專利名稱：免疫球蛋白fc多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及蛋白質工程領域。更加具體而言，其涉及用于篩選在細菌中表達的組合抗體Fc文庫的改良方法和組合物。
背景技術：
當前的重組治療抗體銷售超過100億美元/年并且預計每年增長20. 9 %，到2010 年計劃增長至250億美元/年。單克隆抗體(mAbs)包括當前臨床上的大多數(shù)重組蛋白，其中位于世界各地的公司資助超過150個正在研究的產(chǎn)品O^avlou和BelSey，2005)。至于治療焦點，mAb市場主要集中于腫瘤學和關節(jié)炎、免疫和炎癥性病癥并且這些治療領域內的產(chǎn)品將持續(xù)成為在整個預測階段內的關鍵生長驅動力?？偟膩碚f，遺傳工程化mAbs —般比小分子藥物具有更高的FDA批準成功可能性。至少50個生物工程公司和所有的主要制藥公司實施活性抗體開發(fā)項目。用于mABs分離和生產(chǎn)的最初方法由Milstein和Kohler于1975年首次報導 (Kohler and Milstein, 1975)，并且它包括小鼠淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合，得到小鼠雜交瘤。治療性的鼠mAbs在二十世紀八十年代早期進入臨床研究；然而，但是缺乏有效性和因為患者產(chǎn)生人抗小鼠抗體(HAMA)而快速清除的問題變得明顯。這些問題以及與技術相關的時間和成本消耗變成了發(fā)展mAb生產(chǎn)技術的驅動力。聚合酶鏈式反應(PCR)促進了直接從免疫動物淋巴細胞克隆單克隆抗體基因和片段抗體組合文庫在細菌中的表達 (Orlandi等，1989)。后來的文庫完全通過體外克隆技術使用具有重排互補決定區(qū)3 (⑶R3) 的天然基因產(chǎn)生(Griffiths和Duncan，1998 ；Hoogenboom等，1998)。結果，具有目的特異性的抗體片段的分離不再依賴于相應抗原的免疫原性。此外，合成的組合文庫中的抗原特異性范圍比從免疫小鼠產(chǎn)生的一組雜交瘤的抗原特異性范圍大。這些優(yōu)點促進了開發(fā)針對許多種獨特抗原，包括小分子化合物(半抗原)(Hoogenboom和Winter，199 、分子復合體 (Chames等，2000)、不穩(wěn)定的化合物(Kjaer等，1998)和細胞表面蛋白質(Desai等，1998) 的抗體片段。在微生物細胞中，通過流式細胞術開展展示篩選。具體而言，錨定周質表達 (Anchored周質ic Expression, APEx)基于將抗體片段錨定在大腸桿菌內膜的周質面，然后破壞外膜，與熒光標記的靶孵育并分選原生質球(美國專利7，094，571)。APEx用于抗體片段的親和性成熟(Harvey等，2004 ;HarVey等，2006)。在一個研究中，在僅兩輪的篩選后得到了超過200倍的親和性改善?？贵w治療潛能背后的一個重要機制是抗體募集免疫細胞至靶抗原(或細胞)的能力。因此，抗體的Fc區(qū)對于募集免疫細胞和抗體依賴的細胞毒性(ADCC)是至關重要的。具體而言，由抗體引起的ADCC反應的性質依賴于Fc區(qū)與位于許多細胞類型表面上的受體 (FcR)之間的相互作用。人包括5種不同種類的Fc受體。在另外的單元型中，屬于特定種類的不同F(xiàn)cR的遺傳變體是已知的?？贵w與FcR的結合決定著募集其它免疫細胞和所募集細胞類型的能力。因此，工程改造可募集僅某些種類細胞的抗體的能力對于治療是極其重要的。然而，據(jù)發(fā)明人所知，先前已經(jīng)使用哺乳動物表達的IgG分子開展了改造Fc結構域的嘗試。哺乳動物抗體是糖基化的。碳水化合物鏈連接至Fc區(qū)并且改變蛋白質的構象并且使得抗體能夠結合至FcR。與此相比，由細菌產(chǎn)生的非糖基化的抗體不能夠結合至FcR 并且因此不能夠引起ADCC。希望的是，改造能夠引起ADCC的非糖基化抗體并且，因此從源于細菌表達的低生產(chǎn)成本受益。第二并且最重要的是，具有工程改造Fc區(qū)的哺乳動物抗體表現(xiàn)出對特定的目的 FcR的結合增加，而且它們仍能夠以正常親和性結合其它FcR。因此，雖然此類抗體對于由免疫系統(tǒng)天然產(chǎn)生的分子具有更大的選擇性，但是它們仍然可以介導不希望的免疫反應。雖然如此，目前可以利用的所有高通量抗體抗體篩選技術均依賴于抗體片段的微生物表達。已經(jīng)描述了在文庫構建和篩選中使用抗體片段而不是完整或者全長IgG相對于在微生物中表達長得多的IgG具有局限性。之前從來沒有使用微生物如細菌或酵母表達或者篩選IgG文庫。結果，對結合蛋白質的抗原的分離唯一使用更小的且容易產(chǎn)生的抗體片段開展。一旦分離后，然后此類抗體片段必須融合至表達全長免疫球蛋白的載體，反過來載體優(yōu)先在哺乳動物細胞諸如CHO細胞中表達。大腸桿菌的的細胞質少，這不適合具有二硫鍵的蛋白質的折疊，具有二硫鍵的蛋白質以未折疊的或者不正確折疊的狀態(tài)積累(Baneyx和Mujacic，2004)。與細胞質相比， 大腸桿菌的周質維持在氧化狀態(tài)，這使得可以形成蛋白質二硫鍵。值得注意的是，已經(jīng)成功地采用周質表達用于表達抗體片段，諸如Fv、ScFV、Fab或者F(ab' ) 2 (Kipriyanov和 Little，1999)。這些片段可以相對快速地大量產(chǎn)生，并且保留了抗原結合活性。然而，由于抗體片段缺乏Fc結構域，它們不能夠結合Fcfoi受體并被快速清除；因此，它們僅偶爾適宜用作治療蛋白質(Knight等，19%)。直到最近，全長抗體僅可以在大腸桿菌中表達成為不溶解的聚集物，然后體外重折疊(Boss等，1984 ;Cabilly等，1984)。顯然，這種方法不適合抗體文庫的高通量篩選，因為使用當前的技術不能夠將數(shù)百萬或者數(shù)千萬的抗體逐一重折疊。進一步的問題是，由于大腸桿菌表達的抗體沒有被糖基化，所以它們不能夠結合補體因子Iq(Clq)或者Fc和許多其它Fc受體。然而，非糖基化的Fc結構域可以有效地結合新生兒Fc受體(Fcfoi)。因此，細菌表達的非糖基化抗體的確表現(xiàn)出與人細胞中產(chǎn)生的完全糖基化的IgG相似的血清持久性和藥代動力學。雖然如此，由于非糖基化的抗體不能夠引起補體活化并且不能夠介導免疫細胞諸如巨噬細胞的募集，因此它們先前不能有效地用于許多治療應用。此外，一些研究已經(jīng)報導，F(xiàn)c結構域與一些Fc受體的結合可以具有激活效應，而其它一些則具有抑制效應(Boruchov等.2005 ;Kalergis等，2002)。不同的Fc γ R效應器功能包括抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、細胞因子釋放、吞噬作用和成熟作用。經(jīng)工程改造具有選擇性效應器功能的Fc結構域可以提供生理益處。

發(fā)明內容
本公開提供涉及結合Fc受體的非糖基化抗體Fc結構域的化合物和方法。在一些實施方案中，涉及包含具有來自抗體的非糖基化Fc結構域(“抗體Fc結構域”)的多肽的組合物。在另外的實施方案中，非糖基化Fc結構域是野生型Fc結構域的變體，以致于變異使得Fc結構域可以特異性結合至一種或者更多種Fc受體。在一些實施方案中，具有非糖基化Fc結構域變體的多肽能夠僅結合具有糖基化形式野生型Fc結構域 (“糖基化野生型Fc結構域”)可以結合的Fc受體的亞組。在特定的實施方案中，具有非糖基化Fc結構域變體的多肽可特異性地結合Fc y RI ；在一些情況中，其親和性或者結合能力在具有糖基化野生型Fc結構域多肽的2倍之內。在其它的實施方案中，另外地或者備選地，具有非糖基化Fc結構域變體的多肽與具有糖基化野生型Fc結構域的多肽相比具有顯著降低的親和性或者結合能力(50倍或者更大的降低)。在某些實施方案中，具有非糖基化 Fc結構域變體的多肽具有顯著降低的結合Fc γ Rnb的親和性或者能力。可預期與具有糖基化野生型Fc結構域的多肽相比，多肽具有相當?shù)腛倍之內)對FcyRI的親和性或者結合能力，以及顯著降低的對Fc y RIIB的親和性或者結合能力。如本文所使用，術語“親和性”指兩種試劑可逆性結合的平衡常數(shù)并且表示為 Kd0結合結構域與其靶的親和性可以，例如，從大約100納摩爾(riM)至大約0. InM，從大約 IOOnM至大約1皮摩爾(pM)，或者從大約IOOnM至大約1飛摩爾(fM)；備選地，親和性可以在IOOnM和InM之間或者在0. InM和IOnM之間。此外，考慮了當兩種試劑之間的親和性在上面討論的親和性范圍之內時試劑特異性結合?？贵wFc結構域可以是IgA、IgM、IgE、IgD或者IgG抗體或其變體的Fc結構域。在某些實施方案中，結構域是IgG抗體Fc結構域，諸如IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗體Fc結構域。此外，抗體Fc結構域可以限定為人Fc結構域，在這種情況下，F(xiàn)c結構域特異性結合一種或者更多種人Fc受體。在某些方面中，F(xiàn)c結構域可以是IgGl Fc結構域，諸如抗HER2抗體的Fc結構域，更加具體而言是曲妥珠單抗的Fc結構域。在一些實施方案中考慮了整個多肽是非糖基化的，或者在其它實施方案中考慮了僅多肽的一部分是非糖基化的，如Fc結構域。