專利名稱：制造人源化的非人類哺乳動物的方法
制造人源化的非人類晡乳動物的方法相關(guān)申請本申請要求于2009年6月29日提交的美國臨時申請?zhí)?1/221，438的權(quán)益。通過引用將以上一項或多項申請的全部傳授內(nèi)容結(jié)合在此。
背景技術(shù)：
對于以合成的和控制的方式在小型動物模型中研究針對病原體感染的人類免疫應(yīng)答存在巨大的需求。過去二十年來，已經(jīng)投入了巨大的努力用人血譜系細胞重新構(gòu)建缺少T淋巴細胞和B淋巴細胞的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCid)型小鼠(Shultz LD7Ishikawa F，Greiner DL(2007)Nat RevImmunol 7:118-130)。然而，由于在受體小鼠體內(nèi)移入較差、人類T細胞和B細胞快速消失、或造血細胞惡性腫瘤的快速發(fā)展，早期的嘗試是不成功的。通過使用不僅缺乏T細胞和B細胞(由于scid突變亦或重組活化基因(Rag)突變)而且缺乏自然殺傷(NK)細胞(由于缺失共同的Y鏈(Yc或I12rg))的受體小鼠實現(xiàn)了突 破(Hiramatsu H，et al. (2003) Blood 102 :873-880 ；Traggiai E，et al. (2004) Science304 :104-107) ο將人類造血干細胞(HSC)過繼性轉(zhuǎn)移到N0D_scid I12rg+(NSG)受體亦或BALB/c-Rag2^I12rg^受體體內(nèi)導(dǎo)致HSC在受體骨髓(BM)中穩(wěn)定地、長期地移入并且在外周(人源化小鼠或humice)體內(nèi)產(chǎn)生全人血譜系細胞(Hiramatsu H, et al. (2003)Blood102 :873-880 ;Traggiai E, et al. (2004)Science 304 :104-107)?，F(xiàn)存的人源化小鼠模型提供了用于研究人類病原體感染的一種重要工具(DavisPH, Stanley SL, Jr. (2003)Cell Microbiol 5 :849-860 ；Bente DA, et al. (2005)J Virol79 :13797-13799 ；Islas-Ohlmayer M，et al. (2004) J Virol 78 :13891-13900 ；GuiradoE, et al. (2006)Microbes Infect 8 1252-1259 ；Kneteman NM, et al. (2006) Hepatology43 :1346-1353 Jiang Q, et al. (2008) Blood 112 :2858-2868)(尤其是感染人血譜系細胞的那些)。它們也開始允許在小型動物模型中研究針對病原體的人類免疫應(yīng)答。然而，目前可用的模型遠不是最佳的。例如，在不同的細胞譜系之間人類細胞重建的水平是顯著不同的。B細胞的重建是強勁的并且T細胞的重建是適當(dāng)?shù)模沁@些B細胞和T細胞都是無功能的。此外，NK細胞和髓系細胞的重建通常是較差的或不可檢出的。因此，對于人類免疫系統(tǒng)的改進的非人類模型以及制造它們的方法存在巨大的需求。發(fā)明概述在此所示的是，人類血細胞譜系被人類造血干細胞(HSC)的較差重建的主要是由于在該非人類哺乳動物體內(nèi)缺乏對于這些細胞譜系的發(fā)育和維持所必需的適當(dāng)?shù)娜祟惣毎蜃?。?dāng)將編碼人IL-15和Flt-3/Flk-2配體的質(zhì)粒DNA遞送到人源化小鼠體內(nèi)時(例如通過流體動力學(xué)尾靜脈注射)，人類細胞因子的表達持續(xù)2至3周，并且誘導(dǎo)出高水平的NK細胞持續(xù)一個月以上。細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞表達活化和抑制受體兩者，在體外殺死靶細胞，并且在體內(nèi)對病毒性感染強烈地應(yīng)答。類似地，人類GM-CSF和IL-4、巨噬細胞集落刺激因子、或促紅細胞生成素以及IL-3的表達對應(yīng)地導(dǎo)致樹突狀細胞、單核細胞/巨噬細胞、或紅細胞的重建顯著地增強(參見Chen, Q.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 106 21783-21788 (2009))，通過引用將其結(jié)合在此。而且，GM-CSF和IL-4增強了人類T細胞以及人類B細胞的重建。