖37示出了施用hCTC(A3)細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞(產(chǎn)品目錄號PT_2501，Lonza(ffalkersville,MD))對患急性MI的大鼠心臟組織的影響。并列示出了來自每個動物的兩塊切片一塊取自乳頭肌和心房層面之間的中線，并且另一塊取自乳頭肌。左邊兩列來自溶媒處理組；中間兩列來自hMSC處理組(目標(biāo)劑量IXlO6);右邊兩列來自hCTC(A3)細(xì)胞處理組(目標(biāo)劑量IXIO5)。圖38示出了在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第28天，施用hCTC(A3)細(xì)胞對患有急性MI的大鼠的心臟功能的影響。通過超聲心動描記術(shù)測定三個參數(shù)(FS、LVESD、LVEDD)。圖中示出了在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第28天相對于基線(在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第7天)的變化。圖中示出了來自不同供體的三個hCTC(A3)細(xì)胞批次、人真皮成纖維細(xì)胞和pCTC(A3)細(xì)胞。圖39示出了在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第84天，施用hCTC(A3)細(xì)胞對患有急性MI的大鼠的心臟功能的影響。通過超聲心動描記術(shù)測定三個參數(shù)(FS、LVESD、LVEDD)。圖中示出了在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第84天相對于基線(在心肌梗塞且細(xì)胞施用后第7天)的變化。檢查了人真皮成纖維細(xì)胞以及由不同供體制備的三個不同的hCTC(A3)細(xì)胞批次。具體實施例方式將本發(fā)明的具體實施方式部分分成以下幾個分部分，來描述或舉例說明本發(fā)明的某些特征、實施例或應(yīng)用，這是為了使公開內(nèi)容清楚起見，并非限制本發(fā)明。定義如本文所用，術(shù)語“受損心肌”指處于缺血狀態(tài)下的心肌細(xì)胞。這些缺血狀態(tài)可由心肌梗塞或其他心血管疾病或相關(guān)癥狀引起。如本文所用，“急性心肌梗塞”指通常稱為“心臟病發(fā)作”的病癥，其中當(dāng)對心臟部分的供血中斷時，可導(dǎo)致一些心臟細(xì)胞死亡。該病癥的最常見原因是動脈粥樣硬化易損斑塊破裂后發(fā)生冠狀動脈閉塞(阻塞)，所述斑塊是動脈壁中脂質(zhì)(如膽固醇)和白細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞)的不穩(wěn)定集合。如果長時間不治療，所產(chǎn)生的缺血(供血限制)和缺氧可導(dǎo)致心臟肌肉組織(心肌)損壞和/或死亡。如本文所用，術(shù)語“hCTC(S)群體”或“hCTC(S)”指人心臟組織來源細(xì)胞的非貼壁群體，該細(xì)胞群是根據(jù)本發(fā)明的方法在人心臟組織解離、酶法消化以及過濾后經(jīng)細(xì)胞的初始培養(yǎng)而獲得的。如本文所用，術(shù)語“hCTC(Al)群體”或“hCTC(Al)細(xì)胞”指人心臟組織來源細(xì)胞的貼壁群體，該細(xì)胞群是根據(jù)本發(fā)明的方法在人心臟組織解離、酶法消化以及過濾后經(jīng)細(xì)胞的初始培養(yǎng)而獲得的。如本文所用，術(shù)語“hCTC(A2)群體”或“hCTC(A2)細(xì)胞”指hCTC(S)細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)獲得的貼壁細(xì)胞群。如本文所用，術(shù)語“hCTC(A3)群體”或“hCTC(A3)細(xì)胞”指hCTC(S)和hCTC(Al)細(xì)胞的混合物經(jīng)體外培養(yǎng)獲得的貼壁細(xì)胞群。衍牛本發(fā)明細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了產(chǎn)生不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a.獲得心臟組織，b.解離心臟組織，c.消化心臟組織以釋放細(xì)胞，d.從釋放的細(xì)胞除去心肌細(xì)胞，以及e.培養(yǎng)剩余的細(xì)胞。心臟組織可手工解離。作為另外一種選擇，心臟組織可機(jī)械解離。心肌細(xì)胞可通過任何合適的方法從釋放的細(xì)胞除去。例如，心肌細(xì)胞可通過過濾、離心或通過FACS除去。在一個實施例中，過濾由心臟組織消化而釋放的細(xì)胞以除去心肌細(xì)胞。過濾步驟的目的是排除尺寸比本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞大的細(xì)胞。在一個實施例中，本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的直徑為約5微米至約50微米，并且選擇孔徑為50微米的過濾器，以使本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞可通過過濾器。在一個實施例中，將通過過濾器的人心臟組織來源細(xì)胞在體外培養(yǎng)。在一個實施例中，體外培養(yǎng)的人心臟組織來源細(xì)胞在過濾步驟后為非貼壁細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的混合物。本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞可貼附到任何固體基底。在一個實施例中，固體基底是聚碳酸酯。作為另外一種選擇，固體基底可以是聚苯乙烯。作為另外一種選擇，固體基底可以是玻璃。固體基底也可用包含胞外基質(zhì)蛋白(例如膠原或?qū)诱尺B蛋白等)的吸附層包被。初始培養(yǎng)步驟后獲得的本發(fā)明貼壁細(xì)胞在本文中是指人心臟組織來源(Al)細(xì)胞群或hCTC(Al)細(xì)胞。初始培養(yǎng)步驟后獲得的本發(fā)明非貼壁細(xì)胞在本文中是指人心臟組織來源(S)細(xì)胞群或hCTC(S)細(xì)胞。在一個實施例中，hCTC(Al)細(xì)胞通過培養(yǎng)擴(kuò)增。本發(fā)明的hCTC(Al)細(xì)胞可在任何合適的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，在一個實施例中，心臟組織來源細(xì)胞可在補(bǔ)充有1，OOOg/ID-葡萄糖、584mg/lL-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸鈉以及10%FBS的DMEM中培養(yǎng)?？上蚺囵B(yǎng)基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和鏈霉素50μg/ml。作為另外一種選擇，可向心臟組織的解離和酶法消化后獲得的細(xì)胞懸浮液中添加抗生素。本發(fā)明的hCTC(Al)細(xì)胞可以約1，000至約10，000個活細(xì)胞/cm2的接種密度接種在組織培養(yǎng)基底上。本發(fā)明的hCTC(Al)細(xì)胞可在5-20%v/v的大氣氧下培養(yǎng)。在一個實施例中，在細(xì)胞達(dá)到大約80%匯合度后，對本發(fā)明的hCTC(Al)細(xì)胞進(jìn)行傳代。作為另外一種選擇，在細(xì)胞達(dá)到大約90%匯合度后，對本發(fā)明的hCTC(Al)細(xì)胞進(jìn)行傳代。作為另外一種選擇，本發(fā)明的hCTC(Al)細(xì)胞每一至七天傳代一次。在一個實施例中，hCTC(S)細(xì)胞通過培養(yǎng)擴(kuò)增。在一個實施例中，本發(fā)明的hCTC(S)細(xì)胞可在任何合適的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，在一個實施例中，心臟組織來源細(xì)胞可在補(bǔ)充有l(wèi)，000g/lD-葡萄糖、584mg/lL-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸鈉以及10%FBS的DMEM中培養(yǎng)?？上蚺囵B(yǎng)基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和鏈霉素50μg/ml。作為另外一種選擇，可向心臟組織的解離和酶法消化后獲得的細(xì)胞懸浮液中添加抗生素。本發(fā)明的hCTC(S)細(xì)胞可在5-20%v/v的大氣氧下培養(yǎng)。在一個實施例中，組織培養(yǎng)基每三天更換一次。在一個實施例中，hCTC(S)細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的增加變?yōu)橘N壁的。hCTC(S)細(xì)胞變?yōu)橘N壁時的培養(yǎng)時間為約I天至約7天。hCTC(S)細(xì)胞變?yōu)橘N壁后獲得的貼壁細(xì)胞群在本文中稱為人心臟組織來源(A2)細(xì)胞群或hCTC(A2)細(xì)胞。在一個實施例中，hCTC(A2)細(xì)胞通過培養(yǎng)擴(kuò)增。本發(fā)明的hCTC(A2)細(xì)胞可在任何合適的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，在一個實施例中，心臟組織來源細(xì)胞可在補(bǔ)充有1，OOOg/ID-葡萄糖、584mg/lL-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸鈉以及10%FBS的DMEM中培養(yǎng)?？上蚺囵B(yǎng)基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和鏈霉素50μg/ml。作為另外一種選擇，可向心臟組織的解離和酶法消化后獲得的細(xì)胞懸浮液中添加抗生素。本發(fā)明的hCTC(A2)細(xì)胞可以約1，000至約10，000個活細(xì)胞/cm2的接種密度接種在組織培養(yǎng)基底上。本發(fā)明的hCTC(A2)細(xì)胞可在5-20%v/v的大氣氧下培養(yǎng)。在一個實施例中，在細(xì)胞達(dá)到大約80%匯合度后，對本發(fā)明的hCTC(A2)細(xì)胞進(jìn)行傳代。作為另外一種選擇，在細(xì)胞達(dá)到大約90%匯合度后，對本發(fā)明的hCTC(A2)細(xì)胞進(jìn)行傳代。作為另外一種選擇，本發(fā)明的hCTC(A2)細(xì)胞每一至七天傳代一次。在一個實施例中，hCTC(Al)細(xì)胞和hCTC(S)細(xì)胞的混合物通過培養(yǎng)擴(kuò)增。在一個實施例中，hCTC(Al)細(xì)胞和hCTC(S)細(xì)胞的混合物隨著培養(yǎng)時間的增加形成貼壁細(xì)胞群。hCTC(S)細(xì)胞變?yōu)橘N壁時的培養(yǎng)時間為約2天至約14天。hCTC(Al)細(xì)胞和hCTC(S)細(xì)胞的混合物變?yōu)橘N壁后獲得的貼壁細(xì)胞群在本文中稱為人心臟組織來源(A3)細(xì)胞群或hCTC(A3)細(xì)胞。在一個實施例中，hCTC(A3)細(xì)胞通過培養(yǎng)擴(kuò)增。本發(fā)明的hCTC(A3)細(xì)胞可在任何合適的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，在一個實施例中，心臟組織來源細(xì)胞可在補(bǔ)充有1，OOOg/ID-葡萄糖、584mg/lL-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸鈉以及10%FBS的DMEM中培養(yǎng)?？上蚺囵B(yǎng)基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和鏈霉素50μg/ml。作為另外一種選擇，可向心臟組織的解離和酶法消化后獲得的細(xì)胞懸浮液中添加抗生素。本發(fā)明的hCTC(A3)細(xì)胞可以約1，000至約10，000個活細(xì)胞/cm2的接種密度接種在組織培養(yǎng)基底上。本發(fā)明的hCTC(A3)細(xì)胞可在5-20%v/v的大氣氧下培養(yǎng)。在一個實施例中，在細(xì)胞達(dá)到大約80%匯合度后，對本發(fā)明的hCTC(A3)細(xì)胞進(jìn)行傳代。作為另外一種選擇，在細(xì)胞達(dá)到大約90%匯合度后，對本發(fā)明的hCTC(A3)細(xì)胞進(jìn)行傳代。作為另外一種選擇，本發(fā)明的hCTC(A3)細(xì)胞每一至七天傳代一次。獲得本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的一種方法概述于圖I中。獲得本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的備選方法概述于圖2中。獲得本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的備選方法概述于圖3中。本發(fā)明的細(xì)胞可來源于整個心臟的解離及隨后對解離組織的消化。作為另外一種選擇，本發(fā)明的細(xì)胞可來源于部分心臟組織的解離及隨后對解離組織的消化。該部分可得自心臟的任何部分，例如心房或心室、心尖或心臟任何一側(cè)。解離的心臟組織可使用酶(例如膠原酶和分散酶)消化。酶可單獨或者組合使用。在一個實施例中，解離的心臟組織使用膠原酶和分散酶的混合物消化。膠原酶可在約O.lU/ml至約10U/ml的濃度下使用。作為另外一種選擇，膠原酶可在約O.lU/ml至約5U/ml的濃度下使用。作為另外一種選擇，膠原酶可在約5U/ml的濃度下使用。作為另外一種選擇，膠原酶可在約lU/ml的濃度下使用。分散酶可在約O.5U/ml至約50U/ml的濃度下使用。作為另外一種選擇，膠原酶可在約O.5U/ml至約10U/ml的濃度下使用。作為另外一種選擇，膠原酶可在約10U/ml的濃度下使用。作為另外一種選擇，膠原酶可在約5U/ml的濃度下使用。解離的組織可用酶處理約5分鐘至約5小時。作為另外一種選擇，解離的組織可用酶處理約30分鐘至約5小時。作為另外一種選擇，解離的組織可用酶處理約30分鐘至約4小時。作為另外一種選擇，解離的組織可用酶處理約30分鐘至約3小時。作為另外一種選擇，解離的組織可用酶處理約30分鐘至約2小時。作為另外一種選擇，解離的組織可用酶處理約30分鐘至約I小時。在一個實施例中，解離的組織用酶處理約2.5小時。如果需要，可將本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞暴露于(例如)特異性識別心臟組織來源細(xì)胞表達(dá)的蛋白標(biāo)記物的試劑(如抗體)以鑒定和選擇心臟組織來源細(xì)胞，從而獲得基本上純的心臟組織來源細(xì)胞群。本發(fā)明的細(xì)胞本發(fā)明提供了人心臟組織來源細(xì)胞群，該細(xì)胞群不表達(dá)端粒酶，可通過培養(yǎng)維持和擴(kuò)增，并可用于治療和修復(fù)受損心肌。