還考慮了，多肽除了包含F(xiàn)c結構域之外，還可包含一個或者更多個來自抗體的區(qū)域。多肽可包含來自抗體的抗原結合結構域。此外，多個多肽可以形成抗體或者抗體樣蛋白質。在一些實施方案中，涉及包含能夠結合人FcR多肽的非糖基化抗體Fc結構域的多肽，其中Fc結構域包含特定的氨基酸替換。在一些實施方案中，涉及多個氨基酸替換。在另外的實施方案中，涉及相對于野生型Fc結構域有直至8個氨基酸替換。在人Fc結構域中的替換中，實施方案包括具有這樣的人Fc結構域的多肽，所述人Fc結構域在氨基酸382 和4 位具有氨基酸替換并且在下列任意氨基酸中具有至少一個額外替換2對、241、251、 266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、338、340、341、348、369、 378、382、392、424、426、428和/或434。在一些情況中，特別考慮了，that the人Fc結構域的氨基酸3 是野生型序列，即脯氨酸。在一些實施方案中，多肽在氨基酸382具有人Fc 結構域替換，即纈氨酸(V)替換谷氨酸(E) (E382V)。在本文中采用對于氨基酸的常規(guī)單字母縮寫。在另外的實施方案中，多肽具有在氨基酸4 位的人Fc結構域替換，其為異亮氨酸(M^SI)。在一些情況中，多肽在人Fc結構域的氨基酸382和氨基酸4 位均具有替換，在氨基酸382位為纈氨酸(E382V)，在氨基酸4 位為異亮氨酸(M^SI)。在一些實施方案中，多肽在人Fc結構域的氨基酸3 位具有替換，其為色氨酸(L3^W)。在另外的實施方案中，多肽在人Fc結構域的氨基酸332位具有替換，其為酪氨酸(I332Y)。其它多肽包括至少在人Fc結構域的氨基酸3 和332位具有替換的那些多肽。氨基酸3 位的替換可以是色氨酸(L3^W)并且氨基酸332位的替換可以是酪氨酸(I332Y)。在另外的實施方案中，多肽在人Fc結構域的氨基酸341位具有替換，在更多實施方案中其為纈氨酸(G341V)。 更多實施方案涉及在人Fc結構域382和4 位具有替換并且在結構域上的下列位置具有至少一個額外替換的多肽H224R/Y、F241L、K251F、V266M, E269K, N276D、V279M、N286D, Q295R、N297D、Y300C、N315D、N325S、L328W、A330V/E/I、P331A/S/E、I332Y、K338I/R、K340N/ Q、G341V、V348M、V369A、A378D、K392E、S424L, S426I 或 N4;34S/D。在一些實施方案中考慮了多個額外替換。在一些實施方案中，多肽具有在氨基酸382和4 位具有替換并且還在CH2上部區(qū)域具有至少一個額外替換的非糖基化人Fc結構域。一些實施方案涉及在CH2上部區(qū)域的下列部分中的氨基酸上具有至少一個額外的人Fc結構域替換的多肽234L-239S ； 264V-268H ；297N-299T ；或者 328L-332I。在更多的實施方案中，多肽不具有額外的人結構域替換G341V和/或K338R。 然而，在其它情況中，F(xiàn)c結構域可以具有G341V替換和選自下列組的至少一個其它替換 H224Y、F241L、E269K、N276D、N286D、Y300C、N325S、K338R、V348M、V369A、K392E、S424L 禾口 N434D/S。在一些實施方案中，F(xiàn)c結構域具有選自該組的多個其它替換。多肽可具有包括 K338R替換的Fc結構域替換。在一些實施方案中涉及具有這樣的人Fc結構域的多肽，所述人Fc結構域具有選自下列的一組替換:a) K338R 和 G341V ；b)N297D、N315D 和 K340N ；c)K340N ；d) K338I 禾口 K340N ；e) K340Q 和 A378D ；f) N325S 和 K340N ；g) H224Y、E269K、N325S 和 G341V ；h) G341V 禾口 K392E ； i)K338R、G341V、S424L 和 N434D ； j)F241L 和 G341V ；k) G341V ； 1)N276D 和 G341V ；m) G341V 和 V369A ；n) N286D、G341V 和 N434S ；ο) N325S 和 G341V ；p) Y300C 和 G341V ； q) G341V 禾口 V348M ；r)E382V 和；s)V266M ；t) A330V、P331A 和 Q295R ；u) A330E、P331E 和 V279M ；ν) Α330Ε 和 Ρ331Ε ；w)A330E、P331V 和 S426T ；x)A330E 和 P331V ；y)A330I 和 P331E ；z)A330E ； aa)P331S ；和bb)A330V、P331S、H2MR和L251F。在一些實施方案中考慮了可包括非人Fc 結構域的額外的多肽，在這種情況中，可以在相應氨基酸位進行所述替換。實施方案涉及具有能夠特異性結合一種或更多種人FcR多肽的非糖基化Fc結構域的多肽。在一些實施方案中，非糖基化Fc結構域已經(jīng)進行如此的突變，以致于其可以結合 Fc γ RIa、Fc y Rlla、Fc y Rllb、Fc γ RIIc、Fc γ Rllla、Fc γ RIIIb 或 Fc α RI 中的一種或更多種。考慮了與這些特定人FcR多肽中的一種或者更多種的結合為對于糖基化Fc區(qū)所觀察到結合的 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或者 100% (或者可從它們推導出的任何范圍)之內，或者相對于野生型糖基化Fc結構域，結合改變(增加或者降低)至少或至多50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 % (或者可從它們推導出的任何范圍)。 備選地，在具有突變的的非糖基化Fc結構域的多肽與具有糖基化的和野生型Fc結構域的多肽之間的相對結合能力可以表示為X-倍數(shù)的差異(增加或者降低)。例如，可以是至少或至多至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或者10倍的差異，或者可從它們推導出的任何范圍。在一些實施方案中，具有突變的非糖基化Fc結構域的多肽能夠特異性結合 Fc y RI多肽。在一些情況中，其以具有糖基化和野生型Fc結構域的多肽結合水平的2倍之內的水平結合。在其它的實施方案中，結合水平在糖基化和野生型Fc結構域的至少2倍、 3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或者10倍之內。例如，在本文所述的實施方案中，對于 Fc受體與或者具有非糖基化Fc結構域變體的多肽或者具有糖基化和野生型Fc結構域的多肽的Kd數(shù)值在至少2倍或者3倍之內。在一些實施方案中，與具有非糖基化野生型抗體 Fc結構域的多肽相比，多肽在pH依賴的Fcfoi結合方面具有至少2倍的降低。在一些實施方案中，本文所述的多肽可包括連接體。在更多的實施方案中，連接體是可綴合的連接體。在一些實施方案中，多肽包含來自抗體的Fc結構域。其可包含來自抗體的其他區(qū)域，如另一結合結構域。在某些實施方案中，另外的結合結構域不是FcR結合結構域。在一些實施方案中，其還包含來自抗體的抗原結合位點或者結構域。這將包括來自抗體的所有或者部分可變區(qū)。在其它的實施方案中，多肽包含來自抗體的Fc結構域但是不包含為非FcR結合結構域的另一結合結構域。在一些實施方案中，非Fc結合區(qū)不是抗體的抗原結合位點，但特異性結合細胞表面蛋白。在一些情況中，非Fc結合區(qū)識別的細胞表面蛋白是受體。在一些實施方案中，細胞表面受體是酪氨酸激酶。在另外的實施方案中，多肽具有能夠結合多種酪氨酸激酶受體的非Fc結合區(qū)。在一些實施方案中，此種非Fc結合區(qū)能夠結合VEGF受體、PDGF受體、EGFR受體、ErbB-2受體、EGF受體、HGF受體和其它Src樣酪氨酸激酶受體或其組合中的一種或多種。還特別考慮了，多肽具有識別這些受體酪氨酸激酶中一種或者更多種的抗原結合區(qū)。其他多肽包括具有能夠結合FcR γ I多肽的非糖基化Fc結構域和第二結合結構域的那些多肽，其中第二結合結構域能夠特異性結合細胞表面分子。在一些實施方案中，第二結合結構域是抗體的抗原結合結構域(“抗體抗原結合結構域”)。在一些情況中，第二結合結構域不是抗體抗原結合結構域。在一些實施方案中，第二結合結構域能夠特異性結合其為蛋白質類分子的細胞表面分子。第二結合結構域可以是細胞表面受體的配體或者可以是細胞表面配體的受體。實施方案還考慮了編碼本文所述任意多肽的核酸。核酸可以是分離的和/或重組的。其可以是分離的和/或重組的核酸片段。在一些實施方案中，核酸是DNA，而在其他實施方案中核酸是RNA。在某些實施方案中，核酸是DNA片段。在其它的實施方案中，核酸是能夠表達這樣的任意多肽的表達載體，所述的任意多肽具有特異性結合人FcR多肽的帶有一個或更多個替換的Fc結合結構域。核酸可編碼一種或更多種上述多肽，所述多肽取決于多肽如何產(chǎn)生而可以是糖基化的或者不是糖基化的。在一些實施方案中，涉及編碼具有能夠特異性結合人FcR多肽的Fc結構域的多肽的核酸。