因此，使用人類細胞因子基因表達(例如通過流體動力學(xué)遞送)連同人類HSC—起是用于改善人源化小鼠體內(nèi)特異性人類血細胞譜系的重建的一種簡單且有效的方法，這為在小型動物模型體內(nèi)針對人類疾病以及它們的進展進行建模以及為針對人類免疫應(yīng)答進行研究提供了一種重要的工具。因此，在此提供了在非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血細胞譜系的方法，由此制造出一種人源化的非人類哺乳動物。在具體實施方案中，制造出多種人源化小鼠(humice)。一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血細胞譜系的方法，該方法包括將多種人類造血干細胞(HSC)以及編碼一種或多種人類細胞因子的一種(一種或多種)核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類血細胞譜系的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血細胞譜系。在另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類NK細胞的方法，該方法包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類NK細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成功能性人類NK細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此增強了在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類NK細胞的重建。在又另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類樹突狀細胞的方法，該方法包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此增強了在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些功能性人類樹突狀細胞的重建。在另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類單核細胞/巨噬細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類單核細胞/巨噬細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞。在另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類紅細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類紅細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類紅細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類紅細胞。在另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類T細胞和、人類B細胞的方法，該方法包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類T細胞和人類B細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類T細胞和人類B細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類T細胞和人類B細胞。另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)生產(chǎn)出針對一種免疫原的人類抗體的方法，該方法包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中這些人類細胞因子促進這類人類HSC分化成功能性人類T細胞以及功能性人類B細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類T細胞和功能性人類B細胞的條件下維持該非人類哺乳動物。用該免疫原免疫該非人類哺乳動物并且在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類B細胞生產(chǎn)出針對該免疫原的人類抗體的條件下進行維持，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)生產(chǎn)出針對該免疫原的人類抗體。生產(chǎn)出針對該免疫原的抗體的B細胞可以被進一步分離并且用于制造出雜交瘤，這些雜交瘤分泌出針對該免疫原的單克隆抗體。 分泌出單克隆抗體的雜交瘤以及由這些B細胞生產(chǎn)出的多種抗體(例如多克隆抗體、單克隆抗體)也被本發(fā)明包括。由在此提供的方法所制造的非人類哺乳動物也被本發(fā)明包括。在此說明的這些方法為在一種非人類哺乳動物體內(nèi)(例如,一種人源化小鼠)重建功能性人類血細胞譜系(例如，髓樣細胞、淋巴樣細胞)以及為在多種非人類哺乳動物體內(nèi)生產(chǎn)出人類抗體提供了一種簡單并且有效的方法。附圖簡要說明

