專利名稱：敗血癥的質(zhì)譜診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對來自血流感染(敗血癥)的血液培養(yǎng)物中病原體的質(zhì)譜鑒定。
背景技術(shù)：
許多微生物種(以下稱為微生物)，特別是細菌和單細胞真菌(如酵母菌或霉菌) 還有藻類和原生動物，都可以通過以下方式進行確定性很高的質(zhì)譜鑒定，即在營養(yǎng)培養(yǎng)基上以通常方式繁殖菌落，然后將少量微生物從所述菌落轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜樣品載板上，并用質(zhì)譜儀直接測量蛋白質(zhì)譜。質(zhì)譜圖具體地顯示了不同可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量和豐度，這些蛋白質(zhì)以足夠高的濃度存在于所述微生物中。通過與質(zhì)譜庫中參考質(zhì)譜進行相似性分析，所述微生物的這種蛋白質(zhì)譜可用于來確定其種類。專門用于此用途的專業(yè)質(zhì)譜儀、相應(yīng)的評估及相似性分析程序可通過商業(yè)渠道獲得?，F(xiàn)在，該鑒定過程被證明非常成功并迅速被世界各地的微生物實驗室所采用?！拌b定”微生物是指將其按分類學(xué)等級分類方案加以分類域(真核生物和原核生物)、界、門、綱、目、科、屬、種，以及亞種。微生物樣品的鑒定包括至少確定屬，通常是種，如果可能的話還有亞種甚至株，這一點很重要，例如當(dāng)不同的亞種或株具有不同的病原性時。 在更為普遍的意義上，鑒定還可以指表征所述微生物的其他更多個體特性，如微生物對抗生素的抵抗性。通常含有用于培養(yǎng)菌落的營養(yǎng)培養(yǎng)基作為皮氏培養(yǎng)皿中的瓊脂，根據(jù)微生物的繁殖力，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基使得可在大約六小時到幾天內(nèi)會長出分離的微生物菌落形式的純菌株。如果菌落互相重疊或大量混合，可采用以普通方法再次進行的二次培養(yǎng)來獲得純菌落。最簡單的方法是，將一些微生物從選定菌落以小涂抹棒(swab)轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀樣品載板上，然后用常規(guī)基質(zhì)物質(zhì)(通常為α-氰基-4-羥基肉桂酸[!10^]或2，5-二羥基苯甲酸 [DHB])的強酸溶液噴灑，以便借由基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)進行電離。酸(通常為甲酸或三氟乙酸)可以攻擊細胞壁，并且基質(zhì)溶液的有機溶劑(通常為乙腈)能夠滲入微生物的細胞內(nèi)并使變?nèi)醯募毎谄屏选＝酉聛硗ㄟ^蒸發(fā)溶劑干燥樣品，這會引起溶解的基質(zhì)發(fā)生結(jié)晶。可溶性蛋白和極少量的其他細胞物質(zhì)會包埋到所述基質(zhì)晶體中。然后用質(zhì)譜儀內(nèi)紫外線激光的聚焦閃光轟擊包埋有分析物分子的所述基質(zhì)物質(zhì)晶體，在蒸汽云的高溫等離子體內(nèi)產(chǎn)生分析物分子的離子；然后再根據(jù)這些離子的質(zhì)量將其分離，并在質(zhì)譜儀內(nèi)進行測量。為了達到此目的一般會使用專業(yè)MALDI飛行時間質(zhì)譜儀 (MALDI-TOF-MQ。質(zhì)譜是這些分析物離子的質(zhì)量值的譜。這些離子絕大部分是蛋白離子， 具有最有用信息的離子的質(zhì)量大約在3，000道爾頓到15，000道爾頓之間。這種方法中的蛋白離子絕大部分僅是單電荷的(電荷數(shù)ζ = 1)，因此允許只提及離子的質(zhì)量m，而不需總是使用“質(zhì)荷比”m/z，質(zhì)荷比在使用其他類型的質(zhì)譜法時實際是必需的且常規(guī)的。蛋白質(zhì)的譜恰恰是待研究微生物種的特征，因為每種微生物種均生成其自身的遺傳上預(yù)先確定的蛋白組，每種蛋白具有其自身的特征性分子量。具有可以用質(zhì)譜儀檢測的較高濃度的蛋白質(zhì)的豐度也可廣泛地采用遺傳方法控制，并且僅稍微依賴于營養(yǎng)條件或菌落成熟度。蛋白質(zhì)譜類似地是不同類型的微生物的特征，如同指紋是每個人的特征一樣。如今，公立和私立的研究所以及各大學(xué)微生物研究所的許多實驗室正在充分擴大可靠的且經(jīng)驗證的充分記錄的微生物參考質(zhì)譜庫。這些參考庫必須滿足嚴苛的要求才能在醫(yī)學(xué)和法律上得到認可。本鑒定法已被證明非常成功。其正確鑒定的確定性遠高于目前為止所用的微生物鑒定法。對于數(shù)百種不同類型的微生物，已有可能證明所述鑒定的確定性超過95%。對于大部分疑案來說(與到目前為止使用的微生物鑒定法的鑒定結(jié)果有些偏差)，基因測序已經(jīng)確認了質(zhì)譜鑒定的正確性。如果所述庫中沒有可用于正在研究的微生物種的參考質(zhì)譜(這偶爾發(fā)生，原因是微生物種達數(shù)百萬種并且當(dāng)前譜庫的大小有限)，庫搜索一般都能夠產(chǎn)生有價值的分類將所述微生物分到屬或科的較高分類水平，因為相關(guān)的微生物經(jīng)常含有一些相同類型的蛋白質(zhì)。不過這種情形越來越少見，因為病原微生物現(xiàn)今實際上已全部以參考譜的形式記錄在案，因此一般可以精確鑒定到微生物種的水平。以上簡要描述的利用小涂抹棒把一些微生物從菌落轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀樣品載板的樣品點，然后噴灑基質(zhì)溶液的方法，是最簡單且迄今為止最快速的樣品制備法。