核酸可置于可表達多肽，特別是非糖基化形式多肽的宿主細胞中。宿主細胞可以是原核細胞，諸如細菌細胞。備選地，宿主細胞可以是真核細胞，諸如哺乳動物細胞。在一些實施方案中，宿主細把包含第一表達載體，雖然它還可以包含第二表達載體。由于一些抗體由多個多肽組成，所以考慮了表達這些多肽的宿主細胞。例如，在一些實施方案中，考慮了包括第二表達載體的宿主細胞，所述第二表達載體編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽。在一些實施方案中，涉及宿主細胞群體，其中群體包含表達不同F(xiàn)c結構域的多肽的多種宿主細胞?？紤]了任何兩個不同F(xiàn)c結構域的氨基酸序列之間的同一性差異小于 20%、15%、10%、5%或更小。在一些實施方案中，涉及產(chǎn)生本文所述多肽(具有非糖基化Fc區(qū)的多肽)的方法以及使用它們的方法。就本文所述的任何多肽而言可使用任何這些方法。在一些實施方案中，涉及用于制備非糖基化多肽的方法，包括a)得到能夠表達非糖基化抗體的宿主細胞，所述非糖基化抗體包含能夠結合FcR多肽的Fc結構域，其中Fc 結構域包含氨基酸382和4 位的氨基酸替換并且在下列任意氨基酸中具有至少一個額外替換224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、338、 340、341、348、369、378、382、392、424、426、428 和 / 或 434 ；b)在促進非糖基化抗體表達的情況下培養(yǎng)宿主細胞；和，c)從宿主細胞純化表達的抗體。在一些實施方案中，宿主細胞是原核細胞，諸如細菌細胞。在其它的實施方案中，宿主細胞是真核細胞并且多肽包含N297D 替換。在更多的實施方案中，方法包括從上清液收集表達的抗體，這可以在純化之前進行。在一些實施方案中，方法包括從上清液純化抗體。這可包括將上清液經(jīng)過濾、 HPLC、陰離子或陽離子交換、高效液相色譜(HPLC)、親和層析或其組合純化抗體。在一些實施方案中，方法包括使用能結合IgG Fc區(qū)的葡萄球菌蛋白A的親和層析。其他純化方法是本領域普通技術人員眾所周知的。其他實施方案涉及用于誘導受試者內免疫反應的方法?？梢栽诖朔N方法中使用具有能夠結合FcR多肽的非糖基化Fc結構域的多肽。在某些實施方案中，向受試者開處或者施用非糖基化的并且具有能結合Fc y RI多肽的Fc結構域的抗體。備選地，方法可包括用此種抗體治療受試者?？梢允褂帽疚乃龅娜魏味嚯摹Ｄ承嵤┓桨干婕熬哂蟹翘腔?Fc結構域的多肽，所述非糖基化人Fc結構域包含在氨基酸382和4 位的氨基酸替換并且在下列任意氨基酸中具有至少一個額外替換2對、241、251、266、269、276、279、286、295、 297、300、315、325、328、330、331、332、338、340、341、348、369、378、382、392、424、426、428 和 / 或 434。在一些實施方案中，非糖基化多肽或者抗體能夠特異性結合活化FcR多肽，活化 FcR多肽指活化一種或者更多種免疫細胞的FcR多肽?；罨嚯陌‵c γ RI、IIa, IIIa, nb和IIIc。Fc γ Rnb是抑制性FcR多肽。在更多的實施方案中，非糖基化多肽或者抗體不再以與糖基化的、野生型Fc結構域可比的水平結合抑制性FcR多肽。在特定的實施方案中，非糖基化多肽或者抗體特異性結合Fc γ RI多肽。在更多的實施方案中，非糖基化多肽或者抗體具有降低的結合Fc YRnb多肽的能力，其中其親和性比糖基化的、野生型形式的多肽或抗體小至少50倍。在某些實施方案中，非糖基化抗體是非糖基化形式的治療抗體， 所述治療抗體指用于治療或者處置疾病或病癥的抗體。本文所述的任何抗體或者多肽，包括上面所述的那些，可以用于實施用于誘導免疫反應的方法。治療抗體的實例是曲妥珠單抗。在一些實施方案中，涉及誘導針對表達所靶向細胞表面多肽的靶細胞的樹突細胞 (DC)介導的細胞殺傷的方法，包括a)使靶細胞與包含i)能夠至少特異性結合樹突細胞活化FcR的突變的和非糖基化!^c結構域和ii)結合所靶向細胞表面多肽的第二結合結構域的多肽接觸；和b)在促進殺死靶細胞的情況下將靶細胞與樹突細胞接觸。在一些實施方案中，活化FcR是Fc γ RI多肽。在另外的實施方案中，具有非糖基化Fc結構域的多肽以與具有糖基化野生型Fc結構域的多肽相比降低的水平特異性結合Fc y RIIB多肽。在一些實施方案中，多肽具有這樣的Fc結構域，所述Fc結構域包含在下列氨基酸位的至少一個氨基酸替換224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、340、 348,369,378,382,392,424,426,428和/或434。另外的多肽在上面以及本申請通篇討論。 在一些實施方案中，靶細胞是癌細胞。因此，考慮了在抗體治療中使用非糖基化的和突變的 Fc結構域代替糖基化的和野生型Fc結構域治療癌癥的方法。涉及使用糖基化和野生型Fc 結構域的抗體對其他疾病或者病癥的治療，可以類似地使用本文所述的非糖基化的和Fc 變體多肽實施。其它實施方案涉及用于篩選具有結合一種或者更多種特異性FcR多肽的Fc結構域的非糖基化多肽的方法，包括a)得到一群革蘭氏陰性細菌細胞，該群細胞在它們的周質中表達包含F(xiàn)c結構域的非糖基化多肽，其中群體表達多種不同的Fc結構域；b)使細菌細胞與第一 FcR多肽在使得FcR多肽與非糖基化Fc結構域之間接觸的條件下接觸，其中 FcR 多月太是 Fc y RIa, Fc y RIIa, Fc y Rllb、Fc y RIIc、Fc γ Rllla、Fc γ RIIIb 或者 Fc α RI ； 和，c)基于非糖基化Fc結構域與第一 FcR多肽的結合選擇至少一種細菌細胞。方法還包括從選擇的細菌細胞鑒定或分離非糖基化多肽。同樣，方法可包括確定所選擇細菌細胞中的非糖基化多肽是否能結合其它FcR多肽。在一些實施方案中，確定所選擇細菌細胞中的非糖基化多肽是否能結合其他FcR多肽包括以第二FcR多肽重復步驟a)-c)，以確定非糖基化多肽是否還結合第二 FcR多肽。考慮了步驟a)_c)可以兩種以上不同F(xiàn)cR多肽重復。在一些實施方案中，非糖基化多肽結合多種FcR多肽。在一些實施方案中，方法包括其為大腸桿菌細胞的細菌細胞。在另外的實施方案中，F(xiàn)c結構域是IgG、IgA或IgE Fc結構域。在更多的實施方案中，革蘭氏陰性細菌細胞群體包含編碼多種非糖基化Fc結構域的多種核酸。在一些情況中，多種核酸還編碼與多種非糖基化Fc結構域融合的膜分泌信號。膜分泌信號可以是PelB或者DsbA。另外，非糖基化 Fc結構域可以包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。在某些實施方案中，非糖基化多肽包含真核 FcR結構域。在一些實施方案中，涉及具有特異性結合表1中一種多肽的Fc結構域的多肽。 在某些實施方案中，F(xiàn)c 結構域結合人 Fc y RIa,Fc y RIIa,Fc y RIIb.Fc y RIIc,Fc γ Rllla、 Fc γ RIIIb、Fc α RI或者Clq。在其它的實施方案中，相對于糖基化的和野生型形式的Fc結構域，其具有降低的對Fc YRnb的結合親和性。特定的方法公開于WO 2008/137475中，其通過參考并入本文。其它實施方案涉及用于優(yōu)化Fc結合一種或更多種具有Fc結構域的非糖基化多肽的特異性FcR多肽的方法，包括a)得到一群革蘭氏陰性細菌細胞，該群細胞在它們的周質中表達包含F(xiàn)c結構域的非糖基化多肽，其中群體表達表達不同突變的Fc結構域的不同多肽；b)使細菌細胞與第一 FcR多肽在使得FcR多肽與非糖基化Fc結構域之間接觸的條件下接觸,其中 FcR 多肽是 Fc y RIa, Fc y RIIa, Fc y Rllb、Fc y RIIc、Fc γ Rllla、Fc γ RIIIb 或者Fc α RI ；和c)基于非糖基化Fc結構域與第一 FcR多肽的結合選擇至少一種細菌細胞。 上面討論的任何實施方案可以用于實施這些方法。就本文所述的任何其它方法或者組合物而言，可以用于本發(fā)明方法和/或組合物背景下討論的任何其它實施方案。因此，關于一種方法或者組合物的實施方案也可以應用于本發(fā)明的其它方法和組合物中。
如本文所使用，關于核酸的術語“編碼”或者“編碼的”用于使本領域技術人員容易理解，然而這些術語可以分別與“包含”或者“包含的”互換使用。如本說明書中所使用，“a”或者“an”意思是指一或者一以上。如權利要求書中所使用，當與詞語“包含的”結合使用時，詞語“a”或“an”意思是指一或一以上。在權利要求書中術語“或者”的使用用于指“和/或”，除非明確表明是指僅備選方案，或者備選方案是相互排斥的，雖然本公開支持“或者”指僅備選方案和“和/或”的定義。 如本文所使用，“另一”意思是指至少第二或者更多。在本申請通篇中，術語“大約”用于數(shù)值包括用于確定數(shù)值的儀器、方法的內在誤差變化，或者研究受試者當中存在的變化。根據(jù)下面的詳細描述本發(fā)明的其它目標、特征和優(yōu)勢將變得顯而易見。然而，應當理解，詳細的描述和特定的實施例雖然表明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是僅以例證方式給出，因為根據(jù)該詳細描述對于本領域技術人員而言處于本發(fā)明精神和范圍內的多種改變和修改將是顯而易見的。