圖1A-1B :在體外可以刺激來自humice的骨髓(BM)的人類⑶34+細胞分化成NK細胞。(圖1A)來自humice的BM的單核細胞(左)和用MACS的抗⑶34珠粒純化之后(右)的⑶34對⑶133染色圖的比較。顯示的事項是在人類⑶45+細胞上預(yù)選通。這些數(shù)字表示選通區(qū)中細胞的百分比。顯示來自四只小鼠之一的代表性數(shù)據(jù)。(圖1B)在缺少(對照)或存在IL-15和FL下培養(yǎng)7天的人類⑶34+細胞的NKp46對⑶56染色圖。這些數(shù)字表示⑶56+ NKp46+細胞的百分比。圖2 :流體動力學(xué)注射介導(dǎo)的基因遞送在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生一個全身性人類細胞因子環(huán)境。將表達人類IL-15和FL的pcDNA載體混合在一起(各50 μ g)并且流體動力學(xué)地注入humice體內(nèi)。在指示的時間點處(對于每個時間點η = 3)通過ELISA來分析小鼠血清中人類IL-15和FL的水平。圖3A-3C :在體內(nèi)IL-15和FL的表達刺激了人類NK細胞的發(fā)育。將空的pcDNA載體(對照)或表達IL-15和/或FL的pcDNA載體流體動力學(xué)地注入人源化的小鼠體內(nèi)。九天之后，從指示的組織中制備細胞并且針對人類⑶45、⑶3、以及⑶56進行染色。(圖3A)點狀圖顯示了在⑶45+細胞上⑶3對⑶56染色圖選通。這些數(shù)字表示選通區(qū)中⑶56+003_細胞的百分比。顯示來自每組五只小鼠之一的代表性數(shù)據(jù)。用三種不同供體HSC來構(gòu)建這些humice。(圖3B)在細胞因子基因遞送之后9天在不同器官的⑶45+人類白細胞中⑶56+CD3_NK細胞的頻率(平均值土SEM)的比較(η = 5)。(圖3C)血液中⑶45+人類白細胞中CD56+CD3_NK細胞的隨著時間的頻率(平均值土SEM) (η = 3)。圖4Α-4Ε :人類NK細胞是功能性的。(圖4Α)在humice體內(nèi)在腺病毒感染之后NK細胞介導(dǎo)肝損傷。細胞因子基因遞送之后九天，將PBS或復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad)流體動力學(xué)地注入這些humice體內(nèi)。在感染之后3天收集這些humice的肝進行H&E染色(每組η =3)。箭頭指示壞死區(qū)域以及白細胞滲透。對照，無細胞因子基因遞送的humice ;IL-15/FL，具有細胞因子基因遞送的humice。顯示放大率。(圖4B)血清中ALT水平的比較。在感染之后5天從腺病毒或PBS處理的humice體內(nèi)收集血清，并且檢測ALT活性(平均值土 SEM，每組η = 3)。IL-15/FL/Ad和其他組之間P < O. 05。(圖4C)腺病毒感染的humice體內(nèi)IFN- Y的血清水平。從腺病毒感染的humice體內(nèi)收集血清并且通過ELISA測量IFN- Y。顯示平均值土 SEM(每組η = 3)。P < O. 05。(圖4D)不同humice的肝中MNC的數(shù)量。在腺病毒感染之后5天收獲這些肝臟。對總肝臟MNC進行計數(shù)并且通過流式細胞術(shù)分析對人類⑶45+細胞的數(shù)量進行確定(平均值土SEM，每組η = 3)。IL-15/FL/Ad和其他組之間P < O. 05。(圖4Ε)將⑶56+人類NK細胞定位到肝臟中的損傷上。將肝組織包埋到石蠟中，切片，針對⑶56染色，并且通過顯微術(shù)進行分析。箭頭指示損傷區(qū)。顯示了來自三只小鼠之一的代表性圖像。圖5A-5C :通過對應(yīng)的人類細胞因子基因遞送來誘導(dǎo)特異性人血譜系細胞。(圖5Α)樹突狀細胞的增強的重建。用空的pcDNA載體或表達指示的人類細胞因子基因的pcDNA載體來流體動力學(xué)注射Humice。注射之后九天，從不同器官制備單細胞懸浮液，并且針對人類⑶45、⑶11c、以及CD209進行染色。顯示了在⑶45+人類細胞上⑶209對⑶Ilc染色圖選通。