如果培養(yǎng)后可以用肉眼看到菌落，那么即使同時需要分析數(shù)百個樣品，最多也只需要一到兩個小時就可以完成鑒定。帶有48、96或384個樣品點的質(zhì)譜儀樣品載板均可以從商業(yè)渠道獲得的；獲得這些數(shù)量的樣品的質(zhì)譜需要花費半小時到兩小時。緊急鑒定時可以在幾分鐘內(nèi)鑒定出個體微生物樣品(雖然是在培養(yǎng)后，培養(yǎng)總是耗時的)。還研究了其他樣品制備方法，例如已經(jīng)以超聲波或機械處理破壞所述微生物后提取蛋白質(zhì)，或者已經(jīng)用強酸將所述微生物的細胞壁弱化后(細胞壁有時候很堅硬)提取微生物蛋白質(zhì)。這些分解法可以在因噴灑所述基質(zhì)溶液未破壞所述微生物的細胞壁而無法采用正常擦拭法時使用。如果擦拭法產(chǎn)生的質(zhì)譜好到足以進行對比時，所有分解法均提供與擦拭法生成的譜非常相似的譜，它們在質(zhì)譜中甚至往往顯示較低的干擾背景。如今，由于MALDI飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-T0F)有特別高的檢測靈敏度，微生物蛋白質(zhì)的質(zhì)譜一般是在其線性模式下獲得的，雖然其反射模式下的質(zhì)譜質(zhì)量分辨率和質(zhì)量精確度更好。但是，在反射模式中，只出現(xiàn)大約二十分之一的離子信號，檢測靈敏度也差10 到100倍。高靈敏度的基礎(chǔ)是，飛行時間質(zhì)譜儀的線性模式下不但可以檢測穩(wěn)定的離子，而且可以檢測更多的碎片離子，甚至是來自離子飛行期間發(fā)生的所謂“亞穩(wěn)的”衰變的中性粒子。二次電子倍增器(SEM)可作為離子檢測器使用，測量分子離子、碎片離子和中性粒子， 因為它們都在受到撞擊時產(chǎn)生次級電子。加速后從一種母離子的離子源生成的所有碎片離子和中性粒子具有與母離子相同的速度，因此同時抵達離子檢測器。抵達時間是原先未分解的離子的質(zhì)量度量值。增加檢測靈敏度對許多應(yīng)用而言極為重要，因此可以允許以線性模式操作飛行時間質(zhì)譜儀時存在的許多缺點，如質(zhì)量分辨率明顯降低。解吸和離子化激光儀的能量在這些應(yīng)用中會增加，這會使離子產(chǎn)量增加，但也會增加其不穩(wěn)定性，盡管這點在本發(fā)明中并不重要。利用飛行時間質(zhì)譜儀取得質(zhì)譜通常需要測定大量個體質(zhì)譜，并快速連續(xù)地數(shù)字化，所述個體質(zhì)譜一般都會通過在相同的飛行時間內(nèi)添加測量點而被疊加在一起，以便形成總譜。每個個體譜的離子均是利用針對每個譜的紫外線脈沖激光儀的一束激光閃光產(chǎn)生的?？傋V必須以此方式產(chǎn)生，因為個體譜信號的測量動態(tài)范圍低，并且噪聲大。這里最少需要大約50個個體譜，有些情況下甚至需要1，000個或更多；總譜一般含有數(shù)百個個體譜，現(xiàn)代質(zhì)譜儀能夠在幾秒鐘內(nèi)獲取這些個體質(zhì)譜，并將其疊加。對于微生物鑒定，通常測定從2，000道爾頓到20，000道爾頓的高質(zhì)量范圍的質(zhì)譜。但是，最多大約3，000道爾頓的較低質(zhì)量范圍內(nèi)的質(zhì)量信號可靠性不高，因為它們大部分來自于附著在微生物外部的包衣肽，或來自于依賴營養(yǎng)物種類和有效性的脂肪酸，以及其他各種偶然存在的物質(zhì)。如果僅評價質(zhì)量范圍在3，000和15，000道爾頓之間的質(zhì)量信號，則能得到最佳的鑒定結(jié)果。由于上述原因發(fā)生的低質(zhì)量分辨意味著已經(jīng)不能在該質(zhì)量范圍內(nèi)分辨質(zhì)量信號差1個道爾頓的同位素群。因此，質(zhì)量信號反映了所述同位素群的包絡(luò)線(envelope)外形。這種鑒定微生物的方法需要相同微生物的純培養(yǎng)物，即所謂的“分離物”，以便取得沒有與其他微生物類型的信號重疊的質(zhì)譜。不過，已證明也可以用特殊方法評估兩種微生物種混合物的質(zhì)譜，并且能夠鑒定這兩種微生物種。鑒定確定性僅受到輕微影響。如果生成質(zhì)譜的微生物種超過兩種，鑒定概率和鑒定精確性將明顯降低。微生物鑒定在鑒定血流中的感染性微生物(俗稱敗血癥)時尤為重要。通常微生物會從未知的感染點持續(xù)地或成批地被釋放到血液中。這時，重要的是及早鑒定病原體種類，以便盡早使用正確的抗生素開始靶向治療。質(zhì)譜鑒定法與PCR分析互相競爭，在PCR分析中通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)復(fù)制所述微生物DNA的一些基因序列(其特征在于選擇性發(fā)揮作用的引物對)。這些方法非常快，能夠在數(shù)小時內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果。不過，PCR分析法需要預(yù)先知道所述微生物的種、屬、科或綱， 以選擇正確的引物對。例如，一般而言，根據(jù)革蘭氏陽性或革蘭氏陰性的特征，只能進行“粗略”的分類。微生物的種水平上的確定只在個別案例中有可能實現(xiàn)，并且要根據(jù)假設(shè)采取非常具有針對性的方法。該方法通常限于鑒定個體的、經(jīng)常發(fā)生的以及特別危險的病原體，如金黃葡萄球菌Staphylococcus aureous)。個體微生物種的陽性鑒定仍然靠有價值的“幸運的誤打誤撞”。在陰性鑒定的個案中，雖然了解哪些危險的微生物可以被排除在外的信息確實有其價值，但是并不能提供治療依據(jù)。因此，微生物種的準確確定必須要靠傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法，但是這很容易就耗費3到5天的時間。