本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞的性質(zhì)匯總于表I中。在一個實施例中，本發(fā)明的不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞表達(dá)以下標(biāo)記物中的至少一種CD49e、CD105、CD59、CD54、CD90、CD34和CD117。在一個實施例中，本發(fā)明的不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞不表達(dá)以下標(biāo)記物中的至少一種:MDR、CD19、CD16、CD31、CD45和Isl-I0在一個實施例中，本發(fā)明的不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞表達(dá)以下標(biāo)記物CD49e、CD105、CD59、CD54、CD90、CD34和CD117。在一個實施例中，本發(fā)明的不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞不表達(dá)以下標(biāo)記物MDR、CD19、CD16、CD31、CD45和Isl-I。在一個實施例中，本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞進(jìn)一步分化為心肌細(xì)胞。該分化可在施用給患者之前或之后發(fā)生。分化是指一種或多種與原始細(xì)胞不同的特性或功能的獲得或擁有程度不斷增大的行為(即細(xì)胞特化)。分化可(例如)通過篩查細(xì)胞的表型變化(即鑒定細(xì)胞的形態(tài)變化和/或細(xì)胞上的表面標(biāo)記物)檢測?？墒褂媚軌蚴贡景l(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的任何方法。例如，本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞還可根據(jù)美國專利申請US20040126879中公開的方法分化為心肌細(xì)胞。又如，本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞還可根據(jù)W02004019767中公開的方法分化為心肌細(xì)胞。治療或修復(fù)受損心肌的方法心肌受損由多種心臟疾病引起,例如急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、充血性心力衰竭等。本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞可用作修復(fù)受損心肌的療法。在一個實施例中，本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞可用作修復(fù)由于急性心肌梗塞而受損的心肌的療法。在一個實施例中，本發(fā)明提供了治療患者的受損心肌的方法，該方法包括以下步驟a.獲得不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞群，以及b.以足以治療受損心肌的量給患者施用人心臟組織來源細(xì)胞群。在一個實施例中，本發(fā)明提供了修復(fù)患者的受損心肌的方法，該方法包括以下步驟a.獲得不表達(dá)端粒酶的人心臟組織來源細(xì)胞群，以及b.以足以修復(fù)受損心肌的量給患者施用人心臟組織來源細(xì)胞群。在一個實施例中，將制備的人心臟組織來源細(xì)胞群施用給患者，而無需培養(yǎng)細(xì)胞。在替代實施例中，在施用給患者前將制備的心臟組織來源細(xì)胞群在體外培養(yǎng)。人心臟組織來源細(xì)胞群在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的情況下，培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞群可以是hCTC(Al)細(xì)胞群。作為另外一種選擇，培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞群可以是hCTC(A2)細(xì)胞群。作為另外一種選擇，培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞群可以是hCTC(A3)細(xì)胞群。本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞可通過本領(lǐng)域中任何合適的方法施用給患有心肌受損的患者。此類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于選擇的。例如，給受損心肌施用本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞可通過受損心肌的直接注射進(jìn)行。作為另外一種選擇，本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞可系統(tǒng)施用。在系統(tǒng)遞送本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞時，可通過以下方法提高細(xì)胞遞送至受損心肌的效率例如用至少一種其他試劑處理患者，或采用能夠提高給受損心肌遞送細(xì)胞的另一種方法。例如，本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞可連同另一種選自以下的試劑施用干細(xì)胞因子(SCF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I、青灰因子、血管內(nèi)皮生長因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子和白介素-3。在一個實施例中，根據(jù)美國專利申請US20020061587公開的方法聯(lián)合施用本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞和另一種試劑。在一個實施例中，根據(jù)美國專利申請US2002162796公開的方法聯(lián)合施用本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞和另一種試劑。例如，可通過將患者的心臟循環(huán)與患者的體循環(huán)分離，并且將包含細(xì)胞的溶液灌注至心臟循環(huán)來提高細(xì)胞遞送至受損心肌的效率。該方法的例子在W02007067502中有所公開。在一個實施例中，根據(jù)Iwasaki>Kawamoto等人(Circulation113:1311-1325；2006)公開的方法給患者施用本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞。在替代實施例中，根據(jù)Sherman、Martens等人(NatureClinicalPracticeCardiovascularMedicine3,supplI:S57_64；2006)公開的方法使用可插入冠狀動脈的導(dǎo)管給患者施用本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞。在替代實施例中，使用能夠標(biāo)測心肌電活動的導(dǎo)管給患者施用本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞。在一個實施例中，根據(jù)Perin、Dohmann等人(Circulation107:2294-2302；2003)和Perin、Silva等人(JournalofMolecularandCellularCardiology44486-495；2008)公開的方法使用能夠標(biāo)測心肌電活動的導(dǎo)管給患者施用本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞。在替代實施例中，根據(jù)Sherman、Martens等人(NatureClinicalPracticeCardiovascularMedicine3,supplIS57-64；2006)公開的方法給患者施用本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞。在替代實施例中，根據(jù)Hashemi、Ghods等人(EuropeanHeartJournal29:251-259；2008)公開的方法使用能夠進(jìn)行心肌內(nèi)注射的導(dǎo)管給患者施用本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步通過如下實例舉例說明，但不受限于如下實例。實例I人心臟組織來源細(xì)胞的分離材料和方法-消化酶混合物制備在本發(fā)明中用于從人心臟分離心臟組織來源細(xì)胞的消化酶混合物制備為溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,Gibco,Invitrogen(Carlsbad,CA))的2X混合物儲液?；旌衔飪σ簼舛葹镺.2U/ml或2U/ml膠原酶(ServaElectrophoresisGmbH(Heidelberg,Germany))和10U/ml分散酶II(RocheAppliedScience(Indianapolis,Indiana))。這些酶混合物儲液保存在_40°C下。在消化前，將酶混合物濾過O.22μm真空過濾系統(tǒng)(CorningIncorporated(Acton,MA))。對于人心臟消化，將2U/ml膠原酶儲液用于消化程序。消化酶的終濃度為lU/ml膠原酶和5U/ml分散酶。整個人心臟消化和人心臟組織來源細(xì)胞(hCTC)分離的方法匯總于圖I中。材料和方法-人心臟整個移植廢棄心臟得自國家發(fā)展研究院(NationalDevelopmentandResearchInstitutes)(NDRI,NewYork,NY)。移植廢棄心臟的獲得時間在40-98小時之間。將整個器官浸入生長培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)中，并且保存在4°C下直到細(xì)胞分離處理為止。材料和方法-人心臟組織處理將整個心臟組織轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，并置于方形生物測定皿(CorningInc.(Acton,MA))內(nèi)。使用無菌解剖刀(BardParker,BectonDickinson(Hancock,NY))除去多余脂肪組織。將整個第一心臟切成小塊(2_3cm3)。然后將四分之三的小組織塊手工切碎成細(xì)塊(尺寸為l_2mm3)。該過程需要兩小時完成。將四分之一組織塊轉(zhuǎn)移至PR0250勻漿器室(ProScientific(Oxford,CT))將封蓋置于室上，并且接上PR0250電機(jī)，電機(jī)的速度設(shè)置為3。在不添加任何緩沖液的情況下將組織塊在室溫下勻漿10秒，并且用肉眼觀察組織。當(dāng)組織切碎時勻漿完成(所得碎片的尺寸小于1mm3)。材料和方法-人組織消化將手工處理和勻漿的組織塊都轉(zhuǎn)移至單獨的250ml錐形試管(CorningInc.(Corning,NY))中。添加IOOml室溫PBS,將每個試管中的組織洗漆三次，每次洗滌時將試管翻轉(zhuǎn)五次。然后將試管直立放置，讓組織沉淀。使用2ml抽吸移液管(BDfalcon,BDBiosciences(SanJose,CA))吸出上清液。將消化酶混合物儲液(2X)添加至250ml試管中，酶與組織的比率為1:1。酶的終濃度為lU/ml膠原酶和5U/ml分散酶II。將裝有組織和酶的試管轉(zhuǎn)移至設(shè)置為225rpm的37°C回旋振蕩器(BarnsteadLab(MelrosePark,IL))中,溫育2.5小時。溫育后,將試管轉(zhuǎn)移回生物安全柜。通過在試管中添加室溫PBS，將細(xì)胞懸浮液稀釋。為了除去任何剩余的未消化組織，將細(xì)胞懸浮液濾過8英寸直徑250μm標(biāo)準(zhǔn)試驗篩(Sigma-Aldrich(St.Louis,M0))至500ml玻璃燒杯中。此步驟后，將玻璃燒杯中的細(xì)胞懸浮液再濾過IOOym細(xì)胞過濾網(wǎng)(BDFalcon)至多個50ml錐形試管(BDFalcon)中。然后使用SorvallLegendT離心機(jī)(ThermoFisherScientific,Inc(Waltham,MA))將細(xì)胞懸浮液在室溫下以338Xg離心5分鐘進(jìn)行洗滌，以沉淀細(xì)胞。將上清液吸出，并且將細(xì)胞沉淀物重懸于PBS中，合并到單獨的50ml試管中，手工切碎方法和勻漿方法各使用一管。用40ml室溫PBS再洗滌細(xì)胞懸浮液三次。洗滌后，將沉淀物重懸于20mlACK裂解緩沖液(Lonza(Walkersville，MD))中，并在室溫下溫育10分鐘，以裂解任何剩余的紅細(xì)胞。溫育后，用40ml室溫PBS再洗滌細(xì)胞懸浮液兩次。最后一次離心后,將沉淀物重懸于20ml室溫生長培養(yǎng)基(DMEM、1，000mg/LD-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸鈉、10%胎牛血清、青霉素50U/ml、鏈霉素50μg/ml)中，并計數(shù)。材料和方法-細(xì)胞計數(shù)總活細(xì)胞密度和存活率分析使用Vi-CellXR(BeckmanCoulter(Fullerton,CA))進(jìn)行。Vi-Cell細(xì)胞存活率分析儀使用視頻捕獲技術(shù)獲得流動池中細(xì)胞的多達(dá)100張圖像并進(jìn)行圖像分析，實現(xiàn)了用于細(xì)胞存活率評估的臺盼藍(lán)染色排除法自動化。Vi-Cell的計數(shù)精密度為±6%。樣品根據(jù)制造商說明書(ReferenceManualPN383674Rev.A(《參考手冊PN383674修訂版A》))制備和分析。簡而言之，將RBC裂解后所得的最終細(xì)胞懸浮液的500μL等分試樣轉(zhuǎn)移至Vi-Cell4ml樣品瓶中，并且使用Vi-CellXR細(xì)胞存活率分析儀分析。使用以下默認(rèn)的細(xì)胞類型屬性細(xì)胞亮度85%細(xì)胞銳度100活細(xì)胞光斑亮度75%活細(xì)胞光斑面積5%最小圓度O分布度中等最小直徑5微米最大直徑50微米圖像50張抽吸循環(huán)I次臺盼藍(lán)混合循環(huán)3次結(jié)果-從整個心臟消化獲得的細(xì)胞收獲量整個第一心臟在采用手工切碎方法時消化后的收獲量為在解離和酶法消化后得到4，300萬個活細(xì)胞。存活率為65%。機(jī)械勻漿過程產(chǎn)生1，200萬個活細(xì)胞，存活率為63%。由于超過3倍的組織經(jīng)歷手工過程，兩種過程之間的收獲量和存活率無差異?；谠摻Y(jié)果，隨后的人心臟使用機(jī)械勻漿處理。消化后，總收獲量通常為3，400-6，400萬個活細(xì)胞/心臟。如表2中所示，存活率為55-81%。