顯示了來自五只小鼠之一的代表性數(shù)據(jù)。(圖5B)單核細胞/巨噬細胞的增強的重建。進行與(圖5A)中相同的實驗，除了注射編碼M-CSF的pcDNA，并且將這些細胞針對人類⑶45和⑶14進行染色之外。顯示了在⑶45+人類細胞上⑶14對⑶45+染色圖選通。顯示了來自三只小鼠之一的代表性數(shù)據(jù)。(圖5C)紅細胞的增強的重建。進行與圖5A中相同的實驗，除了注射編碼EPO以及IL-3的pcDNA、并且在注射之后7天和30天針對人類⑶235ab將血液染色之外。顯示了全血細胞的⑶235ab對DAPI染色圖。顯示了來自三只小鼠之一的代表性數(shù)據(jù)。這些數(shù)字表示選通區(qū)中細胞的百分比。圖6A-6B :在人源化小鼠體內(nèi)人類NK細胞的重建。(圖6A)在HSC移入之后十二周，通過流式細胞術(shù)對外周血的單核細胞中人類細胞譜系的重建進行分析。點狀圖顯示在活的有核細胞上人類⑶45對小鼠⑶45選通的染色圖，或在⑶45+人類細胞上⑶3對⑶19，或CD14對CD56選通的染色圖。(圖6B)在一種人源化小鼠的血液、骨髓、脾、肺、以及肝中人類⑶45+細胞的⑶14對⑶56染色圖。這些數(shù)字表示選通區(qū)中這些細胞的百分比。顯示來自六只小鼠之一的代表性數(shù)據(jù)。圖7A-7B :當(dāng)用IL-2信號肽序列表達時循環(huán)中IL-15水平增加。(圖7A) IL-15表達載體的示意圖。將IL-15基因(具有其內(nèi)源性信號序列(SP)或IL-2SP)克隆到具有一個CMV啟動子的pcDNA載體中。(圖7B) IL-15的血清水平的比較。將空pcDNA載體(對照)、編碼IL-15的pcDNA載體、以及具有一個IL-2信號序列的編碼IL-15的pcDNA載體流體動力學(xué)地注入NSG小鼠體內(nèi)。注射之后七天，收集血清并且通過ELISA測定IL-15水平。圖8A-8G :在IL-15和FL表達之后人類細胞的數(shù)量增加。(圖8A-8G)將空pcDNA載體(對照)或表達IL-15和FL兩者的pcDNA載體流體動力學(xué)地注入人源化的小鼠體內(nèi)。九天之后，從這些指定的組織中制備細胞，并且針對人類⑶45加⑶3、⑶56、⑶14、⑶11c、⑶lc、ILT7、⑶303、以及⑶19進行染色。通過用總細胞數(shù)量乘以特定細胞類型的頻率來計算不同器官中人類CD45+白細胞、CD56+NK細胞、0)110+0)10+樹突狀細胞、ILT7+CD303+漿細胞樣樹突狀細胞、⑶14+單核細胞/巨噬細胞、⑶3+T細胞、以及⑶19+B細胞的絕對數(shù)量。顯示平均值土SEM (n = 3)。骨髓(BM)中細胞數(shù)量是來自兩個股骨。圖9 :在IL-15和FL處理的humice體內(nèi)人類NK細胞的細胞表面表型。在遞送IL-15和FL基因之后九天，從指示的器官中制備細胞，并且針對人類⑶45、⑶56加NKG2D、NKG2A、⑶7、⑶69、⑶94、NKp46、KIR、或⑶16進行染色。顯示了在⑶45+人類細胞上⑶56對NKG2D、NKG2A、⑶7、⑶69、⑶94、NKp46、KIR、或⑶16選通的染色圖。這些數(shù)字表示選通區(qū)中細胞的百分比。圖10A-10C :來自IL-15和FL處理的humice的人類NK細胞的細胞毒性和刺激作用。(圖10A)NK細胞是細胞溶解性的。在細胞因子基因遞送之后九天，從BM和脾中純化出人類NK細胞，在不同效應(yīng)物對靶物質(zhì)(E T)比率下與K562細胞混合，并且培養(yǎng)4小時。通過測量上清液中乳酸脫氫酶酶活性來確定NK細胞的細胞溶解活性。(圖10B)在體外聚(IC)刺激之后，NK細胞生產(chǎn)出IFN-γ。將純化的NK細胞(5x 105)單獨地，或在聚(I:C)(50yg/ml)存在下，或在聚(I:C)以及體外分化的人類DC (5x 105)存在下進行培養(yǎng)(參見材料與方法)。24小時之后通過ELISA分析上清液的人類IFN- Y。(圖10C)在體內(nèi)聚(IC)刺激之后，NK細胞生產(chǎn)出IFN-Y。用聚(I:C) (200pg/小鼠)靜脈注射humice。注射之后二十四小時，收集血清并且通過ELISA檢測人類IFN- Y (n = 4)。P < O. 05。圖11 :體外人類⑶34+細胞的分化。從humice的BM中純化出⑶34+人類細胞(左)并且在GM-CSF加IL-4、或M-CSF存在下培養(yǎng)7天，或EPO加IL-3培養(yǎng)20天。然后針對⑶45加⑶209和⑶11c、或⑶14和⑶33、或⑶235ab對這些細胞進行測定。顯示了針對⑶45+細胞的⑶209對⑶Ilc以及⑶14對⑶33染色圖。通過直方圖(粗線)顯示了⑶235ab表達。