專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)抑制針對(duì)膠原基因的天然反義轉(zhuǎn)錄物來(lái)治療膠原基因相關(guān)的疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求保護(hù)提交于2009年6月16日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/187，384、提交于2009年12月16日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/286，939號(hào)和提交于2009年12月16日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/286，965號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)通過(guò)引用以其整體結(jié)合于本文中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)膠原基因和相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對(duì)于核酸功能的許多方面(包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)而言為重要的。雜交對(duì)于探測(cè)特定核酸或者改變其表達(dá)的各種技術(shù)而言亦為主要的。反義核苷酸例如通過(guò)與靶RNA雜交來(lái)擾亂基因表達(dá)，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。反義DNA具有附加的特征，該特征為DNA-RNA雜合體充當(dāng)核糖核酸酶H消化的底物，該活·性存在于大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中?？蓪⒎戳x分子遞送到細(xì)胞中，這與寡脫氧核苷酸(ODN)的情況一祥，或者它們?nèi)鏡NA分子ー樣可由內(nèi)源基因表達(dá)。FDA最近批準(zhǔn)了ー種反義藥物，VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療應(yīng)用。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)使用靶定天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸來(lái)抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用，引起相應(yīng)有義基因的増量調(diào)節(jié)的方法。本文也考慮天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可通過(guò)siRNA、核酶和小分子來(lái)達(dá)到，認(rèn)為所述siRNA、核酶和小分子在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?！獋€(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO 4的核苷酸1-387、SEQ ID NO 5的核苷酸1-561、SEQID NO 6 的核苷酸 1-335、SEQ ID NO 7 的核苷酸 1-613、SEQ ID NO 8 的核苷酸 1-177 和SEQ ID NO 9的核苷酸1-285之內(nèi)的5_30個(gè)連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的天然反義序列，例如SEQID NO :4-9所述的核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :10-29所述。另ー個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義物的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。另ー個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與膠原基因反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含一·種或多種與有義和/或反義膠原基因多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾或取代的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的鍵。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾核苷酸包含經(jīng)修飾的堿基，其包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟-或碳、亞甲基或其他鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選地，所述修飾核苷酸為鎖定核酸分子，包括a -L-LNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸在藥物組合物中施用。治療方案包括至少一次給患者施用反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時(shí)間內(nèi)包含多個(gè)劑量。所述治療可與一種或多種其它類(lèi)型的療法組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質(zhì)體中或附著于載體分子(例如膽固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附圖
簡(jiǎn)述圖I為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對(duì)照，用硫代磷酸寡核苷酸處理IfepG2細(xì)胞后Collal mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，IfepG2細(xì)胞中Collal mRNA的水平在用針對(duì)Collal反義物DW440457設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加。表示為⑶R-1361至⑶R-1364的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID NO :10-13處理的樣品。圖2為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對(duì)照，用硫代磷酸寡核苷酸處理HUVEC細(xì)胞后Colla2 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示HUVEC細(xì)胞中Colla2 mRNA的水平在用針對(duì)Colla2反義物Hs. 571263設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加。表示為CUR-0862、CUR-0864、CUR-0863、CUR-0865、CUR-0866 和 CUR-CUR-0867 的條分別對(duì)應(yīng)于用 SEQ ID NO :14-19 處理的樣品。圖3為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對(duì)照，用硫代磷酸寡核苷酸處理HUVEC細(xì)胞后Col7al mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示HUVEC細(xì)胞中Col7al mRNA的水平在用針對(duì)Col7al設(shè)計(jì)為CV425857(CV425857. 1UCV425857. 12)的 siRNA 之一和針對(duì) BU615800. 1(BU615800. 11)的一種 siRNA 處理后 48h 顯著增加。表示為 CUR-0356、CUR-0358、CUR_0360 和 CUR-0362 的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID NO 20-23處理的樣品。圖4為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對(duì)照，用硫代磷酸寡核苷酸處理IfepG2細(xì)胞后Col7al mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，IfepG2細(xì)胞中Col7al mRNA的水平在用針對(duì)Col7al設(shè)計(jì)為be 142537和bg998538的兩種寡核苷酸處理后48h顯著增加。表示為CUR-0360和CUR-0856至CUR-0860的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID NO 22和SEQID NO 24-28處理的樣品。序列表描述SEQ ID NO 1 :人類(lèi)(Homo sapiens)膠原，I 型，a I (COLlAl) ,mRNA(NCBI 檢索號(hào)NM_000088. 3)。SEQ ID NO 2 :人類(lèi)膠原，I 型，a 2 (C0L1A2)，mRNA (NCBI 檢索號(hào)NM_000089. 3)。SEQ ID NO 3 NM_024013. 11 人類(lèi)膠原，VII 型，a I (C0L7A1)，mRNA(NCBI 檢索號(hào)NM_000094. 3)。SEQ ID NO :4_9 SEQ ID NO 4 :天然 COLlAl 反義序列(DW440457)； SEQ ID NO 5 :天然 C0L1A2 反義序列(Hs. 571263) ；SEQ ID NO 6 :天然 C0L7A1 反義序列(CV425857. I) ；SEQ ID NO 7 :天然 C0L7A1 反義序列(BU615800. I) ；SEQ ID NO 8 天然 C0L7A1 反義序列(BE142537)和 SEQ ID NO 9 :天然 C0L7A1 反義序列(BG998538)。SEQ ID NO 10-29——反義寡核苷酸?！畆’指RNA而*指硫代磷酸酯鍵。SEQ ID NO :30-33分別為反義寡核苷酸SEQ ID NO :20-23的反向互補(bǔ)序列?！畆’指 RNA。發(fā)明詳述參考用于說(shuō)明的示例應(yīng)用在下文中描述本發(fā)明的數(shù)個(gè)方面。應(yīng)當(dāng)理解的是，陳述許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的充分理解。然而，在相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，可在不含一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施本發(fā)明或者可用其他方法來(lái)實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明不受行為或事件的排序限制，因?yàn)橐恍┬袨榭梢圆煌捻樞蜻M(jìn)行和/或與其他行為或事件同時(shí)進(jìn)行。此外，并非所有說(shuō)明性的行為或事件對(duì)實(shí)施本發(fā)明的方法都為必需的。意圖本文公開(kāi)的所有基因、基因名稱(chēng)和基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于來(lái)自任何物種的同源物，對(duì)該物種而言本文公開(kāi)的組合物和方法為適用的。因此，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于來(lái)自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。理解的是，當(dāng)公開(kāi)來(lái)自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，意圖此公開(kāi)僅為示例性的，并且除非其出現(xiàn)的文段中明確指示，否則不應(yīng)理解為限制。因此，例如，對(duì)于本文公開(kāi)的在一些實(shí)施方案中有關(guān)哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來(lái)自其他動(dòng)物(包括但不限于其他哺乳動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi))的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物。在實(shí)施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用的術(shù)語(yǔ)僅以描述具體的實(shí)施方案為目的而不意圖限制本發(fā)明。除非文段另有明確指示，否則也意圖本文所用的單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式。此夕卜，就術(shù)語(yǔ)“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其變型在詳述和/或權(quán)利要求中所用的程度而言，意圖這類(lèi)術(shù)語(yǔ)以類(lèi)似于術(shù)語(yǔ)“包含”的方式為包括在內(nèi)的。術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意為在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)，這部分取決于該值是如何測(cè)定或確定的，即，測(cè)量系統(tǒng)的限制。例如，按照本領(lǐng)域的實(shí)踐，“約”可意為在I個(gè)或大于I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)。或者，“約”可意為高達(dá)給定值的20 %，優(yōu)選10 %，更優(yōu)選5 %，和還更優(yōu)選I %的范圍。或者，具體地關(guān)于生物系統(tǒng)或過(guò)程，該術(shù)語(yǔ)可意為在值的數(shù)量級(jí)之內(nèi)，優(yōu)選在值的5倍之內(nèi)，更優(yōu)選在2倍之內(nèi)。當(dāng)本申請(qǐng)和權(quán)利要求描述具體值時(shí)，除非另作說(shuō)明，否則應(yīng)假設(shè)術(shù)語(yǔ)“約”意為在具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“mRNA”意為目前已知的靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及任何可闡明的其它轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”意為與另一個(gè)RNA或DNA (靶RNA、DNA)結(jié)合的RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過(guò)RNA-RNA相互作用結(jié)合另一個(gè)RNA靶標(biāo)并改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點(diǎn)來(lái)看有用的任何外源RNA或DNA分子。這類(lèi)分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、 酶促RNA、治療用編輯RNA (therapeutic editing RNA)以及激動(dòng)劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物(alternate splicer)、引物、探針以及其他與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，可將這些化合物以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”，也包括天然和/或經(jīng)修飾單體或鍵(linkage)的線性或環(huán)狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和a _異頭物形式、肽核酸(PM)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過(guò)單體與單體相互作用的規(guī)律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對(duì)、Ho6gSteen或反HoGgsteen型堿基配對(duì)等)特異地結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可為“嵌合的”，即，由不同的區(qū)組成。在本發(fā)明的文段中，“嵌合的”化合物為寡核苷酸，其包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)區(qū)，例如，DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等。每個(gè)化學(xué)區(qū)由至少一個(gè)單體單元(即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸典型地包含至少一個(gè)區(qū)，其中所述寡核苷酸為經(jīng)修飾的以表現(xiàn)出一種或多種所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增強(qiáng)的對(duì)核酸酶降解的抗性、增強(qiáng)的細(xì)胞攝取和/或增強(qiáng)的對(duì)靶核酸的結(jié)合親和力。因此寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同的特性。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸類(lèi)似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可由可“全符合狀態(tài)(in “register”)”地連接或通過(guò)間隔物連接的區(qū)組成，所述“全符合狀態(tài)”地連接即此時(shí)單體像在天然DNA—樣連續(xù)地連接。所述間隔物意在構(gòu)成區(qū)之間的共價(jià)“橋”，并在一些情況下具有不超過(guò)約100個(gè)碳原子的長(zhǎng)度。所述間隔物可攜帶不同的功能性，例如具有正或負(fù)電荷、具有特殊的核酸結(jié)合特性(嵌入劑、溝結(jié)合劑、毒素、熒光團(tuán)等)、為親脂的、誘導(dǎo)特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)如例如誘導(dǎo)a -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“膠原基因”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類(lèi)(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用的措詞膠原I型a I ;膠原a-l(I)、C0L1A1、a-1 I型膠原、膠原a-I (I)鏈、014，在文獻(xiàn)中被認(rèn)為是相同的且在本申請(qǐng)中可交換地使用。本文所用的措詞膠原a -2(1)、“膠原I型a 2”、膠原a 2⑴、a _2 I型膠原、膠原a -2(1)鏈和C0L1A2在文獻(xiàn)中被認(rèn)為是相同的且在本申請(qǐng)中可交換地使用。
本文所用的措詞膠原a -I (VII)鏈、C0L7A1、EBDl、EBDCT, EBRl、LC膠原、長(zhǎng)鏈膠原在文獻(xiàn)中被認(rèn)為是相同的且在本申請(qǐng)中可交換地使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合體，或(ii)能夠與祀定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過(guò)理論計(jì)算和/或體外測(cè)定來(lái)確定。用于確定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測(cè)定法描述于下文實(shí)施例中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”包括DNA、從這類(lèi)DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前mRNA和mRNA)以及從這類(lèi)RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。這種通過(guò)特異地與靶核酸雜交的化合物對(duì)該靶核酸功能的調(diào)節(jié)，一般稱(chēng)為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的 RNA功能,包括所有的生活機(jī)能,例如,RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類(lèi)的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。對(duì)靶核酸功能的這類(lèi)干擾的整體效果為對(duì)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸表達(dá)的調(diào)節(jié)。RNA干擾“RNAi”由雙鏈RNA (dsRNA)分子介導(dǎo)，該分子具有與其“靶”核酸序列的序列特異性同源性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，介體為5-25個(gè)核苷酸的“小干擾”RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA通過(guò)稱(chēng)為切酶的RNA酶對(duì)dsRNA的加工得到。siRNA雙鏈體產(chǎn)物募集到叫做RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。不希望受任何具體理論所約束，認(rèn)為隨后RISC被引向靶核酸(適當(dāng)?shù)貫閙RNA)，在此處siRNA雙鏈體以序列特異性的方式相互作用來(lái)介導(dǎo)催化方式的切割。可依照本發(fā)明使用的小干擾RNA，可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知和普通技術(shù)人員熟悉的程序來(lái)合成和使用。用于本發(fā)明的方法中的小干擾RNA適當(dāng)?shù)匕sI-約50個(gè)核苷酸(nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)例中，siRNA可包含約5-約40nt、約5-約30nt、約10-約30nt、約15-約25nt、或約20-25個(gè)核苷酸。適當(dāng)寡核苷酸的挑選通過(guò)使用電腦程序來(lái)促進(jìn)，該程序自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指出具有同一性或同源性的區(qū)。將這類(lèi)程序用于比較例如通過(guò)搜索諸如GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)或通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。對(duì)來(lái)自一系列物種的核酸序列的比較，允許選擇在物種之間顯示適度同一性的核酸序列。在未測(cè)序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡來(lái)確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域眾所周知的，通過(guò)在不同的嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，可能獲得同一性的近似衡量。這些程序允許選擇以下寡核苷酸，其對(duì)待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)出高度的互補(bǔ)性，并且對(duì)其他物種中的相應(yīng)核酸序列表現(xiàn)出較低程度的互補(bǔ)性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在挑選用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)幕騾^(qū)方面具有相當(dāng)大的自由?！懊复賀NA”意為具有酶活性的RNA分子。酶促核酸(核酶)通過(guò)首先結(jié)合靶RNA來(lái)起作用。這類(lèi)結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分進(jìn)行，所述靶結(jié)合部分保持緊密靠近進(jìn)行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先識(shí)別而后通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，且一旦結(jié)合到正確的位點(diǎn)，即進(jìn)行酶促切割靶RNA。“誘餌RNA”意為模擬配體的天然結(jié)合域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結(jié)合靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性配體。例如，已顯示HIV反式激活應(yīng)答(TAR)RNA的過(guò)表達(dá)可充當(dāng)“誘餌”并有效地結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合到在HIV RNA中編碼的TAR序列。這意指特定的實(shí)例。本領(lǐng)域人員將認(rèn)識(shí)到，這只是一個(gè)實(shí)例，而其他的實(shí)施方案可使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)容易地產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單體”通常指以下單體，其通過(guò)磷酸二酯鍵或其類(lèi)似物連接以形成大小范圍從少量單體單元(例如從約3-4)到約數(shù)百個(gè)單體單元的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類(lèi)似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，先前認(rèn)為“非天然存在”的多種核苷酸后來(lái)已在自然中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且還包括其雜環(huán)類(lèi)似物和互變異構(gòu)體。其他類(lèi)型的核苷酸的說(shuō)明性實(shí)例為以下分子，其含有腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-橋亞乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤、肌苷，和在美國(guó)專(zhuān)利第5，432，272號(hào)中描述的“非·天然存在的”核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”意在涵蓋這些實(shí)例以及其類(lèi)似物和互變異構(gòu)體中的每一個(gè)和全部。尤其令人關(guān)注的核苷酸為含腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被認(rèn)為是有關(guān)人中的治療和診斷應(yīng)用的天然存在核苷酸。核苷酸包含天然2，-脫氧和 2，-輕基糖，例如，如 Kornberg 和 Baker,DNA 復(fù)制(DNA Replication),第 2 版(Freeman, San Francisco, 1992)中所述的以及其類(lèi)似物。提及核苷酸的“類(lèi)似物”包括具有經(jīng)修飾的堿基部分和/或經(jīng)修飾的糖部分的合成核苷酸。這類(lèi)類(lèi)似物包括設(shè)計(jì)以增強(qiáng)結(jié)合特性的合成核苷酸，所述結(jié)合特性為例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。本文所用的“雜交”意為寡聚化合物的基本上互補(bǔ)鏈的配對(duì)。一種配對(duì)的機(jī)理涉及寡聚化合物的鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可為沃森-克里克、Hodgsteen或反HoOgsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為互補(bǔ)的核苷酸，其通過(guò)形成氫鍵配對(duì)。雜交可在各種環(huán)境下進(jìn)行。反義化合物為“可特異地雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性來(lái)避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況中的生理?xiàng)l件下，以及在體外測(cè)定情況下進(jìn)行測(cè)定的條件下。本文所用的短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”是指以下條件，在該條件下本發(fā)明的化合物與其靶序列雜交，但與最少數(shù)量的其他序列雜交。嚴(yán)格條件為序列依賴(lài)的且在不同環(huán)境下將不同，在本發(fā)明的文段中，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及正在其中研究它們的試驗(yàn)來(lái)確定。一般而言，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M)的含有諸如Na++或K++等無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的鹽(即，低離子強(qiáng)度)、溫度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體的Tm，以及存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，雜交率對(duì)于每I %甲酰胺減少I(mǎi). I %。高嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例為0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v)SDS、60°C下達(dá)30分鐘。