下列附圖構成了本說明書的一部分并且之所以包括下列附圖是為了進一步證明本發(fā)明的某些方面。參照這些附圖中的一個或者更多個并結合本文給出的特定實施方案的詳細描述可以更好地理解本發(fā)明。圖1以糖基化IgGlFc的3D結構表示的分離的非糖基化Fc5的突變點(382E和 428M) (PBD 碼:1FC1)。圖2在糖基化IgG晶體結構上表示的CH3結構域中的兩個β片層，包括β_片層 C中的382Ε和β -片層C中的^8M。(PBD碼1FC1)。圖3用于工程改造非糖基化Fc5結構域的易錯PCR文庫。圖4來自不同輪分選的以Fc y RIa-FITC標記的原生質球的熒光直方圖。圖5表現(xiàn)出對Fc y RIa比對Fc5具有更高親和性的分離的Fc突變體克隆的DNA 序列。對于以Fc y RIa標記的各個克隆的平均熒光數(shù)值在括號中顯示。圖6在糖基化IgGlFc的3D結構上表示的分離的非糖基化Fc601_619的突變點 (PBD 碼1FC1)。圖7對于以30nM Fc y RIa-FITC標記的野生型Fe、Fc5和Fc601的原生質球的熒光直方圖。M 平均熒光強度。圖8在糖基化IgGlFc的3D結構上表示的分離的非糖基化Fc 601的突變點 (K338R、G341V、E382V、M428I) (PBD 碼1FC1)。圖9質粒pSTJ4-赫賽汀IgGl圖譜。圖10通過對于結合Fc y RIa的BIACore分析所確定的非糖基化曲妥珠單抗、曲妥珠單抗_Fc5、曲妥珠單抗-Fc601和糖基化曲妥珠單抗的動力學速率和平衡解離常數(shù)。圖11對于曲妥珠單抗抗體與Fc y RIIa-GST結合的ELISA測定。圖12對于曲妥珠單抗抗體與Fc y RIIb-GST結合的ELISA測定。圖13對于曲妥珠單抗抗體與Fc YRIIIa結合的ELISA測定。圖14對于在pH 7. 4和6. 0下與Fcfoi進行pH依賴性結合的ELISA測定。板以非糖基化曲妥珠單抗、曲妥珠單抗_Fc5、曲妥珠單抗-Fc601或者商業(yè)化的糖基化曲妥珠單抗包被并且使用抗GST-HRP抗體確定Fcfoi的結合。圖15對Fc y RIa比對Fc5具有更高親和性和pH依賴性Fcfoi結合的文庫。圖16用于構建CH2上部區(qū)域隨機化的4個亞文庫的基因裝配PCR。圖17表現(xiàn)出對Fc y RIa比對Fc5具有更高親和性的分離的Fc突變體克隆的DNA 序列。對于以Fc y RIa標記的各個克隆的平均熒光數(shù)值在括號中顯示。圖18Fc701-709中突變總結。圖19以InM Fc y RIa-FITC標記的野生型Fe、Fc5、Fc701和Fc702的原生質球細胞的熒光直方圖。M 平均熒光強度。圖20以InM Fc y RIa-FITC標記的野生型Fe、Fc5、Fc601和Fc701原生質球細胞的熒光直方圖。M 平均熒光強度。圖21在糖基化IgGlFc的3D結構上表示的分離的非糖基化Fc5的突變點(382E 和 428M)(PBD 碼:1FC1)。圖22通過對于結合Fc y RI的BIACore分析所確定的非糖基化曲妥珠單抗、曲妥珠單抗_Fc5、曲妥珠單抗_Fc601、曲妥珠單抗-Fc701和糖基化曲妥珠單抗的動力學速率和平衡解離常數(shù)。圖23對于在pH 7. 4和6. 0下進行pH依賴性結合Fcfoi的ELISA測定。板以非糖基化曲妥珠單抗、曲妥珠單抗_Fc5、曲妥珠單抗_Fc601、曲妥珠單抗-Fc701或者商業(yè)化的糖基化曲妥珠單抗包被并且使用抗GST-HRP抗體確定Fcfoi的結合。圖M共價錨定的全長IgG展示系統(tǒng)。圖25在雙質粒共價錨定的全長IgG展示系統(tǒng)和雙順反子系統(tǒng)之間的FACS信號的比較?；蛘呤褂秒p質粒的錨定全長IgG展示系統(tǒng)或者使用雙順反子全長IgG展示系統(tǒng)表達曲妥珠單抗全長IgG。M 平均熒光強度。原生質球與30nMFc y RI-FITC探針孵育以便檢測。圖沈在雙質粒共價錨定全長IgG展示系統(tǒng)和雙順反子系統(tǒng)之間FACS信號比較?；蛘呤褂秒p質粒錨定全長IgG展示系統(tǒng)或者雙順反子全長IgG展示系統(tǒng)表達曲妥珠單抗全長IgG。Μ:平均熒光強度。原生質球與30nM Fc γ RIIa-GST孵育并以多克隆抗 GST-FITCd 200)探針標記以便檢測。圖27使用雙質粒的共價錨定全長IgG展示系統(tǒng)和雙順反子系統(tǒng)的曲妥珠單抗全長IgG的FACS分析。表達曲妥珠單抗全長IgG的原生質球與30nMFc y RI-FITC探針孵育以便檢測。M 平均熒光強度。圖觀使用雙質粒的共價錨定全長IgG展示系統(tǒng)和雙順反子系統(tǒng)的曲妥珠單抗全長IgG的FACS分析。表達曲妥珠單抗全長IgG的原生質球與30nMFc y RIIa-GST孵育并且用多克隆抗GST-FITCd 200)探針孵育以便檢測。M 平均熒光強度。圖四文庫CH2上部區(qū)域隨機化的文庫。圖30使用PBMC作為效應器細胞和使用SkBr3作為靶細胞的ADCC測定。*，P
<0. 05。圖31使用mDCs作為效應器細胞和使用SkBr3作為靶細胞的ADCC測定。*，P
<0. 05 ；**，P < 0. 01。
具體實施例方式發(fā)明人先前克服了當前免疫治療技術在提供能夠結合Fc受體多肽的非糖基化抗體Fc結構域中的數(shù)個主要問題。已經(jīng)開發(fā)出具有工程化特征的另外的Fc結構域。雖然提供了關于Fc文庫和篩選方法的信息，但是在下面描述更多的實施方案和優(yōu)勢。I.周質表汰在一些實施方案中，包含抗體Fc結構域的多肽可以在革蘭氏陰性細菌周質空間中表達。此外，在一些方面中，抗體Fc結構域可以錨定在內膜的周質面上。例如，F(xiàn)c結構域可以與跨膜或者膜結合多肽直接融合，或者可以與跨膜或者膜結合多肽相互作用(例如通過蛋白質-蛋白質相互作用)。此種技術可以稱作“錨定周質表達”或者“APEx”。周質區(qū)室包含于革蘭氏陰性細胞的內膜與外膜之間(見例如Oliver，1996)。作為亞細胞區(qū)室，周質區(qū)室的大小、形狀和內容物伴隨著細胞的生長和分裂而變化。在肽聚糖雜聚物框架內是密集環(huán)境的周質蛋白質和較少的水，賦予區(qū)室凝膠樣的稠度(Hobot等， 1984 ；van Wielink和Duine，1990)。取決于距外膜的距離、其形成支撐細胞形狀的胞壁質球囊的閉合以及滲透性溶解的抵抗，肽聚糖以不同程度聚合。外膜(見Nikaido，1996)由磷脂類、孔蛋白和伸向外界基質的脂多糖(LPS)構成。 外膜完整性的分子基礎在于LPS結合二價陽離子(Mg2+和Ca2+)的能力和通過靜電彼此連接在膜上形成高序準晶體的有序“瓦屋頂”的能力(Labischinski等，1985)。膜形成非常嚴格的通透性屏障、允許小于約650Da的分子經(jīng)過孔蛋白通過(Burman等，1972 ；Decad和 Nikaido, 1976)。大的充滿水的孔蛋白通道主要負責允許單糖和二糖、離子和氨基酸自由通過進入周質區(qū)室(Nikaido和Nakae，1979 ；Nikaido和Vaara，1985)。因為分子進入周質具有如此嚴格的生理調節(jié)，乍一看大配體(即大約650Da的排斥界限)可以在篩選方法中采用是不可思議的。然而，發(fā)明人已經(jīng)證明，大于2000Da大小的配體可以擴散進入周質中，而不破壞周質膜。如下文所述，可以對細菌細胞進行一種或者更多種處理，由此使外膜滲透性更大來輔助此種擴散。用于在周質空間中表達多肽并且特別是抗體的方法在本領域中是已知的，例如見美國專利7，094, 571和美國專利公布20030180937和20030219870，每一文獻通過參考并入本文。在一些情況中，本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌細胞可以限定為大腸桿菌細胞。此外， 在一些方面中，革蘭氏陰性細菌細胞可以限定為遺傳工程改造的細菌細胞，諸如大腸桿菌 Jude-I 株。II.外膜的透化在一些實施方案中，涉及破壞、透化或者去除細菌外膜的方法是本領域眾所周知的，例如，見美國專利7，094，571。例如，在細菌細胞與FcR多肽接觸之前，用高滲條件、物理應力、溶菌酶、EDTA、消化酶、破壞外膜的化學試劑、通過以噬菌體感染細菌或者上述方法的組合處理細菌細胞的外膜。因此，在一些情況中，外膜可以通過溶菌酶和EDTA處理來破壞。 此外，在某些實施方案中，細菌外膜可以完全去除。在一個實施方案中，采用用于增加外膜對一種或者更多種標記配體通透性的方法。這使得可以篩選標記配體的進入，否則標記的配體不能夠跨過外膜。然而，某些種類的分子，例如大于650Da排斥界限的疏水性抗生素類本身可擴散通過細菌外膜，而不依賴于膜孔蛋白(Farmer等，1999)。這樣做實際上是該過程可將膜透化(Jouerme和Jimter，1990)。此種機制已經(jīng)被用于以多粘菌素B九肽體內選擇性標記細胞質膜蛋白的周質環(huán) (Wada等，1999)。同樣，某些長鏈磷酸鹽聚合物(IOOPi)似乎完全繞過外膜的正常分子篩活性(Rao 和 iTorriani, 1988)。