實例2本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的選擇和體外培養(yǎng)將人心臟的解離和酶法消化后獲得的細(xì)胞懸浮液擴(kuò)增，以用于進(jìn)一步實驗分析。從人心臟的解離和酶法消化獲得的細(xì)胞的初始接種根據(jù)實例I中描述的方法，將從人心臟的解離和酶法消化獲得的細(xì)胞懸浮液添加至T225組織培養(yǎng)瓶(CorningInc.(Corning,NY))中。將IOml細(xì)胞懸浮液添加至每個培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中裝有50ml生長培養(yǎng)基(DMEM、l，000mg/LD-葡萄糖、584mg/LL-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸鈉、10%胎牛血清、青霉素50U/ml、鏈霉素50μg/ml,Invitrogen(Calsbald,CA))。初始培養(yǎng)物的最終體積為60ml。將細(xì)胞在37°C下在含20%O2和5%CO2的氣氛中培養(yǎng)2天。這段時間后，可觀察到異質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物?？捎^察到非貼壁、相亮細(xì)胞(本文稱為hCTC(S)細(xì)胞)，并且可觀察到貼壁細(xì)胞(本文稱為hCTC(Al)細(xì)胞)。參見圖4。初始培養(yǎng)步驟后獲得的hCTC⑶細(xì)胞與Anversa(Beltrami,Barlucchi等人，2003；Cell114(6):763-76)描述為心臟干細(xì)胞的細(xì)胞具有類似的形態(tài)。參見圖4a。此外，可觀察到類似于Messina等人(Messina,DeAngelis等人，2004!CirculationResearch95(9):911-21)描述的細(xì)胞團(tuán)，如圖4b中所示。hCTC(S)群體的擴(kuò)增在一項研究中，在初始的兩天培養(yǎng)期后，將hCTC(S)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出。將hCTC(S)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml錐形試管。將hCTC(S)細(xì)胞在室溫下以338Xg離心5分鐘。棄去上清液，并且將細(xì)胞沉淀物重懸于20ml新鮮生長培養(yǎng)基中。重懸后對hCTC(S)細(xì)胞計數(shù)。從初始培養(yǎng)步驟獲得的hCTC(S)細(xì)胞的總數(shù)為約1，000-1，400萬個總細(xì)胞。將一部分hCTC(S)細(xì)胞以100-150萬/ml低溫冷藏于保藏培養(yǎng)基中，并且保存在-140°C下。剩余的細(xì)胞通過培養(yǎng)擴(kuò)增。將hCTC(S)細(xì)胞以5，000個細(xì)胞/cm2的接種密度轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)2天后，hCTC(S)細(xì)胞變?yōu)橘N壁的，并且形成均質(zhì)的貼壁細(xì)胞群，該細(xì)胞群在本文稱為hCTC(A2)群體或hCTC(A2)細(xì)胞。一旦本發(fā)明的hCTC(A2)細(xì)胞在hCTC(S)接種后約10-14天達(dá)到80%匯合度，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，所述消化通過以下步驟進(jìn)行吸出生長培養(yǎng)基，用60ml室溫PBS洗滌，然后向每個培養(yǎng)瓶添加4ml胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen(Carlsbad，CA))。將hCTC(A2)細(xì)胞在室溫下溫育大約5分鐘，直到細(xì)胞脫離。向每個培養(yǎng)瓶添加6ml生長培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至新的50ml錐形試管(BDFalcon,BDBiosciences(SanJose,CA))。移取500μL等分試樣,轉(zhuǎn)移至Vi-cell樣品杯中，以便使用Vi-Cell細(xì)胞存活率分析儀計數(shù)，如實例I中所描述。將這些細(xì)胞以5，000個細(xì)胞/cm2或3，000個細(xì)胞/cm2轉(zhuǎn)接。hCTC(S)細(xì)胞擴(kuò)增也可使用低溫冷藏細(xì)胞進(jìn)行。將S細(xì)胞的冰凍試劑瓶在37°C下解凍，并用PBS洗滌一次。然后對細(xì)胞計數(shù)，并且以5，000個細(xì)胞/cm2接種在培養(yǎng)瓶的生長培養(yǎng)基中。每天觀察細(xì)胞擴(kuò)增和匯合度。通過肉眼觀察，培養(yǎng)2天后非貼壁hCTC(S)細(xì)胞顯著減少，并且非貼壁hCTC(S)經(jīng)10-14天時間的培養(yǎng)其數(shù)量不會增加。培養(yǎng)2天后所培養(yǎng)的hCTC(S)細(xì)胞開始附著于培養(yǎng)瓶上，并且生長為貼壁細(xì)胞。它們在hCTC(S)細(xì)胞接種后10-14天達(dá)到80%匯合度。雖然在培養(yǎng)中仍然可觀察到一些hCTC(S)細(xì)胞，但是該非貼壁群體的數(shù)量在培養(yǎng)中不會增加。這可能是由于在培養(yǎng)中非貼壁hCTC(S)的形態(tài)變?yōu)橘N壁hCTC(A2)。由于2天后hCTC(S)細(xì)胞附著于培養(yǎng)瓶上，非貼壁細(xì)胞的數(shù)量變得非常低，故而不對其計數(shù)。相比之下，來源于hCTC(S)細(xì)胞的貼壁hCTC(A2)細(xì)胞顯示出一些生長潛力，如圖5a中所示可達(dá)10TOL。當(dāng)hCTC(A2)細(xì)胞以5，000個細(xì)胞/cm2或3，000個細(xì)胞/cm2接種時，該群體的生長率在1-3TOL/傳代之間，直到其在9-10PDL達(dá)到平臺。然而，PDL計算是基于接種在培養(yǎng)物中的初始細(xì)胞數(shù)量(即hCTC(S)細(xì)胞數(shù)量)，PDL的估算可能不完全準(zhǔn)確。hCTC(Al)群體的擴(kuò)增從包含初始兩天接種的細(xì)胞的培養(yǎng)瓶除去包含hCTC(S)細(xì)胞的培養(yǎng)基后，向培養(yǎng)瓶中存在的剩余貼壁細(xì)胞添加60ml新鮮生長培養(yǎng)基。將hCTC(Al)細(xì)胞培養(yǎng)直至細(xì)胞達(dá)到80%匯合度。這段時間后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，所述消化通過以下步驟進(jìn)行吸出生長培養(yǎng)基，用60ml室溫PBS洗滌，并且添加4ml胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen(Carlsbad，CA))。將細(xì)胞在室溫下溫育大約5分鐘，直到細(xì)胞脫離。向每個培養(yǎng)瓶添加6ml生長培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至新的50ml錐形試管(BDFalcon,BDBiosciences(SanJose,CA))。移取500μL等分試樣,轉(zhuǎn)移至Vi-cell樣品杯，以便使用Vi-Cell細(xì)胞存活率分析儀計數(shù)。然后將一部分細(xì)胞用低溫冷藏培養(yǎng)基(90%FBS和10%DMS0)重懸，并且以100-150萬個細(xì)胞/ml保留并保存在_140°C下。通過以3，000個細(xì)胞/cm2從冰凍試劑瓶轉(zhuǎn)接細(xì)胞來擴(kuò)增剩余的細(xì)胞。轉(zhuǎn)接后三天更換用過的培養(yǎng)基，將細(xì)胞在第7天進(jìn)行傳代。這些細(xì)胞每7天通過胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，在第3天更換培養(yǎng)基。hCTC(A3)群體的擴(kuò)增洗滌一瓶hCTC(Al)和一瓶hCTC(S)細(xì)胞，然后合并至50ml維形試管(BDFalcon,BDBiosciences(SanJose,CA))中。將5，000個細(xì)胞/cm2或3，000個細(xì)胞/cm2的合并細(xì)胞懸浮液混合物添加至單獨的T225培養(yǎng)瓶中。每個培養(yǎng)瓶中添加60ml/瓶的新鮮生長培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞在37°C、20%大氣O2下培養(yǎng)2天。這段時間后，大多數(shù)細(xì)胞形成貼壁細(xì)胞群，該細(xì)胞群在本文稱為hCTC(A3)群體或hCTC(A3)細(xì)胞。一旦細(xì)胞達(dá)到80%匯合度，將細(xì)胞通過胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，并且以5，000個細(xì)胞/cm2或3，000個細(xì)胞/cm2的接種密度轉(zhuǎn)接以鑒定適當(dāng)?shù)慕臃N密度，并且在37°C、20%大氣O2下培養(yǎng)。hCTC(A3)細(xì)胞通常在接種后7天達(dá)到80%匯合度。每天用肉眼觀察非貼壁hCTC(S)細(xì)胞，培養(yǎng)2天后這些細(xì)胞顯著減少，使得hCTC(A3)細(xì)胞變?yōu)榫|(zhì)的細(xì)胞群。這平均需要約2天。hCTC(A3)群體能夠以1-3TOL/傳代的速率擴(kuò)增。當(dāng)hCTC(A3)細(xì)胞以5，000個細(xì)胞/cm2的密度接種時，hCTC(A3)在達(dá)到衰老前能夠達(dá)到9-10H)L。相比之下，當(dāng)hCTC(A3)細(xì)胞以3，000個細(xì)胞/cm2的密度接種時，hCTC(A3)在達(dá)到衰老前能夠達(dá)到24TOL。參見圖5b。本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的鑒定hCTC(A2)和hCTC(A3)細(xì)胞每次傳代時顯示出1-3PDL的類似生長率。兩種細(xì)胞都需要約7天來達(dá)到80-90%傳代匯合度。當(dāng)它們來源于hCTC(S)細(xì)胞群時，觀察到這兩種細(xì)胞群之間的總PDL差異可能是由于最初低估了hCTC(A2)細(xì)胞的I3DL。在通過本發(fā)明的方法分離的所有人心臟組織來源細(xì)胞群中，未觀察到細(xì)胞表面標(biāo)記物或基因的表達(dá)差異。hCTC(Al)、hCTC(S)、hCTC(A2)和hCTC(A3)細(xì)胞不表達(dá)端粒酶。參見表I的本發(fā)明人心臟組織來源細(xì)胞以及本領(lǐng)域心臟祖細(xì)胞中所表達(dá)基因的列表。根據(jù)本發(fā)明的方法分離的所有細(xì)胞群顯示出GATA4和Nkx2.5基因的陽性表達(dá)。未觀察到肌球蛋白重鏈的表達(dá)。在本發(fā)明的所有細(xì)胞群中，通過基因表達(dá)檢測干細(xì)胞標(biāo)記物c-kit。參見表8。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞為⑶105和⑶90陽性。本發(fā)明的細(xì)胞不表達(dá)⑶31、⑶45和⑶16。參見表8。未觀察到本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞群有顯著的特征差異。選擇hCTC(A3)群體用于進(jìn)一步鑒定。實例3人心臟組織來源細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞密度和缺氧對細(xì)胞生長有影響(TavalucR等人，CellCycle6:20,2554-2562，2007年10月15日)。細(xì)胞相互接觸可降低細(xì)胞生長潛力，低接種密度可減少細(xì)胞接觸的可能性，從而增加生長潛力。缺氧或低O2分壓已顯示出可降低細(xì)胞生長的接觸抑制(NonomuraY.等人；TheJournalofRheumatology,2009年4月，第36卷第4期，第698-705頁)。在本發(fā)明中，與5，000個細(xì)胞/cm2相比，3，000個細(xì)胞/cm2的接種密度顯示出更大的生長潛力。為了比較O2水平對細(xì)胞生長的影響，每次傳代后，將hCTC(A3)細(xì)胞以3，000個細(xì)胞/cm2接種在T225培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞在20%O2或5%O2的氣氛中培養(yǎng)。在第3天，用60ml新鮮生長培養(yǎng)基更換用過的培養(yǎng)基。在第7天，根據(jù)實例2中描述的方法收集hCTC(A3)細(xì)胞。通過在觀察到衰老之前對累計總PDL進(jìn)行檢查，來確定生長動力學(xué)。實驗的總持續(xù)時間大于100天，在此期間內(nèi)，細(xì)胞傳代16-17次。hCTC(A3)細(xì)胞在常氧條件(20%O2)下培養(yǎng)時，生長曲線在TOL24達(dá)到平臺。然而，當(dāng)TOL12的hCTC(A3)細(xì)胞在低氧條件(5%O2)下培養(yǎng)時，生長曲線在TOL28達(dá)到平臺，如圖6中所示。實例4大鼠心臟組織來源細(xì)胞的分離將8-12周齡的Sprague-Dawley大鼠用異氟醚麻醉,并且打開腹腔。移開腸子,切斷主動脈。將27號注射針插入胸腔靜脈，并且用IOml含有5U/ml肝素的PBS灌注心臟。然后通過將IOml含有5U/ml肝素的PBS注入胸主動脈來對心臟進(jìn)行逆行灌注。小心操作，確保心臟在整個手術(shù)期間保持搏動。然后將整個心臟從胸腔摘除，并置于冰冷的Hank’s緩沖液中。將五個分離的大鼠心臟合在一起，用于解離和酶法消化。然后將分離的大鼠心臟用20ml室溫PBS洗滌兩次，并棄去上清液。然后在室溫下用外科手術(shù)刀將心臟手工切碎，并且將切碎的組織轉(zhuǎn)移至三個50ml試管中。然后將切碎的組織用25mlPBS洗滌三次，每次洗滌時將試管翻轉(zhuǎn)五次。將組織塊轉(zhuǎn)移至單獨的50ml錐形試管(CorningInc.(Corning,NY))中。添加30ml室溫PBS，將每個試管中的組織洗滌三次，每次洗滌時將試管翻轉(zhuǎn)五次。然后將試管直立放置，讓組織沉淀。使用2ml抽吸移液管(BDfalcon,BDBiosciences(SanJose,CA))吸出上清液。將消化酶混合物儲液(2X)添加至50ml試管中，酶與組織的比率為I:I?；旌厦傅慕K濃度為lU/ml膠原酶和5U/ml分散酶II。將裝有組織和酶的試管轉(zhuǎn)移至設(shè)置為225rpm的37°C回旋振蕩器(BarnsteadLab(MelrosePark,IL))中，溫育2.5小時。溫育后，將試管轉(zhuǎn)移回生物安全柜。通過在試管中添加室溫PBS，將細(xì)胞懸浮液稀釋。為了除去任何剩余的未消化組織，將細(xì)胞懸浮液濾過8英寸直徑100μm細(xì)胞過濾網(wǎng)(BDFalcon)，然后濾過40μm細(xì)胞過濾網(wǎng)(BDFalcon)至六個50ml錐形試管(BDFalcon)。