本文所用的“互補(bǔ)的”是指在一條或兩條寡聚鏈上兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果在反義化合物的某個(gè)位置上的核堿基能夠與在靶核酸的某個(gè)位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認(rèn)為所述寡核苷酸和所述靶核酸之間氫鍵合的位置為互補(bǔ)位置。當(dāng)可彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)了每個(gè)分子中足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置時(shí)，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子為彼此互補(bǔ)的。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”為以下術(shù)語(yǔ)，其用于表示在足夠數(shù)量的核苷酸上有足夠程度的精確配對(duì)或互補(bǔ)性，使得穩(wěn)定和特異 的結(jié)合發(fā)生在寡聚化合物和靶核酸之間。據(jù)本領(lǐng)域了解，寡聚化合物的序列不需要與其可特異雜交的靶核酸的序列100%互補(bǔ)。此外，寡核苷酸可在一個(gè)或多個(gè)區(qū)段上雜交，使得間插或鄰近的區(qū)段不涉及雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包含與其靶定的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，其中反義化合物的20個(gè)核苷酸中有18個(gè)與靶區(qū)互補(bǔ)且因而會(huì)特異地雜交的反義化合物，表示90%互補(bǔ)性。在此實(shí)例中，余下的非互補(bǔ)核苷酸可與互補(bǔ)核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此鄰接或鄰接互補(bǔ)核苷酸。因此，長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸的反義化合物具有4 (四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸，該非互補(bǔ)核苷酸位于與靶核酸完全互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)的側(cè)翼，所述反義化合物會(huì)具有與靶核酸77. 8%的總互補(bǔ)性，因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸區(qū)的互補(bǔ)性百分比可使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對(duì)搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地確定。同源性、序列同一性或互補(bǔ)性百分比可通過(guò)例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系統(tǒng)版本8, GeneticsComputer Group, University Research Park, Madison ffis.)使用默認(rèn)設(shè)置來(lái)確定，該程序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. AppI. Math.，(1981) 2,482-489)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“解鏈溫度(Tm) ”是指以下溫度，在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下，在該溫度下平衡時(shí)50%與靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸與靶序列雜交。典型地，嚴(yán)格條件為以下條件，其中鹽濃度至少為約0. 01-1. OM Na離子濃度(或其他鹽)，pH 7. 0-8. 3且溫度對(duì)于短寡核苷酸(例如，10-50個(gè)核苷酸)而言至少為約30°C。嚴(yán)格條件也可通過(guò)外加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來(lái)達(dá)到。本文所用的“調(diào)節(jié)”意為在基因表達(dá)方面的增加(刺激)或減少(抑制)。術(shù)語(yǔ)“變體”，當(dāng)用于多核苷酸序列的文段中時(shí)，可包括有關(guān)野生型基因的多核苷酸序列。此定義也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)的”變體。剪接變體可具有與參比分子顯著的同一性，但因?yàn)樵趍RNA加工期間外顯子的可變剪接而一般具有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。對(duì)應(yīng)的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物種變體為在不同物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中尤其實(shí)用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可由核酸序列中的至少一個(gè)突變產(chǎn)生并可導(dǎo)致產(chǎn)生改變的mRNA或者其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不變的多肽。任何給定的天然或重組基因可不具有、具有一個(gè)或許多等位基因形式。產(chǎn)生變體的常見(jiàn)突變變化一般歸因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些變化類(lèi)型中的每一個(gè)可單獨(dú)或與其他類(lèi)型聯(lián)合發(fā)生，在給定序列中發(fā)生一次或多次。產(chǎn)生的多肽一般將具有相對(duì)于彼此的顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體為在給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體也可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單堿基突變，其中多核苷酸序列因一個(gè)堿基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病狀態(tài)傾向(即與抗性相對(duì)的易感性)的某個(gè)群體。衍生多核苷酸包括經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的核酸，例如用烷基、?；虬被脫Q氫。衍生物(例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這些中示例性的是硫代磷酸酯及本領(lǐng)域已知的其他含硫的種類(lèi)。衍生核酸也可含有標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等?！把苌摹倍嚯幕螂臑榻?jīng)修飾的多肽或肽，例如，通過(guò)糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸鹽化作用、還原/烷基化、?；⒒瘜W(xué)偶聯(lián)或溫性福爾馬林處理。也可將衍生物修飾以含有可檢測(cè)標(biāo)記(直接地或間接地)，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。本文所用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”或“患者”意在包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長(zhǎng)耳鹿、紹、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥(niǎo)、雞、爬行動(dòng)物、魚(yú)、昆蟲(chóng)和蜘蛛類(lèi)。

“哺乳動(dòng)物”涵蓋通常在醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如，人和馴養(yǎng)動(dòng)物)。實(shí)例包括貓科動(dòng)物、犬、馬、牛科動(dòng)物和人，以及僅僅人?！疤幚怼被颉爸委煛焙w對(duì)哺乳動(dòng)物中疾病狀態(tài)的治療，并包括(a)防止疾病狀態(tài)出現(xiàn)于哺乳動(dòng)物中，特別是當(dāng)這類(lèi)哺乳動(dòng)物傾向于疾病狀態(tài)但尚未診斷為患有該疾病狀態(tài)時(shí)；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如，阻止其發(fā)展；和/或(C)減輕疾病狀態(tài)，例如，引起疾病狀態(tài)的退行直到達(dá)到所需的終末點(diǎn)。治療也包括改善疾病的癥狀(例如，減少疼痛或不適)，其中這類(lèi)改善可直接或可非直接地影響疾病(例如，原因、傳遞、表達(dá)等)。本文所用的“癌癥”是指在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的所有類(lèi)型的癌癥或新生物或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥自身表現(xiàn)為包含癌癥惡性細(xì)胞的“腫瘤”或組織。腫瘤的實(shí)例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤?？赏ㄟ^(guò)依照本發(fā)明的公開(kāi)組合物治療的其它癌癥，包括但不限于，例如，何杰金病(Hodgkin' sDisease)、非何杰金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細(xì)胞肺腫瘤、原發(fā)性腦腫瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰腺胰島素瘤(insulanoma)、惡性類(lèi)癌、膀胱癌、惡化前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌、惡性高鈣血癥、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌?！吧窠?jīng)疾病或病癥”是指神經(jīng)系統(tǒng)和/或視覺(jué)系統(tǒng)的任何疾病或病癥?！吧窠?jīng)疾病或病癥”包括涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、腦干和小腦)、周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(包括腦神經(jīng))和自主神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)_■者中)的疾病或病癥。神經(jīng)病癥的實(shí)例包括但不限于，頭痛、木僵和昏迷、癡呆、發(fā)作、睡眠障礙、創(chuàng)傷、感染、新生物、神經(jīng)眼科學(xué)、運(yùn)動(dòng)障礙、脫髓鞘病、脊髓病癥、以及周?chē)窠?jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的病癥。成癮和精神病也包含在神經(jīng)病癥的定義中，包括但不限于，雙相性精神障礙和精神分裂癥。以下為可使用依照本發(fā)明的組合物和方法治療的數(shù)種神經(jīng)病癥、癥狀、體征和綜合征的清單獲得性癲癇樣失語(yǔ)癥；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；年齡相關(guān)性黃斑變性；胼胝體發(fā)育不全；失認(rèn)癥；艾卡迪綜合征；亞歷山大??；阿爾拍斯病(Alpers’ disease);交叉性偏癱；血管性癡呆；肌萎縮側(cè)索硬化；無(wú)腦畸形；Angelma綜合征；血管瘤??；缺氧；失語(yǔ)癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿-基氏腦畸形(Anronl-Chiari malformation);動(dòng)靜脈畸形；阿斯佩各綜合征；共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telegiectasia);注意不集中的過(guò)度反應(yīng)癥；孤獨(dú)癥；自主神經(jīng)功能障礙；背痛；巴滕??；貝切特??；貝爾氏麻痹；良性自發(fā)性瞼痙攣；良性灶；肌萎縮；良性顱內(nèi)高血壓；賓斯旺格??；瞼痙攣；Bloch Sulzberger綜合征；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)；脊髓腫瘤；布朗-塞卡爾綜合征；卡納萬(wàn)病；腕管綜合征；灼痛；中樞性疼痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解；頭部病癥(cephalic disorder);腦動(dòng)脈瘤；腦動(dòng)脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓；夏-馬-圖??；化學(xué)療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛；Chiari畸形；舞蹈癥；慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病；慢性痛；慢性區(qū)域性疼痛綜合征；科-勒綜合征；昏迷，包括持續(xù)性植物狀態(tài)；先天性面癱；皮質(zhì)基底節(jié)變性；顱動(dòng)脈炎；顱縫早閉；克雅??；累積性創(chuàng)傷障礙(cumulative trauma disorder);庫(kù)興綜合征(Cushing, s syndrome);巨細(xì)胞包涵體?。?巨細(xì)胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征；丹-沃(DandyWalker)綜合征；Dawson??；德摩西埃綜合征；Dejerine-Klumke麻痹；癡呆；皮肌炎；糖尿病神經(jīng)病變；彌漫性硬化；自主神經(jīng)功能異常；書(shū)寫(xiě)困難；誦讀困難；張力失常；早期幼兒癲癇性腦??；空蝶鞍綜合征；腦炎；腦膨出；腦三叉神經(jīng)血管瘤病；癲癇；歐勃麻痹；特發(fā)性震顫；法布里??；法爾綜合征；昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性癲癇發(fā)作；費(fèi)希爾綜合征；弗里德賴(lài)希共濟(jì)失調(diào)；額顳癡呆和其它“tau蛋白病變(tauopathies)”；高歇病；格斯特曼綜合征；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；巨細(xì)胞性包涵體病；細(xì)胞性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；格-巴綜合征；HTLV_1相關(guān)性脊髓??；哈-斯??；顱腦損傷；頭痛；偏側(cè)面肌痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經(jīng)炎型遺傳性共濟(jì)失調(diào)；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；HIV相關(guān)性癡呆和神經(jīng)病(還是AIDS的神經(jīng)表現(xiàn))；前腦無(wú)裂畸形；亨廷頓舞蹈病和其它聚谷氨酰胺重復(fù)疾病(polyglutamine repeat disease ；積水性無(wú)腦畸形；腦積水；皮質(zhì)醇增多癥；缺氧；免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調(diào)癥；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒雷夫敘姆??；嬰兒性痙攣；炎性肌?。伙B內(nèi)囊腫；顱內(nèi)高血壓；Joubert綜合征；基-塞(Keams-Sayre)綜合征；肯尼迪病Kinsboum綜合征；克-費(fèi)(Klippel Feil)綜合征；克拉伯?。粠?kù)-韋病；庫(kù)魯病；拉福拉??；朗-愛(ài)(Lambert-Eaton)肌無(wú)力綜合征；Landau_Kleffner綜合征；側(cè)髓(瓦倫伯格)綜合征；學(xué)習(xí)無(wú)能；利氏病；Lennox-Gustaut綜合征；累-奈綜合征；腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；路易(Lewy)體癡呆；無(wú)腦回；閉鎖綜合征；Lou Gehrig病(即，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病或肌萎縮側(cè)索硬化)；椎間盤(pán)疾?。蝗R姆病-神經(jīng)后遺癥；馬-約??；巨腦(macrencephaly);巨腦(megalencephaly);梅-羅綜合征；美尼爾癥；腦膜炎；門(mén)克斯?。划惾拘阅X白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；小頭畸形；偏頭痛；米勒費(fèi)希爾綜合征；小中風(fēng)(mini-stroke);線粒體肌??；默比厄斯綜合征；單肢肌萎縮；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?。荒X底異常血管網(wǎng)?。徽扯嗵前Y；多發(fā)性梗塞性癡呆(milti-infarct dementia)；多病灶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)??；多發(fā)性硬化和其它脫髓鞘病癥；多系統(tǒng)萎縮伴隨直立性低血壓；P肌肉萎縮癥；重癥肌無(wú)力；髓鞘脫失(myelinoclastic)彌漫性硬化；嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣攣；肌病；先天性肌強(qiáng)直；發(fā)作性睡??；神經(jīng)纖維瘤病；神經(jīng)阻滯劑惡性綜合征；AIDS的神經(jīng)表現(xiàn)；狼瘡的神經(jīng)后遺癥；神經(jīng)性肌強(qiáng)直；神經(jīng)元臘樣脂褐質(zhì)癥；神經(jīng)元遷移障礙；尼曼-皮克病；0’ Sullivan-McLeod綜合征；枕神經(jīng)痛；隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征；大田原(Ohtahara)綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼肌陣痙攣；視神經(jīng)炎；直立性低血壓；過(guò)度使用綜合征；感覺(jué)異常；神經(jīng)變性疾病或病癥(帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化以及其它和神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病和病癥)；先天性副肌強(qiáng)直；類(lèi)腫瘤性疾?。话l(fā)作性發(fā)作(paroxysmal attacks);帕-羅(Parry Romberg)綜合征；佩-梅病；周期性癱瘓；周?chē)窠?jīng)病；疼痛性神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛；持續(xù)性植物狀態(tài)；全身性發(fā)育遲緩；感光性噴嚏反射；植烷酸貯積??；皮克病；神經(jīng)挾捏；垂體瘤；多肌炎；腦穿通畸形；小兒麻痹癥后期綜合征；皰疹后神經(jīng)痛；感染后腦脊髓炎；直立性低血壓；普-韋(Prader-Willi)綜合征；原發(fā)性側(cè)索硬化；朊病毒??；進(jìn)行性一側(cè)面萎縮；進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦??；進(jìn)行性硬化性灰質(zhì)萎縮；進(jìn)行性核上性麻痹；腦假瘤；拉姆齊 亨特綜合征(I型和11型)；拉斯馬森(Rasmussen)腦炎；反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良綜合征；雷夫敘姆病；反復(fù)性運(yùn)動(dòng)障礙；反復(fù)性應(yīng)激損傷；腿多動(dòng)綜合征；逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)性脊髓?。焕滋鼐C合征；雷耶綜合征；舞蹈??；桑德霍夫??；謝耳德??；腦裂；視隔發(fā)育不 全(septo-optic dysplasia);驚嚇?gòu)雰壕C合征；帶狀皰疫；希-德綜合征；斯耶格倫綜合征；睡眠性呼吸暫停；索托斯綜合征(Soto' s syndrome);痙攣狀態(tài)；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓瘤；脊髓性肌萎縮；僵人綜合征(Stiff-Person syndrome);中風(fēng)；斯-韋綜合征；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動(dòng)脈硬化性腦病；西德納姆舞蹈?。粫炟?；脊髓空洞癥；遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙；泰-薩?。伙D動(dòng)脈炎；脊髓栓系綜合征(tethered spinal cord syndrome);肌強(qiáng)直性白內(nèi)障；胸廓出口綜合征；三叉神經(jīng)痛；Todd麻痹；圖雷特綜合癥；短暫性腦缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦??；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經(jīng)痛；熱帶痙攣性輕截癱；結(jié)節(jié)性硬化癥；血管性癡呆(多發(fā)梗塞性癡呆)；血管炎，包括顳動(dòng)脈炎；希-林(VonHippel-Lindau)?。煌邆惒窬C合征；韋-霍(Werdnig-Hoffman)病；韋斯特綜合征；急性頸部扭傷(whiplash);威廉斯綜合征；Wildon?。灰约皾蔂栱f格綜合征?！把装Y”是指全身性炎性病況以及局部地與單核細(xì)胞、白細(xì)胞和/或中性粒細(xì)胞的遷移和吸引有關(guān)的病況。炎癥的實(shí)例包括但不限于，因以下引發(fā)的炎癥感染致病生物(包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、病毒、真菌、以及寄生物，例如原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng))、移植排斥(包括實(shí)質(zhì)器官的排斥，例如腎、肝、心、肺或角膜，以及骨髓移植的排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))或者局限性慢性或急性自身免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)。自身免疫性疾病包括急性腎小球腎炎；類(lèi)風(fēng)濕性或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎；慢性腎小球腎炎；炎性腸病，例如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎；與粒細(xì)胞輸注有關(guān)的綜合征；炎性皮膚病，例如接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、銀屑??；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);自身免疫性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、以及糖尿病的某些形式、或任何其它自體免疫狀態(tài)(其中受試者自身免疫系統(tǒng)的攻擊導(dǎo)致病理性組織破壞)。變態(tài)反應(yīng)包括變應(yīng)性哮喘、慢性支氣管炎、急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。全身性炎性疾病狀態(tài)包括與創(chuàng)傷、燒傷、缺血事件(例如在心、腦、腸或外周脈管系統(tǒng)中的血栓形成事件，包括心肌梗死和中風(fēng))后的再灌注、膿毒癥、ARDS或多器官功能障礙綜合征相關(guān)的炎癥。炎性細(xì)胞募集也在粥樣硬化斑塊中發(fā)生。炎癥包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、韋格納肉芽腫病、橋本甲狀腺炎、肝細(xì)胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性淋巴樣增生、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、乳頭狀癌、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宮內(nèi)膜異位(adenomyosis)、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)、急性子宮頸炎、慢性子宮頸炎、淋巴樣增生、多發(fā)性硬化、繼發(fā)于特發(fā)性血小板減少性紫癜的肥大、原發(fā)性IgA腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、肺氣腫、慢性腎盂腎炎、以及慢性膀胱炎。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標(biāo)在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括膠原基因的核酸序列，包括但不限于與膠原基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中,祀標(biāo)包括COLlAl的核酸序列,包括但不限于與COLlAl基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中,祀標(biāo)包括C0L1A2的核酸序列,包括但不限于與C0L1A2基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。