文獻DE 10 2007 058 516 Al (WP0 2009/065580 Al)描述了一種方法，可借由離心或過濾直接把病原體從體液中分離出來，這樣可將微生物從沉淀物(離心或過濾片狀沉淀物)轉(zhuǎn)移到樣品載板上。該文獻中還描述了一種更好的方法，那就是清除還留在離心管內(nèi)的上清液后，分解所述沉淀物的微生物，例如通過添加幾微升的強酸基質(zhì)溶液，接著把帶有釋放出的蛋白質(zhì)的溶液轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜樣品載板上。利用離心法，即使未產(chǎn)生肉眼可見的片狀沉淀物也可以進行分解。離心片狀沉淀物的能見度極限約為大約IO6個微生物；相比之下，檢測極限約為約IO4個微生物，但是未來仍有可能提高。IO4個微生物一般含有100 皮克以上的可溶性蛋白質(zhì)，但質(zhì)譜檢測的極限遠低于此。因為對于澄清體液(clear body fluid)中的感染不需要培養(yǎng)階段，因此利用這種將體液直接離心的方法可以在幾分鐘內(nèi)在質(zhì)譜實驗室中完成鑒定。直接離心或過濾微生物的這種方法之所以成功，原因在于，在絕大多數(shù)的案例中
5(遠超過70% )，體液中的急性微生物感染僅由單一微生物種引起。約15%的較低百分比的案例中有兩個微生物種，這些案例中的兩個微生物種一般都可以用質(zhì)譜識別。急性感染病原體的這種種純度與其他人體內(nèi)或人體表面出現(xiàn)的微生物形成鮮明對比——如人體腸道菌叢中的大約IO14個細菌含有至少400個細菌種，這些細菌互相平衡生長。但直接離心的方法只有當(dāng)微生物以每毫升超過IO4個微生物的極高濃度存在時才有效，而這種濃度在內(nèi)部體液中非常少見。體液一般為無菌狀態(tài)，也就是說，體液中通常不含有任何微生物。如同上述引用文獻中的描述，在離心器或微濾器中沉淀微生物的方法可以直接且高度成功地應(yīng)用于所有澄清的體液(如淋巴液、關(guān)節(jié)液或腦脊髓液(液體))，甚至排泄的體液(如尿液或淚液)。對于含有內(nèi)源性細胞的體液(如全血)必須引入中間步驟首先通過培養(yǎng)血液來培養(yǎng)微生物，因為微生物濃度通常只有每毫升0. 5到10個；然后完全并徹底破壞血細胞(如紅血球或白血球)以便徹底去除全部的人蛋白質(zhì)。在引用的文獻中，這種破壞例如通過添加蒸餾水完成。與細菌的較堅硬細胞壁不同，人類細胞的細胞膜非常脆弱， 可以很輕易地用水的滲透壓破壞。反復(fù)添加蒸餾水并離心，可以得到足夠干凈的片狀沉淀物，其中不再含有人類細胞的殘留物。但是，在申請人的實驗室中利用這種添加蒸餾水的方法進行的試驗，即使是在多次反復(fù)沖洗和離心操作時，也并沒有成功地提供足夠干凈的離心沉淀物。即使沉淀物不再帶輕微的紅色，與人類蛋白質(zhì)信號的重疊仍然總是干擾來自這些沉淀物的微生物蛋白質(zhì)的信號，達到使鑒定變得不可靠的程度。本發(fā)明旨在提供一種快速的方法，用于清晰地分離血液中的敗血癥病原體，而不殘留任何微量的人類蛋白質(zhì)，使得質(zhì)譜鑒定的精確度達到種或亞種的水平，同時還可以對所述病原體進行其他研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于一種用于通過從體液中沉淀微生物或使微生物成片狀沉淀物進行直接沉淀的方法，所述方法借由文獻DE 10 2007 058 516 Al (WP0 2009/065580 Al)中獲悉的離心或過濾，但使用強表面活性劑溶液(即兩親的表面活性物質(zhì))而非純蒸餾水來破壞細胞。SDS(十二烷基硫酸鈉)——一種生物技術(shù)中用作蛋白質(zhì)的變性劑的強陰離子表面活性劑——經(jīng)證實是理想的，雖然有如下事實(1)已知微量表面活性劑在電離過程(如 MALDI)中是蛋白質(zhì)和其他分析物物質(zhì)的電離抑制劑，(2)已知如SDS的強力表面活性劑會殺死微生物，也就是它們通過破壞細菌的復(fù)制能力而起到殺細菌劑作用。在一個特別簡單的實施方案中，把表面活性劑未經(jīng)任何預(yù)先處理直接添加到約 Iml來自血液培養(yǎng)物的血液中，然后在振蕩器(shaker)中充分混合10到30秒。優(yōu)選地，把表面活性劑以溶液形式添加，例如以10 μ 1到200 μ 1的5%到20% SDS水溶液的形式?；旌现罅⒓磳⑺龌旌衔镆?0，OOOg離心2分鐘，棄去上清液。在大多數(shù)情況下，如果片狀沉淀物清晰可見，所述沉淀物會顯示非常清晰的白色。為了去除任何微量的表面活性劑，將片狀沉淀物用Iml的蒸餾水清洗并再次離心。再度移除上清液。此時，可以用幾微升的甲酸及乙腈簡單地處理所述沉淀物并將1到2 μ 1的所述溶液轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜樣品載板上，此時添加基質(zhì)溶液并且進行干燥。由于這些準備步驟都可以很快進行，最多只需15分鐘就可以在將樣品準備在載板上以用于質(zhì)譜測量。只需要幾分鐘就可以把樣品載板放到質(zhì)譜儀的排氣(evacuated)離子源中并測量，所以半小時內(nèi)就能夠完成質(zhì)譜鑒定。出乎意料地，可以獲得微生物蛋白質(zhì)譜的清晰質(zhì)譜，而沒有任何人類蛋白質(zhì)的干擾信號；雖然中間使用了表面活性劑，但是所述測量仍被證明是高度靈敏的。從血液樣品中沉淀微生物以進行質(zhì)譜鑒定的這種方法只有在血液中微生物水平為超過IO4個微生物/毫升的高水平時才能實施，患者的原始血液中通常沒有這么多的量。在正常敗血癥中，以“菌落形成單位”(CFU)測量的存活并活躍的微生物水平在0. 5至 10CFU/ml之間，只有受到感染的兒童才顯示最高達100CFU/ml和100CFU/ml以上的水平。 