大鼠CTC所用過濾器尺寸小于人細(xì)胞所用過濾器尺寸，因為大鼠和人之間的肌細(xì)胞大小存在差異。然后使用SorvallLegendT離心機(jī)(ThermoFisherScientific,Inc(Waltham,MA))將細(xì)胞懸浮液在室溫下以338Xg離心5分針進(jìn)行洗滌，以沉淀細(xì)胞。將上清液吸出，并且將細(xì)胞沉淀重懸于生長培養(yǎng)基中，合并到一個盛有20ml生長培養(yǎng)基的50ml試管中，然后取樣確定細(xì)胞收獲量。獲得的典型收獲量為1，000萬個細(xì)胞/心臟，存活率為70%。在大鼠心臟組織來源細(xì)胞的制備中，使用0.lU/ml或lU/ml膠原酶儲液消化心臟組織。3小時溫育后，如實例I中所述，將20ml生長培養(yǎng)基添加至每個試管中。然而，用0.lU/ml膠原酶消化的大鼠心臟組織未產(chǎn)生任何細(xì)胞。將解離和酶法消化心臟組織獲得的細(xì)胞懸浮液接種于T225組織培養(yǎng)瓶(CorningInc.(Corning,NY))中，所述接種通過轉(zhuǎn)移IOml進(jìn)每個瓶中來進(jìn)行。將35ml生長培養(yǎng)基(DMEM>1,000mg/LD-葡萄糖、584mg/LL-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸鈉、10%胎牛血清、青霉素50U/ml、鏈霉素50yg/ml,Invitrogen(Calsbald,CA))添加至每個培養(yǎng)瓶中，使每個培養(yǎng)瓶內(nèi)的最終體積為45ml。在37°C下、20%O2和5%CO2的氣氛中進(jìn)行兩天的初始細(xì)胞培養(yǎng)。初始兩天培養(yǎng)后，取出非貼壁rCTC(S)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至50ml錐形試管中，在室溫下以338Xg離心5分鐘。棄去上清液，并將細(xì)胞沉淀重懸于20ml生長培養(yǎng)基中。對細(xì)胞計進(jìn)行數(shù)，并且以5，000個細(xì)胞/cm2的接種密度重新接種于T225培養(yǎng)瓶中。將rCTC(S)細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在經(jīng)歷額外兩天的培養(yǎng)后，注意到rCTC(s)細(xì)胞變?yōu)橘N壁的。SrCTC(S)細(xì)胞變?yōu)橘N壁時形成的貼壁細(xì)胞群稱為rCTC(A2)細(xì)胞群或rCTC(A2)細(xì)胞。根據(jù)實例2中描述的方法，在第7天通過胰蛋白酶消化收集rCTC(A2)細(xì)胞并傳代。將rCTC(A2)細(xì)胞以5，000個細(xì)胞/cm2的密度接種于T225培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中含45ml生長培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到大約80%匯合度時進(jìn)行細(xì)胞傳代。觀察到的rCTC(A2)細(xì)胞生長曲線在圖7中示出。實例5表汰GFP的小鼠心臟組織來源細(xì)胞的分離將五只8-12周齡的FVB.Cg-Tg(ACTB-EGFP)B5Nagy/J小鼠(GFP小鼠，JacksonLab(BarHarbor,Maine))用異氟醚麻醉,并且打開腹腔。移開腸子,切斷主動脈。將27號注射針插入胸腔靜脈，并且用IOml含有5U/ml肝素的PBS灌注心臟。然后通過將IOml含有5U/ml肝素的PBS注入胸主動脈來對心臟進(jìn)行逆行灌注。小心操作，確保心臟在整個手術(shù)期間保持搏動。然后將整個心臟從胸腔摘除，并置于冰冷的Hank’s緩沖液中。將五個分離的GFP小鼠心臟組合在一起，用于解離和酶法消化。然后將分離的小鼠心臟用20ml室溫PBS洗滌兩次，并棄去上清液。然后在室溫下用外科手術(shù)刀將心臟手工切碎，并且將切碎的組織轉(zhuǎn)移至三個50ml試管中。然后將切碎的組織用25mlPBS洗滌三次，每次洗滌時將試管翻轉(zhuǎn)五次。將組織塊轉(zhuǎn)移至單獨的50ml錐形試管(CorningInc.(Corning,NY))中。添加30ml室溫PBS，將每個試管中的組織洗滌三次，每次洗滌時將試管翻轉(zhuǎn)五次。然后將試管直立放置，讓組織沉淀。使用2ml抽吸移液管(BDfalcon,BDBiosciences(SanJose7CA))吸出上清液。將消化酶混合物儲液(2X)添加至50ml試管中，酶與組織的比率為1:1?；旌厦傅慕K濃度為lU/ml膠原酶和5U/ml分散酶II。將裝有組織和酶的試管轉(zhuǎn)移至設(shè)置為225rpm的37°C回旋振蕩器(BarnsteadLab(MelrosePark,IL))中，溫育2.5小時。溫育后，將試管轉(zhuǎn)移回生物安全柜。通過在試管中添加室溫PBSJf細(xì)胞懸浮液稀釋。為了除去任何剩余的未消化組織，將細(xì)胞懸浮液濾過8英寸直徑IOOym細(xì)胞過濾網(wǎng)(BDFalcon),然后濾過40μm細(xì)胞過濾網(wǎng)(BDFalcon)至6個50ml錐形試管(BDFalcon)。大鼠CTC所用過濾器尺寸小于人細(xì)胞所用過濾器尺寸，因為大鼠和人之間的肌細(xì)胞大小存在差異。然后使用SorvallLegendT離心機(jī)(ThermoFisherScientific,Inc(Waltham,MA))將細(xì)胞懸浮液在室溫下以338Xg離心5分鐘進(jìn)行洗滌，以沉淀細(xì)胞。將上清液吸出，并且將細(xì)胞沉淀重懸于生長培養(yǎng)基中，合并到一個盛有20ml生長培養(yǎng)基的50ml試管中，然后取樣確定細(xì)胞收獲量。獲得的典型收獲量為1，000萬個細(xì)胞/心臟，存活率為70%。3小時溫育后，如實例4中所述，將20ml生長培養(yǎng)基添加至每個試管中。為了除去任何剩余的未消化組織，將細(xì)胞懸浮液濾過8英寸直徑100μm細(xì)胞過濾網(wǎng)(BDFalcon)，然后濾過40μm細(xì)胞過濾網(wǎng)(BDFalcon)至六個50ml錐形試管(BDFalcon)。使用SorvallLegendT離心機(jī)(ThermoFisherScientific,Inc(Waltham,MA))將細(xì)胞懸浮液在室溫下以338Xg離心5分鐘進(jìn)行洗滌，以沉淀細(xì)胞。將上清液吸出，并且將細(xì)胞沉淀重懸于生長培養(yǎng)基中，合并到一個盛有20ml生長培養(yǎng)基的50ml試管中，然后取樣確定細(xì)胞收獲量?；?次分離，獲得的典型收獲量為1，000萬個細(xì)胞/心臟，存活率為70%。mCTC(A2)群體用于隨后研究。在研究前，將細(xì)胞擴(kuò)增用于傳代兩次。實例6細(xì)胞低溫冷藏、存活率和回收率制備本發(fā)明的大鼠和人心臟組織來源細(xì)胞用于低溫冷藏。簡而言之，來自hCTC(A3)或rCTC(A2)群體的細(xì)胞通過擴(kuò)增低溫冷藏的早期傳代hCTC(A3)和rCTC(A2)細(xì)胞而獲得。細(xì)胞以3，000個細(xì)胞/cm2接種后，在37°C、20%大氣O2下培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)7天后進(jìn)行傳代，培養(yǎng)的第3天更換培養(yǎng)基。在12-14PDL時收集細(xì)胞。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸于包含2%DMSO的CRY0ST0RD-LITE(BiolifeSolutions,Inc(Bothell,WA))中用于低溫冷藏,然后使用帶有DeltaT軟件的Integra750Plus程序冷凍儀(Planer(Middlesex,U.K.))將所得細(xì)胞懸浮液低溫冷藏于Nalgene2mL無菌內(nèi)旋蓋聚丙烯凍存管(NalgneNunc(Rochester,NY))中。在放入保持在15°C的程序冷凍儀之前細(xì)胞和溶液處于室溫下。將樣品溫度探頭置于盛有凍存緩沖液的瓶中。使用以下程序進(jìn)行低溫冷藏步驟編號速率(°C/min)終點溫度TC)觸發(fā)器1-I-6樣品2-25-65冷凍室3+10-19冷凍室4+2.16-14冷凍室5-I-100冷凍室6-10-140冷凍室當(dāng)溫度達(dá)到_140°C時，將樣品轉(zhuǎn)移至液氮罐儲存。低溫冷藏后本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的存活率和回收率在液氮罐(-1400C)中儲存一個月后，將一瓶以100萬個細(xì)胞/瓶懸浮于CRY0ST0RD-LITE中的hCTC(A3)細(xì)胞在室溫下解凍。然后將試劑瓶轉(zhuǎn)移至生物安全柜。將50yL(含50萬個細(xì)胞)樣品轉(zhuǎn)移至裝有50μL臺盼藍(lán)溶液的I.8mL微量離心管。將10μL轉(zhuǎn)移至血細(xì)胞計數(shù)器并計數(shù)，以便對該細(xì)胞制備物進(jìn)行雙重計數(shù)。這些計數(shù)確定了h通過注射針前的回收率和存活率。在未進(jìn)行室溫溫育時，為了確定通過注射針后Utl通過注射針后)的細(xì)胞存活率和回收率，將100μL細(xì)胞懸浮液通過30號注射針(BD產(chǎn)品目錄號305106)吸入ImL結(jié)核菌素注射器(BD產(chǎn)品目錄號309602)。然后使樣品再次通過注射針注入I.8mL微量離心管。將IOOyL臺盼藍(lán)添加至該試管中，并且如上所述進(jìn)行雙重計數(shù)。該過程在室溫溫育10min、20min、30min的時間后進(jìn)行，以及30分鐘不通過注射針的情況下進(jìn)行。在儲存一個月后，hCTC(A3)細(xì)胞解凍后的存活率確定為94%。如表3和圖8中所示，細(xì)胞回收率為54萬，類似于低溫冷藏前的原細(xì)胞數(shù)。在室溫溫育30分鐘(該時間是大鼠梗塞手術(shù)期間細(xì)胞施用必需的時間)后，人心臟組織來源細(xì)胞通過30號施用針后測試的存活率大于90%。如表3和圖8中所示，其回收率類似于通過注射針前的細(xì)胞數(shù)。將hCTC(A3)細(xì)胞擴(kuò)增至TOL12，并儲存用于將來的體內(nèi)研究。對儲存的細(xì)胞樣品檢查核型異常。結(jié)果匯總于表4中。大鼠CTC生物相容性如上所述，將一瓶以200萬個細(xì)胞/瓶懸浮于CRY0ST0RD-LITE中的rCTC(A2)細(xì)胞解凍。然后將試劑瓶轉(zhuǎn)移至生物安全柜。將50μL樣品轉(zhuǎn)移至裝有50μL臺盼藍(lán)溶液的I.8mL微量離心管。將10μL轉(zhuǎn)移至血細(xì)胞計數(shù)器并計數(shù)，以便對該細(xì)胞制備物進(jìn)行三重計數(shù)。為了確定通過注射針后的細(xì)胞收獲量和存活率基線，同時在通過注射針前和通過注射針后在0、10、20、30min的溫育時間進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。在每個時間點，將100μL細(xì)胞懸浮液通過30號注射針(BD產(chǎn)品目錄號305106)吸入ImL結(jié)核菌素注射器(BD產(chǎn)品目錄號309602)。然后使樣品再次通過注射針注入I.8mL微量離心管。將100μL臺盼藍(lán)添加至該試管中，并且如上所述進(jìn)行三重計數(shù)。該過程在室溫溫育lOmin、20min和30min的時間后進(jìn)行，以模擬大鼠急性心肌梗塞模型中細(xì)胞施用的潛在過程。在液氮中儲存一個月后，rCTC(A2)細(xì)胞解凍后的存活率為94%。細(xì)胞的回收率為140萬/ml，約為原細(xì)胞濃度(200萬/ml)的70%。在室溫溫育30分鐘(該時間是大鼠梗塞手術(shù)期間注射必需的時程)后，rCTC(A2)細(xì)胞在通過注射針后的存活率大于90%。如表5和圖9中所示，其回收率類似于通過注射針前的回收率。實例7本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞的鑒定在心臟組織來源細(xì)胞群中確定細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)，該細(xì)胞群通過本發(fā)明的方法從大鼠和人心臟組織獲得。測試的細(xì)胞表面標(biāo)記物在表6中示出。人真皮成纖維細(xì)胞群作為對照包括于其中。超過90%的hCTC(A3)細(xì)胞群表達(dá)CD59、CD105、CD54和CD90(單獨分析)。大約30%的hCTC(A3)細(xì)胞群表達(dá)⑶34，它是內(nèi)皮祖細(xì)胞的一種干細(xì)胞標(biāo)記物。同時，約30%的hCTC(A3)顯示出c-Kit陽性。相比之下，小于5%的hCTC(A3)細(xì)胞群表達(dá)CD31、CD45或CD16。參見圖10、11和表7。hCTC(Al)、hCTC(Al)和hCTC(S)細(xì)胞群還顯示出類似的細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)。參見表8。此外，rCTC(A3)細(xì)胞群觀察到類似的結(jié)果。參見圖12。CD54(即，細(xì)胞間粘附分子-I(ICAM))結(jié)合到白細(xì)胞上的整聯(lián)蛋白，并介導(dǎo)白細(xì)胞遷移出血管屏障到達(dá)組織(YangL等人，Blood106(2):584_92，2005年7月)。因此，當(dāng)hCTC(A3)施用至冠狀動脈時，該分子的細(xì)胞表面表達(dá)可促進(jìn)hCTC(A3)從脈管系統(tǒng)至心肌的易位。實例8心臟組織來源細(xì)胞的基因表達(dá)分析采集以下心臟組織來源細(xì)胞群的RNA樣品hCTC(Al)、hCTC(A2)、hCTC(A3)、rCTC(A2)和mCTC(A2)(RNA從每個細(xì)胞群的100萬個細(xì)胞采集)。通過所采集樣品的實時PCR確定一組基因的表達(dá)情況。實時PCR反應(yīng)根據(jù)表9中定義的反應(yīng)混合物引發(fā)，并且所測基因的引物在表10中示出。檢查兩類基因心臟特異性基因和干細(xì)胞基因。心臟特異性基因還可分為分化標(biāo)記物(例如肌球蛋白重鏈(MyHC))和未分化心臟標(biāo)記物(例如GATA-4和Nkx2.5)。干細(xì)胞基因還可歸類為干細(xì)胞標(biāo)記物c_kit、胚胎心臟標(biāo)記物islet-Ι和細(xì)胞分裂標(biāo)記物端粒酶。管家基因一3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)用作基準(zhǔn)，使每個樣品中的表達(dá)水平歸一化。實驗發(fā)現(xiàn)，所測基因的表達(dá)情況在hCTC(Al)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群體中是類似的。參見表10。