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在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括C0L7A1的核酸序列，包括但不限于與C0L7A1基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。I型膠原為脈管系統(tǒng)中最豐富的ECM成分且在斑塊中被大量發(fā)現(xiàn)，其水平影響斑塊的易損性且與動(dòng)脈粥樣硬化的死亡率和發(fā)病率相關(guān)(Libby P.，等(2000) J. Intern.Med. 247 :349-358 ；Rekhter MD.，(1993) Am. J. Pathol. 143 :1634-1648)。它由兩個(gè)相當(dāng)大的基因產(chǎn)生的兩條a I(I)鏈和一條a 2(1)鏈組成，所述基因位于人和小鼠基因組二者的不同染色體上(Myllyharju, J.，等(2001)Ann. Med. 33,7-21)。I型膠原為原纖維膠原家族的成員且占在骨中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的80-90%。其也在諸如皮膚、韌帶和腱等組織中被大量發(fā)現(xiàn)。C0L1A1基因位于17號(hào)染色體長(zhǎng)(q)臂的21. 3-22. I位置之間，從堿基對(duì)45，616，455到堿基對(duì)45，633，991。I型膠原為脈管系統(tǒng)中最豐富的ECM成分且在斑塊中被大量發(fā)現(xiàn)，其水平影響斑塊的易損性且與動(dòng)脈粥樣硬化的死亡率和發(fā)病率相關(guān)(Libby P.，等(2000) J. Intern.Med. 247 :349-358 ；Rekhter MD.，(1993) Am. J. Pathol. 143 :1634-1648)。它由兩個(gè)相當(dāng)大的基因產(chǎn)生的兩條a I(I)鏈和一條a 2(1)鏈組成，所述基因位于人和小鼠基因組二者的不同染色體上(Myllyharju, J. (2001)Ann. Med. 33, 7-21)。膠原 a 2(1)基因(C0L1A2)位于染色體7q22. I。膠原VII型a I (大皰性表皮松解癥，營(yíng)養(yǎng)不良性，顯性和隱性)，也稱(chēng)為C0L7AI，為人基因。此基因編碼VII型膠原的a鏈。由三條完全相同的a膠原鏈組成的VII型膠原原纖維局限在復(fù)層鱗狀上皮下的基底區(qū)。它充當(dāng)外部上皮和下面間質(zhì)之間的固著性原纖維。此基因中的突變與所有形式的營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥有關(guān)。然而在沒(méi)有突變時(shí)，對(duì)VII型膠原的自身免疫應(yīng)答可導(dǎo)致此疾病的獲得性形式，稱(chēng)為獲得性大皰性表皮松解癥。在視網(wǎng)膜中也發(fā)現(xiàn)VII型膠原；其在此器官中的功能未知。C0L7A1位于人3號(hào)染色體的短臂，在表示為3p21. 31的染色體區(qū)中。所述基因大小為約31，000個(gè)堿基對(duì)并且因?yàn)槠渚幋a序列極度斷裂成118個(gè)外顯子而值得注意。C0L7A1轉(zhuǎn)錄成9，287個(gè)堿基對(duì)的mRNA。在皮膚中，VII型膠原蛋白由角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞合成。
營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥(DEB)為臨床異質(zhì)性可遺傳皮膚病癥，以輕微創(chuàng)傷之后皮膚和粘膜的起皰為特征，且具有寬范圍的臨床嚴(yán)重性。所有形式均由C0L7AI中的突變引起，所述基因編碼膠原VII。此膠原(固著性原纖維的主要成分)在DEB皮膚中減少或缺失，且固著性原纖維在形態(tài)上改變或缺失并在功能上缺陷。值得注意的是，盡管有顯著的科學(xué)成果，但基因突變的全譜以及導(dǎo)致這些視覺(jué)性和功能性改變的分子機(jī)制仍難以捉摸。全世界而言，DEB影響數(shù)千家庭。因此，對(duì)于精確診斷、預(yù)測(cè)、遺傳咨詢和可靠的產(chǎn)前診斷以及重要地鑒定用于未來(lái)基因治療試驗(yàn)的適宜候選者而言，迫切需要有效的C0L7A1突變檢測(cè)。C0L7A1位于3p21區(qū)之內(nèi)并跨越超過(guò)30. 5kb。其與其它膠原基因共享結(jié)構(gòu)特征且由118個(gè)小外顯子和小內(nèi)含子組成。迄今為止，雖然已報(bào)道多于200種不同的突變，但是非常少頻發(fā)突變或熱點(diǎn)為已知的。在一些實(shí)施方案中，使用反義寡核苷酸預(yù)防或治療與膠原基因家族成員有關(guān)的疾病或病癥?？捎糜衫梅戳x化合物獲得的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的示例性膠原基因介導(dǎo)的疾病和病癥包括膠原障礙、年齡相關(guān)的膠原降解、成骨不全、耳硬化(OTSC)、 骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、食管鱗狀上皮細(xì)胞癌、軟骨發(fā)育不全、非典型馬方綜合征(atypicalMarfan syndrome)、埃-當(dāng)綜合征(Ehlers-Danlos syndrome) (EDS)、營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥(DEB)、卡菲病、動(dòng)脈瘤(例如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤)、特發(fā)性肺纖維化、肝硬化、腎纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、硬皮病、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、癌癥、炎癥、遺傳性疾病(例如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良)、神經(jīng)疾病或病癥(例如帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、戈謝病(Gaucher disease))、代謝病(例如I型糖尿病)、自身免疫性疾病或病癥、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷等)、缺血，以及其它血管、心臟、皮膚疾病或病癥，皮膚老化、需要皮膚工程的皮膚疾病或病癥或病況、需要移植的肝臟或腎臟疾??；腱、骨或組織再生；骨骼修復(fù)、軟骨和骨修復(fù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸調(diào)節(jié)患有與膠原基因有關(guān)的疾病或病癥或處于形成與膠原基因有關(guān)的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的患者中膠原基因的正常表達(dá)和/或正常功能。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供基于膠原基因的基質(zhì)組合物，所述組合物包含由膠原原纖維組成的三維純化膠原基質(zhì)，其中通過(guò)使膠原原纖維細(xì)胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)膠原原纖維細(xì)胞中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供體外、離體或體內(nèi)傷口愈合或組織再生或組織工程的方法，所述方法包括給傷口施用本發(fā)明的胞外基質(zhì)組合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供制備基于膠原基因的基質(zhì)組合物的方法，包括使膠原原纖維細(xì)胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供用于支持干細(xì)胞的組合物，所述組合物包含含有膠原原纖維的工程改造的、純化的基于膠原基因的基質(zhì)，以及干細(xì)胞群?？蓪⒈景l(fā)明工程改造的、純化的基于膠原的基質(zhì)組合物單獨(dú)使用或與細(xì)胞聯(lián)合使用，作為組織移植構(gòu)建體增強(qiáng)受損或患病組織的修復(fù)。
依照一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于培養(yǎng)干細(xì)胞的改進(jìn)方法。所述方法包括制備如本發(fā)明所提供的具有所需特性的經(jīng)增溶的膠原基因組合物，向經(jīng)增溶的膠原基因組合物中加入細(xì)胞和在受控條件下使膠原組合物聚合以提供由膠原原纖維形成并具有所需微觀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中將細(xì)胞加入基于膠原基因的基質(zhì)中，并在適于增殖所述細(xì)胞的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。在實(shí)施方案中，將基于膠原基因的基質(zhì)組合物用于預(yù)防或治療與損失特定細(xì)胞類(lèi)型或組織有關(guān)的疾病或病癥，所述細(xì)胞類(lèi)型或組織可被由多能干細(xì)胞再生的新細(xì)胞/組織替換。在實(shí)施方案中，將基于膠原基因的基質(zhì)組合物與至少一種選自下列的轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合使用0CT4、c-myc、KLF4和/或Sox2、NANOG, LIN28和從給定成體組織誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所需的其它轉(zhuǎn)錄因子?？蓪⑦@些細(xì)胞進(jìn)一步引入損傷中并使其在體外或體內(nèi)分化成所需細(xì)胞類(lèi)型。
可用由利用干細(xì)胞和反義化合物從基于膠原基因的基質(zhì)組合物中再生的細(xì)胞/組織治療的疾病的實(shí)例包括癌癥、遺傳性疾病(例如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良)、神經(jīng)變性疾病(例如帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、戈謝病)、代謝病(例如I型糖尿病)、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷，等等)、缺血，以及其它需要移植的血管、心臟、肝臟或腎臟疾病。在實(shí)施方案中，也可將基于膠原基因的基質(zhì)組合物用于腱、骨或組織再生；骨骼修復(fù)、軟骨、骨修復(fù)過(guò)程、骨質(zhì)疏松、用于關(guān)節(jié)成形術(shù)的假體等，其可原位注入輕微的無(wú)連接性骨折或軟骨損傷中，注入骨質(zhì)疏松個(gè)體的體循環(huán)中，或?qū)⑵湮皆谶m當(dāng)生物材料(膠原、羥磷灰石等)中植入以促進(jìn)損傷中軟骨或骨形成。此外，可將所述組合物吸附在覆蓋用于髖、膝關(guān)節(jié)成形術(shù)的假體的輕磷灰石(periapatite)中，以增強(qiáng)這些假體在宿主中的生物整合，延長(zhǎng)它們的壽命。還可將所述組合物用于脊柱關(guān)節(jié)固定術(shù)以促進(jìn)脊柱融合和改善通過(guò)使用自體移植物或骨庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行的這些程序的效率。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，給需要皮膚治療的受試者或處于形成使他們需要皮膚治療的病況的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者，提供治療和/或美容方案及相關(guān)的定制治療。例如可基于受試者的膠原基因狀態(tài)進(jìn)行診斷?；颊叩慕o定組織例如皮膚中的膠原基因表達(dá)水平可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文別處所述的方法確定，例如，通過(guò)使用PCR或基于抗體的檢測(cè)方法分析組織。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供用于皮膚治療和/或美容應(yīng)用的組合物，所述組合物包含膠原基因反義寡核苷酸，例如以增量調(diào)節(jié)皮膚中膠原基因的表達(dá)。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :4-29所述。在實(shí)施方案中，用本發(fā)明的寡核苷酸在體內(nèi)處理細(xì)胞，以增長(zhǎng)細(xì)胞壽命或防止凋亡。例如，可如本文所述通過(guò)處理皮膚(例如上皮細(xì)胞)防止皮膚老化，例如形成皺紋。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，使皮膚與包含如本文所述的膠原基因反義化合物的藥物或美容組合物接觸。示例性皮膚困擾或皮膚病況包括與炎癥、曬傷或自然老化有關(guān)或由它們引發(fā)的疾病或病癥。例如，所述組合物在預(yù)防或治療下列中具有效用接觸性皮炎(包括刺激性接觸性皮炎和變應(yīng)性接觸性皮炎)、特應(yīng)性皮炎(也稱(chēng)為變應(yīng)性濕疹)、光化性角化病、角質(zhì)化病癥(包括濕疹)、大皰性表皮松解癥(包括penfigus)、剝脫性皮炎、脂溢性皮炎、紅斑(包括多形性紅斑和結(jié)節(jié)性紅斑)、由日光或其它光源引發(fā)的損傷、盤(pán)狀紅斑狼瘡、皮肌炎、皮膚癌和自然老化的作用。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含膠原基因反義寡核苷酸的組合物，例如增量調(diào)節(jié)頭皮中膠原基因的表達(dá)并抑制雄激素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而防止雄激素性脫發(fā)(脫發(fā))。在實(shí)施方案中，給患脫發(fā)的患者施用局部或全身制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本文所述的反義寡核苷酸摻入到含有局部載體和包含本領(lǐng)域已知的任何這類(lèi)材料的局部制劑中，所述局部載體一般適于局部藥物施用。所述局部載體可被挑選以便提供所需形式的組合物，例如作為軟膏劑、洗劑、乳膏劑、微乳劑、凝膠劑、油劑、溶液劑等，以及可由天然存在或合成來(lái)源的材料組成。優(yōu)選的是，所選載體對(duì)局部制劑的活性劑或其它成分沒(méi)有不利影響。用于本文的適宜局部載體的實(shí)例包括水、醇和其它無(wú)毒有機(jī)溶劑、甘油、礦物油、硅酮、石油凝膠、羊毛脂、脂肪酸、植物油、對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)、蠟等。制劑可為無(wú)色無(wú)臭的軟膏劑、洗劑、乳膏劑、微乳劑和凝膠劑?？蓪⒈景l(fā)明的反義寡核苷酸摻入到軟膏劑中，所述軟膏劑一般為半固體制劑，其典型地基于礦脂或其它石油衍生物。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所領(lǐng)會(huì)，待使用的特定軟膏 基質(zhì)為這樣的軟膏基質(zhì)，其將提供最佳藥物遞送，并且優(yōu)選地還將提供其它的所需特性，例如，潤(rùn)滑性等。當(dāng)使用其它載體或溶媒時(shí)，軟膏基質(zhì)應(yīng)當(dāng)為惰性、穩(wěn)定、無(wú)刺激和非致敏的。如在Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.)中所說(shuō)明，可將軟膏基質(zhì)分成四類(lèi)油性基質(zhì)；可乳化基質(zhì)；乳劑基質(zhì)；和水溶性基質(zhì)。油性軟膏基質(zhì)包括例如植物油、獲自動(dòng)物的脂肪和獲自石油的半固體碳?xì)浠衔铩？扇榛浉嗷|(zhì)也稱(chēng)為可吸收軟膏基質(zhì)，含很少水或不含水且包括例如硫酸羥基甘油三硬脂酸酯、無(wú)水羊毛脂和親水礦脂。乳劑軟膏基質(zhì)為油包水(W/0)乳劑或水包油(0/W)乳劑，且包括例如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。示例性水溶性軟膏基質(zhì)由不同分子量的聚乙二醇(PEG)制備(參見(jiàn)，例如上述 Remington' s)。可將本發(fā)明的反義寡核苷酸摻入到洗劑中，所述洗劑一般為無(wú)摩擦施用給皮膚表面的制劑，且典型地為液體或半流體制劑，其中固體顆粒(包括活性劑)存在于水或醇基質(zhì)中。洗劑通常為固體的混懸劑，且可包含水包油型液體油狀乳劑。因?yàn)橐子谑┯昧鲃?dòng)性較高的組合物，洗劑為用于處理大面積身體區(qū)域的優(yōu)選制劑。一般必需的是，將洗劑中的不溶性物質(zhì)細(xì)碎。洗劑將典型地含有助懸劑以形成更好的分散體，和含有用于定域和維持活性劑與皮膚接觸的化合物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等。用于與本發(fā)明方法聯(lián)合使用的示例性洗劑包含與親水礦脂混合的丙二醇，例如其可以Aquaphor 商標(biāo)獲自Beiersdorf，Inc. (Norwalk, Conn.)的?？蓪⒈景l(fā)明的反義寡核苷酸摻入到乳膏劑中，所述乳膏劑一般為水包油或油包水的粘性液體或半固體乳劑，。乳膏基質(zhì)可水洗，且包含油相、乳化劑和水相。油相一般由礦脂和例如鯨蠟醇或硬脂醇等脂肪醇組成；盡管非必須，但水相通常體積超過(guò)油相，且一般含有濕潤(rùn)劑。如上述Remington' s中所說(shuō)明，乳膏制劑中的乳化劑一般為非離子、陰離子、陽(yáng)離子或兩性表面活性劑?？蓪⒈景l(fā)明的反義寡核苷酸摻入到微乳劑中，所述微乳劑一般為兩種不混溶液體(例如油和水)的熱力學(xué)穩(wěn)定的各向同性澄清分散體，其通過(guò)表面活性劑分子的界面膜穩(wěn)定(制藥工藝學(xué)百科全書(shū)(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology) (New York Marcel Dekker, 1992)，第9卷)。對(duì)制備微乳劑而言，表面活性劑(乳化劑)、助表面活性劑(助乳化劑)、油相和水相為必需的。適宜表面活性劑包括用于制備乳劑的任何表面活性齊U，例如典型地用于制備乳膏劑的乳化劑。助表面活性劑(或“助乳化劑”)一般選自聚甘油衍生物、甘油衍生物和脂肪醇。盡管非必須，但優(yōu)選的乳化劑/助乳化劑組合一般選自單硬脂酸甘油酯和聚氧乙烯硬脂酸酯；聚乙二醇和硬脂酸棕櫚酸乙二醇酯；以及辛酸和癸酸甘油三酯和油酸聚乙二醇甘油酯。水相不僅包括水，還典型地包括緩沖液、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇、優(yōu)選低分子量聚乙二醇(例如PEG 300和PEG 400)和/或甘油等，而油相將一般包括例如脂肪酸酯、改性植物油、硅酮油、甘油單酯二酯和三酯的混合物、PEG的單酯和二酯(例如，油酸聚乙二醇甘油酯)等。將本發(fā)明的反義寡核苷酸摻入到凝膠制劑中，所述凝膠制劑一般為由小的無(wú)機(jī)顆粒構(gòu)成的混懸液(兩相系統(tǒng))或在載液各處基本上均勻分布的大的有機(jī)分子(單相凝膠)組成的半固體系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)例如使活性劑、載液和適宜膠凝劑(例如西黃蓍膠(在2-5%)、海藻酸鈉(在2-10 %)、明膠(在2-15%)、甲基 纖維素(在3-5% )、羧甲基纖維素鈉(在2-5% )、卡波姆(在0. 3-5% )或聚乙烯醇(在10-20% ))合并在一起并混合直至產(chǎn)生特征性半固體產(chǎn)物來(lái)制作單相凝膠。其它適宜膠凝劑包括甲基羥基纖維素、聚氧乙烯-聚氧丙烯、羥乙基纖維素和明膠。盡管凝膠通常使用水性載液，但是也可將醇和油用作載液?？蓪⒈绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種添加劑包含在制劑例如局部制劑中。添加劑的實(shí)例包括但不限于增溶劑、皮膚滲透促進(jìn)劑、遮光劑、防腐劑(例如抗氧化劑)、膠凝劑、緩沖齊U、表面活性劑(特別是非離子和兩性表面活性劑)、乳化劑、軟化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、著色劑、香料等。特別優(yōu)選連同乳化劑、軟化劑和防腐劑一起包含增溶劑和/或皮膚滲透促進(jìn)劑。最佳局部制劑包含大約2%重量-60%重量、優(yōu)選2%重量-50%重量的增溶劑和/或皮膚滲透促進(jìn)劑；2%重量-50%重量、優(yōu)選2%重量-20%重量的乳化劑；2%重量-20%重量的軟化劑；和0. 01-0. 2%重量的防腐劑，而活性劑和載體(例如水)組成制劑的余下部分。皮膚滲透促進(jìn)劑用來(lái)促進(jìn)治療水平活性劑的通行以通過(guò)合理大小面積的未破損皮膚。適宜促進(jìn)劑在本領(lǐng)域眾所周知且包括例如低級(jí)鏈烷醇，例如甲醇、乙醇和2-丙醇；燒基甲基亞諷，例如~■甲基亞諷(DMSO)、癸甲基亞諷(CltlMSO)和十四燒基甲基亞諷；吡咯烷酮，例如2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮和N-(-羥乙基)吡咯烷酮；尿素；N，N- 二乙基-間-甲苯酰胺；C2-C6鏈烷二醇；雜溶劑，例如二甲基甲酰胺(DMF)、N，N- 二甲基乙酰胺(DMA)和四氫糠醇；以及I-取代氮雜環(huán)庚烷-2-酮、具體為1-n-十二烷基環(huán)氮雜環(huán)庚燒_2_麗(月桂氣罩麗；可以商標(biāo)AzoneR 獲自Whitby Research Incorporated,Richmond, Va.)。增溶劑的實(shí)例包括但不限于下列親水性醚，例如二乙烯二醇單乙醚(乙氧基二甘醇，可市購(gòu)為T(mén)ranscutol )和二乙烯二醇單乙醚油酸酯(可市購(gòu)為Soficutol );聚乙烯蓖麻油衍生物，例如聚氧35蓖麻油、聚氧40氫化蓖麻油等；聚乙二醇、特別是低分子量聚乙二醇，例如PEG 300和PEG 400，以及聚乙二醇衍生物，例如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(可市購(gòu)為L(zhǎng)abrasol );烷基甲基亞砜，例如DMSO ;吡咯烷酮，例如2-吡咯烷酮和N-甲基-2-吡咯烷酮；以及DMA。許多增溶劑也可充當(dāng)吸收促進(jìn)劑?？蓪为?dú)的增溶劑摻入到制劑中，或?qū)⒃鋈軇┑幕旌衔飺饺肫渲?。適宜乳化劑和助乳化劑包括但不限于對(duì)微乳劑描述的那些乳化劑和助乳化劑。軟化劑包括例如丙二醇、甘油、肉豆蘧酸異丙酯、聚丙二醇_2(PPG-2)肉豆蘧醚丙酸酯等。
其它活化劑也可包含在制劑中，例如其它抗炎劑、鎮(zhèn)痛劑、抗微生物劑、抗真菌劑、抗生素、維生素、抗氧化劑和通常在防曬制劑中存在的防曬劑，其包括但不限于鄰氨基苯甲酸酯、二苯酮(特別是二苯酮-3)、樟腦衍生物、肉桂酸酯(例如甲氧肉桂酸辛酯)、二苯酰甲烷(例如丁基甲氧基二苯酰甲烷)、對(duì)氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物和水楊酸酯(例如水楊酸辛酯)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)于膠原基因(其包括但不限于非編碼區(qū))的多核苷酸而言為特異的。膠原基因靶標(biāo)包括膠原基因的變體；膠原基因的突變體，包括SNP ;膠原基因的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA分子。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不單獨(dú)限于膠原基因多核苷酸，而是擴(kuò)展到膠原基因的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定膠原基因靶標(biāo)的天然反義序列(針對(duì)編碼和非編碼區(qū)的天然反義物)，所述膠原基因靶標(biāo)包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變 體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA或DNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括變體，其中在所述化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸為腺嘌呤，則可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥(niǎo)苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的變體。這可在所述反義化合物的任何位置上完成。在一些實(shí)施方案中，反義化合物與靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約50*%-約60*%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80*%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。反義化合物在以下情況時(shí)為可特異性雜交的所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性損失，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。這類(lèi)條件包括，即，在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況中的生理?xiàng)l件，以及在體外測(cè)定情況下進(jìn)行測(cè)定的條件。反義化合物，不論DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情況時(shí)為可特異性雜交的所述化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用損失，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免所述反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況中的生理?xiàng)l件下，以及在體外測(cè)定情況下進(jìn)行測(cè)定的條件下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶定膠原基因調(diào)節(jié)膠原基因的表達(dá)或功能，膠原基因包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列、一個(gè)或多個(gè)如SEQ ID NO :4-9所述的序列等。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)或功能與對(duì)照相比為增量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)或功能與對(duì)照相比為減量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :10-29所述的核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類(lèi)似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類(lèi)似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無(wú)需在此描述。反義物的特異性和靈敏性也被本領(lǐng)域的技術(shù)人員掌握用于治療用途。已將反義寡核苷酸用作在動(dòng)物和人的疾病狀態(tài)治療中的治療部分。已將反義寡核苷酸安全和有效地施用給人，并且目前正在進(jìn)行許多臨床試驗(yàn)。因此已確定寡核苷酸可為有用的治療形式，其可將經(jīng)配置以在用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物尤其人的治療方案中有用。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡聚反義化合物(具體地寡核苷酸)結(jié)合到靶核酸分子并調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有的生活機(jī)能,例如RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類(lèi)的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。所述功能可被增量調(diào)節(jié)或受抑制，這取決于所需的功能。