因此，不得不通過在最佳溫度下把血液孵育在合適的血液培養(yǎng)瓶中用適當(dāng)?shù)奶砑游锱囵B(yǎng)所述血液中的微生物。該培養(yǎng)方式是眾所周知的，并顯著地比利用皮氏培養(yǎng)皿進行的培養(yǎng)物培養(yǎng)快很多，特別是對嚴重感染，通常在幾小時到最長達幾天內(nèi)就可提供足夠的微生物用于鑒定。只有生長非常緩慢的微生物(例如一些分枝桿菌)才需要幾天到幾星期的培養(yǎng)時間。該方法具有獨特的優(yōu)點，不需要任何事先了解而將所述微生物分類到微生物種甚至亞種的水平。不需要形態(tài)(或顯微鏡)檢查、生物化學(xué)基本反應(yīng)或其他類型的預(yù)先測試。 知道了微生物類，治療所述患者的醫(yī)師就可以馬上開始對患者進行靶向治療，因為對于大部分的微生物而言，已知對它們有效的抗生素信息。該微生物種對抗生素的抗藥性(根據(jù)地區(qū)或醫(yī)院不同而有所變化)通常也是已知曉的。對在加護病房中的敗血癥患者盡早開始靶向治療不但對患者很有益(甚至挽救生命)，而且也非常節(jié)省花費。雖然在微生物學(xué)中已知可以用強表面活性劑(特別是SDQ溶解血細胞，但一般不使用這種方法。像SDS這樣的強表面活性劑被認為是殺菌劑，而微生物的復(fù)制能力在微生物鑒定法中很重要。不過這并不適用于質(zhì)譜鑒定法，因為在質(zhì)譜鑒定法中，必須保留的僅僅是細胞壁的結(jié)構(gòu)完整件和內(nèi)部蛋白質(zhì)的化學(xué)完整件，而不是復(fù)制能力。伯.是,根據(jù)上文描述的本發(fā)明的非常快速方法，其中微生物最多只暴露于SDS幾分鐘，令人驚訝的是，雖然表面活性劑有殺菌作用，但是很多微生物依然存活并保持它們的復(fù)制能力；因此，所述從血液中隔離和分離微生物的方法還可以用于提供更多分離形式的微生物用于其他研究，如抗性測試ο本發(fā)明特別基于快速及完全的溶解不同類型的血細胞，而不破壞微生物。血細胞脆弱的細胞膜主要由磷脂構(gòu)成，磷脂以非共價鍵的方式形成膜。強表面活性劑(尤其是 SDS)可溶解蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的全部非共價鍵，并摧毀所述分子的四級和三級結(jié)構(gòu)。因此，細胞膜會完全溶解。血細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也被SDS破壞和溶解，包括細胞核的膜以及白血球的染色體。離心或過濾后，這些溶解的成分全都與上清液一起被移除。因白血球DNA引起的一些新問題將在稍后討論。另一方面，細菌的細胞壁非常穩(wěn)定；它們主要是由交聯(lián)的聚合胞壁質(zhì)組成。該共價鍵結(jié)合的網(wǎng)面能夠經(jīng)受表面活性劑的溶解作用。對于接下來的質(zhì)譜鑒定而言，只要微生物的內(nèi)部蛋白質(zhì)不喪失或改變其一級結(jié)構(gòu)，使用本方法過程中微生物是否死亡(例如借由展開內(nèi)部蛋白質(zhì)的三級或四級結(jié)構(gòu))或者是否仍然能夠復(fù)制并不重要。但是對于許多微生物來說，根據(jù)本發(fā)明的短暫隔離和分離方法仍然能夠留下足夠的微生物，這些微生物在后續(xù)培養(yǎng)中作為分離物進行復(fù)制。


圖1顯示了簡單的基本程序，已知該程序?qū)τ谒邪籽蛩秸５幕颊叩难憾际浅晒Φ?。圖2顯示了高白血球水平時克服DNA凝集問題的方法，不過是以靈敏度降低為代價。圖3顯示了具有一般靈敏度的程序，該程序可以應(yīng)用到所有高白血球水平的血液樣本。
具體實施例方式以下敘述的優(yōu)選實施方案是基于具有超過IO4個微生物/毫升的足夠高濃度微生物的血液樣品。僅在極少數(shù)的情況下，如果醫(yī)師處理特別急性的感染，這可以是原始狀態(tài)的釋放血液；通常，該方法涉及在可從商業(yè)渠道獲得的適當(dāng)血液培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)了數(shù)小時到數(shù)天的血液。專家應(yīng)了解，所述培養(yǎng)通常是將幾對血液樣品放在幾對培養(yǎng)瓶中進行，一組用于培養(yǎng)好氧性微生物，另一組則用于培養(yǎng)厭氧性微生物。所述培養(yǎng)瓶中已經(jīng)放了抗凝血劑和營養(yǎng)物；添加血液后，將所述培養(yǎng)瓶放在37°C的培養(yǎng)箱中孵育。此外，血液培養(yǎng)瓶中也已經(jīng)含有大多數(shù)抗生素的抑制劑或吸附材料。即使試圖用原始血液進行立即鑒定(在未來質(zhì)譜檢測靈敏性得到充分發(fā)展后將更有可能實現(xiàn))，未使用的血液部分仍然方便進行培養(yǎng)。這些血液可以作為儲備，以防利用原始血液的直接鑒定法沒有獲得足夠可靠的鑒定結(jié)果。目前有幾種可從商業(yè)渠道獲得的具體血液培養(yǎng)瓶，具有嵌入式指示器用于指示微生物生長狀態(tài)是否足夠。大多數(shù)情況下，這些指示器是根據(jù)對所述微生物產(chǎn)生的不斷增加的二氧化碳濃度的測量。這些血液培養(yǎng)瓶易于處理，并通過信號自動指示微生物的充分繁殖。但是，本申請人實驗室中的研究已表明，該信號在質(zhì)譜鑒定時很晚才會出現(xiàn)。在信號顯示微生物充分繁殖之前二到四小時，已經(jīng)可以利用培養(yǎng)的血液成功地獲得鑒定結(jié)果。因此， 對于危險且嚴重的敗血癥的情況，應(yīng)每小時或每兩小時或者其他適當(dāng)?shù)臅r間間隔嘗試所培養(yǎng)的血液中的微生物進行質(zhì)譜鑒定，而不是等待信號出現(xiàn)。