在無EPO和IL-3下培養(yǎng)的純⑶34+細胞用作對照(細線)。圖12A-12C :在人源化小鼠體內(nèi)在破傷風(fēng)類毒素疫苗免疫之后人類細胞增殖。(圖12A)免疫的實驗流程在第O天，用編碼人類GM-CSF和IL-4的質(zhì)?；蚩誴cDNA載體(載體)流體動力學(xué)地注射具有類似人類白細胞重建(50-80% )的12周齡的人源化小鼠。七天之后，用破傷風(fēng)類毒素(TT)將這些小鼠免疫三次。通過腹腔注射21. f.破傷風(fēng)類毒素疫苗進行初次免疫，緊接著以兩個三周間隔進行另外兩次增強。第二次增強之后兩周對這些小鼠進行分析。(圖12B)來自GM-CSF和IL-4處理小鼠的脾顯著地增大。(圖12C)不同humice的脾中單核細胞(MNC)的數(shù)量。在免疫之后收獲這些脾。對總脾MNC進行計數(shù)并且通過流式細胞術(shù)分析對人類⑶45+細胞的數(shù)量進行確定(平均值土 SEM，每組η = 3)。圖13 :在GM-CSF和IL_4處理的、TT免疫的humice體內(nèi)人類B細胞的細胞表面表型。從脾中制備這些細胞，并且針對人類⑶45、小鼠⑶45、⑶19加IgM、IgD、⑶10、⑶268、0)5、0)21、0)27、186、或0)20進行染色。顯示了在 CD45+人類細胞上 CD19 對 IgM、IgD、CD10、CD268、CD5、CD21、CD27、IgG、或 CD20 選通的染色圖。圖14 :在GM-CSF和IL_4處理的、TT免疫的humice體內(nèi)人類T細胞的細胞表面表型。從脾中制備這些細胞，并且針對人類⑶45、小鼠⑶45、⑶19加IgM、IgD、⑶10、⑶268、⑶5、⑶21、⑶27、IgG、或⑶20進行染色。顯示了在⑶45+人類細胞上⑶3對T細胞活化標(biāo)志物HLA-DR和CD40L選通染色圖。圖15A-15C :在TT免疫的humice體內(nèi)人類IgG、IgM和TT特異性人類IgG的血清水平。從TT免疫的humice體內(nèi)收集血清并且通過ELISA針對人類IgG、IgM以及TT特異性人類IgG進行測量。(圖15A)血清中人類總IgG。與載體處理的小鼠相比較，GMXSF+IL-4處理的小鼠產(chǎn)生顯著地更高的人類總IgG水平。(圖15B)血清中人類總IgM。GM_CSF+IL-4處理的小鼠也具有總?cè)祟怚gM的更高的血清水平。(圖15C)血清中人類TT特異性IgG。圖16A-16B :在細胞因子處理的小鼠體內(nèi)TT特異性人類T細胞應(yīng)答。在第三次免疫之后兩周，收獲脾并且通過流式細胞術(shù)確定人類T細胞的百分比。對于ELISP0T測定而言，將相同數(shù)量(5X 105)的來自不同樣品的人類T細胞接種到涂覆有抗人類IFN-Y或抗人類IL-4抗體的孔中并且在以下三種條件下培養(yǎng)24小時僅培養(yǎng)基(對照)、在PMA存在下或在TT特異性肽的存在下。將ELISP0T顯色。(圖16A)具有來自免疫小鼠脾細胞的代表性人類IFN- Y ELISP0T孔。(圖16B)具有來自免疫小鼠脾細胞的代表性人類IL-4ELISP0T孔。顯示的數(shù)據(jù)是來自二個獨立實驗之一。
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圖17 :將編碼人類 IL-15、FL、GM-CSF, IL-4 以及 M-CSF (各 50 μ g)的 DNA 質(zhì)粒的混合物溶于PBS中并且注入12周齡人源化小鼠體內(nèi)(η = 2)。七天之后，收集血清并且通過ELISA對這些人類細胞因子進行分析。發(fā)明詳細說明近來，在移入人類胎兒胸腺、肝、以及自體人類⑶34+細胞的NOD-scid小鼠(BLT小鼠)體內(nèi)已經(jīng)報道了人類樹突狀細胞(DC)和單核細胞/巨噬細胞的顯著重建(Wege AK,et al. (2008) Curr Top Microbiol Tmmunol 324:149-165)。在 BLT 小鼠體內(nèi)仍然不存在人類NK細胞。因為NK細胞和髓樣細胞在先天免疫應(yīng)答中起重要作用，開發(fā)具有這些細胞類型足夠水平重建的人類非人類哺乳動物，例如人源化小鼠，對于了解人源化小鼠模型在傳染性疾病研究和涉及血譜系細胞的其他研究(例如，血液學(xué)疾病研究，例如貧血、免疫缺陷、癌)中的全部潛力是關(guān)鍵性的。全血細胞譜系是從常規(guī)人造血干細胞(HSC)衍生的。在它們的分化和維持期間細胞因子起到重要作用。