hCTC(Al)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群體中表達(dá)了干細(xì)胞標(biāo)記物c-kit(Ct27-29)，而端粒酶和islet-Ι的表達(dá)不可檢測當(dāng)Ct值為40時未檢測到基因的信息。在hCTC(Al)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群體中，心臟標(biāo)記物GATA4和Nkx2.5分別在CT值為25和32-34時表達(dá)，而在任一個hCTC(Al)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群體中均未觀察到肌球蛋白重鏈或心臟肌動蛋白的表達(dá)。參見表10。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞是“類祖細(xì)胞的”，即與心肌細(xì)胞(1%)和人成纖維細(xì)胞(12%)相比，在hCTC(Al)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群體中，祖細(xì)胞標(biāo)記物與分化細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的比率大于50，000。參見表10、表11和圖13。rCTC(A2)細(xì)胞也表達(dá)心臟譜系基因，例如GATA_4(Ct:28)和Nkx2.5(Ct:27)。然而，與人心臟組織來源細(xì)胞不同，Nkx2.5在大鼠心臟組織來源細(xì)胞中的表達(dá)水平高于人心臟組織來源細(xì)胞中觀察到的水平。標(biāo)記物C-kit、Islet-I和端粒酶也在rCTC(A2)細(xì)胞中表達(dá)。參見表12。類似的從大鼠心臟獲得的心臟組織來源細(xì)胞、小鼠心臟組織來源細(xì)胞也表達(dá)Nkx2.5、c-kit、Islet-I和端粒酶。參見表13。實例9心臟組織來源細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞首先將根據(jù)實例5中描述的方法獲得的mCTC(A2)細(xì)胞(200K)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，然后通過胰蛋白酶消化收集，并且在與大鼠心肌細(xì)胞(100萬，產(chǎn)品目錄號R357，CellApplication,Inc.(Austin,TX))以I:5的比率混合之前計數(shù)。將大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)5天后，用胰蛋白酶消化并計數(shù)，然后與mCTC(A2)細(xì)胞混合。將細(xì)胞混合物接種于層粘連蛋白處理的6孔板(產(chǎn)品目錄號354595BDBiosciences,NJ)上5天。通過在包含DMEM-F12(1I)+10%馬血清的組織培養(yǎng)基(Sigma)(下文稱為分化培養(yǎng)基)中培養(yǎng)細(xì)胞混合物來測試mCTC(A2)細(xì)胞分化的能力。在20%O2的氣氛、37°C下，將細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。這段時間后，收集細(xì)胞，并提取RNA。對來自mCTC(A2)細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)物，以及來自mCTC(A2)細(xì)胞的平行培養(yǎng)物的總RNA進(jìn)行測試，得出鼠肌球蛋白重鏈的基因表達(dá)情況。使用以下鼠肌球蛋白重鏈引物類型名稱序列正向引物MHC-小鼠-FGAAACACCTGAAGAATTCTCAAGCT反向引物MHC-小鼠-RTTGGCATGGACAGCATCATC探針MHC-小鼠-PACTTGAAGGACACCCAGC與單一mCTC(A2)細(xì)胞的平行培養(yǎng)物相比，mCTC(A2)細(xì)胞與大鼠心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)物可使鼠肌球蛋白重鏈的表達(dá)增加9倍。參見圖14。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的心臟來源細(xì)胞能夠分化為心肌細(xì)胞，并且本發(fā)明的細(xì)胞與心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)可促進(jìn)分化。實例10豬心臟組織來源細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和鑒定每次分離時，從MarshallBioresources(NorthRose,NY)獲得8-12周齡的哥廷根小型豬(Giittingenminiswine)的單個心臟。在收集之前,灌注心臟以放空血液,在運輸期間將整個器官浸于冰上的DMEM+10%FBS中。從切取至組織消化的時間在48-96小時之間。根據(jù)以下描述的過程進(jìn)行四次單獨分離。將心臟切為小塊(尺寸為大約2至3cm3)。如實例I中所述，這些組織塊的勻漿通過機(jī)械勻漿來進(jìn)行，以產(chǎn)生尺寸小于Imm3的心臟組織碎片，然后轉(zhuǎn)移至一個250ml錐形試管(CorningInc.(Corning,NY)),并洗漆三次。將消化酶混合物儲液(2X)添加至250ml試管中，酶與組織的比率為1:1。酶的終濃度為lU/ml膠原酶和5U/ml分散酶II。將裝有組織和酶的試管轉(zhuǎn)移至設(shè)置為225rpm的37°C回旋振蕩器(BarnsteadLab(MelrosePark,IL))中，溫育2.5小時。溫育后，為了除去任何剩余的未消化組織，將細(xì)胞懸浮液濾過8英寸直徑250μm標(biāo)準(zhǔn)試驗篩，以除去未消化的結(jié)締組織和脂肪組織(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))，然后進(jìn)一步濾過IOOym細(xì)胞過濾網(wǎng)，以除去心肌細(xì)胞(BDFalcon)。將包含通過過濾器的細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至多個50ml錐形試管(BDFalcon)。然后洗滌細(xì)胞懸浮液。洗滌后，將沉淀物重懸于20mlACK裂解緩沖液(Lonza(Walkersville，MD))中，并在室溫下溫育10分鐘，以裂解任何剩余的紅細(xì)胞。溫育后，用40ml室溫PBS再洗滌細(xì)胞懸浮液兩次。最后一次離心后，將沉淀重懸于20ml室溫生長培養(yǎng)基中，并計數(shù)。在解離和酶法消化后，在20ml體積中細(xì)胞的收獲量通常為2700萬個細(xì)胞。存活率通常為80%。將解離和酶法消化獲得的細(xì)胞懸浮液添加至T225組織培養(yǎng)瓶(CorningInc.(Corning,NY))中。將IOml細(xì)胞懸浮液添加至每個培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中裝有50ml生長培養(yǎng)基(DMEM、l，000mg/LD-葡萄糖、584mg/LL-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸鈉、10%胎牛血清、青霉素50U/ml、鏈霉素50μg/ml,Invitrogen(Calsbald,CA))。初始培養(yǎng)物的最終體積為60ml。將細(xì)胞在37°C下在含20%O2和5%CO2的氣氛中培養(yǎng)2天。這段時間后，可觀察到異質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物?？捎^察到非貼壁、相亮細(xì)胞(本文稱為PCTC(S)細(xì)胞)，并且可觀察到貼壁細(xì)胞(本文稱為PCTC(Al)細(xì)胞)。根據(jù)本發(fā)明方法的豬心臟解離和酶法消化，以及隨后的細(xì)胞擴(kuò)增可產(chǎn)生以下細(xì)胞群pCTC(S)、pCTC(Al)、pCTC(A2)和pCTC(A3)細(xì)胞。本發(fā)明的豬心臟組織來源細(xì)胞的形態(tài)類似于本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞。選擇pCTC(A3)群體用于進(jìn)一步鑒定和隨后的體內(nèi)研究。pCTC(S)細(xì)胞和pCTC(Al)細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)而初始擴(kuò)增為T225培養(yǎng)瓶中的混合物。每個培養(yǎng)瓶中添加60ml/瓶的新鮮生長培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞在37°C、20%O2下培養(yǎng)2天。這段時間后，大多數(shù)細(xì)胞形成貼壁細(xì)胞群，該細(xì)胞群在本文稱為pCTC(A3)群體或pCTC(A3)細(xì)胞。培養(yǎng)2天后，通過肉眼觀察，非貼壁細(xì)胞的數(shù)量減少，使得pCTC(A3)細(xì)胞變?yōu)榫|(zhì)的細(xì)胞群。這平均需要2天。一旦細(xì)胞達(dá)到90-100%匯合度，將pCTC(A3)細(xì)胞傳代，并以3000個細(xì)胞/cm2重新接種。pCTC(A3)細(xì)胞在培養(yǎng)中的擴(kuò)增超過人心臟組織來源細(xì)胞的生長。pCTC(A3)細(xì)胞在3-4天中生長至超過90%匯合度。參見圖15中本發(fā)明的pCTC(A3)細(xì)胞觀察到的生長曲線。如實時PCR所確定，pCTC(A3)細(xì)胞不表達(dá)端粒酶或肌球蛋白重鏈。然而，pCTC(A3)細(xì)胞表達(dá)GATA-4。在本發(fā)明的豬心臟組織來源細(xì)胞中，未檢查Nkx2.5的表達(dá)。細(xì)胞表面標(biāo)記物的單染色顯示，pCTC(A3)細(xì)胞群的超過90%對⑶105和⑶90的表達(dá)是陽性的。少于5%的pCTC(A3)細(xì)胞表達(dá)⑶45、⑶16或豬內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(產(chǎn)品目錄號MCA1752，Serotec)。該標(biāo)記物是組織相容性復(fù)合物II型分子，該分子在很多組織中的毛細(xì)血管內(nèi)皮上鑒定，如Wilson等人(Immunology.1996年5月；88(1):98-103)所示。參見圖16和表14。未檢查其他細(xì)胞群例如pCTC(Al)或pCTC(A2)細(xì)胞。實例11用本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞治療急件心肌梗塞大鼠急性心肌梗塞模型大鼠心肌梗塞模型已成功用于測試諸如ACEI和β_阻滯劑之類的試劑作為人AMI療法的效力。在實驗的所有階段，根據(jù)當(dāng)?shù)匾?guī)章制度處理動物。大鼠心肌梗塞模型業(yè)已建立，用于模擬心肌梗塞后的人病理生理，以及梗塞后心臟功能的進(jìn)一步惡化(PfefferΜ.Α.等人,CircRes1979；44:503-12；LitwinS.E.等人，Circulation1994;89:345-54;HodsmanG.P.等人，Circulation1988;78:376-81)。用氯胺酮和甲苯噻嗪(分別為60和10mg/kgIP)麻醉雌性裸大鼠(體重250至300g；ShizuokaAgriculturalCooperationAssociation(Shizuoka,Japan)),并且通過氣管插管施加正壓呼吸。在左四肋間隙打開胸部，把心臟從腹內(nèi)取出，并切割心包膜。此后，用鑷子夾住心臟，并且在冠狀動脈左前降支下、距其原位大約2mm處用6-OPiOline縫合線打成環(huán)。通過拉動綁扎線永久封閉動脈來誘導(dǎo)心臟的AMI?？捎萌庋塾^察到梗死心肌的變色。如下面細(xì)胞施用中所描述，梗塞誘導(dǎo)后約20min，在變色區(qū)的邊界區(qū)域注射心臟組織來源細(xì)胞懸浮液或溶媒。注射后，關(guān)閉胸部，并且將大鼠放回其籠中。在手術(shù)后每個特定時間，通過麻醉下切除心臟來處死大鼠。將保存在_80°C下的低溫冷藏hCTC(A3)和rCTC(A2)細(xì)胞群在冰上解凍，并且在給測試動物施用前確定它們的存活率。在本研究中使用的所有細(xì)胞群中，細(xì)胞存活率均大于95%。冠狀動脈左前降支綁扎后20分鐘，給測試動物施用細(xì)胞。在變色區(qū)的邊界區(qū)域注射低溫冷藏hCTC(A3)細(xì)胞群。測試動物接受在120μ1CryostorD-Iite中的以下目標(biāo)劑量之一(15只動物/目標(biāo)劑量)=IXlO4個細(xì)胞(低劑量)、1XIO5個細(xì)胞(中劑量)或IXlO6個細(xì)胞(高劑量)。在變色區(qū)的邊界區(qū)域注射低溫冷藏rCTC(A2)細(xì)胞群，作為平行實驗。測試動物接受在120μICryostorD-Iite中的以下目標(biāo)劑量之一(15只動物/目標(biāo)劑量)=IXlO6個細(xì)胞。在所有測試動物中，低溫冷藏細(xì)胞均置于總體積為120μI的低溫冷藏培養(yǎng)基中。將一個目標(biāo)劑量的細(xì)胞注射至心臟變色區(qū)周圍的五個單獨部位。接受低溫冷藏培養(yǎng)基(120μI)注射的對照組也包括于研究中。在AMI誘導(dǎo)后5和28天，用經(jīng)胸超聲心動描記術(shù)(S0N0S5500，PhilipsMedicalSystems)進(jìn)行左心室(LV)功能評估。當(dāng)進(jìn)行超聲心動描記術(shù)時，將大鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉。LV舒張末期和收縮末期內(nèi)徑(分別為LVEDD和LVESD)以及縮短分?jǐn)?shù)(FS)在中部乳頭肌水平測量。FS通過測量收縮期內(nèi)徑(收縮末期)和舒張期內(nèi)徑(灌注末期)之間的差值百分比來反映心臟的泵血效應(yīng)。局部室壁運動記分(RWMS)根據(jù)公布的標(biāo)準(zhǔn)評估1分室壁運動和增厚正常；2分室壁運動和增厚減少；3分不存在室壁運動和增厚；4分向外運動或膨出。(參見例如Schiller、Shah等人(JournalofAmericanSocietyofEchocardiographyvol2:358-367;1989))。簡而言之，從超聲心動圖獲得十七張連續(xù)切面圖像，并且基于表15中的定義給出每個切面的室壁運動記分。所有17個節(jié)段的分?jǐn)?shù)的總和用作室壁收縮性的指標(biāo)。RWMS是收縮的直接量度。RWMS的減少表明了收縮的改善，并反映了心臟肌肉功能的改善。表15描述了每個分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)。研究中觀察到的死亡率為16%。如表16中所示，組之間的死亡率無顯著差異。結(jié)果圖17復(fù)制自Pffeffer等人(1999)的AtlasofHeartFailure,顯不了梗塞后觀察到的心臟病理變化。