從血液直接取得微生物(未經(jīng)血液培養(yǎng))并在皮氏培養(yǎng)皿中進一步培養(yǎng)的早期方法是在1976年前后由G. L Dorn開發(fā)的，利用了血細胞溶解和軟離心。溶解-離心法的開發(fā)導(dǎo)致了知名的“Isolator ”試管誕生，首先由杜邦公司(美國威明頓)進行商業(yè)制造，接著由美國新澤西州Cranbury Wampole Laboratories生產(chǎn)，現(xiàn)在英國Basingstoke Hunt的 Oxoid Limited也生產(chǎn)這種產(chǎn)品。Isolator 是Carter-Wallace，Inc.的商標(公司位于美國紐約州的紐約市，郵編10105)。過去三十年來，在全球各地用于分離微生物，特別是從人類巨噬細胞(一種白血球)分離分枝細菌，使用的Isolator 試管數(shù)量達幾百萬支。根據(jù)“Wampole Isolator 手冊”，Isolator 試管含有(a)皂角苷，用于宿主細胞溶解，(b)聚丙二醇，作為泡沫緩速劑(f0am retardant), (c)聚茴香硫酸鈉(SPS)，作為抗凝血劑，(d) EDTA，作為抗凝血劑，(e)全氟烷(Fluorinert)，一種用于濃縮細菌的且不與水混溶的液體塑料(作為離心墊)。有不同類型的皂角苷，它們都是由不同植物產(chǎn)生的天然去污劑(表面活性劑)。Isolator 試管內(nèi)的皂角苷是經(jīng)過脫毒的皂角苷，能夠溶解人類細胞的細胞壁而不殺死微生物。Isolator 試管用于軟離心，僅可以3，OOOg離心30分鐘的較長時間，目的也在于不破壞微生物。該方法的目的是從血液中提取活性微生物，用于在具有適當(dāng)養(yǎng)分的皮氏培養(yǎng)皿中重新培養(yǎng)所述微生物。與此方法相反，本發(fā)明以從培養(yǎng)的血液中快速回收純 Μ微生物以用于質(zhì)譜鑒定為目標，必須去除所有微量的人類蛋白質(zhì)，否則會干擾鑒定。在所述質(zhì)譜鑒定法中，不要求對于微生物鑒定方法來說很重要的微生物復(fù)制能力，因為在質(zhì)譜鑒定法中需要保持的僅是細胞壁的結(jié)構(gòu)完整性和內(nèi)部蛋白質(zhì)分子的化學(xué)完整性，而不是復(fù)制能力。對于質(zhì)譜鑒定，如果通過展開內(nèi)部蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)使其變性，則復(fù)制能力不起任何作用。但是，在根據(jù)上述本發(fā)明的非?？焖俜椒?其中微生物最多只暴露于SDS幾分鐘)中，已證明雖然SDS 有抗生作用，但是很多微生物仍然保持其復(fù)制能力；因此，從血液中隔離和分離微生物的方法也可以提供更多分離微生物用于其他研究，如抗性測試。圖1中顯示了一個從培養(yǎng)的血液中分離和隔離微生物的方法的非常簡單但很成功的實施方案。該方法首先將近Iml的血液添加到幾支專用離心管的每一支內(nèi)，加入表面活性劑溶液，然后混合均勻。優(yōu)選地，把表面活性劑以溶液形式添加，例如20到200μ 1(優(yōu)選100 μ 1)的5%到20% (優(yōu)選10% )的SDS溶液。將血液放到幾支離心管內(nèi)不但可以使離心平衡，還可以立即取得確認樣品以用于可靠的鑒定。在振蕩器中混合10到30秒后，將離心管內(nèi)的血液樣品以10，OOOg離心兩分鐘。利用例如帶有可移除吸頭的常規(guī)移液管將深紅色上清液移除。這時取出微生物沉淀物并用蒸餾水清洗；在再次離心后，剩下分離的微生物的沉淀物，如果可見則為純白色。只有嚴重的病例才需要重復(fù)清洗步驟以便排除所有的微量人類蛋白質(zhì)；每次清洗處理僅延長整個過程約2到3分鐘。操作SDS溶液需要小心，因為該溶液很容易產(chǎn)生泡沫，而頑固的泡沫會維持數(shù)小時或者甚至數(shù)天，使得難以使用所述液體。在優(yōu)選的模式中，可以在SDS溶液中添加泡沫抑制劑(消泡劑)。目前市場中有幾種類型的消泡劑。使用消泡劑的原則已經(jīng)從Isolator 試管已知。在最后一次清除上清液后，必須提取微生物的可溶性蛋白質(zhì)。這可以通過利用生理-化學(xué)方法破壞細胞壁并溶解蛋白質(zhì)來進行。通常所述提取可簡單地通過加入大約幾微升的70%甲酸來進行，甲酸會猛烈攻擊所述微生物細胞壁的肽聚糖(胞壁質(zhì))并破壞細胞結(jié)構(gòu)。為了盡量溶解更多蛋白質(zhì)添加了等量的乙腈。僅在少見的案例中，需要使用聲波或機械性破壞等其它方法。為了使固體組成(如細胞壁碎片)沉淀，將可溶性蛋白質(zhì)溶液離心，然后把約1 μ 1的各上清液利用移液管移到MALDI樣品載板的樣品點上。在干燥以后， 把約1 μ 1的基質(zhì)物質(zhì)溶液(優(yōu)選溶解在水中的HCCA或DHB和帶有少量三氟乙酸的乙腈) 添加到每個樣品制劑中?？梢詫字б蜒b有血液樣品的離心管同時進行這些步驟。在干燥后，樣品載板上的樣品制劑可以開始用于獲取質(zhì)譜。如果需要分析的血液樣品很多，可以同時處理這些樣品，把樣品制劑放到同一個MALDI樣品載板的其它樣品點上。目前可從商業(yè)渠道獲得不同類型的MALDI樣品載板，帶有48、96、384個樣品點。例如，有些樣品載板含有在疏水性環(huán)境中的直徑為約2毫米的親水性固定位置。然后，轉(zhuǎn)移的溶液會在所述固定位置形成直徑為2毫米的半球形小滴。其它市面上出售的樣品載板的樣品點含有預(yù)先裝好的基質(zhì)物質(zhì)層(HCCA)。一次性樣品載板上有直徑為2毫米的肉眼可見的激光蝕刻環(huán)，用來阻止所述小滴擴散。這些樣品載板都適用于于根據(jù)本發(fā)明方法的質(zhì)譜測量部分。