已經(jīng)鑒定出導致配體透過進入周質而不損失活力或者所表達蛋白質不從細胞釋放的條件，但是本發(fā)明將在無需保持外膜的情況下開展。如本文中所證明，F(xiàn)c結構域表達或錨定在周質空間內的候選結合蛋白，消除了對維持外膜(作為防止結合蛋白從細胞外漏的屏障)以檢測標記配體的需要。結果，表達錨定至細胞質膜外面(周質面)的結合蛋白的細胞可以簡單地通過具有部分透化膜或者幾乎完全去除外膜的細胞與熒光標記的配體溶液孵育而進行熒光標記。不同菌株細菌宿主的外膜通透性在很大程度上變化。先前已經(jīng)證明，缺乏組蛋白樣蛋白質會因為OmpF過表達而弓I起通透性增加，結果導致對于OmpF翻譯的負向調節(jié)mRNA 的數(shù)量降低O^ainbeni等，1997)。同樣，DNA復制和染色體分離依賴于復制體與內膜的直接接觸，內膜本身與外膜在很多點接觸。對于文庫篩選應用的優(yōu)選宿主是大腸桿菌ABLEC株， 另外其具有降低質?？截悢?shù)的突變。諸如高滲脅迫的處理可以顯著改善標記。已知許多試劑，包括鈣離子(Bukau等， 1985)和甚至Tris緩沖液(Irvin等，1981)改變外膜通透性。此外，噬菌體感染刺激標記過程。絲狀噬菌體內膜蛋白pill和大多聚體外膜蛋白PlV均可改變膜通透性(Boeke等， 1982)，其中已知pIV中的突變體改善在正常情況下所排斥的麥芽糊精的進入(Marciano 等，1999)。使用包括菌株、鹽和噬菌體的正確組合的本發(fā)明技術，可以達到高程度的通透性 (Daugherty等，1999)。然后，可以容易地將包含結合至熒光標記配體的錨定或周質相關多肽的細胞從表達結合蛋白的細胞分離，而無需使用流式細胞術或者其它相關技術對于標記配體的親和性。然而，在一些情況中，希望使用破壞性更小的技術以維持細胞的活力。在這方面，EDTA和溶菌酶處理也是有用的。III.抗體結合性多肽在某些方面，涉及用于鑒定對抗體結合性多肽諸如Fc受體具有特異親和性的抗體Fc結構域的方法。在一些實施方案中，F(xiàn)c結構域經(jīng)工程改造以結合一種或者更多種特異性Fc受體。另外地或者備選地，F(xiàn)c結構域可以工程改造以致于其特異性地結合一種或者更多種特異性Fc受體。在某些實施方案中，涉及包含已經(jīng)相對于天然或者野生型蛋白質進行修飾的蛋白質類分子的組合物。在一些實施方案中，蛋白質類化合物已經(jīng)缺失了氨基酸殘基；在其它的實施方案中，蛋白質類化合物的氨基酸殘基已經(jīng)被替代，而在又一實施方案中，在蛋白質類化合物中進行了氨基酸殘基的缺失和替代兩者。此外，蛋白質類化合物可包括包含一種以上多肽實體的氨基酸分子。如本文所使用，“蛋白質類分子”、“蛋白質類組合物”、“蛋白質類化合物”、 “蛋白質類鏈”或者“蛋白質類材料”通常指，但不限于，大于約200個氨基酸的蛋白質或者從基因翻譯的全長內源序列；100個氨基酸或者更大的多肽；和/或3至100個氨基酸的肽。 上面描述的所有的“蛋白質類”術語在本文中可以互換使用；然而，特別考慮了，實施方案可以局限于特定類型的蛋白質類化合物，諸如多肽。此外，這些術語同樣可以應用于融合蛋白質或者蛋白質綴合物。蛋白質可以包括一種以上的多肽。例如，IgG抗體具有兩個重鏈多肽和兩個輕鏈多肽，通過二硫鍵將它們彼此連接起來。如本文所使用，“不同的Fc結構域”可以定義為與另一 Fc有少至1個氨基酸差異的結構域。用于產(chǎn)生不同抗體Fc結構域文庫或者編碼抗體的核酸的方法在本領域中眾所周知并且在本文中舉例說明。例如，在一些情況中，如在本文中所例證，F(xiàn)c結構域可以通過易錯PCR擴增。此外，在某些情況下，多種抗體Fc結構域可以包含已經(jīng)隨機化的一串(1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)氨基酸。在某些情況下，可將Fc結構域經(jīng)工程改造進行特定突變。例如，在一些方面中，正常情況下在抗體Fc結構域中被糖基化的殘基可以突變。此外，在某些方面，正常情況下糖基化的殘基(或者鄰近殘基)可以用作插入1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10個或更多個氨基酸的位點。氨基酸插入可以在對應于IgGlFc (SEQ ID NO 2)氨基酸384的殘基或者附近進行。在又一種情況中，根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌群體可以定義為包含至少約1 X IO3,1 X IO4,1 X IO5,1 X IO6,1 X IO7,1 X IO8或者更多不同抗體Fc 結構域。在一些特定情況中，革蘭氏陰性細菌細胞群體可以通過包括下列步驟的方法產(chǎn)生 (a)制備編碼多種不同抗體Fc結構域的多種核酸；和(b)以所述核酸轉化革蘭氏陰性細菌群體，其中革蘭氏陰性細菌包含表達在周質中的多種抗體Fc結構域。許多種抗體結合結構域(例如FcR多肽)是本領域已知的并且可以在本發(fā)明方法和組合物中使用。例如，在一些方面中，F(xiàn)cR可以對Ig的特定類型或者亞型具有特異性，諸如 IgA、IgM、IgE 或者 IgG (例如 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3 或者 IgG4)。因此，在一些實施方案中，抗體結合結構域可以限定為IgG結合結構域。FcR多肽可包含真核的、原核的或者合成的FcR結構域。例如，抗體Fc-結合結構域可以限定為哺乳動物的、細菌的或者合成的結合結構域。用于在本發(fā)明中使用的一些Fc-結合結構域包括但不限于來自表1多肽之一的結合結構域。例如，F(xiàn)c 結合多肽可以由 FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FCGR1A、 FcgrU FCGR2, FCGR2, Fcgr2, Fcgr2, FCGR3, FCGR3, Fcgr3, FCGR3, Fcgr3, FCGRT, mrp4, spa或者spg基因編碼。優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明使用的FcR多肽可以是來自人Fc y RIa, Fc y RIIa, Fc y Rllb、Fc y RIIc、Fc γ Rllla、Fc γ Rlllb、Fc α RI 或 Clq 的 Fc 結合區(qū)。在本發(fā)明的又一實施方案中，F(xiàn)c多肽可以錨定至革蘭氏陰性細菌的內膜。用于將多肽錨定至革蘭氏陰性細菌內膜的方法和組合物已經(jīng)在先前描述(美國專利7，094，571和美國專利公布20050260736)。因此，在一些方面中，F(xiàn)c結構域可以融合至與細菌內膜結合或者整合入細菌內膜的多肽。此種融合蛋白質可以包括與Fc結構域的N末端或者C末端融合，并且在一些情況中可以在膜錨定多肽與Fc結構域之間包括額外的連接體氨基酸。在某些特定的情況中，膜錨定多肽可以是又大腸桿菌NlpA基因編碼的前6個氨基酸，來自大腸桿菌內膜蛋白的一個或者更多個跨膜α -螺旋，絲狀噬菌體的基因III蛋白質或其片段， 或者內膜脂蛋白或其片段。因此，作為實例，膜錨定多肽可以是內膜脂蛋白或其片段，諸如來自 AraH、MglC, MalF, MalG, MalC, MalD, RbsC, RbsC, ArtM, ArtQ, GlnP, Proff, HisM, HisQ, LivH> LivM> LivA> LivE> DppB、DppC、OppB> AmiC> AmiD、BtuC、ThuD、FecC、FecD、FecR、FepD> NikB, NikC、CysT、Cysff, UgpA, UgpE, PstA, PstC、PotB, PotC、PotH, Pod、ModB, NosY、PhnM, LacY、SecY、TolC、Dsb、B、DsbD、TouB> TatC、CheY、TraB> ExbD> ExbB 或者 Aas0技術人員將理解，基于它們與FcR相互作用(結合)而選擇細胞的方法在本領域中眾所周知。例如，F(xiàn)cR可以固定在柱或者珠上(例如磁珠)并且通過重復洗滌珠(例如磁分離)或者柱分離與FcR結合的細菌細胞。此外，在一些方面中，靶配體可以用例如熒光體、放射性同位素或者酶標記。因此，在一些情況中，細菌細胞可以通過檢測所結合FcR上的標記來選擇。例如，熒光團可以用于使用熒光激活細胞分選(FACS)來選擇細胞。此外， 在一些方面中，細菌細胞可以基于兩種或者更多種FcR多肽的結合或者不結合來選擇。例如，可以選擇表現(xiàn)出結合兩種FcR多肽的抗體的細菌，其中使用每一FcR進行連續(xù)地選擇細菌。相反，在某些方面，可以選擇表現(xiàn)出結合一種FcR(諸如包含第一標記的FcR)但不結合第二 FcR(例如包含第二標記)的抗體Fc結構域的細菌。前述方法可以用于，例如，鑒定結合特異性FcR但不結合第二特異性FcR的抗體Fc結構域。在某些實施方案中，至少一種蛋白質類分子的大小可以包括，但不限于，大約或者至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、 220、230、240、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、 1000個或者更多個氨基分子殘基，和可從其推導出的任何范圍?