反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少一部分雜交的其他寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的文段中，將反義化合物靶定到特定的核酸分子可為多步過(guò)程。所述過(guò)程通常以鑒定待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸開(kāi)始。此靶核酸可為，例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或來(lái)自傳染劑的核酸分子。在本發(fā)明中，所述靶核酸編碼膠原基因。靶定過(guò)程通常也包括確定靶核酸內(nèi)的至少一個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)以用于發(fā)生反義相互作用，使得產(chǎn)生所需的效應(yīng)，例如，表達(dá)的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語(yǔ)“區(qū)”定義為具有至少一個(gè)可識(shí)別結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)內(nèi)為區(qū)段。“區(qū)段”定義為在靶核酸內(nèi)區(qū)的較小或亞部分。本發(fā)明所用的“位點(diǎn)”定義為靶核酸內(nèi)的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到膠原基因的天然反義序列并調(diào)節(jié)膠原基因(SEQ ID NO :1-3)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實(shí)例包括SEQ ID NO :4-29。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到膠原基因多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段并調(diào)節(jié)膠原基因的表達(dá)和/或功能。所述區(qū)段包含膠原基因有義或反義多核苷酸的至少五個(gè)連續(xù)的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對(duì)膠原基因的天然反義序列而言為特異的，其中所述寡核苷酸與膠原基因的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)膠原基因的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO :10-29所述的序列、使用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短或較長(zhǎng)的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類(lèi)似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類(lèi)似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無(wú)需在此描述。由于如本領(lǐng)域已知，翻譯起始密碼子通常為5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)的DNA分子中為5' -ATG)，因而翻譯起始密碼子也稱(chēng)為“AUG密碼子”、“起始密碼子”或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有翻譯起始密碼子，其具有RNA序列5' -GUG、5' -UUG或5' -CUG;以及5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語(yǔ)“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括許多密碼子序列，但在每個(gè)情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個(gè)或更多個(gè)備選起始密碼子，其中的任何一個(gè)可優(yōu)先地用于在特定細(xì)胞類(lèi)型或組織中或在特定條件組下的翻譯起始。在本發(fā)明的文段中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指這樣的一個(gè)或多個(gè)密碼子，其在體內(nèi)用于起始由編碼膠原基因的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯，與這類(lèi)密碼子的一個(gè)或多個(gè)序列無(wú)關(guān)?；虻姆g終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三個(gè)序列中的一個(gè)，即，5 ^ -UAA,5/ -UAG和5' -UGA (對(duì)應(yīng)的DNA序列分別為5' -TAA,5' -TAG 和 5' -TGA)。術(shù)語(yǔ)“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指從翻譯起始密碼子開(kāi)始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個(gè)連續(xù)的核苷酸的這類(lèi)mRNA或基因的部分。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指從翻譯終止密碼子開(kāi)始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個(gè)連續(xù)的核苷酸的這類(lèi)mRNA或基因的部分。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或“翻譯終止密碼子區(qū)”)均為可用本發(fā)明的反義化合物有效地靶定的區(qū)?！け绢I(lǐng)域已知的可讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指在翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)，也為可有效地靶定的區(qū)。在本發(fā)明的文段中，靶定的區(qū)為包含基因可讀框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)。另一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，是指在翻譯起始密碼子的5’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’加帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上對(duì)應(yīng)的核苷酸)。再一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的3’非翻譯區(qū)(3' UTR)，是指在翻譯終止密碼子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3’末端之間的核苷酸(或基因上對(duì)應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5’加帽位點(diǎn)包含經(jīng)由5’ -5’三磷酸酯鍵連接到mRNA的5’最末端殘基的N7-甲基化鳥(niǎo)苷殘基。認(rèn)為mRNA的5’帽區(qū)包括5’帽子結(jié)構(gòu)本身以及鄰近該帽位點(diǎn)的前50個(gè)核苷酸。用于本發(fā)明的另一種靶區(qū)為5’帽區(qū)。盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物為直接翻譯的，但是許多包含一個(gè)或多個(gè)稱(chēng)為“內(nèi)含子”的區(qū)，其在翻譯前被從轉(zhuǎn)錄物中切除。余下的(且因此翻譯的)區(qū)稱(chēng)為“外顯子”，并將其剪接在一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶定剪接位點(diǎn)(即，內(nèi)含子-外顯子連接處或外顯子-內(nèi)含子連接處)在疾病牽涉異常剪接或疾病牽涉特定剪接產(chǎn)物過(guò)度產(chǎn)生的狀況中特別有用。因重排或缺失所致的異常融合連接處為靶位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案。經(jīng)由來(lái)自不同基因來(lái)源的兩個(gè)(或更多個(gè))mRNA的剪接過(guò)程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱(chēng)為“融合轉(zhuǎn)錄物”。內(nèi)含子可使用靶定到例如DNA或前mRNA的反義化合物來(lái)有效地靶定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到天然反義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到有義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。
可變RNA轉(zhuǎn)錄物可產(chǎn)生自DNA的相同基因組區(qū)。這些可變轉(zhuǎn)錄物一般稱(chēng)為“變體”。更具體地，“前mRNA變體”為產(chǎn)生自相同的基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，其與產(chǎn)生自相同的基因組DNA的其他轉(zhuǎn)錄物在其起始或終止位置上不同且包含內(nèi)含子和外顯子序列二者。當(dāng)剪接期間切除了一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)、或其部分時(shí)，前mRNA變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體為經(jīng)加工的前mRNA變體，并且由于剪接所致，每種獨(dú)特的前mRNA變體必須總是產(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱(chēng)為“可變剪接變體”。如果未發(fā)生前mRNA變體的剪接，則前mRNA變體與mRNA變體完全相同。變體可通過(guò)使用可變信號(hào)啟動(dòng)或終止轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生。前mRNA和mRNA可具有多于一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。起源于使用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱(chēng)為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。使用可變終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物稱(chēng)為該前mRNA或mRNA的“可變終止變體”。可變終止變體的一個(gè)具體類(lèi)型為“聚腺苷酸變體”，其中所產(chǎn)生的多重轉(zhuǎn)錄物起因于轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)對(duì)其中一種“聚腺苷酸終止信號(hào)”的可變選擇，從而產(chǎn)生終止在獨(dú)特 的聚腺苷酸位點(diǎn)上的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的文段內(nèi)，本文所述的變體類(lèi)型也為靶核酸的實(shí)施 方案。將反義化合物與之雜交的靶核酸上的位置定義為活性反義化合物靶定的靶區(qū)的至少5個(gè)核甘酸長(zhǎng)的部分。雖然將某些示例性靶區(qū)段的具體序列列舉于此，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)至IJ，這些用于說(shuō)明和描述在本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實(shí)施方案。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，其他靶區(qū)段可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地鑒定。認(rèn)為以下靶區(qū)段同樣適合靶定，該靶區(qū)段長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸并包含選自說(shuō)明性靶區(qū)段之內(nèi)的一段至少五(5)個(gè)連續(xù)的核苷酸。靶區(qū)段可包括DNA或RNA序列，其包含來(lái)自說(shuō)明性靶區(qū)段之一的5’末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開(kāi)始于靶區(qū)段5’末端的緊接上游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個(gè)核苷酸為止)。類(lèi)似的靶區(qū)段由以下DNA或RNA序列表示，該序列包含來(lái)自說(shuō)明性靶區(qū)段之一的3’末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開(kāi)始于靶區(qū)段3’末端的緊接下游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個(gè)核苷酸為止)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文所說(shuō)明的靶區(qū)段，無(wú)需過(guò)度試驗(yàn)就能夠鑒定另外的靶區(qū)段。一旦鑒定一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，就選出與該靶標(biāo)足夠互補(bǔ)的反義化合物，所述足夠互補(bǔ)即充分良好且具有足夠的特異性雜交以得到所需的效果。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡核苷酸與特定靶標(biāo)的反義鏈結(jié)合。所述寡核苷酸長(zhǎng)度為至少5個(gè)核苷酸且可為合成的，使得每個(gè)寡核苷酸靶定重疊的序列，由此將寡核苷酸合成為覆蓋靶多核苷酸的全長(zhǎng)。靶標(biāo)也包括編碼區(qū)以及非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)反義寡核苷酸來(lái)靶定特定核酸。將反義化合物靶定到特定核酸為多步過(guò)程。該過(guò)程通常開(kāi)始于鑒定其功能待調(diào)節(jié)的核酸序列。這可為，例如其表達(dá)與特定的病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA (ncRNA)。可將RNA歸類(lèi)為⑴信使RNA(mRNA)，其被翻譯成蛋白，和⑵非編碼蛋白的RNA (ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度的終止密碼子并缺少任何廣泛的“可讀框”的其他轉(zhuǎn)錄單元(TU)。許多ncRNA似乎開(kāi)始于蛋白編碼基因座的3’非翻譯區(qū)(3丨UTR)中的起始位點(diǎn)。ncRNA常常為罕見(jiàn)的且至少一半已由FANTOM協(xié)會(huì)測(cè)序的ncRNA似乎未聚腺苷酸化。大多數(shù)研究者因?yàn)槊黠@的原因而關(guān)注經(jīng)加工并輸出到細(xì)胞質(zhì)的聚腺苷酸化mRNA。近來(lái)，已顯示非聚腺苷酸化核RNA的群體可非常巨大，且許多這類(lèi)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生于基因內(nèi)區(qū)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制為通過(guò)與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對(duì)。通過(guò)堿基配對(duì)起作用的RNA可分組成⑴順式編碼RNA，其在相同的基因位置、但在其所作用的RNA相反的鏈上編碼，因此顯示對(duì)其靶標(biāo)完美的互補(bǔ)性，和(2)反式編碼RNA，其在與其所作用的RNA不同的染色體位置上編碼，一般不表現(xiàn)出與其靶標(biāo)完美的堿基配對(duì)潛能。不希望受到理論的約束，通過(guò)本文所述的反義寡核苷酸來(lái)擾亂反義多核苷酸，可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達(dá)。然而，此調(diào)節(jié)可為不一致的(反義敲減導(dǎo)致信使RNA上升)或一致的(反義敲減導(dǎo)致伴隨的信使RNA下降)。在這些情況下，可將反義寡核苷酸靶定到反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，引起其敲減或隔離。編碼以及非編碼反義物可以相同的方式來(lái)靶定，并且任一種類(lèi)別均能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)有義轉(zhuǎn)錄物——以一致或不一致的方式。用于鑒定針對(duì)靶標(biāo)使用的新寡核苷酸的策略可基于通過(guò)反義寡核苷酸或任何其他調(diào)節(jié)所需靶標(biāo)的方法對(duì)反義RNA轉(zhuǎn)錄物的敲減。 策略I :在不一致調(diào)節(jié)的情況下，敲減所述反義轉(zhuǎn)錄物提升常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。若后者基因編碼已知或假定的藥物靶標(biāo)，則其反義配對(duì)物的敲減可預(yù)料到地模擬受體激動(dòng)劑或酶刺激劑的作用。策略2 :在一致調(diào)節(jié)的情況下，可伴隨地敲減反義和有義轉(zhuǎn)錄物兩者，從而達(dá)到常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同下降。如果例如將反義寡核苷酸用于進(jìn)行敲減，則此策略可用于應(yīng)用針對(duì)有義轉(zhuǎn)錄物靶定的一種反義寡核苷酸和針對(duì)相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一種反義寡核苷酸，或同時(shí)靶定重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個(gè)有力對(duì)稱(chēng)的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)，以及與靶核酸的至少一部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。因此，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物且可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或末端突起、錯(cuò)配或環(huán)。將反義化合物常規(guī)地制備為線性的，但可被連接或者另外制備成環(huán)狀和/或分枝的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交以形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈，或具有足夠自我互補(bǔ)性以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈?？蓪⑺鰞蓷l鏈內(nèi)部連接而留下游離的3’或5’末端，或可將其連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端上包含突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。所述雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進(jìn)一步的修飾可包括與末端之一、經(jīng)挑選的核苷酸位置、糖位置或與核苷間鍵之一連接的綴合基團(tuán)?；蛘撸鰞蓷l鏈可經(jīng)由非核酸部分或連接基團(tuán)來(lái)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可呈自我互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對(duì)折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過(guò)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來(lái)完成，然而，在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能為增量調(diào)節(jié)的。當(dāng)形成自兩條鏈，或呈在其自身上對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)發(fā)夾型分子形式的單鏈時(shí)，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))為以沃森-克里克模式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。
一旦弓I入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可經(jīng)由基于占據(jù)的機(jī)制來(lái)運(yùn)作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’脫氧糖和一般地T而不是U堿基)或“RNA樣”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’羥基或2’修飾的糖和一般U而不是T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)，最普通地A和B型。據(jù)認(rèn)為，一般而言，具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“RNA樣”。在一些(嵌合的)實(shí)施方案中，反義化合物可包含A和B型區(qū)兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所需的寡核苷酸或反義化合物，包括以下中的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經(jīng)修飾的鍵的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA);微小干擾RNA(miRNA);小時(shí)序RNA(stRNA);或短發(fā)夾RNA(shRNA) yj、RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa);小激活RNA(saRNA)、或其組合。 dsRNA也可激活基因表達(dá)，這是已被稱(chēng)為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa的機(jī)制。靶定基因啟動(dòng)子的dsRNA誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。在人細(xì)胞中使用合成dsRNA(稱(chēng)為“小激活RNA” (saRNA))證實(shí)RNAa。已發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA))是稱(chēng)為RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi總是導(dǎo)致基因沉默。然而，在下文實(shí)施例章節(jié)詳述的例子中，顯示寡核苷酸增加膠原基因多核苷酸和其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNA也可充當(dāng)小激活RNA(saRNA)。不希望受理論約束，通過(guò)靶定基因啟動(dòng)子中的序列，saRNA在稱(chēng)為dsRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的現(xiàn)象中誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文鑒定的“靶區(qū)段”可用于篩選調(diào)節(jié)膠原基因多核苷酸表達(dá)的另外化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”為以下化合物，其減少或增加編碼膠原基因的核酸分子的表達(dá)并包含與靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5個(gè)核苷酸的部分。篩選方法包括以下步驟使編碼膠原基因有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，以及選擇一種或多種減少或增加編碼膠原基因多核苷酸的核酸分子表達(dá)的候選調(diào)節(jié)劑(例如SEQ IDNO :10-29)。一旦顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如減少或增加)編碼膠原基因多核苷酸的核酸分子表達(dá)，則可將所述調(diào)節(jié)劑用于膠原基因多核苷酸功能的進(jìn)一步調(diào)查研究，或用作依照本發(fā)明的研究、診斷或治療劑。靶定天然反義序列調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，膠原基因(例如檢索號(hào)NM_000088、NM_000089、NM_000094)。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)為膠原基因的反義多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸(例如檢索號(hào)NM_000088、NM_000089、NM_000094)的有義和/或天然反義序列、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子且所述靶標(biāo)包括反義和/或有義膠原基因多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。本發(fā)明的靶區(qū)段也可與本發(fā)明的其各自互補(bǔ)的反義化合物結(jié)合，以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域中已顯示這類(lèi)雙鏈寡核苷酸部分經(jīng)由反義機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)靶表達(dá)和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，所述雙鏈部分可經(jīng)受化學(xué)修飾。例如，已顯示這類(lèi)雙鏈部分通過(guò)所述雙鏈體的反義鏈與靶標(biāo)的典型雜交來(lái)抑制該靶標(biāo)，從而觸發(fā)靶標(biāo)的酶促降解。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸祀定膠原基因多核苷酸(例如檢索號(hào)NM_000088、NM_000089、NM_000094)、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不單獨(dú)限于膠原基因而是擴(kuò)展到膠原基因分子的任何同種型、受體、同源物等等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的天然反義序列(例如，如SEQ ID NO :4-9所述的多核苷酸)，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :10-29所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸與膠原基因反義物的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，并調(diào)節(jié)膠原基因分子的表達(dá)和/或功能，所述核酸序列包括但不限于與膠原基因多核苷酸有關(guān)的非編碼有義和/或反義序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸與如SEQ ID NO :4_9所述的膠原基因天然反 義物的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，并調(diào)節(jié)膠原基因分子的表達(dá)和/或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO 10-29的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列且調(diào)節(jié)膠原基因分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶標(biāo)包括膠原基因，包括其家族成員、膠原基因的變體；膠原基因的突變體，包括SNP ;膠原基因的非編碼序列；膠原基因的等位基因；物種變體、片段等等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，祀定膠原基因多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA);微小干擾 RNA (miRNA);小時(shí)序 RNA (stRNA);或短發(fā)夾RNA(shRNA);小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa);或小激活RNA(saRNA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，膠原基因多核苷酸(例如SEQ ID NO :4_9)的靶定調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)或功能相比于對(duì)照為增量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)或功能相比于對(duì)照為減量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義化合物包括如SEQ ID NO :10-29所述的序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸、更短或更長(zhǎng)的片段、經(jīng)修飾的鍵等等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID NO 10-29包含一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸。所需靶核酸的調(diào)節(jié)可以本領(lǐng)域已知的數(shù)個(gè)方式來(lái)進(jìn)行。例如，反義寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)為能夠催化一種或多種不同反應(yīng)(包括以核苷酸堿基序列特異的方式反復(fù)切割其他單獨(dú)的核酸分子的能力)的核酸分子。這類(lèi)酶促核酸分子可用于，例如，靶定幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄物。由于反式切割酶促核酸分子的序列特異性，其有望作為用于人類(lèi)疾病的治療劑?？