可以用很多種方式修改用于測量樣品的簡單制備方法。其中一個選項是利用已經(jīng)帶有一薄層基質(zhì)物質(zhì)(例如HCCA)的樣品載板。然后，可以把含有甲酸和乙腈的上清液用移液管直接移到該薄層上。該薄膜具有立即吸附基質(zhì)晶體表面上所有蛋白質(zhì)的特性，使得在大約1分鐘后，可以利用例如移液管或簡單使用吸液紙去除剩余的液體。這種做法還可以去除諸如鹽類或殘留的表面活性劑等的雜質(zhì)。接下來可選的添加的一滴乙腈可以把蛋白質(zhì)牢牢地包埋入所述薄層的小晶體內(nèi)，從而增加靈敏度。也可以用微濾沉淀和清洗微生物，而不是用離心來沉淀微生物。因為添加表面活性劑會使血細胞的細胞膜和它們的內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本上完全溶解，利用微濾也可以獲得所述微生物的純分離物。從血液中分離微生物及制備測量樣品的這些過程總共只需約10到15分鐘。接著，把裝有所述樣品制劑的樣品載板通過真空鎖定以常規(guī)方式放到從商業(yè)渠道獲得的質(zhì)譜儀的離子源中。質(zhì)譜儀運轉(zhuǎn)約5分鐘。在其中紫外線脈沖激光以200赫茲運轉(zhuǎn)的質(zhì)譜儀中，只需要幾秒即可從測量的樣品獲得足夠數(shù)量的個體譜，從而得到非常有用的總質(zhì)譜。因此，一分鐘后就可以獲得質(zhì)譜(現(xiàn)在有2kHZ激光器的MALDI-T0F質(zhì)譜儀可以從商業(yè)渠道獲得)。還有一些從商業(yè)渠道獲得的計算機程序可以利用微生物的質(zhì)譜進行隨后的微生物鑒定，例如“Biotyper”(德國Bruker Daltonik, Bremen)。從良好的質(zhì)譜鑒定微生物所需要的時間視計算機的性能、參考質(zhì)庫的大小、相似性分析的算法而定。在質(zhì)譜儀中使用從商業(yè)渠道獲得的計算機，只需要幾秒鐘到最多幾分鐘就可以鑒定樣品(包括確認樣品)質(zhì)譜；因此，在對血液中的微生物進行成功培養(yǎng)后，半小時內(nèi)就能以數(shù)字或打印方式取得微生物鑒定結(jié)果。所有這些取得純微生物沉淀物并接著用質(zhì)譜儀鑒定的簡單方法用于第一次送到醫(yī)院的正常患者血液時都很成功。本發(fā)明的該最簡單實施方案的鑒定成功率超過95%。然而，有許多具有最新手段的?？漆t(yī)院，這些醫(yī)院中患有慢性病和許多未知疾病的患者最終經(jīng)歷了徹底檢測和特殊治療。在這些具有患罕見和難解疾病的患者的醫(yī)院中， 在用SDS溶液處理血液樣品后，高達40%的血液樣品形成大的粘性塊并可視地充溢在深紅色液體中。這些粘性物帶有未知百分比的微生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用移液管吸取粘性物周圍的一些液體用于進一步處理，但是該方法非常困難，并且會因未知因素降低檢測極限。研究表明，這些粘性塊主要由大量增加的白血球的DNA組成，可能混雜了血液中凝結(jié)的蛋白質(zhì)。患者的血液中通常顯示白血球的數(shù)量激增。對于這個問題，有幾種解決方案。首先又很簡單的解決方案是，添加SDS溶液前可以用蒸餾水把血液稀釋至2到10倍，優(yōu)選約5倍。稀釋至5倍會將成功率增加到90%以上，但是如果使用相同的Iml離心管，也會將該方法的靈敏性降低5倍。對于嚴重病例，可能無法等待為了產(chǎn)生更多微生物所需的更長培養(yǎng)時間。作為針對凝結(jié)問題的第二個解決方案，可以使用一種在添加SDS溶液前先離心血液樣品的方法。該方法的成功率得到了提高，可能是因為在添加SDS溶液前先去除了血液中全部凝結(jié)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的該更優(yōu)選的實施方案中(該實施方案可以作為標準程序引進到?？漆t(yī)院)，先離心初始放到離心管內(nèi)的血液而不添加表面活性劑溶液。接著去除含有上百種蛋白質(zhì)、添加的營養(yǎng)物和抗凝劑的上清血漿，然后用表面活性劑溶液(如SDS溶
10液)僅處理深紅色的沉淀物，添加到試管的總量最高為1ml。Iml血液中的深紅色沉淀物不但含有微生物，通常還含有5百萬個紅血球、7千個白血球，還有20萬個血小板，將其在振蕩器中與添加的表面活性劑溶液一起混合，從而破壞血細胞的細胞膜并釋放出可溶性蛋白質(zhì)。再度離心該深紅色溶液，這時上清液依然為深紅色，而沉淀物若肉眼可見則是純白色。 這時可以重復(fù)除去上清液、添加表面活性劑溶液和離心的過程，以便去除最后的血細胞殘留物。然后可以反復(fù)用純蒸餾水重復(fù)該過程，以去除表面活性劑，因為表面活性劑會干擾基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)的電離。在最后一次去除上清液后，不論是否可見都以上述方法分解沉淀物，然后把可溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣品載板上。作為針對血液凝結(jié)問題的第三個解決方案，可以與特殊抗凝劑一起配制SDS溶液，以便抑制所述粘性物的形成。該方案可以與第二種方案結(jié)合。作為第四個解決方案，可以添加一種或多種核酸酶溶解所述粘性物。如果在最后的清洗步驟后看到沉淀物，則可以實施本發(fā)明的另一個實施方案，包括用涂抹棒將少量如此分離的微生物移到樣品載板上，在樣品載板上可以用普通的方法處理所述微生物。傳統(tǒng)擦拭技術(shù)的質(zhì)譜在很大程度上與離心管內(nèi)使用酸的分解技術(shù)的質(zhì)譜類似。如果有明顯差異，該兩種樣品制備方式的質(zhì)譜可以進入質(zhì)譜庫作為參考質(zhì)譜使用。