；衔锟砂▉碜許EQ ID N0:2(人IgG Fc多肽)或者來自SEQ ID NO 4_31的上述數(shù)量的連續(xù)氨基酸，并且它們可以進一步地與SEQ ID NO :2或者SEQ ID NO 4-31中的任何序列具有百分比同一性或者同源性(下面討論)?？紤]了，對于SEQ ID NO :2的實施方案可以使用本文所述的任何其它氨基酸序列，并且根據(jù)情況反之亦然。如本文所使用，“氨基分子”指任何氨基酸、氨基酸衍生物或者本領域普通技術人員已知的氨基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質類分子的殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基分子打斷氨基分子殘基序列。在其它的實施方案中，序列可以包含一個或者一個以上非氨基分子部分。在特定的實施方案中，蛋白質類分子的殘基序列可以被一個或者更多個非氨基分子部分打斷。A.修飾的蛋白質和多肽實施方案涉及修飾的蛋白質和多肽，特別是表現(xiàn)出與非修飾形式具有可比性的至少一種功能活性的修飾蛋白質或多肽，然而，修飾的蛋白質或者多肽擁有超過非修飾形式的額外的優(yōu)勢，諸如引起ADCC，更容易或者更廉價生產(chǎn)，較少地引起副作用，和/或具有更佳或者更長的有效性或生物利用率。因此，當本申請?zhí)岬健靶揎椀鞍踪|”或者“修飾多肽”的功能或者活性時，本領域普通技術人員將理解這包括例如這樣的蛋白質或多肽，1)表現(xiàn)出與未修飾蛋白質或者多肽具有至少一種相同的活性或者具有至少一種相同的特異性，但是具有不同水平的另一活性或者特異性；和2、擁有優(yōu)于未修飾蛋白質或者多肽的額外的優(yōu)勢?；钚缘臏y定可以使用本領域技術人員熟悉的，特別是關于蛋白質活性的測定法實現(xiàn)，并且可以包括例如為了比較的目的使用天然和/或重組形式的修飾的或者未修飾的蛋白質或者多肽。特別考慮了，關于“修飾蛋白質”的實施方案可以使用“修飾多肽”實施，并且反之亦然。除了本文討論的修飾的蛋白質和多肽之外，實施方案可以包括WO 2008/137475中描述的結構域、多肽和蛋白質，該文獻明確地通過參考并入本文。修飾的蛋白質可以具有氨基酸缺失和/或替換；因此，具有缺失的蛋白質、具有替換的蛋白質，和具有缺失和替換的蛋白質是修飾的蛋白質。在一些實施方案中，這些修飾的蛋白質還可以包括氨基酸插入或者添加，諸如在融合蛋白中或者具有連體體的蛋白質中。 “修飾的缺失的蛋白質”缺乏一個或者更多個天然蛋白質殘基，但是具有天然蛋白質的特異性和/或活性?！靶揎椀娜笔У牡鞍踪|”還可以具有降低的免疫原性或者抗原性。修飾的缺失的蛋白質的實例是這樣的一種蛋白質，即其缺失至少一個抗原區(qū)的氨基酸殘基，抗原區(qū)即決定在特定生物體，諸如修飾蛋白質可能會施用的生物體類型中抗原性的蛋白質區(qū)域。替換或替代變體有代表性地包括在蛋白質內的一個或更多個位點一種氨基酸與另一種氨基酸的交換，并且可以經(jīng)設計以調節(jié)多肽的一種或更多種特性，特別是其效應器功能和/或生物利用率。替換可以是保守的或者不是保守的，保守的即一個氨基酸用另一相似形狀和電荷的氨基酸替換。保守替換是本領域眾所周知的并且包括例如如下變化丙氨酸至絲氨酸；精氨酸至賴氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至絲氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；組氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸至亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或異亮氨酸；苯基丙氨酸至酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸至蘇氨酸；蘇氨酸至絲氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及纈氨酸至異亮氨酸或亮氨酸。除了缺失或替換外，修飾的蛋白質可以具有殘基插入，其有代表性地包括在多肽中加入至少一個殘基。這可以包括插入靶向肽或多肽或者只是信號殘基。末端添加，稱作融合蛋白在下面討論。術語“生物功能等效”在本領域中很容易理解并且在本文中進一步詳細定義。因此，包括了具有約70%和約80%之間，或者約81%和約90%之間，或者甚至約91%和約 99%之間的與天然多肽氨基酸同一或者功能等效氨基酸的序列，前提是維持了蛋白質的生物學活性。修飾的蛋白質可以與其天然相似物在生物功能上等效。還應當理解，氨基酸和核酸序列可以包括額外的殘基，諸如額外的N-末端或者 C-末端氨基酸或者5'或者3'序列，并且在本質上仍然如在本文所公開的序列之一所述， 只要序列滿足了上述標準即可，包括就蛋白質表達而言維持了蛋白質的生物學活性。末端序列的添加特別應用于核酸序列，核酸序列例如可以包括編碼區(qū)5'或3'部分的不同的非編碼側翼或者可以包括不同的內部序列，即已知基因內存在的內含子。下面是基于改變蛋白質氨基酸以產(chǎn)生等效或者甚至改善的、第二代分子的討論。 例如，某些氨基酸可以替換蛋白質結構中的其它氨基酸，而具有或不具有相當大的與結構例如作用物分子結合位點的相互作用結合能力的損失。由于限定蛋白質生物學功能活性的是該蛋白質的相互作用能力和性質，所以可以在蛋白質序列中并且在其DNA編碼序列中進行某些氨基酸替換，盡管如此仍產(chǎn)生具有相似特性的蛋白質。因此發(fā)明人考慮了，可以對基因的DNA序列進行多種改變而不會造成它們的生物學有效性或者活性相當大的損失， 如下面所討論。如果滿足下列“同源性標準”之一，則蛋白質類分子與第二蛋白質類分子具有“同源性”或者認為是“同源的” 1)蛋白質類分子與第二蛋白質類分子在同一位置具有至少30%的序列同一性；幻在第二蛋白質類分子內的相同位置上具有一些序列同一性，并且如本文所述，對于第二蛋白質類分子，在非相同的殘基上，至少30%的殘基為保守性的差異；或者幻至少30%的蛋白質類分子與第二蛋白質類分子具有序列同一性，但是在相同殘基之間可能具有非相同的殘基缺口。如本文所使用，術語“同源的”可以同樣地應用于蛋白質類分子的區(qū)域，而不是整個分子。如果術語“同源性”或者“同源的”通過數(shù)量限定，例如 “50%同源性”或者“50%同源的”，則對于1)、2)和3)的同源性標準調整為從“至少30%” 至“至少50%”。因此考慮了，在兩個蛋白質類分子或者蛋白質類分子的部分之間存在至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更高的
同源性。備選地，修飾的多肽可以表征為與未修飾多肽或者與本文公開的任何多肽，包括 SEQ ID NO :2或者SEQ ID NO :4_31中的任何序列具有一定的同一性百分數(shù)。兩個蛋白質類分子或者蛋白質類分子的部分之間的同一性百分數(shù)可以是至多或者至少50<%、55%、60%、 65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% (或者可從它們推導出的任何范圍)?？紤]了，上面討論的同一性百分數(shù)與多肽特定區(qū)域與多肽未修飾區(qū)域的比較有關。例如，多肽可包含修飾的或者突變的Fc結構域，其可以基于修飾的或者突變的Fc結構域與來自同一物種的非修飾的或者突變的Fc結構域的氨基酸序列同一性進行表征。表征為例如與未修飾Fc結構域具有90%同一性的修飾的或者突變的人Fc結構域意思是指，在該結構域中有90%的氨基酸與未修飾人Fc結構域(SEQ ID NO 2)的氨基酸相同。在產(chǎn)生此類改變中，可以考慮氨基酸的親疏水性指數(shù)。在本領域中普遍理解親疏水性氨基酸指數(shù)對賦予蛋白質的相互作用的生物學功能上的重要性(Kyte和Doolittle， 1982)。一般認為，氨基酸的相對親疏水性特征有利于所得到蛋白質的二級結構，其反過來限定了蛋白質與其他分子例如酶、作用物、受體、DNA、抗體、抗原等等的相互作用。本領域中還理解，可以基于親水性有效地產(chǎn)生相似氨基酸的替換。美國專利 4，554，101，通過參考并入本文，描述了如通過鄰近氨基酸的親水性所決定的蛋白質的最大局部平均親水性與蛋白質的生物學特性相關。如在美國專利4，554，101中所詳細描述，對氨基酸殘基指定下列親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0士1)；谷氨酸(+3.0士1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(_0.5士1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸(-0. 5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸 (-2. 5)；色氨酸(-3. 4)。應當理解，氨基酸可以替換具有相似親水性值的另一氨基酸，而仍然產(chǎn)生生物學上等效的和免疫學上等效的蛋白質。在此類改變中，優(yōu)選其親水性值在士2之內的氨基酸替換，特別優(yōu)選親水性值在士 1之內的那些氨基酸替換，并且更加特別優(yōu)選其親水性值在士0.5之內的那些氨基酸替換。如上面所大概描述，氨基酸替換通常基于氨基酸側鏈取代物的相對相似性，例如， 它們的疏水性、親水性、電荷、大小等等?？紤]具有多種前述特征的示例性替換是本領域技術人員眾所周知的并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。結合Fc結構域的多種Fc受體是本領域眾所周知的并且一些受體實例列于下表1 中。表1:選擇的FcR多肽CN 102549016 A蛋白質名稱基因名稱描述生物長度(aa)參考文獻