蓪⒚复俸怂岱肿釉O(shè)計(jì)成在細(xì)胞RNA背景下切割特定的RNA靶標(biāo)。這類(lèi)切割事件致使mRNA無(wú)功能且終止從該RNA的蛋白表達(dá)。以這種方式，可選擇性地抑制與疾病狀態(tài)有關(guān)的蛋白合成。一般而言，帶有RNA切割活性的酶促核酸通過(guò)首先與靶RNA結(jié)合來(lái)起作用。這類(lèi)結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分來(lái)進(jìn)行，該酶促核酸的靶結(jié)合部分保持緊密靠近進(jìn)行切割靶RNA的分子的酶促部分。因此，所述酶促核酸首先識(shí)別而后通過(guò)互補(bǔ)的堿基配對(duì)與靶RNA結(jié)合，且一旦與正確的位點(diǎn)結(jié)合，即進(jìn)行酶促地切割靶RNA。這類(lèi)靶RNA的策略性切割將破壞其指導(dǎo)合成編碼蛋白的能力。在酶促核酸結(jié)合和切割其RNA靶標(biāo)之后，其從該RNA中釋放以尋找另一個(gè)靶標(biāo)且可反復(fù)結(jié)合和切割新靶標(biāo)。已使用諸如體外選擇(進(jìn)化)策略等數(shù)種途徑來(lái)進(jìn)化能夠催化各種反應(yīng)的新核酸催化劑，所述反應(yīng)為例如磷酸二酯鍵和酰胺鍵的切割和連接。催化活性最佳的核酶的開(kāi)發(fā)會(huì)顯著地有助于以調(diào)節(jié)基因表達(dá)為目的而采用RNA切割核酶的任何策略。例如錘頭狀核酶在存在Mg2+輔因子的飽和(IOmM)濃度下，以約Imin-I的催化速率(kcat)起作用。已顯示人造“RNA連接酶”核酶以約IOOmin-I的速率催化相應(yīng)的自我修飾反應(yīng)。此外，據(jù)了解具有由DNA組成的底物結(jié)合臂的某些經(jīng)修飾的錘頭狀核酶，以接近IOOmin-I的倍數(shù)轉(zhuǎn)換速率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最終，用某些核苷酸類(lèi)似物置換在錘頭的催化核心內(nèi)的特定殘基產(chǎn)生顯示·出在催化速率上多達(dá)10倍改進(jìn)的修飾核酶。這些研究結(jié)果證實(shí)核酶可以以顯著高于大多數(shù)天然自我切割核酶展示于體外的催化速率，促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)化。那么可能的是，可優(yōu)化某些自我切割核酶的結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生最高的催化活性，或者可制備展示出顯著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA基序。通過(guò)符合“錘頭”模型的RNA催化劑來(lái)分子間切割RNA底物首先顯示于1987年。將所述RNA催化劑回收并與多種RNA分子反應(yīng)，證實(shí)其為真正催化性的?；凇板N頭”基序設(shè)計(jì)的催化性RNA已通過(guò)在催化性RNA中作出適當(dāng)?shù)膲A基改變以維持與靶序列的必要堿基配對(duì)，來(lái)用于切割特定靶序列。這允許使用催化性RNA來(lái)切割特定靶序列，并指出根據(jù)“錘頭”模型設(shè)計(jì)的催化性RNA可能在體內(nèi)切割特定底物RNA。RNA干擾(RNAi)已成為調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的強(qiáng)大工具。此方法要求使用表達(dá)質(zhì)?；虿《疽约凹庸こ蓅iRNA的小發(fā)夾RNA的編碼序列，將小干擾RNA(siRNA)作為RNA本身或作為DNA遞送。此系統(tǒng)能夠有效將前siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到它們?cè)谄渲谢钴S的細(xì)胞質(zhì)中，并允許使用經(jīng)調(diào)節(jié)的和組織特異的啟動(dòng)子用于基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體、或其模擬物、嵌合體、類(lèi)似物或同源物。此術(shù)語(yǔ)包括由天然存在核苷酸、糖和共價(jià)核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸以及類(lèi)似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。由于所需性質(zhì)，例如增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、對(duì)靶核酸增強(qiáng)的親和力以及在核酸酶存在時(shí)增大的穩(wěn)定性，常常需要這類(lèi)經(jīng)修飾或取代的寡核苷酸超過(guò)天然形式。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類(lèi)似物或同源物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA以及與靶核酸的至少一部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。因此，它們可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物且可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或末端突起、錯(cuò)配或環(huán)。將反義化合物常規(guī)地制備成線性但可經(jīng)連接或者另外地制備成環(huán)狀和/或分枝的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交以形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈，或帶有足夠自我互補(bǔ)性以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。可將所述兩條鏈內(nèi)部連接而留下游離的3’或5’末端或可將其連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端上包含突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進(jìn)一步的修飾可包括與末端之一、經(jīng)挑選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一連接的綴合基團(tuán)。備選地，所述兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或連接基團(tuán)來(lái)連接。當(dāng)形成自僅一條鏈時(shí)，dsRNA可采取自我互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對(duì)折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過(guò)dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的穩(wěn)定表達(dá)來(lái)完成。當(dāng)形成自兩條鏈或采取在其自身上對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式的單鏈時(shí)，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))為以沃森-克里克模式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。 一旦弓丨入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可經(jīng)由基于占據(jù)的機(jī)制來(lái)運(yùn)作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’脫氧糖和，一般地，T而不是U堿基)或“RNA樣”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’羥基或2’修飾的糖和，一般U而不是T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)，最普通地A和B型。據(jù)認(rèn)為，一般而言，具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“RNA樣 ”。在一些(嵌合的)實(shí)施方案中，反義化合物可包含A和B型區(qū)兩者。依照本發(fā)明的反義化合物可包含約5-約80個(gè)核苷酸(即約5-約80個(gè)連接核苷)長(zhǎng)度的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長(zhǎng)度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包含5-約80個(gè)核苷酸，而本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如，dsRNA)包含5-約80個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 或 80 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有10-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這包括具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49或50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為15個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有12或13-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這包括具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分的反義化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括其中不同的堿基存在于化合物中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個(gè)核苷酸為腺苷，那么可產(chǎn)生在此位置包含胸苷、鳥(niǎo)苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置上進(jìn)行。然后使用本文所述的方法來(lái)檢測(cè)這些化合物以確定其抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物與靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約40%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80*%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸(例如，SEQ ID NO :4-29中所述的核酸分子)包含一個(gè)或多個(gè)取代或修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，將核苷酸用鎖定核酸(LNA)取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定與膠原基因有關(guān)的編碼和/或非編碼序列以及如SEQ ID NO :1-9所述的序列有義和/或反義的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)。也將寡核苷酸靶定到SEQ ID NO :1-9的重疊區(qū)。本發(fā)明的某些寡核苷酸為嵌合寡核苷酸?！扒逗瞎押塑账帷被颉扒逗象w”，在本發(fā)明的文段中，為包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)上不同區(qū)的寡核苷酸，每個(gè)區(qū)由至少一個(gè)核苷酸組成。這些寡核苷酸典型地包含賦予一種或多種有益特性(例如，對(duì)核酸酶的抗性增強(qiáng)、攝入細(xì)胞增強(qiáng)、對(duì)靶標(biāo)增強(qiáng)的結(jié)合親和力)的修飾核苷酸的至少一個(gè)區(qū)，以及作為能夠切割RNAiDNA或RNA = RNA雜合體的酶底物的區(qū)。作為實(shí)例，核糖核酸酶H為細(xì)胞核酸內(nèi)切酶，其切割RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈。核糖核酸酶H的活化因此導(dǎo)致RNA靶標(biāo)的切割，從而大大地增強(qiáng)基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)效率。因此，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時(shí)，與雜交到相同靶區(qū)的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，常常可用較短的寡核苷酸獲得相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。RNA靶標(biāo)的切割可通 過(guò)凝膠電泳和必要時(shí)本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)，常規(guī)地檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸包含修飾成增加靶結(jié)合親和力的至少一個(gè)區(qū)，并且通常包含充當(dāng)核糖核酸酶H的底物的區(qū)。寡核苷酸對(duì)其靶標(biāo)(在此情況下，編碼ras的核酸)的親和力通過(guò)測(cè)定寡核苷酸/靶標(biāo)對(duì)的Tm來(lái)常規(guī)地確定，Tm為寡核苷酸與靶標(biāo)解離的溫度；解離以分光光度法檢測(cè)。Tm越高,寡核苷酸對(duì)祀標(biāo)的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可作為如上所述的兩種或更多種寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)而形成。本領(lǐng)域亦已將這類(lèi)化合物稱(chēng)為雜合體或gapmer。教導(dǎo)制備這類(lèi)雜合結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第 5，013，830,5, 149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133、5，565，350,5, 623，065,5, 652，355,5, 652，356 及 5，700，922 號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的寡核苷酸區(qū)包含在糖的2’位置上修飾的至少一個(gè)核苷酸，最優(yōu)選2’ -0烷基、2’ -0-烷基-0-烷基或2’ -氟修飾的核苷酸。在其它實(shí)施方案中，RNA修飾包括在RNA 3’末端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的2’ -氟、2’ -氨基和2’ 0-甲基修飾。將這類(lèi)修飾常規(guī)地?fù)饺氲焦押塑账嶂?，已顯示這些寡核苷酸具有比2’ -脫氧寡核苷酸對(duì)給定靶標(biāo)更高的Tm(即，更高的靶結(jié)合親和力)。這種增加的親和力的作用大大地增強(qiáng)基因表達(dá)的RNAi寡核苷酸抑制。核糖核酸酶H為切割RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶；此酶的活化因此導(dǎo)致RNA靶標(biāo)的切割，且因此可大大地增強(qiáng)RNAi抑制效率。RNA靶標(biāo)的切割可通過(guò)凝膠電泳來(lái)常規(guī)地證實(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，也修飾嵌合寡核苷酸以增強(qiáng)核酸酶抗性。細(xì)胞包含可降解核酸的各種核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。已顯示許多核苷酸和核苷修飾使摻入有它們的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對(duì)核酸酶消化更有抗性。核酸酶抗性通過(guò)將寡核苷酸與細(xì)胞提取物或分離的核酸酶溶液一起孵育并測(cè)定隨時(shí)間推移剩余的完好寡核苷酸的程度(通常地通過(guò)凝膠電泳)來(lái)常規(guī)地測(cè)定。已修飾成增強(qiáng)其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾寡核苷酸保持完好持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。已證實(shí)多種寡核苷酸修飾增強(qiáng)或賦予核酸酶抗性。包含至少一個(gè)硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸為目前更優(yōu)選的。在一些情況下，增強(qiáng)靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾也能夠獨(dú)立地增強(qiáng)核酸酶抗性。一些所需的修飾可在 De Mesmaeker 等，(1995)Acc. Chem. Res. ,28 :366-374 中找到。
預(yù)想用于本發(fā)明的一些寡核苷酸的具體實(shí)例包括包含經(jīng)修飾的骨架的那些，所述經(jīng)修飾的骨架為例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或者短鏈雜原子或雜環(huán)的糖間鍵。最多的為帶有硫代磷酸酯骨架和帶有雜原子骨架的寡核苷酸，雜原子骨架特別地為CH2—NH—0—CH2、CH, —N(CH3)—0—CH2[稱(chēng)為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架]、CH2—0—N (CH3) —CH2、CH2_N (CH3) —N (CH3) —CH2 和 0—N (CH3) —CH2—CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示為0-P—0-CH。由De Mesmaeker等，(1995)Acc.Chem. Res. 28 :366-374公開(kāi)的酰胺骨架也為優(yōu)選的。具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和Weller，美國(guó)專(zhuān)利第5，034，506號(hào))亦是如此。在其他實(shí)施方案中，將寡核苷酸的例如肽核酸(PM)骨架、磷酸二酯骨架替換為聚酰胺骨架，核苷酸直接或間接地與聚酰胺骨架的氮雜氮原子結(jié)合。寡核苷酸也可包含一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。寡核苷酸在 2’ 位置上包含下列中的一種0H、SH、SCH3、F、OCN、0CH30CH3、0CH30(CH2)nCH3、0(CH2)nNH2或0(CH2)nCH3，其中n為I-約10 ;C1_C10低級(jí)烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基或芳烷基；C1 ；Br ；CN ；CF3 ；0CF3 ;0—、S—、或N-烷基；0—、S—、或N-烯基；S0CH3 ；S02CH3 ；0N02 ；N02 ；N3 ；NH2 ;雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基； 取代的甲硅烷基；RNA切割基團(tuán)；報(bào)道基團(tuán)；嵌入劑；改進(jìn)寡核苷酸藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)；或改進(jìn)寡核苷酸藥效學(xué)特性的基團(tuán)以及具有類(lèi)似特性的其他取代基。修飾包括2’ -甲氧乙氧基[2' -0-CH2CH20CH3，也稱(chēng)為I' -0-(2-甲氧乙基)]。其他修飾包括2’ -甲氧基(2' -0—CH3)、2’ -丙氧基(2' -0CH2CH2CH3)和2’ -氟(2' -F)。類(lèi)似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進(jìn)行，具體地在3’末端核苷酸上糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基基團(tuán)的環(huán)丁基。寡核苷酸也可另外或備選地包含核堿基(本領(lǐng)域常常簡(jiǎn)稱(chēng)為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括在天然核酸中僅稀少或短暫地存在的核苷酸，例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特別地5-甲基胞嘧啶(也稱(chēng)為5-甲基-2’脫氧胞嘧啶且常常在本領(lǐng)域中稱(chēng)為5-Me-C)、5_羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基HMC,以及合成核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、
2-(氨烷基氨基)腺嘌呤或其他雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤?？砂ū绢I(lǐng)域已知的“通用的”堿基，例如，肌苷。已顯示5-Me-C取代增強(qiáng)核酸雙鏈體的穩(wěn)定性達(dá)0. 6-1. 2V (Sanghvi，Y. S.，載于Crooke，S. T.和Lebleu，B.，編輯，反義研究和應(yīng)用(Antisense Research and Applications), CRC Press, Boca Raton,1993，276-278頁(yè))且為目前的堿基取代。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學(xué)方法使一種或多種增強(qiáng)寡核苷酸的活性或細(xì)胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這類(lèi)部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽留醇基部分、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、巰基膽固醇、脂族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-消旋-甘油或1，2- 二 -0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸。包含親脂性部分的寡核苷酸以及用于制備這類(lèi)寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域已知的，例如美國(guó)專(zhuān)利第5，138，045、5，218，105 和 5，459，255 號(hào)。
無(wú)需將給定寡核苷酸中的所有位置一致地修飾，且實(shí)際上多于一種上述修飾可摻入到單個(gè)寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸內(nèi)的單個(gè)核苷內(nèi)部。本發(fā)明也包括作為如上文中定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子與另一個(gè)部分綴合，所述部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或聚碳?xì)浠衔?。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可將這些分子在糖、堿基或磷酸基的數(shù)個(gè)位置上連接到一個(gè)或多個(gè)構(gòu)成核酸分子的任何核苷酸。依照本發(fā)明使用的寡核苷酸可通過(guò)眾所周知的固相合成技術(shù)來(lái)便利和常規(guī)地制備。用于這類(lèi)合成的設(shè)備由包括Applied Biosystems在內(nèi)的數(shù)個(gè)供應(yīng)商銷(xiāo)售。也可使用用于這類(lèi)合成的任何其他方法；寡核苷酸的實(shí)際合成完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的才能之內(nèi)。亦眾所周知的是使用類(lèi)似技術(shù)來(lái)制備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生 物。還眾所周知的是使用類(lèi)似技術(shù)和市購(gòu)經(jīng)修飾的amidites和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)品，例如生物素、突光黃、卩丫唳、或補(bǔ)骨脂素修飾的amidites和/或CPG(可從Glen Research,Sterling VA購(gòu)買(mǎi))，以合成熒光標(biāo)記的、生物素化的或其他修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。依照本發(fā)明，使用修飾(例如使用LNA單體)以增加寡核苷酸的效價(jià)、特異性和作用持續(xù)時(shí)間并拓寬其施用途徑，所述寡核苷酸由諸如M0E、ANA、FANA、PS等當(dāng)前的化學(xué)物質(zhì)組成。這可通過(guò)用LNA單體取代當(dāng)前寡核苷酸中的一些單體來(lái)完成。LNA修飾的寡核苷酸可具有類(lèi)似于母體化合物的大小或可更大或優(yōu)選更小。這類(lèi)LNA修飾寡核苷酸包含少于約70%、更優(yōu)選少于約60%、最優(yōu)選少于約50%的LNA單體且其大小在約5_25個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選在約12-20個(gè)核苷酸之間。修飾的寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3’烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3’ -5’鍵合的硼烷磷酸酯(boranophosphates)、這些的2’ -5’連接類(lèi)似物，以及具有反極性的那些，其中核苷單元的相鄰對(duì)為3’ -5’與5’ -3’或2’ -5’與5’ -2’連接的。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)制備上述含磷鍵的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第3，687，808、4，469，863,4, 476，301,5, 023，243,5, 177，196,5, 188，897,5, 264，423,5, 276，019、5，278，302,5,286，717,5,321，131,5, 399，676,5, 405, 939,5, 453，496,5, 455，233、5，466，677,5, 476，925,5, 519，126,5, 536, 821,5, 541，306,5, 550, 111,5, 563, 253、5，571，799,5, 587，361和5，625，050號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。修飾的寡核苷酸骨架(其中不包含磷原子)，具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲乙?；?formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亞甲基甲乙酰基和硫代甲乙?；羌?；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2組分部分的其他骨架。