本發(fā)明提供了一種可靠鑒定血液中微生物病原體的方法，該方法比以往的微生物學(xué)方法(在實踐中一般通過在皮氏培養(yǎng)皿的凝膠上培養(yǎng)微生物進行)顯著更簡單、更快速。 本發(fā)明在培養(yǎng)過程后直接從血液獲得純化的微生物，它們在血液中以充足的種純度存在， 而對于出現(xiàn)在人體其它部位中或上的微生物卻不是如此。與PCR分析法不同，本發(fā)明的鑒定法可以在事先無任何了解的情況下實施，卻可以直接達到鑒定微生物的種或亞種水平。 目前沒有其它鑒定方法如此快速可靠。本發(fā)明特別基于以如下方式快速及完全破壞不同類型的血細胞即獲得非常純的微生物，而來自血細胞的內(nèi)源性血液蛋白質(zhì)不會干擾該鑒定。與血細胞不同，微生物細胞的結(jié)構(gòu)在該鑒定過程中不會遭到破壞。血細胞脆弱的細胞膜主要由磷脂構(gòu)成，磷脂以非共價鍵的方式形成膜。表面活性劑(特別是SDQ對蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的作用特別是基于破壞所有非共價鍵，從而破壞細胞膜和細胞結(jié)構(gòu)分子的四級和三級結(jié)構(gòu)。因此，細胞膜和所有內(nèi)部細胞結(jié)構(gòu)會完全溶解，所述表面活性劑發(fā)揮溶解劑的作用。細胞膜的磷脂自身是兩親性的， 也就是具有表面活性劑的特性，能夠通過形成膠束被其它表面活性劑以納米膠體的形式溶解。血細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(包括白血球細胞核的膜及染色體)也會被SDS破壞并徹底溶解。 所有這些溶解成分在離心后會隨上清液一起被去除，或者通過微濾被去除。另一方面，細菌的細胞壁非常穩(wěn)定；它們主要是以共價鍵交交聯(lián)并因此聚合的胞壁質(zhì)(肽聚糖)組成。對于革蘭氏陽性菌，還有與磷壁酸(也是聚合的)的交聯(lián)。這些共價鍵結(jié)合的網(wǎng)能夠承受至少數(shù)分鐘的表面活性劑的短時間溶解作用。只要不釋放內(nèi)部蛋白質(zhì)或改變其一級結(jié)構(gòu)，在本方法中微生物是否死亡對于后續(xù)的質(zhì)譜鑒定是無關(guān)的。但是對于許多微生物來說，根據(jù)本發(fā)明的短暫方法仍然能夠使足夠多的微生物存活下來并復(fù)制， 用于進一步培養(yǎng)。這種方法非常簡單。因此對分離的微生物進行的鑒定在傳統(tǒng)方法后進行，但傳統(tǒng)方法通常是基于通過在培養(yǎng)基培養(yǎng)單獨的菌落來分離一種類型的微生物。這種分離自動存在，因為對于急性感染來說只有一種或最多只有兩種微生物被發(fā)現(xiàn)是病原體。這表示從被感染的血液中分離這些微生物能夠提供足夠量的微生物，所述微生物代表足夠純的微生物培養(yǎng)物(分離物)。即使存在兩種微生物，這方法也仍然非常有效。為了簡化鑒定血液中微生物的方法，可以制備含表面活性劑及消泡劑的即用混合物的分析試劑盒并將其進入商業(yè)渠道銷售。所述混合物中可能含有額外的抗凝血劑和核酸酶；這些混合物的滅菌部分可以裝入即用的排氣離心杯中，易于裝填血液樣品。該分析試劑盒中還可包括純化的溶液，用于從沉淀的微生物中提取蛋白質(zhì)；以及基質(zhì)溶液，用于在質(zhì)譜樣品載板上的樣品制備。該分析試劑盒中甚至還可以包括單向質(zhì)譜樣品載板。如果隔離和分離微生物的方法中使用的離心管比鑒定需要的多(如十二支離心管)，那么一些分離的微生物沉淀物也可以用于進一步的診斷目的一例如在有抗生素的情況下使用傳統(tǒng)的功能性培養(yǎng)試驗法確定微生物的抗藥性。從內(nèi)源細胞分離微生物積聚物的方法不但可以應(yīng)用于血液，也可以應(yīng)用于膿腫或其它炎癥病灶，因為其中也含有內(nèi)源性細胞。該方法的一個例子是化膿性病灶，即一些生物的積聚物，一些被部分消化的微生物混合有攻擊所述微生物的某些類型的白血球。在這種情況下，內(nèi)源性細胞也可以被表面活性劑溶液溶解。另一個例子是有炎癥的鼻粘膜，其以鼻粘膜擦拭物形式獲得并且其中主要目的是鑒定微生物。也可以從其它粘膜獲得這些類型的樣品。在上述方法中，利用基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)電離質(zhì)譜儀獲得微生物的質(zhì)譜。 這是常用的方式，但不必唯一的方式。例如，也可以用電噴射來離子化微生物的可溶性蛋白質(zhì)的溶液。這種類型的電離可產(chǎn)生質(zhì)量范圍大約為600到1，600道爾頓的重疊程度很高的多電荷離子，需要高分辨率的質(zhì)譜儀。正交發(fā)射離子的飛行時間質(zhì)譜儀(OTOF-MS)可以作質(zhì)譜儀使用，也可以使用離子回旋共振質(zhì)譜儀(ICR-MQ或其他高分辨率的質(zhì)譜儀。為了取得微生物的質(zhì)譜，可將電噴霧離子化形成的電子的不同電荷水平以數(shù)學(xué)方式結(jié)合。不過，也可以進行物理電荷還原。這涉及了把荷正電的蛋白質(zhì)離子和合適的荷負電離子一塊引入位于電噴射離子源和分析器之間的離子反應(yīng)器，造成蛋白質(zhì)離子的去質(zhì)子化。然后，把這些蛋白質(zhì)離子引入質(zhì)譜儀中，不過質(zhì)譜儀必須能夠處理大范圍的質(zhì)量。其他已知的電離法也可以在這里使用。例如，一個有利的方法是大氣壓化學(xué)電離 (APCI)。通過將液體霧化和蒸發(fā)液滴，或者通過非電離的弱激光解吸(“激光消融”)把分子化學(xué)電離。化學(xué)電離幾乎只提供單電荷的離子，因此用起來很理想，但是同樣需要能夠處理大范圍質(zhì)量的質(zhì)譜儀。了解本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用許多種的方式修改以上所述的方法。這些修改中有一些已經(jīng)在上文進行了描述；還有一些方法基于直接分離來自血液、膿腫或其他炎癥組織的微生物，可以產(chǎn)生對其鑒定所需要的微生物質(zhì)譜信息。