"Ft^ RII-a FCGR2A低親和性免疫球人(人類)317(Stuart 等，
(CD32)蛋白γ Fc區(qū)受體1987)
___II a前體____
Fc-γ RII a FCGR2A低.和性免疫球 Pantroglodytes 316
蛋白γ Fc區(qū)受體(黑猩猩)
___II a前體____
Fc-γ RII b FCGR2B低親和性免疫球人(人類)310(Stuart 等，
蛋白γ Fc區(qū)受體 1989) __ II b 前體____
權利要求
1.包含能夠結合人FcR多肽的非糖基化抗體Fc結構域的多肽，其中該Fc結構域包含氨基酸382和氨基酸4 位的氨基酸替換與下列任何位氨基酸的至少一個額外替換2對、 241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、338、340、341、 348、369、378、382、392、424、426、428 和 / 或 434。
2.權利要求1的多肽，其中Fc結構域能夠結合人FcYRI多肽。
3.權利要求1的多肽，其中至少一個額外替換是CH2上部區(qū)域的氨基酸替換。
4.權利要求3的多肽，其中至少一個額外替換是CH2上部區(qū)域下列部分中的氨基酸替換:234L-239S ；264V-268H ；297N-299T ；或者 328L-332I。
5.權利要求1的多肽，其中氨基酸382位的替換是纈氨酸(E382V)。
6.權利要求1的多肽，其中氨基酸4 位的替換是異亮氨酸(M4^I)。
7.權利要求6的多肽，其中氨基酸382位的替換是纈氨酸(E382V)并且氨基酸4 位的替換是異亮氨酸(M4^I)。
8.權利要求1的多肽，其中氨基酸3 位的替換是色氨酸。
9.權利要求1的多肽，其中氨基酸332位的替換是酪氨酸(I332Y)。
10.權利要求1的多肽，其至少在氨基酸3 和332位具有另一替換。
11.權利要求10的多肽，其中氨基酸3 位的替換是色氨酸(L3^W)并且氨基酸332 位的替換是酪氨酸(I332Y)。
12.權利要求1的多肽，其在氨基酸341位具有另一替換。
13.權利要求12的多肽，其中氨基酸341位的替代是纈氨酸(G341V)。
14.權利要求1的多肽，其中至少一個額外替換是:H224R/Y,F241L、K251F、V266M、 E269K、N276D、V279M、N286D、Q295R、N297D、Y300C、N315D、N325S、L328W、A330V/E/I、P331A/ S/E、I332Y、K338I/R、K340N/Q、G341V、V348M、V369A、A378D、K392E、S424L、S426I 或 N434S/ D0
15.權利要求1的多肽，其中與具有非糖基化野生型抗體Fc結構域的多肽相比所述多肽對Fcfoi的pH依賴性的結合降低至少2倍。
16.權利要求14的多肽，其中所述多肽不具有額外替換G341V。
17.權利要求14的多肽，其中所述多肽不具有額外替換K338R。
18.權利要求17的多肽，其中所述多肽不具有額外替換K338R和G341V。
19.權利要求14的多肽，其中所述Fc結構域具有E382V和M428I替換和額外替換 GiMlV 和 / 或 K;MON/Q。
20.權利要求19的多肽，其中Fc結構域具有額外替換G341V。
21.權利要求20的多肽，其中Fc結構域具有至少一個選自下組的其它替換H224Y、 F241L、E269K、N276D、N286D、Y300C、N325S、K338R、V348M、V369A、K392E、S424L 和 N434D/S。
22.權利要求21的多肽，其中Fc結構域具有選自該組的多個其它替換。
23.權利要求21的多肽，其中Fc結構域包含K338R替換。
24.權利要求14的多肽，其中Fc結構域包含選自下列的替換組合a)K338R和G341V； b)N297D、N315D 和 K340N ；c)K340N ；d) K338I 和 K340N ；e)K340Q 和 A378D ；f) N325S 和 K340N ； g)H224Y、E269K、N325S 和 G341V ；h) G341V 和 K392E ； i)K338R、G341V、S424L 和 N434D ； j) F241L 和 G341V ；k) G341V ；1) N276D 和 G341V ；m) G341V 和 V369A ；n) N286D、G341V 和 N434S ；ο)N325S和 G341V ；p) Y300C和 G341V ；q) G341V和 V348M ；r) E382V和M428I ；s)V266M ；t)A330V、 P331A 和 Q295R ；u) A330E、P331E 和 V279M ；v)A330E 和 P331E ；w) A330E、P331V 和 S426T ；χ) Α330Ε 和 P331V ；y)A330I 和 P331E ；z)A330E ；aa)P331S ；以及 bb)A330V、P331S、H224R 和 L251F0
25.權利要求20的多肽，還包含可綴合的連接體。
26.權利要求20的多肽，還包含非FcR結合結構域。
27.權利要求沈的多肽，其中所述非FcR結合結構域是抗體的抗原結合位點。
28.權利要求沈的多肽，其中所述非Fc結合區(qū)不是抗體的抗原結合位點。
29.權利要求觀的多肽，其中所述非Fc結合區(qū)結合細胞表面蛋白。
30.權利要求觀的多肽，其中所述細胞表面蛋白是受體。
31.權利要求30的多肽，其中所述受體是酪氨酸激酶。
32.權利要求31的多肽，其中所述非Fc結合區(qū)結合多個酪氨酸激酶受體。
33.編碼權利要求1-32的任一多肽的核酸。
34.權利要求33的核酸，其中所述核酸是DNA片段。
35.權利要求33的核酸，其中所述核酸是表達載體。
36.包含權利要求33的核酸的宿主細胞。
37.權利要求36的宿主細胞，其中所述核酸在第一表達載體中。
38.權利要求37的宿主細胞，還包含第二表達載體。
39.權利要求38的宿主細胞，其中第二表達載體編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽。
40.權利要求39的宿主細胞的群體，其中該群體含有表達不同F(xiàn)c結構域的多個宿主細胞。
41.權利要求40的宿主細胞的群體，其中任何兩個不同F(xiàn)c結構域的氨基酸序列同一性差異小于20%。
42.包含能夠結合FcRγ I多肽的非糖基化Fc結構域和第二結合結構域的多肽，其中所述第二結合結構域能夠結合細胞表面分子。
43.權利要求42的多肽，其中所述第二結合結構域是抗體抗原結合結構域。
44.權利要求42的多肽，其中所述第二結合結構域不是抗體抗原結合結構域。
45.權利要求42的多肽，其中所述細胞表面分子是蛋白質類分子。
46.權利要求42的多肽，其中所述第二結合結構域是細胞表面受體的配體。
47.權利要求42的多肽，其中所述第二結合結構域是細胞表面配體的受體。
48.編碼權利要求42-47的任一多肽的核酸。
49.權利要求48的核酸，其中所述核酸是DNA片段。
50.權利要求48的核酸，其中所述核酸是表達載體。
51.包含權利要求48的核酸的宿主細胞。
52.權利要求51的宿主細胞，其中所述核酸在第一表達載體中。
53.權利要求52的宿主細胞，還包含第二表達載體。
54.權利要求53的宿主細胞，其中所述第二表達載體編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽。
55.用于制備非糖基化多肽的體外方法，包括a)獲得能夠表達非糖基化抗體的宿主細胞，所述非糖基化抗體包含能結合FcR多肽的 Fc結構域，其中所述Fc結構域包含氨基酸382和4 位的氨基酸替換與在下列任一位氨基酸的至少一個額外替換:224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、 330、331、332、338、340、341、348、369、378、382、392、424、426、428 和 / 或 434 ；b)在促進非糖基化抗體表達的情況下培養(yǎng)宿主細胞；和，c)從所述宿主細胞純化表達的抗體。
56.權利要求55的方法，其中所述宿主細胞是原核細胞。
57.權利要求55的方法，其中所述宿主細胞是真核細胞并且所述多肽包含N297D替換。
58.權利要求55的方法，還包括從上清液收集表達的抗體。
59.權利要求58的方法，其中從上清液純化抗體包括將上清液的抗體進行過濾、HPLC、 陰離子或陽離子交換、高效液相色譜(HPLC)、親和層析或其組合。
60.權利要求59的方法，其中親和層析涉及蛋白A。