大鼠急性心肌梗塞模型已建立，用于模擬人患者的AMI和慢性心力衰竭。梗塞后，如人中，心室經(jīng)歷了一系列病理生理變化，首先是梗死區(qū)域處心肌更換為纖維組織。心室中的收縮和壓力可導(dǎo)致梗死擴(kuò)展、心室逐漸擴(kuò)張，并最終導(dǎo)致左心室重塑，該重塑表現(xiàn)為心室的幾何形狀從橢圓形變?yōu)榍驙睿⒊霈F(xiàn)肌細(xì)胞肥大一類的細(xì)胞變化。低溫冷藏的hCTC(A3)細(xì)胞群改善了整體心臟功能和心臟收縮性，如分別通過縮短分?jǐn)?shù)(FS)和局部室壁運動記分(RWMS)所測量的。整體心臟功能和心臟收縮性的改善可在hCTC(A3)細(xì)胞的所有目標(biāo)劑量觀察到。參見圖18和19。在施用后五天，施用了rCTC(A2)細(xì)胞或目標(biāo)劑量為IXlO6的hCTC(A3)細(xì)胞的動物顯示出(hCTC(A3))和(rCTC(A2))處理后的FS分別比溶媒處理動物小3.3%和3.8%。在細(xì)胞施用后四周，縮短分?jǐn)?shù)的絕對值(通過第28天觀察到的FS值減去第5天觀察到的FS值計算)得到提高。參見圖18及表17和18。用lX104fhCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中FS的絕對值為9.687±I.329%(η=12，P小于O.001)。用IXIO5個hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中FS的絕對值為10.9±I.6%(η=11，P<O.001)。用IXIO6個hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中FS的絕對值為12.9±1.8%(η=10，P小于O.001)。有幾種可能原因可解釋rCTC細(xì)胞在本發(fā)明使用的實驗?zāi)Ｐ椭袩o效。雖然裸大鼠是免疫缺陷型，但是它們對外源細(xì)胞的排斥并未完全消除。在當(dāng)前研究中，rCTC比人細(xì)胞更易受到裸大鼠的免疫排斥。由于免疫排斥，它們在心肌中的滯留量下降，從而影響到它們對心肌的作用。在細(xì)胞施用四周后，在用hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中也可觀察到RWMS下降。在梗塞和細(xì)胞施用后5天，用lX104fhCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中RWMS分?jǐn)?shù)為24.42±1.4，但是在梗塞和細(xì)胞施用后4周下降至21.08±I.7(η=12，P小于O.001)。在梗塞和細(xì)胞施用后5天，用lX105fhCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中RWMS分?jǐn)?shù)為25.58±1.4，并且下降至21·08±1·9(η=11，P小于O.001)。在梗塞和細(xì)胞施用后5天，用IXIO6個hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中RWMS分?jǐn)?shù)為25.91±I.6，并且在梗塞和細(xì)胞施用后4周下降至20±I.7(η=10，P小于O.001)。雖然rCTC(A2)處理未顯示出縮短分?jǐn)?shù)下降，但是觀察到RWMS略有下降。在梗塞和細(xì)胞施用后5天，用lX106frCTC(A2)細(xì)胞處理的動物中RWMS分?jǐn)?shù)為25.29±1.9，并且在細(xì)胞施用后四周下降至23.86±2.3(n=12,P=O.09)參見圖19及表17和19。在rCTC(A2)處理動物中觀察到的數(shù)據(jù)表明，雖然rCTC(A2)細(xì)胞未改善整體功能，但是它們改善了心臟收縮性，如RWMS所示。在另一個方面，在用hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中觀察到的數(shù)據(jù)表明，人心臟組織來源細(xì)胞改善了整體心臟功能和心臟收縮性。在接受hCTC(A3)細(xì)胞的動物中，心臟重塑也得以阻止。心臟重塑是指缺血性損傷(例如心肌梗塞)后觀察到的心臟大小、形狀和功能的變化。觀察到的變化包括梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞死亡和室壁不成比例的變薄。薄室壁不能承受心臟上的壓力和容量負(fù)荷。因此，首先在梗死區(qū)域出現(xiàn)心室擴(kuò)張，隨后擴(kuò)展到代償?shù)姆枪Ｋ佬呐K肌肉。由于心臟經(jīng)歷持續(xù)的擴(kuò)張，隨著時間的推移，心室尺寸變大，形狀越來越不像橢圓而更接近球形，如超聲心動描記術(shù)中內(nèi)徑增加所顯示的。心室質(zhì)量和容量的增加會更進(jìn)一步給心臟功能帶來不利影響。在舒張末期容量的增加最終會損害心臟收縮之間的松弛能力，進(jìn)一步導(dǎo)致功能下降。心室擴(kuò)大的嚴(yán)重性決定了患者的預(yù)后。心室擴(kuò)大與心力衰竭患者的預(yù)期壽命縮短相關(guān)聯(lián)。急性心肌梗塞誘導(dǎo)后，動物左心室中心臟重塑的程度通過超聲心動描記術(shù)測量舒張末期左心室內(nèi)徑(左心室舒張末期內(nèi)徑，LVEDD)和收縮末期左心室內(nèi)徑(左心室收縮末期內(nèi)徑，LVESD)來確定。LVEDD和LVESD的增加代表心臟重塑嚴(yán)重性增加。相反地，觀察到的LVEDD和LVESD值的減少代表心臟重塑的逆轉(zhuǎn)或心臟功能的改善。在溶媒處理動物中，LVEDD從細(xì)胞施用后五天的O.74±O.020mm增加至細(xì)胞施用后4周的O.83±0.019mm。這相當(dāng)于左心室相對增加12%[100%(D28-D5)/D5]。在用rCTC(A2)細(xì)胞處理的動物中，LVEDD從細(xì)胞施用后五天的O.69±0.022mm增加至細(xì)胞施用后4周的O.80±0.018mm。在用IXIO4個hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中，LVEDD從細(xì)胞施用后五天的O.70±0.012mm增加至細(xì)胞施用后4周的O.77±0.022mm。在用lX105fhCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中，LVEDD未顯示出顯著變化，其中LVEDD在細(xì)胞施用后五天為O.73±0.012mm,并且在細(xì)胞施用后4周為O.74±0.023mm，相對變化%1.4%(與溶媒組相比，P小于O.01)。相似地，在用lX106fhCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中，LVEDD也未顯示出顯著變化，其中LVEDD在細(xì)胞施用后五天為O.76±0.Ollmm,并且在細(xì)胞施用后4周為O.71±O.028mm，減去細(xì)胞施用后五天的數(shù)據(jù)的相對變化為6.6%(與溶媒組相比，P小于O.001)。這些數(shù)據(jù)表明，lX105fhCTC(A3)的劑量和IXIO6個hCTC(A3)的劑量可阻止心臟重塑。參見圖23、表17和表20。LVEDD的相對變化(100%(28D-5D)/5D)在表21和圖20-21中示出。在用lX104fhCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中，LVEDD在第5天為O.71±0.045mm，并且在第28天為0.78±O.079mm。在用IXIO6個rCTC(A2)細(xì)胞處理的動物中，LVEDD在第5天為O.70±O.083mm,并且在第28天為O.80±O.071mm。與溶媒處理的動物相比，LVEDD無顯著的差異，這表明與溶媒組相比，重塑未得到改善。參見表17和圖23。用人心臟組織來源細(xì)胞處理的動物也顯示出左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)的減少。LVESD是收縮末期心室大小的量度。該參數(shù)不僅表示重塑,也表示心臟肌肉的收縮性。LVESD的減少相當(dāng)于收縮強(qiáng)度的增加。在溶媒處理動物中，LVESD從第5天至第28天均增加。在用IXIO4個hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中，LVESD維持在相同水平(第5天為O.56±0.05cm，第28天為0.54±O.08cm)。在用IXIO5個hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中的LVESD(第5天為O.58±0.04cm,第28天為O.51±0.08cm)和IXlO6個hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中的LVESD(第5天為O.62土O.05cm,第28天為O.48土O.09cm)均減少。參見圖22和表22。通過超聲心動描記術(shù)在每個時間點從每個動物測量的所有四個參數(shù)的功能數(shù)據(jù)在圖23中示出。第5天和第28天之間的趨勢變化在每個組中一致。hCTC(A3)細(xì)胞施用的目標(biāo)劑量與心臟功能(如通過縮短分?jǐn)?shù)(FS)測量的整體功能所確定)的分析顯示出細(xì)胞劑量和功能改善之間的相關(guān)性(P=O.001,η=35)。參見圖24。相似地，可觀察到hCTC(A3)細(xì)胞施用的目標(biāo)劑量與心臟重塑(如LVEDD從第5天至第28天的絕對變化(28D-5D)所確定)的分析(p=O.0002,η=35)。參見圖25。相關(guān)性已建立，并且其顯示出指數(shù)變化，而不是線性變化。實例12大鼠急件心肌梗塞樽型中人心臟組織來源細(xì)胞的滯留量為了進(jìn)一步理解人心臟組織來源細(xì)胞作為受損心肌療法的機(jī)制和生物學(xué)有益效果，從上述實例中的人心臟細(xì)胞處理的動物心臟采集組織樣品，以確定施用后四周的動物中人心臟組織來源細(xì)胞的滯留量。將心臟從上述實例中人心臟組織來源細(xì)胞處理的動物摘除，并在細(xì)胞施用后四周收集。細(xì)胞滯留量通過組織學(xué)(η=6/細(xì)胞劑量)和定量實時PCR(η=4/細(xì)胞劑量)測定。為了建立基線細(xì)胞滯留值，冠狀動脈左前降支綁扎后20分鐘，給測試動物施用hCTC(A3)細(xì)胞。在變色區(qū)的邊界區(qū)域、每個動物的五個單獨注射部位中注射低溫冷藏的hCTC(A3)細(xì)胞群。給動物施用IXΙΟ4、IXIO5或IXIO6個細(xì)胞的目標(biāo)劑量。在0、1、3和7天處死動物，并摘除心臟，用于通過定量實時PCR(n=3/處理組)進(jìn)行細(xì)胞滯留分析。在采得用于定量實時PCR的樣品的情況下，處理心臟組織以獲得總RNA?；谛呐K樣品中檢測的人RNA的量，評估人細(xì)胞的滯留量。在用hCTC(A3)細(xì)胞處理的動物中，細(xì)胞施用后4周可檢測到來自人心臟組織來源細(xì)胞的RNA。細(xì)胞滯留量表現(xiàn)出劑量依賴性，接受IXIO6個hCTC(A3)細(xì)胞的動物比接受lX105fhCTC(A3)細(xì)胞的動物顯示出更大的細(xì)胞滯留量。在接受lX104fhCTC(A3)細(xì)胞的動物中，基于樣品中檢測到的人RNA的量，估計細(xì)胞滯留量處于背景水平。人RNA可在細(xì)胞施用后O、I天、3天和7天處死的動物心臟中檢測到。施用后細(xì)胞滯留量即迅速下降，并且在細(xì)胞施用后24小時進(jìn)一步下降。如圖26的圖c和d中所示，細(xì)胞施用后，僅有約8%的目標(biāo)劑量剩余，如根據(jù)心臟樣品中檢測到的人RNA的量所評估。使用O時間點作為基線，當(dāng)在細(xì)胞施用后24小時確定時，細(xì)胞滯留的水平進(jìn)一步下降至大約O時間點的10%。細(xì)胞施用后第7天，細(xì)胞滯留的水平仍然保持在相同水平?？捎^察到人心臟組織來源細(xì)胞滯留和心臟重塑阻止之間的相關(guān)性。在接受人心臟組織來源細(xì)胞的動物中，LVEDD的變化(D28-D5)與人心臟組織來源細(xì)胞的滯留相關(guān)聯(lián)?？蓮膱D27中看出，相關(guān)性的趨勢具有顯著性，P值為0.023，r2值為41%。在高血壓的良好處方藥依那普利的臨床藥理學(xué)研究中(LilianMurray等人，BrJClinPharmacol.1998；45(6):559-566)，可觀察到研究中依那普利和血壓降低的顯著相關(guān)性(p小于O.01)。然而，“模型的預(yù)測能力增加了(r2=23.6%,P小于O.01)，但是仍然不能解釋響應(yīng)的大多數(shù)變_S*，，里ο在采得用于免疫組織化學(xué)的樣品的情況下，將心臟包埋在OCT培養(yǎng)基中，并且在液氮中快速冷凍(11=6/組)。在心臟的基部、中部和頂端水平切片。將包埋的冷凍組織送至QualTekTechnology(SantaBarbara,CA)進(jìn)行進(jìn)一步組織學(xué)評估。將組織在室溫下解凍，然后在福爾馬林中重新固定并包埋于石蠟中，再切成5μπι切片。將切片用抗人核基質(zhì)抗原(huNuMA)的抗體染色，以便識別大鼠心肌中的人心臟組織來源細(xì)胞。免疫組織化學(xué)結(jié)果與qPCR的結(jié)果相符。在接受目標(biāo)劑量為IXIO6個hCTC(A3)細(xì)胞的動物心肌中鑒定陽性人NuMA染色結(jié)果。參見圖28的分圖a和圖29。染成深褐色的且染色特性顯示出與人組織對照相似的NuMA陽性細(xì)胞在本文中以兩個橢圓環(huán)示出，并且未顯示出背景染色。細(xì)胞數(shù)量的估值為大約100個人細(xì)胞/切片。如圖29的圖d中所示，在高倍放大下，也可鑒定出類肌細(xì)胞人細(xì)胞。在溶媒處理動物中，未觀察到人NuMA的染色。參見圖28的分圖a和b、圖29和圖30。實例13人心臟組織來源細(xì)胞減少急件心肌梗塞動物樽型的fl巴大為了進(jìn)一步理解人心臟組織來源細(xì)胞作為受損心肌療法的機(jī)制和生物學(xué)有益效果，從實例11中的人心臟細(xì)胞處理的動物心臟采集組織樣品，以確定人心臟組織來源細(xì)胞的施用對心臟梗死面積普通病理的影響。由QualTek(SantaBarbara,CA)的病理學(xué)家評估組織病理。病理學(xué)家對研究處理不知情。將心臟組織包埋在石蠟塊中。獲得整個器官每5μπι的切片，并評估普通病理。通過評分系統(tǒng)進(jìn)行肥大評估。在肥大心肌(I分)中，通常可發(fā)現(xiàn)具有擴(kuò)大的細(xì)胞質(zhì)和奇核的心肌細(xì)胞。否則，心肌評為O分。對出現(xiàn)肥大和無肥大的切片進(jìn)行計數(shù)，在圖31中以占總切片的比例示出，以表示整個心臟中肥大的比例。在溶媒處理的動物心臟中觀察到心肌肥大，其中大約70%的心肌顯示出肥大(I分)。參見圖31。當(dāng)與溶媒處理的動物相比時，用人心臟組織來源細(xì)胞處理可顯著減少心臟中觀察到的肥大。在接受目標(biāo)劑量為IX104、1XIO5或IXlO6的hCTC(A3)細(xì)胞的心臟中，肥大心肌減少至30%-50%。