教導(dǎo)制備上述寡聚核苷的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第5，034，506,5, 166，315,5, 185，444,5, 214，134,5, 216，141,5, 235，033,5, 264，562、5，264，564,5, 405，938,5, 434，257,5, 466，677,5, 470，967,5, 489，677,5, 541，307、5，561，225,5,596，086,5,602,240,5,610, 289,5, 602, 240,5, 608, 046,5, 610, 289、5，618，704,5, 623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439 號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。在其他寡核苷酸模擬物中，將核苷酸單元的糖和核苷間鍵(即骨架)，均用新基團(tuán)置換。維持堿基單元用于與適當(dāng)?shù)暮怂岚谢衔镫s交。一種這類(lèi)寡聚化合物，即已顯示具有優(yōu)秀的雜交特性的寡核苷酸模擬物，稱(chēng)為肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架替換為含酰胺的骨架，具體地氨乙基氨基乙酸骨架。將核堿基保留并直接或間接地與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導(dǎo)制備PNA化合物的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第5，539，082,5, 714，331和5，719，262號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。PNA化合物的進(jìn)一步教導(dǎo)可在Nielsen等，(1991) Science 254，1497-1500中找到。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，帶有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和帶有雜原子骨架的寡聚核苷，雜原子骨架具體地為-CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N (CH3) -0-CH2-(稱(chēng)為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架)、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、-CH2N (CH3)-N (CH3)CH2-和-O-N (CH3) -CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示為上文引用的美國(guó)專(zhuān)利第5，489，677號(hào)的-0-P-0-CH2-，以及上文引用的美國(guó)專(zhuān)利第5，602，240號(hào)的酰胺骨架。具有上文引用的美國(guó)專(zhuān)利第5，034，506號(hào)的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸亦是如此。修飾寡核苷酸也可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)取代的糖部分。寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種0H;F;0-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或0烷基-0-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可為取代或未取代的C到CO烷基或C2到CO烯基和炔基。特別是 0 (CH2) n0mCH3、0 (CH2) n，0CH3、0 (CH2) nNH2、0 (CH2) nCH3、0 (CH2) n0NH2 及0(CH2n0N(CH2)nCH3)2，其中n和m可為I-約10。其他的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種C到CO、低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、用于改進(jìn)寡核苷酸藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)、或用于改進(jìn)寡核苷酸藥效學(xué)特性的基團(tuán)，以及具有類(lèi)似特性的其他取代基。修飾包括2’ -甲氧乙氧基(2' -0-CH2CH20CH3，也稱(chēng)為2’ -0-(2-甲氧乙基)或2' -M0E)，S卩，烷氧基烷氧基基團(tuán)。另外的修飾包括2’- 二甲基氨基氧基乙氧基，即0(CH2)20N(CH3)2基團(tuán)，也稱(chēng)為2' -DMAOE(如下文實(shí)施例中所述)，以及2’ -二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱(chēng)為2’ -0-二甲基氨基乙氧基乙基或2' -DMAE0E)，即2' -0-CH2-0-CH2-N(CH2)2。其他修飾包括2’ -甲氧基(2' -0CH3)、2’ -氨基丙氧基(2' -0CH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2' -F)。類(lèi)似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進(jìn)行，具體地在3’末端核苷酸上或2’ -5’連接的寡核苷酸中糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基糖的環(huán)丁基部分。教導(dǎo)制備這類(lèi)經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第4，981，957,5, 118，800,5, 319，080,5, 359，044、5，393，878、5，446，137、5，466，786、5，514，785、5，519，134、5，567，811,5, 576，427、5，591，722、5，597, 909、5，610, 300、5，627, 053、5，639，873、5，646，265、5，658，873、5，670, 633和5，700, 920號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。寡核苷酸也可包含核堿基(本領(lǐng)域常常簡(jiǎn)稱(chēng)為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥(niǎo)嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、
2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤、5-鹵代具體地5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤(methylquanine)和7_甲基腺嘌呤、8_氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤和
3-脫氮雜腺嘌呤。此外，核苷酸包括公開(kāi)于以下文獻(xiàn)中的核苷酸美國(guó)專(zhuān)利第3，687，808號(hào)、“高分子科學(xué)和工程的簡(jiǎn)明百科全書(shū)(The Concise Encyclopedia of Polymer Science AndEngineering) ”，858-859 頁(yè)，Kroschwitz, J. I.，編輯，John ffiley&Sons, 1990、Englisch等，'Angewandle Chemie, International Edition' , 1991, 30,613頁(yè)及Sanghvi, Y. S ,第15 章，“反義研究和應(yīng)用(Antisense Research and Applications) ”，289-302 頁(yè)，Crooke，S. T.和Lebleu，B. ea.，CRC Press，1993。這些核苷酸中的某些對(duì)于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力特別地有用。這些包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代增加核酸雙鏈體的穩(wěn)定性達(dá)0. 6-1. 20C (Sanghvi, Y. S.，Crooke, S. T.和Lebleu，B.，編輯，“反義研究和應(yīng)用”，CRC Press, Boca Raton，1993，276-278頁(yè))且為目前的堿基取代，更特別地當(dāng)與2’ -0甲氧基乙基糖修飾組合時(shí)。教導(dǎo)制備上述修飾核苷酸以及其他修飾核苷酸的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第 3，687，808、以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273、5，367，066,5, 432，272,5, 457，187,5, 459，255,5, 484，908,5, 502，177,5, 525，711、5，552，540,5, 587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941 號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用
結(jié)合于本文中。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使所述寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，該部分或綴合物增強(qiáng)所述寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。這類(lèi)部分包括但不限于，脂質(zhì)部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二-十六燒基_消旋_甘油或I，2- 二 -0-十六燒基_消旋_甘油-3-H-勝酸二乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-t羥膽固醇部分。教導(dǎo)制備這類(lèi)寡核苷酸綴合物的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717,5, 580, 731,5, 580, 731,5, 591，584,5, 109, 124,5, 118，802,5, 138，045、5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、4，667，025,4,762，779,4,789，737,4,824，941,4, 835，263,4, 876，335,4, 904，582、4，958，013,5, 082，830,5, 112，963,5, 214，136,5, 082，830,5, 112，963,5, 214，136、5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552,5,567，810,5, 574，142,5,585，481,5, 587，371,5,595，726,5,597，696、5，599，923,5, 599, 928和5,688,941號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。藥物開(kāi)發(fā)本發(fā)明的化合物也可應(yīng)用于藥物開(kāi)發(fā)和靶標(biāo)驗(yàn)證的領(lǐng)域。本發(fā)明包括本文所鑒定的化合物和靶區(qū)段在闡明存在于膠原基因多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或病況之間的關(guān)系的藥物開(kāi)發(fā)努力中的應(yīng)用。這些方法包括檢測(cè)或 調(diào)節(jié)膠原基因多核苷酸，包括使本發(fā)明的化合物與樣品、組織、細(xì)胞或生物體接觸；在處理后的某個(gè)時(shí)間測(cè)定膠原基因多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)的表型或化學(xué)終末點(diǎn)，以及任選將該測(cè)定值與未處理樣品或與用本發(fā)明的另一種化合物處理的樣品比較。這些方法也可與其他試驗(yàn)平行或組合進(jìn)行以確定未知基因的功能用于靶標(biāo)驗(yàn)證過(guò)程，或確定特定基因產(chǎn)物作為用于治療或預(yù)防特定疾病、病況或表型的靶標(biāo)的有效性。評(píng)價(jià)基因表達(dá)的增量調(diào)節(jié)或抑制外源核酸到宿主細(xì)胞或生物體中的轉(zhuǎn)移可通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)胞或生物體中核酸的存在情況來(lái)評(píng)價(jià)。這類(lèi)檢測(cè)可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的數(shù)種方法來(lái)完成。例如，外源核酸的存在情況可通過(guò)DNA印跡或通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)使用以下引物來(lái)檢測(cè)，該引物特異地?cái)U(kuò)增與所述核酸相關(guān)的核苷酸序列。外源核酸的表達(dá)也可使用包括基因表達(dá)分析在內(nèi)的常規(guī)方法來(lái)測(cè)定。例如，由外源核酸產(chǎn)生的mRNA可使用RNA印跡和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來(lái)檢測(cè)和定量。來(lái)自外源核酸的RNA表達(dá)也可通過(guò)測(cè)定酶活性或報(bào)道蛋白活性來(lái)檢測(cè)。例如，反義調(diào)節(jié)活性可根據(jù)靶核酸表達(dá)的減少或增加間接地測(cè)定，靶核酸表達(dá)的減少或增加作為外源核酸正在產(chǎn)生效應(yīng)物RNA的指示。基于序列保守性，可設(shè)計(jì)和使用引物來(lái)擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)。最初，可使用來(lái)自每個(gè)基因的最高表達(dá)的編碼區(qū)來(lái)建立模型對(duì)照基因，但任何編碼或非編碼區(qū)均可使用。每個(gè)對(duì)照基因通過(guò)將每個(gè)編碼區(qū)插入報(bào)道基因編碼區(qū)和其聚腺苷酸信號(hào)之間來(lái)裝配。這些質(zhì)?？僧a(chǎn)生在基因的上游部分具有報(bào)道基因以及在3’非編碼區(qū)中具有潛在RNAi靶標(biāo)的mRNA。各個(gè)反義寡核苷酸的有效性可通過(guò)調(diào)節(jié)報(bào)道基因來(lái)測(cè)定。可用于本發(fā)明的方法中的報(bào)道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)半乳糖苷酶(LacZ)葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚(yú)堿合酶(OCS)以及其衍生物。多重選擇標(biāo)記為可利用的，其賦予對(duì)氨芐青霉素、博來(lái)霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦(phosphinothricin)、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。確定報(bào)道基因調(diào)節(jié)的方法為本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于，熒光法(例如熒光光譜法、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、熒光顯微法)、抗生素抗性測(cè)定。COLlAl、C0L1A2、C0L7A1蛋白和mRNA表達(dá)可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文別處所描述的方法測(cè)定。例如，免疫測(cè)定法(例如ELISA)可用來(lái)測(cè)定蛋白水平。用于ELISA的膠原基因抗體可市購(gòu)，例如，從 R&D Systems (Minneapolis, MN), Abeam, Cambridge, MA。在實(shí)施方案中，使用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品(例如，體內(nèi)或體外細(xì)胞或組織)中的COLlAl、C0L1A2、C0L7A1表達(dá)(例如，mRNA或蛋白)通過(guò)與對(duì)照樣品中的膠原基因表達(dá)相比較來(lái)評(píng)價(jià)。例如，蛋白或核酸表達(dá)可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，與模擬處理或未處理樣品中的蛋白或核酸表達(dá)相比較。或者，與用對(duì)照反義寡核苷酸(例如，具有已改變或不同序列的反義寡核苷酸)處理的樣品的比較可根據(jù)所需信息來(lái)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將已處理樣品對(duì)比未處理樣品在膠原基因蛋白或核酸表達(dá)方面的差異，與已處理樣品對(duì)比未處理樣品在不同核酸(包括研究者認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜魏螛?biāo)準(zhǔn)，例如，持家基因)表達(dá)方面的差異相比較?？蓪⒂^察到的差異根據(jù)需要例如以比例或分?jǐn)?shù)的形式表達(dá)，用于與對(duì)照比較。在實(shí)施方案中，膠原基因mRNA或蛋白水平，在用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品中，相對(duì)于未處理樣品或用對(duì)照核酸處理的樣品增加至約I. 25倍-約10倍或更多或者減少至約1/1. 25-約1/10或更少。在實(shí)施方案中，膠原基因mRNA或蛋白水平增加或減少至至少約 I. 25倍、至少約I. 3倍、至少約I. 4倍、至少約I. 5倍、至少約I. 6倍、至少約I. 7倍、至少約I. 8倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、至少約5. 5倍、至少約6倍、至少約6. 5倍、至少約7倍、至少約7. 5倍、至少約8倍、至少約8. 5倍、至少約9倍、至少約9. 5倍、或至少約10倍或更多。試劑盒、研究試劑、診斷和治療本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療和預(yù)防，并作為研究試劑和試劑盒的組分。此夕卜，能夠靈敏特異地抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸，常常被普通技術(shù)人員用于闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑的各個(gè)成員的功能。對(duì)于用于試劑盒和診斷和各種生物系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物(單獨(dú)的或與其他化合物或治療劑組合)可用作在差異和/或組合分析中的工具，以闡明在細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)的基因的一部分或全部互補(bǔ)序列的表達(dá)模式。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物系統(tǒng)”或“系統(tǒng)”定義為表達(dá)或使得能夠表達(dá)膠原基因產(chǎn)物的任何生物體、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，將在用一種或多種反義化合物處理的細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)模式與未用反義化合物處理的對(duì)照細(xì)胞或組織相比較，并針對(duì)基因表達(dá)的差異水平分析產(chǎn)生的模式，因?yàn)樗鼈冇嘘P(guān)于，例如，所檢測(cè)基因的疾病相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可對(duì)受刺激或未受刺激的細(xì)胞以及在影響表達(dá)模式的其他化合物存在或不存在時(shí)進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析方法的實(shí)例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo，(2000) FEBS Lett.，480，17-24 ;Celis 等，(2000) FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE (基因表達(dá)的系列分析)(Madden 等，(2000) Drug Discov. Today, 5,415-425)、READS (已消化 cDNA 的限制酶擴(kuò)增)(Prashar 和 Weissman, (1999)Methods Enzymol. ,303,258-72)、TOGA (總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe 等，(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,97,1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis 等,(2000)FEBS Lett. ,480,2-16 ;Jungblut 等,Electrophoresis,1999，20，2100-10)、已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)測(cè)序(Celis 等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16 ;Larsson 等,J. Biotechnol. , 2000,80,143-57)、消減 RNA 指紋法(subtractive RNAfingerprinting, SuRF) (Fuchs 等，(2000)Anal. Biochem. 286,91-98 ；Larson 等，(2000)Cytometry 41, 203-208)、消減克隆(subtractive cloning)、差異顯不(DD) (Jurecic和 Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21) > 比較基因組雜交(Carulli 等，(1998) J. Cell Biochem. Suppl.，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35,1895-904)和質(zhì)譜分析法(To, Comb. (2000) Chem. HighThroughput Screen,3,235-41)。本發(fā)明的化合物對(duì)于研究和診斷而言為有用的，因?yàn)檫@些化合物與編碼膠原基因的核酸雜交。例如，作為有效的膠原基因調(diào)節(jié)劑以本文公開(kāi)的這類(lèi)效率和這類(lèi)條件下雜交的寡核苷酸，在有利于基因擴(kuò)增或檢測(cè)的條件下分別為有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要對(duì)編碼膠原基因的核酸分子特異檢測(cè)的方法中，和可用于擴(kuò)增所述核酸分子，以用于檢測(cè)或用于進(jìn)一步研究膠原基因。本發(fā)明的反義寡核苷酸(具體地，引物和探 針)與編碼膠原基因的核酸的雜交，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)。這類(lèi)方法可包括使酶與所述寡核苷酸綴合、放射性標(biāo)記所述寡核苷酸或任何其他適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。也可制備使用這類(lèi)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)樣品中膠原基因水平的試劑盒。反義物的特異性和靈敏性也由本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握用于治療用途。已將反義化合物在動(dòng)物(包括人)的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已安全和有效地施用給人且許多臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行。因此確立的是，反義化合物可為有用的治療形式，可將其經(jīng)配置以在用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物、尤其是人的治療方案中有用。對(duì)于治療而言，將懷疑具有可通過(guò)調(diào)節(jié)膠原基因多核苷酸的表達(dá)來(lái)治療的疾病或病癥的動(dòng)物(優(yōu)選人)，通過(guò)施用依照本發(fā)明的反義化合物來(lái)治療。例如，在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，所述方法包括給需要治療的動(dòng)物施用治療上有效量的膠原基因調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明的膠原基因調(diào)節(jié)劑有效地調(diào)節(jié)膠原基因的活性或調(diào)節(jié)膠原基因蛋白的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物中膠原基因的活性或表達(dá)與對(duì)照相比抑制了約10%。優(yōu)選地，將動(dòng)物中膠原基因的活性或表達(dá)抑制約30%。更優(yōu)選地，將動(dòng)物中膠原基因的活性或表達(dá)抑制50%或更多。因此，與對(duì)照相比，寡聚化合物將膠原基因mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，在動(dòng)物中膠原基因的活性或表達(dá)增加約10%。優(yōu)選地，在動(dòng)物中膠原基因的活性或表達(dá)增加約30%。更優(yōu)選地，在動(dòng)物中膠原基因的活性或表達(dá)增加50%或更多。因此，與對(duì)照比較，寡聚化合物使膠原基因mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。例如，膠原基因表達(dá)的下降可在動(dòng)物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其他體液、組織或器官中測(cè)定。優(yōu)選地，包含于待分析的所述液體、組織或器官之內(nèi)的細(xì)胞包含編碼膠原基因肽的核酸分子和/或膠原基因蛋白本身。本發(fā)明的化合物可通過(guò)向合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中添加有效量的化合物來(lái)用于藥物組合物。本發(fā)明的化合物和方法的應(yīng)用也可為預(yù)防上有用的。綴合物本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學(xué)方法將一種或多種增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這些部分或綴合物可包含與官能團(tuán)(例如伯羥基或仲羥基)共價(jià)結(jié)合的綴合基團(tuán)。本發(fā)明的綴合基團(tuán)包括嵌入齊U、報(bào)道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)寡聚體藥效學(xué)特性的基團(tuán)，以及增強(qiáng)寡聚體藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)。典型的綴合基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光黃、羅丹明、香豆素和染料。增強(qiáng)藥效學(xué)特性的基團(tuán)，在本發(fā)明的文段中，包括改善攝取、增強(qiáng)對(duì)降解的抗性和/或加強(qiáng)與靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。增強(qiáng)藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)，在本發(fā)明的文段中，包括改善本發(fā)明的化合物的攝取、分布、代謝或分泌的基團(tuán)。代表性的綴合基團(tuán)在提交于1992年10月23日的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US92/09196和美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)中公開(kāi)，所述文獻(xiàn)通過(guò)弓I用結(jié)合于本文中。綴合部分包括但不限于，脂質(zhì)部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。也可將本發(fā)明的寡核苷酸與活性藥物物質(zhì)綴合，例如，阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)_(+)普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5_三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜草、11引哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺 類(lèi)藥物、抗糖尿病藥、抗菌劑或抗生素。教導(dǎo)制備這類(lèi)寡核苷酸綴合物的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717,5, 580, 731,5, 580, 731,5, 591，584,5, 109, 124,5, 118，802,5, 138，045、5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、4，667，025,4,762，779,4,789，737,4,824，941,4,835，263,4,876，335,4,904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481,5, 587，371,5, 595，726、5，597，696、5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941 號(hào)。制劑本發(fā)明的化合物也可與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、封裝、綴合或以其他方式締合，作為例如，脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服的、直腸的、局部的或其他制劑，用于有助于攝取、分布和/或吸收。教導(dǎo)制備這類(lèi)攝取、分布和/或吸收輔助制劑的代表性的美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于，美國(guó)專(zhuān)利第5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127、5，521，291、5，543，165、5，547，932、5，583，020、5，591，721、4，426，330、4，534，899、5，013，556、5，108，921、5，213，804、5，227，170、5，264，221,5,356，633、5，395，619、5，416，016,5, 417，978,5, 462，854,5, 469，854,5, 512，295,5, 527，528,5, 534，259、5，543，152,5, 556，948,5, 580，575和5，595，756號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。盡管，反義寡核苷酸不需要在載體的情況中施用以便調(diào)節(jié)靶表達(dá)和/或功能，但是本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于反義寡核苷酸表達(dá)的表達(dá)載體構(gòu)建體，包括啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子基因序列并且擁有強(qiáng)組成型啟動(dòng)子活性，或可在所需情況下誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)施涉及用適合的核酸遞送系統(tǒng)施用至少一種前述反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含與多核苷酸可操作連接的非病毒載體。這類(lèi)非病毒載體的實(shí)例包括單獨(dú)的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO :10-29中的任一個(gè)或多個(gè))或與適合的蛋白、多糖或脂質(zhì)制劑組合的寡核苷酸。其他適合的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，典型地來(lái)自腺病毒、腺病毒伴隨病毒(AAV)、依賴(lài)輔助病毒的腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或仙臺(tái)病毒-脂質(zhì)體(HVJ)復(fù)合體中的至少一種的序列。優(yōu)選地，所述病毒載體包含與多核苷酸可操作連接的強(qiáng)真核啟動(dòng)子，例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。另外的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體,其中g(shù)ag基因和pol基因來(lái)自HIV基因組而env基因來(lái)自另一種病毒。DNA病毒載體為優(yōu)選的。這些載體包括痘病毒載體(例如正痘病毒或禽痘病毒載體)、皰疹病毒載體(例如單純皰疹I(lǐng)病毒(HSV)載體、腺病毒載體和腺伴隨病毒載體。