61.根據(jù)權利要求1至32任一項的多肽，用于在受試者中誘導免疫反應。
62.權利要求61的方法，其中非糖基化抗體能夠特異性結合Fcγ RI多肽。
63.權利要求61的方法，其中所述非糖基化抗體能夠以比糖基化的野生型形式的抗體小至少50倍的水平特異性結合Fc y RIIb多肽。
64.權利要求63的方法，其中抗體是非糖基化形式的治療抗體。
65.誘導樹突細胞(DC)介導的細胞殺死的方法，其針對表達靶細胞表面多肽的靶細胞，包括a)使靶細胞與多肽接觸，所述多肽包含能夠特異性結合至少Fcγ RI多肽的突變和非糖基化Fc結構域與結合靶細胞表面多肽的第二結合結構域，其中非糖基化Fc結構域以比糖基化Fc結構域小至少50倍的水平特異性結合Fc y RIIB多肽；和b)在促進殺死靶細胞的條件下將靶細胞與樹突細胞接觸。
66.權利要求65的方法，其中Fc結構域包含在下列氨基酸處至少一個氨基酸替換 224、241、251、266、269、276、279、286、295、297、300、315、325、328、330、331、332、340、348、 369、378、382、392、424、426、428 和 / 或 434。
67.權利要求66的方法，其中Fc結構域包含替換E382V和M^8I。
68.篩選非糖基化多肽的體外方法，所述非糖基化多肽具有結合特異性Fcγ R多肽的 Fc結構域，所述方法包括a)獲得一革蘭氏陰性細菌細胞群，該群細胞在它們的周質中表達包含F(xiàn)c結構域的非糖基化多肽，其中該群表達多個不同的Fc結構域；b)使該細菌細胞與第一FcR多肽在使得Fc γ R多肽與非糖基化Fc結構域之間接觸的條件下接觸，其中 Fc γ R 多肽是 Fc γ RIa、FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa, Fc γ RIIIb 或 Fc α RI ；c)基于非糖基化Fc結構域與第一FcR多肽的結合選擇至少一種細菌細胞。
69.權利要求68的方法，還包括從選擇的細菌細胞鑒定或分離非糖基化多肽。
70.權利要求68的方法，還包括確定所選擇的細菌細胞中的非糖基化多肽是否能結合其它FcR多肽。
71.權利要求70的方法，其中確定所選擇的細菌細胞中的非糖基化多肽是否能結合其它FcR多肽包括以第二 FcR多肽重復步驟a)-c)，以確定非糖基化多肽是否還結合該第二 FcR多肽。
72.權利要求71的方法，其中以兩種以上不同F(xiàn)cR多肽重復所述步驟a)-c)。
73.權利要求72的方法，其中所述非糖基化多肽結合多種FcR多肽。
74.權利要求68的方法，其中所述細菌細胞是大腸桿菌細胞。
75.權利要求68的方法，其中所述Fc結構域是IgG、IgA或IgEFc結構域。
76.權利要求75的方法，其中所述IgGFc結構域是IgGlFc結構域。
77.權利要求76的方法，其中所述IgGlFc結構域是抗HER2抗體的Fc結構域。
78.權利要求77的方法，其中所述IgGlFc結構域是曲妥珠單抗Fc結構域。
79.權利要求68的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌細胞群包含編碼所述多個非糖基化 Fc結構域的多個核酸。
80.權利要求79的方法，其中多個核酸還編碼融合至所述多個非糖基化Fc結構域的膜分泌信號。
81.權利要求80的方法，其中所述膜分泌信號是PelB。
82.權利要求80的方法，其中所述膜分泌信號是DsbA。
83.權利要求68的方法，其中所述非糖基化Fc結構域包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。
84.權利要求68的方法，其中所述非糖基化多肽包含真核Fc結構域。
85.權利要求68的方法，其中所述非糖基化多肽包含合成的Fc結構域。
86.權利要求84的方法，其中所述FcR多肽包含來自表1多肽之一的抗體結合結構域。
87.權利要求86的方法，其中所述FcR多肽包含來自人Fcγ RIa、Fc y RIIa、Fc yRIIb, Fc y RIIc、Fc y Rllla、Fc y Rlllb、Fc α RI 或 Clq 的抗體結合結構域。
88.權利要求87的方法，其中所述FcR多肽包含來自人Fcγ RIa的抗體結合結構域。
89.權利要求68的方法，其中所述FcR多肽被標記。
90.權利要求89的方法，其中所述FcR多肽用熒光團、放射性同位素或酶標記。
91.權利要求90的方法，其中所述FcR多肽用熒光團標記。
92.權利要求89的方法，其中所述FcR多肽與熒光蛋白或者酶融合。
93.權利要求92的方法，其中所述FcR多肽與綠色熒光蛋白GFP融合。
94.權利要求68的方法，其中所述FcR多肽被固定化。
95.權利要求68的方法，其中步驟(c)的所述選擇進一步定義為包括至少兩輪選擇，其中基于Fc多肽與FcR多肽的結合將在第一輪選擇中獲得的細菌細胞的亞群進行至少第二輪選擇。
96.權利要求95的方法，包括2至10輪選擇。
97.權利要求96的方法，其中通過FACS或磁分離進行選擇。
98.權利要求68的方法，還包括將細菌細胞與至少兩種FcR多肽接觸。
99.權利要求98的方法，其中所述至少兩種FcR多肽包含不同的標記。
100.權利要求99的方法，還包括基于所述非糖基化Fc結構域與所述至少兩種FcR多肽的結合選擇細菌細胞。
101.權利要求99的方法，還包括基于所述非糖基化Fc結構域與至少一種FcR多肽的結合和基于所述非糖基化Fc結構域不結合至少一種其它FcR多肽選擇細菌細胞。
102.權利要求68的方法，還包括在所述細菌細胞與FcR多肽接觸之前破壞細菌細胞的外膜。
103.權利要求102的方法，其中破壞細菌細胞的外膜包括用高滲條件處理、用物理應力處理、用噬菌體感染細菌、用溶菌酶處理、用EDTA處理、用消化酶處理或者用破壞外膜的化學試劑處理。
104.權利要求103的方法，其中破壞細菌細胞的外膜包括所述方法的組合。
105.權利要求102的方法，其中破壞細菌細胞的外膜包括加熱細菌細胞和物理、化學和酶破壞外膜的組合。
106.權利要求102的方法，其中破壞細菌細胞的外膜還包括去除所述細菌的外膜。
107.權利要求68的方法，還包括去除未與非糖基化Fc結構域結合的FcR多肽。
108.權利要求68的方法，其中細菌在包含蔗糖、山梨醇、甘露醇或者海藻糖的培養(yǎng)基中生長。
109.權利要求68的方法，其中細菌在包含海藻糖的培養(yǎng)基中生長。
110.權利要求68的方法，還定義為產(chǎn)生編碼對FcR多肽具有特異性親和性的抗體Fc 多肽的核酸序列的方法，并且還包括從細菌細胞克隆編碼Fc多肽的核酸序列的步驟以產(chǎn)生編碼對FcR多肽具有特異性親和性的抗體Fc多肽的核酸序列。
111.權利要求110的方法，其中克隆包括所述核酸序列的擴增。
112.權利要求110的方法，還定義為產(chǎn)生對FcR多肽具有特異性親和性的抗體Fc多肽的方法，并且還包括表達編碼抗體Fc多肽的核酸序列的步驟以產(chǎn)生對FcR多肽具有特異性親和性的抗體Fc多肽。
113.權利要求112的方法，其中FcR多肽是Fcγ RI多肽。
114.權利要求68的方法，其中所述多個不同的Fc結構域是一種Fc結構域的突變變體。
115.權利要求114的方法，其中所述突變變體隨機產(chǎn)生。
116.用于優(yōu)化具有Fc結構域的非糖基化多肽的結合一種或更多種特異性FcR多肽的 Fc的體外方法，包括a)獲得革蘭氏陰性細菌細胞群，該群的細胞在它們的周質中表達包含F(xiàn)c結構域的非糖基化多肽，其中所述群表達多個表達不同突變Fc結構域的不同多肽；b)使所述細菌細胞與第一FcR多肽在使得所述FcR多肽與非糖基化Fc結構域之間接觸的條件下接觸，其中所述FcR多肽是Fc γ RIa、FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, Fc y Rllla、Fc γ RIIIb 或 Fc α RI ；c)基于所述非糖基化Fc結構域與所述第一FcR多肽的結合選擇至少一種細菌細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有非糖基化抗體Fc結構域的多肽的方法和組合物。在某些實施方案中，與天然Fc結構域相比，具有非糖基化Fc結構域的多肽包含一個或更多個替換。此外，一些實施方案涉及結合一些Fc受體但不結合其它受體的Fc結構域。例如，提供具有非糖基化Fc結構域的多肽，所述非糖基化Fc結構域以糖基化Fc結構域結合水平2倍之內的水平選擇性結合FcγRI，但是對其它Fc受體的結合顯著降低。此外，本發(fā)明提供使用具有修飾的非糖基化Fc結構域和第二非Fc結合結構域的多肽促進抗體依賴性細胞介導毒性(ADCC)的方法和組合物，所述的第二非Fc結合結構域可以是抗體的抗原結合區(qū)或者非抗原結合區(qū)。一些實施方案涉及具有此類多肽的抗體，其可以具有相同或者不同的非Fc結合結構域。
文檔編號C12N15/13GK102549016SQ201080038758
公開日2012年7月4日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權日2009年6月30日
發(fā)明者G·喬吉歐, S·T·鄭, S·雷迪 申請人:研究發(fā)展基金會