參見圖31。為了闡明心肌梗塞的嚴(yán)重性，在每個心臟的乳頭肌水平的切片上進(jìn)行Masson三色染色。通過直接測量梗死區(qū)域和非梗死區(qū)域確定梗死面積。按100%[梗死面積/(梗死面積+非梗死面積)]估算相對梗死面積。所有形態(tài)測量研究根據(jù)Irasaki等人在Circulation.2006；113:1311-1325中描述的方法進(jìn)行。與溶媒組(24.1±2·9%)相比，在接受IXIO5(16.5±7·3%,p=O.02)或IXlO6個hCTC(A3)細(xì)胞(14.8±8.6%，p=O.01)的動物中觀察到相對梗死面積減少的趨勢。參見圖32的分圖a。相似地，與溶媒處理組(748±191)相比，也在接受IXIO5(557±221，p=O.09)或1X106(537±261，p=O.08)個hCTC(A3)細(xì)胞的動物中觀察到實際梗死區(qū)域的梗死面積減少的趨勢。參見圖32的分圖b。在溶媒處理的動物心臟中觀察到心肌肥大，其中大約70%的心肌顯示出肥大(I分)。參見圖31。當(dāng)與溶媒處理的動物相比時，用人心臟組織來源細(xì)胞處理可顯著減少心臟中觀察到的肥大。在接受目標(biāo)劑量為IX104、1XIO5或IXlO6的hCTC(A3)細(xì)胞的心臟中，肥大心肌減少至30%-50%。參見圖31。hCTC能實現(xiàn)肥大減少可直接歸因于營養(yǎng)作用或旁分泌作用，即hCTC分泌的細(xì)胞因子(如表24中所示)，和/或是由于肌細(xì)胞從頭生成的增加而出現(xiàn)繼發(fā)效應(yīng)(如下面實例14中所討論)。實例14在急件心肌梗塞的動物樽型中人心臟組織來源細(xì)胞增加了毛細(xì)血管密度為了進(jìn)一步理解人心臟組織來源細(xì)胞作為受損心肌療法的機(jī)制和生物學(xué)有益效果，從實例11中的人心臟細(xì)胞處理的動物心臟采集組織樣品，以確定人心臟組織來源細(xì)胞的施用對梗死區(qū)域邊界區(qū)毛細(xì)血管密度的作用。隨機(jī)選擇五個在梗死區(qū)域的邊界區(qū)采集的每個心臟左心室的組織切片，并且通過組織學(xué)檢查對毛細(xì)血管密度進(jìn)行形態(tài)測量評估，其中毛細(xì)血管可使用抗同工凝集素B4(VectorLaboratories(Burlingame,CA))或⑶31的抗體來顯現(xiàn)。同工凝集素B4對內(nèi)皮細(xì)胞表面糖殘基具有特異性，并已證實可識別多種狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞，如Vasudevan等人在NatureNeuroscience11:429-439(2008)中所描述，以及Schmidt等人在Development134,2913-2923(2007)中所描述。⑶31也稱為血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(PECAM)，已廣泛用于鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，從而可鑒定包括心臟在內(nèi)的各種組織中的脈管系統(tǒng)(Tabibiazar和Rockson,EurHeartJ，2001年，第22卷；903_918)。通過同工凝集素B4或⑶31進(jìn)行的毛細(xì)血管顯現(xiàn)表明，人心臟組織來源細(xì)胞的施用可增加在梗死區(qū)域邊界區(qū)的毛細(xì)血管密度。與溶媒處理組相比，細(xì)胞施用后四周，施用所有劑量的hCTC(A3)細(xì)胞都導(dǎo)致毛細(xì)血管密度的增加。參見圖33的分圖a和b。(對于同工凝集素B4染色，p=0.0068，并且對于CD31染色，p=0.0005)。毛細(xì)血管密度增加的部分原因是本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞分泌了一些因子。這些營養(yǎng)因子可(例如)以旁分泌方式在心臟細(xì)胞上發(fā)揮作用。營養(yǎng)因子可直接或間接影響血管形成、血管功能和血液動力學(xué)、心臟肌肉重塑和功能、肌細(xì)胞增殖(例如肌細(xì)胞生成)、肌細(xì)胞肥大、纖維化或增加心臟細(xì)胞存活率。營養(yǎng)因子也可調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)。為了確定人心臟組織來源細(xì)胞是否分泌營養(yǎng)因子，從體外培養(yǎng)七天的hCTC(A3)細(xì)胞群收集培養(yǎng)基。在測定所分泌細(xì)胞因子的存在之前，將培養(yǎng)基樣品保存在_80°C。hCTC(A3)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素2(ANG2)。參見表24。這些細(xì)胞因子在血管生成中發(fā)揮重要功能。更重要地，VEGF和ANG2的組合可協(xié)同引發(fā)和提高毛細(xì)血管出芽過程,如Maisonpierre等人在Science27755-60(1997)中所證實，以及Ramsauer等人在JournalofClinicalInvestigation1101615-1617(2002)中所綜述。實例15在接受本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的動物中的非梗死區(qū)域人心臟組織來源細(xì)胞增加了肌細(xì)胞密度為了進(jìn)一步理解人心臟組織來源細(xì)胞作為受損心肌療法的機(jī)制和生物學(xué)有益效果，從實例11中的人心臟細(xì)胞處理的動物心臟采集組織樣品，以確定人心臟組織來源細(xì)胞的施用對梗死區(qū)域的邊界區(qū)大鼠肌細(xì)胞的增殖的作用以及對心臟的非梗死區(qū)域中肌細(xì)胞密度的作用。將福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品切成4μπι切片。從每個動物選擇一張大約第17次切片的載玻片。將切片與抗Ki-67(ΜΙΒ-5)的抗體在室溫下溫育60分鐘，在PBS中洗滌，并且與微聚物標(biāo)記的親和小鼠IgG二抗溫育。將載玻片在PBS中洗滌，然后用可產(chǎn)生深藍(lán)色/灰色反應(yīng)產(chǎn)物的VectorSG底物顯色。將在PBS中沖洗過的載玻片使用DAPI(KPL(Gaithersburg,Maryland))進(jìn)行復(fù)染。陽性和陰性對照包括在每個染色方案中。平行地，將福爾馬林固定的切片與抗心臟肌球蛋白的抗體在室溫下溫育45分鐘，在PBS中洗滌，并且與生物素化小鼠IgG二抗溫育。在二次溫育完成后，施用VectastainABC-AP試劑(VectastainUniversalABC-APKit,VectorLaboratories,Inc.(Burlingame,CA))30分鐘。將載玻片在PBS中洗滌，然后使用可產(chǎn)生暗粉色至紅色反應(yīng)產(chǎn)物的液體永固紅色原(LiquidPermanentRedChromogen)(Dako(Carpinteria,CA))顯色。將在PBS中沖洗過的載玻片使用DAPI(KPL(Gaithersburg，Maryland))進(jìn)行復(fù)染。陽性和陰性對照包括在每個染色方案中。增殖的肌細(xì)胞通過Ki-67和肌球蛋白重鏈(MHC)雙染色測量。對MHC染色所識別的總肌細(xì)胞計數(shù)。在一個高倍視野中的總肌細(xì)胞數(shù)量在所有劑量的溶媒和細(xì)胞處理組之間是類似的。與溶媒處理的(2.3±0.01%)動物或接受IXIO6(I.2±0.01%)個細(xì)胞的動物相比，在接受1Χ104(3·8±0·02%)或1Χ105(3·7±0·02%)個hCTC(A3)細(xì)胞的動物中，總肌細(xì)胞中的增殖肌細(xì)胞的比率更高。參見表25和圖34。在接受IXIO6個細(xì)胞的動物中，總肌細(xì)胞中增殖肌細(xì)胞低比率的一種可能解釋是由于肌細(xì)胞響應(yīng)hCTC(A3)處理而進(jìn)入GO。Ki-67是細(xì)胞增殖標(biāo)記物，存在于細(xì)胞周期的所有階段。然而，當(dāng)周期中的細(xì)胞退出進(jìn)入GO期時，Ki-67不再存在。參見(例如)(ThomasScholzen2000；JournalofCellularPhysiology;182(3),311-322)。H&E染色將載玻片用2次更換二甲苯來脫蠟，每張載玻片10分鐘，然后用2次更換無水乙醇來重新水合，5分鐘每次，然后用95%乙醇處理2分鐘，并且用70%乙醇處理2分鐘。將載玻片在蒸餾水中短暫洗滌，然后在蘇木精溶液中染色8分鐘，在流動自來水中洗滌5分鐘，在I%酸性乙醇中分色30秒，用流動自來水洗滌I分鐘，在O.2%氨水中染色30秒至I分鐘。然后將載玻片在流動自來水中洗滌5分鐘，在95%乙醇(浸潰10次)中沖洗，然后在伊紅-焰紅B溶液中復(fù)染30秒至I分鐘，用95%乙醇脫水，2次更換無水乙醇，5分鐘每次，在2次更換二甲苯中洗滌，5分鐘每次，并且用二甲苯類封固劑封固。對于H&E染色載玻片，一個層面取樣自每個動物。在每個層面中，選擇五個400X視野出7，500μm2/視野)，所述視野包含橫切肌原纖維，并且左心室壁中大多數(shù)剖面毛細(xì)血管遠(yuǎn)離梗死區(qū)。每個層面的肌細(xì)胞密度報告為五個視野的平均值，并且以mm2表示。計算每個處理組的平均值、平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)誤差。在400X放大下，蘇木精和伊紅(H&E)染色組織中通常可見單個肌細(xì)胞。圖35示出了從接受IXIO5個hCTC(A3)細(xì)胞的心臟樣品以及從取自溶媒處理動物的樣品獲得的代表性圖像。在表26中，溶媒組的平均值(1813±84/mm2)低于任何處理組的平均值(IXlO4個hCTC(A3)細(xì)胞:2210±227，lX105fhCTC(A3)細(xì)胞:2220±186，IXIO6個hCTC(A3)細(xì)胞2113±186)。肌細(xì)胞密度增加的原因可能是增殖肌細(xì)胞(肌細(xì)胞生成)的增加和/或肌細(xì)胞肥大的減少，例如實例13中所描述。實例16人心臟組織來源細(xì)胞處理誘導(dǎo)大鼠心肌中差異的基因表達(dá)為了理解人心臟組織來源細(xì)胞施用誘導(dǎo)的分子變化，進(jìn)行基因譜研究以比較溶媒組和人心臟組織來源細(xì)胞處理組中的基因表達(dá)水平。細(xì)胞施用后四周，從接受1X104、IX105、1XIO6個hCTC(A3)細(xì)胞或溶媒的動物，從用于實例11中所描述研究的動物收集大鼠心臟。從樣品收集總RNA。將得自Affymetrix的HG_U133_Plus_2基因芯片用于進(jìn)行樣品中的基因表達(dá)分析。微陣列數(shù)據(jù)集使用SpotfireDecisionSite和“通過平均值歸一化”功能在整個微陣列芯片進(jìn)行歸一化。單個芯片組織成用于比較的組(目標(biāo)劑量為1X104、1X105和lX106hCTC(A3)和溶媒)。使用SpotfireDecisionSite建立p值和組之間的倍數(shù)變化。將至少3列數(shù)據(jù)的PresentCall列中不存在P,至少2列中不存在組比較p值小于或等于O.05的基因過濾出來，以及至少2列中不存在倍數(shù)變化大于或等于2.O或小于或等于O.5的任何基因過濾出來。過濾集包括45個所關(guān)注的基因。然后將45個基因輸入得自SpotfireDecisionSite的PrincipleComponentAnalysis(PCA)程序，以便使用該基因子集直觀地示出組分離。參見表27，其中已鑒定和列出差異表達(dá)的基因。在鑒定的基因中，轉(zhuǎn)化生長因子β受體(TGFPR)在以任何劑量接受hCTC(A3)細(xì)胞的動物中下調(diào)。參見圖35。TGFPR通路在先前的研究中已表明了心肌梗塞后可促進(jìn)肥大(參見(例如)Watkins,Jonker等人，CardiovascRes.2006FebI；69(2):432_9)和重塑(Ellmers,Scott等人,Endocrinology.2008Nov；149(11):5828-34)。據(jù)報道，TGF^和TGFPR的阻斷可減少肥大后的重塑和纖維化(參見例如Ellmers，Scott等人，Endocrinology.2008年11月；149(11):5828-34)。此外，據(jù)報道，梗塞后TGFβ和TGF3R通路的激活可增加肌細(xì)胞及心室的肥大和重塑(參見(例如)Matsumoto-Ida,Takimoto等人，AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2006Feb；290(2):H709_15)。通過差異基因表達(dá)分析鑒定的另一個基因是神經(jīng)元型一氧化氮合酶(N0S1)。梗塞后，NOSl在心臟中的表達(dá)增加。據(jù)報道，NOSl的過量表達(dá)可減少心肌的收縮性(參見例如Burkard,Rokita等人，CircRes.2007年2月16日；100(3):e32_44)。據(jù)報道，在人衰竭心臟中，NOSl在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)顯著增加，表明了NOSl在心臟功能不全發(fā)病中起到作用(參見例如Damy，Ratajczak等人，Lancet.2004年4月24日；363(9418):1365-7)。與溶媒處理的心肌相比，在所有劑量的hCTC(A3)細(xì)胞處理的心肌中，NOSl表達(dá)減少了10倍多。實例17在大鼠急性心肌梗寒模型中人心臟組織來源細(xì)胞處理減少了梗死面積并阻止肥太在嚙齒動物急性心肌梗塞模型中，將人心臟組織來源細(xì)胞治療受損心肌的效力與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞相比較。將96只8-10周齡的雌性裸大鼠(CharlesRiverLaboratories)用于本研究。按實例11中所述方法進(jìn)行外科手術(shù)。施用懸浮于ΙΟΟμΙ體積CryoStorD-Iite中的IXIO5個hCTC(A3)細(xì)胞(第I批)。施用懸浮于100μI體積CryostorD-Iite中的IXIO6個人間充質(zhì)干細(xì)胞(產(chǎn)品目錄號PT_2501，Lonza)，作為平行實驗。使用與實例11中的描述類似的過程，其中基于外科醫(yī)生的偏好作出以下修改當(dāng)梗死區(qū)域的變色可清晰觀察到時，在大約LAD綁扎后10分鐘，使用配有29號注射針的O.3ml胰島素注射器，將細(xì)胞注射至梗死邊界區(qū)域的兩個部位，每個部位注射50μI。在細(xì)胞施用后28天處死動物，并摘除心臟用于隨后的分析。剪去心房，并用鹽水沖洗心室。在切成四塊2mm切片前，將心臟浸入10%中性緩沖福爾馬林(NBF)中24h，對每塊切片進(jìn)行處理用于顯微鏡檢查，包埋于石蠟中，切成5μπι切片，并且用蘇木精和伊紅(Η&Ε)和/或Masson三色染料染色。將來自每個動物的兩塊切片并列示出一塊取自乳頭肌和基部層之間的中線，一塊取自乳頭肌。