權(quán)利要求
1.用于對血液中微生物進行質(zhì)譜鑒定的方法，包括以下步驟-通過添加表面活性劑溶解來自所述血液培養(yǎng)物的血液樣品中的血細胞，-通過離心或過濾沉淀所述微生物，-獲取所述微生物的質(zhì)譜，-通過所述質(zhì)譜鑒定所述微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過培養(yǎng)產(chǎn)生足夠數(shù)量的血液中的微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中清洗通過離心沉淀的所述微生物并再次進行離心。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中將十二烷基硫酸鈉(SDQ用作所述表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中所添加的表面活性劑為溶液形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述表面活性劑溶液中含有消泡劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中將抗凝血劑添加到所述血液樣品中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其中將一種或多種核酸酶添加到所述血液樣品中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中用蒸餾水稀釋用于所述血液樣品的所述血液，稀釋比例在1 2和1 10之間。
10.根據(jù)權(quán)利9的方法，其中用蒸餾水稀釋用于所述血液樣品的所述血液，稀釋比例為約 1 5。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其中將所述血液樣品離心，去除上清液，然后添加所述表面活性劑溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其中利用生理-化學(xué)方法將所述沉淀的微生物分解。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中用含有酸如甲酸或三氟乙酸和有機溶劑如乙腈的溶液分解所述沉淀的微生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的方法，其中使用基質(zhì)物質(zhì)在質(zhì)譜樣品載板上進行測量樣品的制備，其中所述沉淀微生物的可溶性蛋白質(zhì)包埋在所述基質(zhì)物質(zhì)的晶體中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的方法，其中所述測量樣品的制備包括把一些所述沉淀的微生物轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜樣品載板上，向所述質(zhì)譜樣品載板上添加基質(zhì)溶液。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其中用基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)飛行時間質(zhì)譜儀來進行所述質(zhì)譜測量。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項的方法，其中使用沉淀的微生物來確定它們對抗生素的抗性。
18.用于從血液、膿腫、炎癥組織樣品或粘膜擦拭樣品獲得未經(jīng)人蛋白質(zhì)污染的純形式的微生物的方法，所述微生物用于進行質(zhì)譜鑒定，其中用表面活性劑破壞所述血液、膿腫、 炎癥組織樣品或粘膜擦拭樣品的內(nèi)源性人細胞，并且通過離心或過濾將所述微生物以沉淀形式從所述液體中分離。
19.用于根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項的對血液中微生物的質(zhì)譜鑒定的分析試劑盒， 包含含消泡劑的即用表面活性劑溶液。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及利用對來自血流感染(敗血癥)的血培養(yǎng)物中病原體的質(zhì)譜鑒定。本發(fā)明提供了一種方法，用所述方法可以在血液培養(yǎng)瓶中經(jīng)過相對短暫培養(yǎng)后從血液中分離純形式的微生物病原體，而無任何血細胞(如紅血球和白血球)的人類干擾蛋白質(zhì)或任何殘留級分，并能夠通過對它們的蛋白質(zhì)譜的質(zhì)譜測量直接進行鑒定。該方法基于使用相對較強的表面活性劑來通過溶解所述血細胞的脆弱細胞膜和大部分內(nèi)部結(jié)構(gòu)而破壞所述血細胞；盡管表面活性劑在MALDI和其他進行質(zhì)譜測量所需要的電離過程中被視為強的電離抑制劑。該方法允許借助離心或過濾獲得純化形式的未知病原體，并允許在種或亞種分類水平上鑒定未知病原體。獲自高水平白血球的DNA的問題可以借由具體措施解決。充分培養(yǎng)之后，在質(zhì)譜實驗室中進行所述鑒定只需要半小時。
文檔編號C12Q1/04GK102471798SQ201080032009
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日
發(fā)明者T·梅爾 申請人:布魯克·道爾頓公司