·
本發(fā)明的反義化合物包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、或這類(lèi)酯的鹽、或任何其他化合物，其在施用給動(dòng)物包括人后，能夠提供(直接地或間接地)生物學(xué)活性的代謝物或其殘留物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的生理上和藥學(xué)上可接受的鹽SP，保留母體化合物的所需生物活性且不對(duì)其賦予非所需的毒理學(xué)作用的鹽。對(duì)于寡核苷酸而言，藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例和其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以若干方式來(lái)施用，這取決于是否需要局部或全身治療以及待治療的區(qū)域。施用可為局部的(包括眼的和至黏膜包括陰道和直腸遞送)、肺的(例如，通過(guò)吸入或吹入散劑或氣霧劑，包括通過(guò)噴霧器)、氣管內(nèi)的、鼻內(nèi)的、表皮的和經(jīng)皮的、□服的或胃腸外的。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉注射或輸注；或顱內(nèi)例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。對(duì)于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組織而言，可通過(guò)例如注射或輸注進(jìn)入腦脊液進(jìn)行施用。施用反義RNA進(jìn)入腦脊液已在例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2007/0117772號(hào)，“Methodsfor slowing familial ALS disease progression(減緩家族性 ALS疾病進(jìn)展的方法)”中描述，該申請(qǐng)通過(guò)引用以其整體結(jié)合于本文中。如果意圖將本發(fā)明的反義寡核苷酸施用給中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞，可與一種或多種能夠促進(jìn)主題反義寡核苷酸滲透穿過(guò)血腦屏障的物質(zhì)一起施用。注射可在例如內(nèi)嗅皮質(zhì)或海馬中進(jìn)行。通過(guò)施用腺病毒載體遞送神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子至肌肉組織中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利第 6，632，427 號(hào)，“Adenoviral-vector-mediated gene transfer intomedullary motor neurons (腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入髓質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)”,其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。直接遞送載體至腦(例如，紋狀體、丘腦、海馬或黑質(zhì))為本領(lǐng)域已知且描述于例如美國(guó)專(zhuān)利第6，756，523號(hào)，“Adenovirus vectors for the transfer of foreigngenes into cells of the central nervous system particularly in brain(用于轉(zhuǎn)移外源基因進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞(具體地腦中)的腺病毒載體)”，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。施用可快速，如通過(guò)注射，或在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，如通過(guò)緩慢輸注或施用緩釋制劑。主題反義寡核苷酸也可與提供所需藥學(xué)或藥效學(xué)特性的物質(zhì)連接或綴合。例如，反義寡核苷酸可與本領(lǐng)域已知的促進(jìn)滲透或轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)血腦屏障的任何物質(zhì)(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體)偶聯(lián)，并通過(guò)靜脈注射施用。反義化合物可與例如使反義化合物更有效和/或增加反義化合物轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)血腦屏障的病毒載體連接。滲透性血腦屏障破壞也可通過(guò)例如輸注糖或氨基酸來(lái)完成，所述糖包括但不限于，內(nèi)消旋赤蘚醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纖維二糖、D(+)麥芽糖、D(+)蜜三糖、L(+)鼠李糖、D⑴蜜二糖、D(-)核糖、側(cè)金盞糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)巖藻糖、L(-)巖藻糖、D(-)來(lái)蘇糖、L(+)來(lái)蘇糖和L(-)來(lái)蘇糖，所述氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和牛磺酸。用于增強(qiáng)血腦屏障滲透的方法和材料描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利第 4，866，042 號(hào)，“Method for the delivery of genetic material acrossthe blood brain barrier (用于遞送遺傳物質(zhì)穿過(guò)血腦屏障的方法)”,第6，294，520號(hào)，“Material for passage through the blood-brain barrier (用于通過(guò)血腦屏障的材料)，，，和第6，936，589號(hào)，“Parenteral delivery systems (胃腸外遞送系統(tǒng))”，全部通過(guò)引用以其整體結(jié)合于本文中。
主題反義化合物可與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、封裝、綴合或以其他方式締合，作為例如脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服的、直腸的、局部的或其他制劑，用于有助于攝取、分布和/或吸收。例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)可包含在制劑中以促進(jìn)寡核苷酸攝取。一種顯示出促進(jìn)攝取的這類(lèi)組合物為L(zhǎng)IP0FECTIN (可從GIBCO-BRL，Bethesda, MD獲得)。認(rèn)為帶有至少一個(gè)2’ -0-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸對(duì)于口服施用而言為特別有用的。用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠齊IJ、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體劑和散劑。常規(guī)藥物載體、水性、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等可為必要的或所需的。包被的避孕套、手套等也可為有用的。可適宜地以單位劑型存在的本發(fā)明藥物制劑，可根據(jù)藥學(xué)工業(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。這類(lèi)技術(shù)包括使活性成分與藥物載體或賦形劑組合的步驟。一般而言，制劑如下制備通過(guò)使活性成分與液體載體或細(xì)碎的固體載體或兩者均勻和緊密地組合，隨后在需要時(shí)使產(chǎn)物成形?？蓪⒈景l(fā)明的組合物制成任何許多可能劑型，例如但不限于，片劑、膠囊劑、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。也可將本發(fā)明的組合物在水性、非水性或混合介質(zhì)中制成混懸劑。水性混懸劑可進(jìn)一步包含增加混懸劑粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述混懸劑也可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于，溶液劑、乳劑、泡沫劑和含脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可包含一種或多種滲透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成分。乳劑典型地為一種液體以通常直徑超過(guò)0. I y m的液滴形式分散在另一種液體中的非均質(zhì)體系。乳劑可包含除分散相之外的其他組分，以及可作為在水相、油相中的溶液或其本身作為單獨(dú)相存在的活性藥物。將微乳劑包括為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。乳劑及其使用為本領(lǐng)域眾所周知的且進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)中。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”意為由排列在一個(gè)或多個(gè)球形雙層中的兩親脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體為具有由親脂材料形成的膜和包含待遞送組合物的水性內(nèi)部的單層或多層囊泡。陽(yáng)離子脂質(zhì)體為帶正電的脂質(zhì)體，認(rèn)為其與帶負(fù)電的DNA分子相互作用以形成穩(wěn)定的復(fù)合體。認(rèn)為pH敏感的或帶負(fù)電的脂質(zhì)體誘捕DNA而不是與其復(fù)合。陽(yáng)離子和非陽(yáng)離子脂質(zhì)體均已用來(lái)遞送DNA到細(xì)胞。脂質(zhì)體也包括“空間上穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，該術(shù)語(yǔ)如本文所用是指包含一種或多種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當(dāng)摻入到脂質(zhì)體中時(shí)，這些特化脂質(zhì)給脂質(zhì)體帶來(lái)相對(duì)于缺乏這類(lèi)特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體增長(zhǎng)的循環(huán)生命期?？臻g上穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實(shí)例為以下脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體形成囊泡的脂質(zhì)部分的部分包含一種或多種糖脂或衍生有一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂質(zhì)體及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)中。本發(fā)明的藥物制劑和組合物也可包含表面活性劑。表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的使用為本領(lǐng)域眾所周知的。表面活性劑及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用各種滲透促進(jìn)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸特別是寡核苷酸的有效遞送。除了有助于非親脂性藥物穿過(guò)細(xì)胞膜的擴(kuò)散之外，滲透促進(jìn)劑還增加親脂性藥物的滲透性?？蓪B透促進(jìn)劑歸類(lèi)為屬于五大類(lèi)的一種，五大類(lèi)即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑。滲透促進(jìn)劑及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，根據(jù)其預(yù)期用途(即給藥途徑)來(lái)常規(guī)地設(shè)計(jì)制劑。用于局部給藥的制劑包括以下制劑，其中本發(fā)明寡核苷酸與局部遞送劑(例如，脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、留類(lèi)化合物、螯合劑和表面活性劑)混合。脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油?；?磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蘧?；字Ｄ憠ADMPC、二硬脂?；字Ｄ憠A)、陰性的(例如二肉豆蘧?；字８视虳MPG)和陽(yáng)離子的(例如二油?；募谆北鵇OTAP和二油酰基-磷脂?；掖及稤0TMA)。對(duì)于局部或其他給藥而言，可將本發(fā)明的寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或可與其(特別是與陽(yáng)離子脂質(zhì)體)形成復(fù)合體?；蛘?，可將寡核苷酸與脂質(zhì)(特別是陽(yáng)離子脂質(zhì))復(fù)合。脂肪酸和酯類(lèi)、其藥學(xué)上可接受的鹽以及它們的使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860 號(hào)中。用于口服給藥的組合物和制劑包括散劑或顆粒劑、微粒、納米粒子、在水或非水性介質(zhì)中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊、小藥囊、片劑或小片。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可為所需的?？诜苿橐韵轮苿?，其中將本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種滲透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑協(xié)同施用。表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。膽汁酸/鹽和脂肪酸及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。滲透促進(jìn)劑的組合亦是如此，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽的組合。具體地組合為月桂酸的鈉鹽、癸酸和UDCA。另外的滲透促進(jìn)劑包括聚氧化乙烯-9-月桂醚、聚氧化乙烯-20-鯨蠟醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以以包括噴霧干燥顆粒的顆粒形式口服地遞送，或絡(luò)合以形成微米或納米粒子。寡核苷酸絡(luò)合劑及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利第6，287，860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。用于胃腸外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可包括無(wú)菌水性溶液劑，其也可含有緩沖液、稀釋劑和其他適合的添加劑，例如但不限于，滲透促進(jìn)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種寡聚化合物和一種或多種其他通過(guò)非反義機(jī)制來(lái)起作用的化學(xué)治療劑。這類(lèi)化學(xué)治療劑的實(shí)例包括但不限于癌癥化學(xué)治療藥物，例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來(lái)霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、雙氯乙基-亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-巰鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧考福霉素、4-羥基過(guò)氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5_氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，這類(lèi)化學(xué)治療劑可單獨(dú)地(例如，5-FU和寡核苷酸)、序貫地(例如，5-FU和寡核苷酸持續(xù)一段時(shí) 間，接著MTX和寡核苷酸)、或與一種或多種其他的這類(lèi)化學(xué)治療劑組合(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放射療法和寡核苷酸)使用?？寡姿?包括但不限于非留體抗炎藥和皮質(zhì)類(lèi)固醇)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可組合到本發(fā)明的組合物中。反義化合物和其他非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。兩種或更多種組合的化合物可一起或序貫使用。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含靶定到第一核酸的一種或多種反義化合物(特別是寡核苷酸)，以及靶定到第二核酸靶標(biāo)的一種或多種其他反義化合物。例如，第一靶標(biāo)可為膠原基因的特定反義序列，第二靶標(biāo)可為來(lái)自另一個(gè)核苷酸序列的區(qū)域?；蛘?，本發(fā)明的組合物可包含靶定到相同膠原基因核酸靶標(biāo)的不同區(qū)域的兩種或更多種反義化合物。本文舉例說(shuō)明了許多反義化合物的實(shí)例而其他的可選自本領(lǐng)域已知的適合化合物。兩種或更多種組合化合物可一起或序貫使用。給藥認(rèn)為治療組合物的制劑和其隨后的施用(給藥)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)之內(nèi)。給藥取決于要治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和應(yīng)答性，而療程從數(shù)天持續(xù)到數(shù)月，或直到完成治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的減輕。最佳給藥方案可根據(jù)患者體內(nèi)藥物蓄積的測(cè)定來(lái)計(jì)算。普通技術(shù)人員可容易地確定最適劑量、給藥方法和重復(fù)率。最適劑量可根據(jù)單獨(dú)寡核苷酸的相對(duì)功效而不同，一般可基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中有效的EC50來(lái)評(píng)價(jià)。一般而言，劑量為0. 01 u g-100g/kg體重,且可每天、每周、每月或每年給藥一次或多次,或甚至每2-20年一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于測(cè)定體液或組織中藥物的停留時(shí)間和濃度來(lái)容易地評(píng)價(jià)給藥的重復(fù)率。成功治療之后，可能需要使患者進(jìn)行維持療法以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中所述寡核苷酸以維持劑量來(lái)施用，范圍為0. 01 Ii g-100g/kg體重,每天一次或多次到每20年一次。在實(shí)施方案中，使用下列劑量的藥物治療患者，所述劑量為至少約I、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、或至少約100mg/kg體重。反義寡核苷酸的某些注射劑量描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利第7，563，884號(hào),“Antisense modulation of PTPlB expression(PTP1B表達(dá)的反義調(diào)節(jié))”通過(guò)引用以其整體結(jié)合于本文中。雖然上文已描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但是應(yīng)理解的是，其僅以實(shí)例的方式提供，而并非限制。對(duì)公開(kāi)的實(shí)施方案的許多改變可依照本文的公開(kāi)內(nèi)容來(lái)進(jìn)行，而不會(huì)背離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應(yīng)受到任何上述的實(shí)施方案所限制。本文提及的所有文件都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本申請(qǐng)引用的所有出版物和專(zhuān)利文件都為所有目的而通過(guò)引用結(jié)合，引用程度如同單獨(dú)地指出各個(gè)出版物或?qū)＠募粯?。至于申?qǐng)人在本文件中對(duì)不同參考文獻(xiàn)的引用，申請(qǐng)人并不承認(rèn)任何具體參考文獻(xiàn)對(duì)其發(fā)明而言為“現(xiàn)有技術(shù)”。本發(fā)明的組合物和方法的實(shí)施方案舉例說(shuō)明于下列實(shí)施例中。
實(shí)施例下列非限制性的實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的經(jīng)挑選的實(shí)施方案。應(yīng)理解的是，所示組分的比例變化和要素備選對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言為顯而易見(jiàn)的且在本發(fā)明的實(shí) 施方案的范圍之內(nèi)。實(shí)施例I :對(duì)膠原基因的反義核酸分子和/或膠原基因多核苷酸有義鏈特異的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)如上指出的術(shù)語(yǔ)“對(duì)......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合體，或(ii)能夠與祀定基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。適當(dāng)寡核苷酸的挑選通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)促進(jìn)，該計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指出同一性或同源性區(qū)域。這類(lèi)程序用于比較例如通過(guò)搜索諸如GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)或通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。來(lái)自一系列物種的核酸序列的比較允許挑選顯示出物種之間適當(dāng)同一性程度的核酸序列。在未測(cè)序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡來(lái)確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。通過(guò)在各種嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，如本領(lǐng)域眾所周知的，可獲得同一性的近似測(cè)量。這些程序允許挑選這樣的寡核苷酸，其對(duì)在待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)高度的互補(bǔ)性而對(duì)在其他物種中的相應(yīng)核酸序列表現(xiàn)較低程度的互補(bǔ)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在挑選用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)幕騾^(qū)域上具有相當(dāng)大的自由。反義化合物為“可特異雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能，導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在需要特異性結(jié)合的條件下具有足夠程度的互補(bǔ)性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測(cè)定或治療處理情況中的生理?xiàng)l件下，以及在體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件下。本文所述的寡核苷酸的雜交特性可通過(guò)本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測(cè)定法來(lái)確定。例如，本文所述的寡核苷酸的特性可通過(guò)使用解鏈曲線測(cè)定法確定靶天然反義物和潛在藥物分子之間的結(jié)合強(qiáng)度來(lái)獲得。靶天然反義物和潛在藥物分子(Molecule)之間的結(jié)合強(qiáng)度，可使用任何已建立的測(cè)定分子間相互作用強(qiáng)度的方法例如解鏈曲線測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)。解鏈曲線測(cè)定法確定這樣的溫度，在該溫度下天然反義物/Molecule復(fù)合體發(fā)生從雙鏈構(gòu)象到單鏈構(gòu)象的迅速轉(zhuǎn)變。此溫度被廣泛認(rèn)可為兩個(gè)分子之間相互作用強(qiáng)度的可