所有組和時間點的組織切片均經(jīng)盲控制，并且根據(jù)疾病的嚴(yán)重性(代償失調(diào)/擴(kuò)張和肥大)分成從最嚴(yán)重到最不嚴(yán)重的級別次序。給每個序數(shù)分配數(shù)字，最高的數(shù)字對應(yīng)于疾病嚴(yán)重性最大。然后撤銷盲控制，并且收集每個組的所有級別數(shù)值。在包括梗死區(qū)在內(nèi)的整個左心室游離壁采集所有圖像。從每個動物的用三色染料染色的2塊組織切片采集低倍(2Χ)圖像，并且分析梗死面積。在采集的圖像上使用Image-ProPlusV5.I軟件(MediaCybernetics,Inc.(Bethesda,MD))進(jìn)行梗死面積的自動形態(tài)測量分析。描出左心室游離壁的周邊，并且指定為所關(guān)注的區(qū)域(AOI)。代表梗死的藍(lán)染區(qū)所占的百分比以及代表功能性心肌的紅染區(qū)所占的百分比是從每張圖像獲取的兩個測量值。在梗塞后28天，對用H&E和/或Masson三色染料染色的心臟組織切片進(jìn)行檢查。與溶媒處理的動物相比，用lX105fhCTC(A3)細(xì)胞處理的動物以及用IXlO6個人間充質(zhì)干細(xì)胞處理的動物顯示出梗死區(qū)域減少。也可觀察到左心室和右心室擴(kuò)張的減少。參見圖36的分圖a和b。另外，在接受IXIO5個hCTC(A3)細(xì)胞的動物以及用IXlO6個人間充質(zhì)干細(xì)胞處理的動物的左心室游離壁中保留有功能性心肌。參見圖36的分圖C。有趣的是，hCTC(A3)細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞顯示出對室間隔(IVS)的差異作用，其中hMSC顯示出IVS的肥大擴(kuò)大，而在接受hCTC(A3)細(xì)胞的動物中則未觀察到此類變化。參見圖37。心肌細(xì)胞肥大變化的跡象存在于兩個組的間隔中，但是更顯著地存在于接受hMSC的動物中。肥大肌細(xì)胞和IVS導(dǎo)致心臟的最終重塑，這表明與人間充質(zhì)干細(xì)胞相比，本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞可對心臟功能起到更大有益效果。實例18在急性心肌梗寒動物模型中本發(fā)明的人心臟組織來源細(xì)胞的多批次和長期效力多批次人心臟組織來源細(xì)胞由三個供體制備。供體信息在表28中描述。簡而言之，第I批得自移植級心臟器官；第2批得自健康心臟，但是供體未達(dá)到移植的年齡標(biāo)準(zhǔn)；第3批得自診斷為衰竭的心臟病癥一擴(kuò)張性心肌病的供體。將雌性裸大鼠(體重250至300g)用氯胺酮和甲苯噻嗪(分別為60和10mg/kgIP)麻醉。在左四肋間隙打開胸部，把心臟從腹內(nèi)取出，并切割心包膜。此后，用鑷子夾住心臟，并且在冠狀動脈左前降支下、距其原位大約2mm處用6-0Proline縫合線打成環(huán)。通過拉動綁扎線封閉動脈來誘導(dǎo)心臟的AMI。可用肉眼觀察到梗死心肌的變色。MI誘導(dǎo)后二十分鐘，使大鼠接受IXlO6個來自第1、2或3批hCTC(A3)的hCTC(A3)細(xì)胞的心肌內(nèi)移植。使動物接受IXIO6個pCTC(A3)細(xì)胞或人新生兒真皮成纖維細(xì)胞(產(chǎn)品目錄號CC-2509，Lonza)或溶媒，作為平行實驗。在施用前所有細(xì)胞群均低溫冷藏，并且將懸浮于CryoStorDlite中的細(xì)胞群以120μI的最終體積注射至心臟中。細(xì)胞在2個部位施用，每個部位注射50μI細(xì)胞懸浮液或CryoStorDlite0注射完成后，關(guān)閉胸部。每組中編入10只動物。研究中觀察到的死亡率為32%。如表29中所示，組之間的死亡率無顯著差異。心臟功能的絕對值在表30中示出。在細(xì)胞施用后1、4和12周，用經(jīng)胸超聲心動描記術(shù)(S0N0S5500，PhilipsMedicalSystems)進(jìn)行LV功能的評估。測量以下參數(shù)左心室(LV)舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、LV收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)、局部室壁運動記分(RWMS)。在所有測試的參數(shù)中，細(xì)胞施用后28天和84天，第I批hCTC(A3)細(xì)胞的施用改善了心臟功能。參見圖38和39。如局部室壁運動記分RWMS和FS所測量，在梗塞后84天，第2批hCTC(A3)細(xì)胞的施用能夠改善心臟收縮性和整體心臟功能。在細(xì)胞施用后7天，溶媒和細(xì)胞處理組之間FS是類似的。然而，細(xì)胞施用后84天，在第2批hCTC(A3)細(xì)胞和第I批hCTC(A3)細(xì)胞的處理組中，通過FS測量的心臟功能分別提高了9·5±6·0%(η=8，P<0·01)、8·9±4·1%(η=8，ρ<0.001)。參見圖39和表30。在溶媒處理組(-1.0±3.3%)、第3批hCTC(-0.4±3.0%)和人成纖維細(xì)胞(4.1±2.1%)組中，觀察到FS幾乎無變化。參見圖39和表30。與溶媒處理的動物相比，在接受hCTC(A3)第I批或第2批細(xì)胞的動物中，RWMS也減少，其中對于第I批細(xì)胞，從第7天的24.83±I.64減少至22.13±I.5(N=8，ρ小于O.05)，對于第2批細(xì)胞，從25.44±I.O減少至23.13±2.2(N=8，ρ小于O.05)，這與整體功能是相符的。參見表30。如LVESD所示，在當(dāng)前研究中，第I批或第2批hCTC(A3)細(xì)胞在梗塞后28和84天可阻止重塑。細(xì)胞施用后28天，在接受第I批hCTC(A3)細(xì)胞的動物中，LVESD減少(-8.9+4.1%)。在接受第2批hCTC(A3)細(xì)胞的動物中，LVESD保持在基線(-0.5±4.3%)。相反地，在溶媒處理的動物中，細(xì)胞施用后28天，LVESD增加16.4±5.2%。在接受第3批hCTC(A3)細(xì)胞或人成纖維細(xì)胞的動物中，LVESD分別增加9.I±2.3%和5.4±3.6%。參見圖38和表30。細(xì)胞施用后84天，在溶媒組中，LVESD增加16.3±2.8%。相似地，接受第3批hCTC(A3)細(xì)胞的動物，或人成纖維細(xì)胞處理的動物，在84天也顯示出左心室的擴(kuò)大。LVESD分別增加12.5±3.7%和7.6±3.7%。相比之下，在接受第1批hCTC(A3)細(xì)胞的動物中(-3.9±5.2%)，或在接受第2批hCTC(A3)細(xì)胞的動物中(_1.8±4.2%)未發(fā)生心臟重塑。參見圖39和表30。如LVEDD所測量，在接受第1批hCTC(A3)細(xì)胞的動物中(7天0.80±0.10cm;84天0.84±0.07cm,5%增量)，以及接受第2批hCTC(A3)細(xì)胞的動物中(7天0.74±0.07cm；84天0.82±0.06cm；6.7%增量)，舒張末期左心室擴(kuò)張的增加得以阻止。相反地，在溶媒處理的動物中(7天0.75±0.03cm;84天0.86±0.06cm；14.6%增量)，以及接受人成纖維細(xì)胞的動物中(7天0.73±0.034cm;84天0.83±0.06cm；13.7%增量)，LVEDD增加。接受第3批hCTC(A3)細(xì)胞的動物也顯示出LVEDD的增加(7天0.73±0.04cm；84天0.82±0.06cm；12.3%增量)。參見圖39和表30。實例19心臟組織來源細(xì)胞的大小方法和材料在細(xì)胞計數(shù)期間，根據(jù)本發(fā)明的方法分析從人、小鼠、豬和大鼠心臟獲得的心臟組織來源細(xì)胞的細(xì)胞大小。在細(xì)胞群消化后和轉(zhuǎn)接前的總活細(xì)胞計數(shù)使用Vi-CellXR(BeckmanCoulter(Fullerton,CA))進(jìn)行。Vi-Cell細(xì)胞存活率分析儀使用視頻捕獲技術(shù)獲得流動池中細(xì)胞的多達(dá)100張圖像并進(jìn)行圖像分析，實現(xiàn)了用于細(xì)胞存活率評估的臺盼藍(lán)染色排除法自動化。樣品根據(jù)制造商說明書(ReferenceManualPN383674Rev.A(《參考手冊PN383674修訂版A》))制備和分析。簡而言之，將RBC裂解后所得的最終細(xì)胞懸浮液的500uL等分試樣轉(zhuǎn)移至Vi-Cell4ml樣品瓶中，并且使用Vi-CellXR細(xì)胞存活率分析儀分析。細(xì)胞大小通過計數(shù)細(xì)胞的平均直徑確定。hCTC(A3)細(xì)胞直徑的平均值為16.7±2.13iim。rCTC(A2)細(xì)胞的直徑為18.4±1.0211111，并且口(1'((六3)細(xì)胞的直徑為17.2±0.42iim。基于這些數(shù)據(jù)，尺寸大于或等于20ym的過濾器可允許本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞通過過濾器收集，并排除其他細(xì)胞類型。實例20本發(fā)明的心臟組織來源細(xì)胞的低溫冷藏得到可直接施用、在臨床時不需要進(jìn)一步處理的產(chǎn)品是有利的。為了得到此類產(chǎn)品，使用臨床批準(zhǔn)的低溫冷藏溶液測試人心臟組織來源細(xì)胞的低溫冷藏。此外，還測試了低溫冷藏溶液在心肌中的毒性。為了進(jìn)行低溫冷藏，將hCTC(A3)細(xì)胞通過胰蛋白酶消化收集于培養(yǎng)瓶。將細(xì)胞庫低溫冷藏于包含2%v/vDMS0的CryoStorDlite(BioLifeSolutions,Inc.(Bothell,WA))中。根據(jù)J.G.Baust和J.M.Baust編輯的AdvancesinBiopreservation中描述的原理，CryoStorDlite是無動物源低溫冷藏液，其設(shè)計用于在超低溫環(huán)境(_80°C至_196°C)下制備和保藏細(xì)胞。也可使用提供(例如)低溫儲存必需的電解質(zhì)、滲透和緩沖條件的其他溶液。使用帶有DeltaT軟件的Integra750Plus程序冷凍儀(Planer(Middlesex,U.K.))將細(xì)胞懸浮液低溫冷藏于Nalgene2mL無菌內(nèi)旋蓋聚丙烯凍存管(NalgneNunc(Rochester,NY))中。在放入保持在15°C的程序冷凍儀之前細(xì)胞和溶液處于室溫下。將樣品溫度探頭置于盛有凍存緩沖液的瓶中。使用以下程序低溫冷藏細(xì)胞步驟編號速率(°C/min)終點溫度(°C)觸發(fā)器觸發(fā)器1-1-6樣品2-25-65冷凍室3+10-19冷‘室4+2.16-14冷凍室5-1-100冷凍室6-10-140冷凍室當(dāng)溫度達(dá)到-140°C時，將樣品轉(zhuǎn)移至液氮罐儲存。將本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。盡管已通過參考實例和優(yōu)選的實施例對本發(fā)明的多個方面進(jìn)行了闡述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不由前面的描述限定，而是由根據(jù)專利法的原理正確解釋的權(quán)利要求書所限定。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生不表達(dá)端粒酶的心臟組織來源細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟a.獲得心臟組織，b.解離所述心臟組織，c.消化所述心臟組織以釋放細(xì)胞，d.從所述釋放的細(xì)胞除去心肌細(xì)胞，以及e.培養(yǎng)剩余的細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述心臟組織是手工解離的。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述心臟組織是機(jī)械解離的。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述心臟組織用至少一種選自膠原酶和分散酶的酶消化。5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中整個心臟用作所述心臟組織的來源。6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中不表達(dá)端粒酶的所述心臟組織來源細(xì)胞表達(dá)以下標(biāo)記物中的至少一種CD49e、CD105、CD59、CD81、CD34和CDl17。7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中不表達(dá)端粒酶的所述心臟組織來源細(xì)胞不表達(dá)以下標(biāo)記物中至少一種MDR、CD19、CD16、CD46、CD106和Isl-I。8.一種治療患者中受損心肌的方法，所述方法包括以下步驟a.獲得不表達(dá)端粒酶的心臟組織來源細(xì)胞群，以及b.以足以治療所述受損心肌的量給所述患者施用所述心臟組織來源細(xì)胞群。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述心臟組織來源細(xì)胞的所述施用是通過直接注射進(jìn)所述受損心肌。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述心臟組織來源細(xì)胞的所述施用是通過直接注射進(jìn)緊密圍繞所述受損心肌的所述心臟區(qū)域。11.一種修復(fù)患者中受損心肌的方法，所述方法包括以下步驟a.獲得不表達(dá)端粒酶的心臟組織來源細(xì)胞群，以及b.以足以修復(fù)所述受損心肌的量給所述患者施用所述心臟組織來源細(xì)胞群。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述心臟組織來源細(xì)胞的所述施用是通過直接注射進(jìn)所述受損心肌。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述心臟組織來源細(xì)胞的所述施用是通過直接注射進(jìn)緊密圍繞所述受損心肌的所述心臟區(qū)域。14.一種純化的人心臟組織來源細(xì)胞群，所述細(xì)胞不表達(dá)端粒酶，但表達(dá)以下標(biāo)記物中的至少一種CD49e、CD105、CD59、CD81、CD34和CDl17。15.一種純化的人心臟組織來源細(xì)胞群，所述細(xì)胞不表達(dá)端粒酶，也不表達(dá)以下標(biāo)記物中的至少一種:MDR、CD19、CD16、CD46、CD106和Isl-I。全文摘要本發(fā)明涉及使用人心臟組織來源細(xì)胞修復(fù)受損心肌的方法和組合物。具體地講，本發(fā)明提供使用不表達(dá)端粒酶的擴(kuò)增人心臟組織來源細(xì)胞修復(fù)受損心肌的方法和組合物。文檔編號C12N5/071GK102712897SQ201080031924公開日2012年10月3日申請日期2010年7月8日優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日發(fā)明者I·R·哈里斯,J·S·肯尼迪,J·楊,S·蒙加,X·王申請人:詹森生物科技公司