靠衡量。
解鏈曲線測(cè)定法可使用實(shí)際的天然反義RNA分子的cDNA拷貝或?qū)?yīng)Molecule的結(jié)合位點(diǎn)的合成DNA或RNA核苷酸來(lái)進(jìn)行。包含進(jìn)行此測(cè)定的所有必需試劑的多種試劑盒為可得的(例如Applied Biosystems Inc. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包含含有雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料、SYBR GreeruSYTO等)之一的適宜的緩沖溶液。dsDNA染料的特性為，其在游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但當(dāng)與dsDNA結(jié)合時(shí)為高度熒光的。為進(jìn)行所述測(cè)定，將所述cDNA或相應(yīng)寡核苷酸以由具體制造商的方案限定的濃度與Molecule混合。將所述混合物加熱到95°C以解離所有預(yù)先形成的dsDNA復(fù)合體，然后緩慢冷卻到室溫或由試劑盒制造商確定的其他較低的溫度以使DNA分子退火。隨后將新形成的復(fù)合體緩慢加熱到95°C，同時(shí)連續(xù)地收集由反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量的數(shù)據(jù)。熒光強(qiáng)度反比于反應(yīng)中存在的dsDNA量。數(shù)據(jù)可使用與所述試劑盒相配的實(shí)時(shí)PCR儀器(例如ABI’sStepOne Plus Real Time PCR System或LightTyper儀器,Roche Dia gnostics,Lewes,UK)來(lái)收集。解鏈峰通過(guò)使用適當(dāng)軟件(例如LightTyper (Roche)或SDS DissociationCurve, ABI)對(duì)溫度(x_軸)繪制熒光關(guān)于溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(在y_軸上的_d (熒光)/dT)的圖形來(lái)構(gòu)建。分析數(shù)據(jù)以確定從dsDNA復(fù)合體迅速轉(zhuǎn)變到單鏈分子的溫度。此溫度稱(chēng)為T(mén)m且正比于兩個(gè)分子之間的相互作用強(qiáng)度。典型地，Tm將超過(guò)40°C。實(shí)施例2 :膠原基因多核苷酸的調(diào)節(jié)用反義寡核苷酸處理IfepG2細(xì)胞使來(lái)自ATCC的IfepG2細(xì)胞(目錄號(hào)HB-8065)在37 °C和5 % CO2下生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone 目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV)+10 %FBS (Mediatech 目錄號(hào) MT35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))。試驗(yàn)的前一天將所述細(xì)胞以密度I. 5XlOVml再接種到6孔板，并在37°C和5% CO2下培養(yǎng)。在試驗(yàn)當(dāng)天將6孔板中的培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 u M的濃度。將2 ill此溶液與400 u I Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào)31985-070)和4 u I Lipofectamine2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫下孵育 20min,然后施用到具有H印G2細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。含有2 Ul水代替所述寡核苷酸溶液的類(lèi)似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照。在37°C和5% CO2下培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。添加反義寡核苷酸48h后,將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說(shuō)明書(shū)使用Promega的SV TotalRNA Isolation System(目錄號(hào) Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(目錄號(hào)74181)從細(xì)胞中提取RNA。向如制造商的方案中所述使用Thermo Scientific的 Verso cDNA 試劑盒(目錄號(hào) AB1453B)或 High Capacity cDNA Reverse TranscriptionKit(目錄號(hào)4368813)進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，添加600ng RNA。將來(lái)自此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)使用 ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號(hào) 4369510)和由 ABI (AppliedBiosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00164004_ml、Hs00164310_ml, AppliedBiosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物/探針的實(shí)時(shí)PCR,來(lái)監(jiān)控基因表達(dá)。使用下面的 PCR 循環(huán)50°C,2min ；95°C, IOmin ;40 個(gè)循環(huán)的(95。。，15 秒;60°C，Imin)，使用Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)。用反義寡核苷酸處理后基因表達(dá)的倍數(shù)變化基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的不同來(lái)計(jì)算。結(jié)果實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中Collal mRNA的水平在用針對(duì)Collal反義物DW440457設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加(圖I)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中Col7al mRNA的水平在用針對(duì)Col7al設(shè)計(jì)為bel42537和bg998538的兩種寡核苷酸處理后48h顯著增加(圖4)。用反義寡核苷酸處理HUVEC細(xì)胞使來(lái)自ATCC 的 HUVEC 細(xì)胞(Promo Cell 目錄號(hào) C-12253)在 37°C 和 5 % CO2 下生長(zhǎng)于上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Epithelial Growth Media) (Promo Cell目錄號(hào)C-22010)。試驗(yàn)的前一天使用Promo Cell Detach Kit(目錄號(hào)C-41200)將所述細(xì)胞以密度I. 5X 105/ml 再接種到6孔板，并在37°C和5% CO2下培養(yǎng)。在試驗(yàn)當(dāng)天將6孔板中的培養(yǎng)基換成新鮮的上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 ii M的濃度。將2 ill此溶液與400 u IOpti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco 目錄號(hào) 31985-070)和 4 u ILipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào)11668019)在室溫下孵育20min，然后施用到具有HUVEC細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。含有2 U I水代替所述寡核苷酸溶液的類(lèi)似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照。在37°C和5% CO2下培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。添加反義寡核苷酸48h后，將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說(shuō)明書(shū)使用Promega的SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào)Z3105)或Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181)從細(xì)胞中提取RNA。向如制造商的方案中所述使用Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，添加600ng RNA。將來(lái)自此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)使用ABITaqman Gene Expression Mix (目錄號(hào) 4369510)和由 ABI (Applied Biosystems TaqmanGene Expression Assay :Hs01028970_ml和 Hs00164310_ml, Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物/探針的實(shí)時(shí)PCR，來(lái)監(jiān)控基因表達(dá)。使用下面的PCR循環(huán)50°C，2min ;95°C，IOmin ;40 個(gè)循環(huán)的(95°C，15 秒；60°C，Imin)，使用 St印One Plus RealTime PCR Machine (Applied Biosystems Inc.)或 Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)。用反義寡核苷酸處理后基因表達(dá)的倍數(shù)變化基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的不同來(lái)計(jì)算。結(jié)果實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，HUVEC細(xì)胞中Colla2 mRNA的水平在用針對(duì)Colla2反義物Hs. 571263設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加(圖2)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，HUVEC細(xì)胞中Col7al mRNA的水平在用針對(duì)Col7al設(shè)計(jì)為CV425857(CV425857. 1_1、CV425857. 1_2)的 siRNA 之一和針對(duì) BU615800. 1(BU615800. 1_1)的一種siRNA處理后48h顯著增加(圖3)。盡管已就一個(gè)或多個(gè)實(shí)現(xiàn)舉例說(shuō)明并描述本發(fā)明，但在閱讀和理解本說(shuō)明書(shū)和附圖后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到等價(jià)改變和修飾。此外，雖然本發(fā)明的具體特征可能已就幾個(gè)實(shí)現(xiàn)中的唯一一個(gè)公開(kāi)，但這類(lèi)特征可與其他實(shí)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)其他特征組合，因?yàn)閷?duì)于任何給定或具體應(yīng)用而言可為所需和有利的。本公開(kāi)內(nèi)容的摘要將允許讀者快速確定本技術(shù)公開(kāi)內(nèi)容的性質(zhì)。在理解以下的情況下將其提出其將不用于解釋或限制隨附權(quán)利要求的范圍或含義。
權(quán)利要求
1.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括 使所述細(xì)胞或組織與至少ー種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少ー種寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一'丨生,所述多核苷酸包含在 SEQ ID SEQ ID NO :4 的核苷酸 1_387、SEQ ID NO :5 的核苷酸 1_561、SEQ ID SEQID NO 6 的核苷酸 1-335、SEQ ID NO 7 的核苷酸 1-613、SEQ ID NO 8 的核苷酸 1-177 和SEQ ID NO 9的核苷酸1-285之內(nèi)的5_30個(gè)連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
2.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括 使所述細(xì)胞或組織與至少ー種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少ー種寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的天然反義物的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
3.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括 使所述細(xì)胞或組織與至少ー種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一'注；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
4.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括 使所述細(xì)胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少ー種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中膠原基因的功能和/或表達(dá)在體內(nèi)或體外相對(duì)于對(duì)照増加。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定包含膠原基因多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法,其中所述至少一種反義寡核苷酸包含ー種或多種選自以下的修飾至少ー種經(jīng)修飾的糖部分、至少ー種經(jīng)修飾的核苷間鍵、至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經(jīng)修飾糖部分2’ -O-甲氧基こ基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、ニ環(huán)糖部分及其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經(jīng)修飾核苷間鍵硫代磷酸酷、2’ -O-甲氧基こ基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酷、碳酸酯、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯及其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經(jīng)修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其類(lèi)似物、衍生物及組合。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述至少ー種寡核苷酸包含至少ー個(gè)如SEQID NO 10-29所述的寡核苷酸序列。
14.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中膠原基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括 使所述細(xì)胞或組織與至少ー種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的短干擾RNA (SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少ー種siRNA寡核苷酸對(duì)膠原基因多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少ー種siRNA寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中膠原基因的功能和/或表達(dá)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約五個(gè)連續(xù)核酸的序列具有至少80%序列同一性，所述序列與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補(bǔ)。
16.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中膠原基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括 使所述細(xì)胞或組織與至少ー種長(zhǎng)度為約5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對(duì)膠原基因多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異，其中所述至少一種反義寡核苷酸與至少ー個(gè)如SEQ ID NO :1-9所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中膠原基因的功能和/或表達(dá)。
17.ー種合成的、經(jīng)修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少ー種修飾，其中所述至少ー種修飾選自至少ー種經(jīng)修飾的糖部分；至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸間鍵；至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸為與正常對(duì)照相比在體內(nèi)或體外與膠原基因雜交并調(diào)節(jié)所述基因的功能和/或表達(dá)的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酷、碳酸酷、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯及其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類(lèi)似物、衍生物及組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸硫代磷酸酷、烷基膦酸酷、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酷、碳酸酯、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯及其組合。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類(lèi)似物、衍生物及組合。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー種選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -O-甲氧基こ基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、ニ環(huán)糖部分及其組合。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包含多種修飾,其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -O-甲氧基こ基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、ニ環(huán)糖部分及其組合。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度為至少約5-30個(gè)核苷酸且與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約20%序列同一'注。
27.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約80%序列同一性。
28.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與正常對(duì)照相比在體內(nèi)或體外與至少一種膠原基因多核苷酸雜交并調(diào)節(jié)所述多核苷酸的表達(dá)和/或功能。
29.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQIDNO 10-29所述的序列。
30.一種組合物，所述組合物包含對(duì)ー種或多種膠原基因多核苷酸特異的ー種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID NO : 10-29所述核苷酸序列中的任ー個(gè)相比,具有至少約40 %序列同一性。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO : 10-29所述的核苷酸序列。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中如SEQID NO :10-29所述的寡核苷酸包含ー種或多種修飾或取代。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述ー種或多種修飾選自硫代磷酸酷、甲基膦酸酷、肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括 給患者施用治療有效劑量的至少ー種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種膠原基因多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，并調(diào)節(jié)所述至少一種膠原基因多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病。
36.權(quán)利要求35的方法,其中與至少ー種膠原基因多核苷酸有關(guān)的疾病選自膠原障礙、年齡相關(guān)的膠原降解、成骨不全、耳硬化(OTSC)、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、食管鱗狀上皮細(xì)胞癌、軟骨發(fā)育不全、非典型馬方綜合征、埃-當(dāng)綜合征(EDS)、營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥(DEB)、卡菲病、動(dòng)脈瘤(例如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤)、特發(fā)性肺纖維化、肝硬化、腎纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、硬皮病、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、癌癥、炎癥、遺傳性疾病(例如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良)、神經(jīng)疾病或病癥(例如帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、戈謝病)、代謝病(例如I型糖尿病)、自身免疫性疾病或病癥、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷等)、缺血，以及其它血管、心臟、皮膚疾病或病癥，皮膚老化、需要皮膚工程的皮膚疾病或病癥或病況、需要移植的肝臟或腎臟疾??；腱、骨或組織再生；骨骼修復(fù)、軟骨和骨修復(fù)。
37.ー種鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的至少ー種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)有關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個(gè)連續(xù)核苷酸的至少ー種寡核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與所選的靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸互補(bǔ)；在嚴(yán)格雜交條件下，測(cè)定反義寡核苷酸與靶多核苷酸或所選靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；以及基于獲得的信息選擇用于體內(nèi)施用的至少ー種寡核苷酸。
38.一種預(yù)防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的皮膚病況的方法，所述方法包括 給具有皮膚病況或處于形成皮膚病況的風(fēng)險(xiǎn)中的患者施用治療有效劑量的至少ー種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種膠原基因多核苷酸的天然反義序列結(jié)合并調(diào)節(jié)所述至少一種膠原基因多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病性皮膚病況。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述皮膚病況由炎癥、光損傷或老化引發(fā)。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述皮膚病況為形成皺紋、接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、光化性角化病、角質(zhì)化病癥、大皰性表皮松解癥、剝脫性皮炎、脂溢性皮炎、紅斑、盤(pán)狀紅斑狼瘡、皮肌炎、皮膚癌或自然老化的作用。
41.ー種基于膠原基因的基質(zhì)組合物，所述組合物包含由膠原原纖維組成的三維純化膠原基質(zhì)，其中通過(guò)使膠原原纖維細(xì)胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少ー種反義寡核苷酸接觸，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)膠原原纖維細(xì)胞中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID NO :10-29所述核苷酸序列中的任ー個(gè)相比,具有至少約40 %序列同一性。
43.權(quán)利要求41的組合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO : 10-29所述的核苷酸序列。
44.權(quán)利要求41的組合物，其中所述組合物支持干細(xì)胞。
45.ー種體外、離體或體內(nèi)傷ロ愈合或組織再生或組織工程的方法，所述方法包括給傷ロ施用如權(quán)利要求41所定義的胞外基質(zhì)組合物。
46.一種制備基于膠原基因的基質(zhì)組合物的方法，所述方法包括使膠原原纖維細(xì)胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少ー種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，具體而言，其通過(guò)靶定膠原基因的天然反義多核苷酸，來(lái)調(diào)節(jié)膠原基因的表達(dá)和/或功能。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與膠原基因表達(dá)有關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102695797SQ201080037030
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者J·科拉德, O·霍爾科瓦謝爾曼 申請(qǐng)人:歐科庫(kù)爾納有限責(zé)任公司