例如，NK細胞的發(fā)育和存活需要IL-15 (Mrozek E, et al. (1996)Blood 87 =2632-2640)，樹突狀細胞(DC)發(fā)育需要 GM-CSF 和 IL-4 (Rosenzwajg M, etal. (1996)Blood 87 :535-544)，單核細胞/巨噬細胞發(fā)育和維持需要巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF) (Stec M, et al. (2007) J Leukoc Biol 82 :594-602)，并且紅細胞(EPO)發(fā)育需要促紅細胞生成素(EPO)和 IL-3 (Giarratana MC, et al. (2005) Nat Biotechnol 23:69-74)。然而，由于人類和小鼠之間進化趨異，這些細胞因子是種特異性的(即小鼠細胞因子在人類細胞中不起作用)。例如，小鼠IL-15對人類NK細胞以及前體沒有作用(EisenmanJ，et al. (2002)Cytokine 20 :121-129)，這導(dǎo)致在humice體內(nèi)人類NK細胞較差的重建(Huntington ND, et al. (2009) J Exp Med 206 :25-34 ；Kalberer CP, et al. (2003) Blood102 :127-135)。類似地，已經(jīng)報道小鼠 GM-CSF、IL-4 (Metcalf D (1986) Blood 67 :257-267 ；Mosmann TR,et al. (1987)J Immunol 138 :1813-1816)、M_CSF(Fixe P,Praloran V(1997)Eur Cytokine Netw 8:125-136)以及 IL-3 (Stevenson LM, Jones DG (1994) J Comp Pathol111 :99-106)在人類細胞上都不起作用。研究了在humice體內(nèi)NK細胞和髓樣細胞的較差重建和功能是否是由于缺少特異性人類細胞因子。在此所述的是用于確定重建小鼠體內(nèi)人類細胞因子的表達是否刺激特定的人血譜系細胞的分化、存活、以及功能的實驗。這種研究導(dǎo)致開發(fā)出一種簡單并且有效的方法從而使用人源化小鼠在作為舉例的人源化非人類哺乳動物體內(nèi)改善特異性人血譜系細胞的重建。當(dāng)遞送編碼人類IL-15和Flt-3/Flk-2配體(FL)的核酸時，在humice循環(huán)中檢測出特異性人類細胞因子持續(xù)2至3周。其結(jié)果是，在不同器官中觀察到顯著提高 數(shù)量的人類NK細胞持續(xù)一個月以上。在體外和體內(nèi)細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞是全功能的。使用同樣策略，在humice體內(nèi)還大大增強了人類樹突狀細胞、單核細胞/巨噬細胞、以及紅細胞的重建水平。在此所述的研究證明在人源化小鼠的現(xiàn)有模型中NK細胞和髓樣細胞的較差重建是由于缺少它們的分化和維持所需要的適當(dāng)?shù)娜祟惣毎蜃?，并且證明人類細胞因子基因的遞送(例如流體動力學(xué)地遞送)是用于克服這些細胞譜系的較差重建的一種簡單并且有效的方法。因此，本發(fā)明一方面針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血譜系細胞(例如，一種單一人血譜系細胞(例如，NK細胞)；多重人血譜系細胞(例如，NK細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞等)，并且在一些實施方案中，全人血譜系細胞)的一種方法。在這個實施方案中，將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到該非人類哺乳動物體內(nèi)。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且用人類HSC來重建該非人類哺乳動物的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建人類造血干細胞(HSC)。如在此使用的，HSC(例如人類HSC)是自身更新的干細胞，當(dāng)移入受體體內(nèi)時，這些干細胞能夠“再生”或“重建”移植受體(例如，非人類哺乳動物；免疫缺陷型非人類哺乳動物)的造血系統(tǒng)并且在受體體內(nèi)維持(例如長期地)造血細胞生成。HSC是產(chǎn)生(分化成)多種血細胞類型的多能性干細胞，這些細胞類型包括髓樣細胞(例如，單核細胞和巨噬細胞、嗜中性細胞、嗜堿性細胞、嗜酸性細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板、樹突狀細胞)以及淋巴樣譜系(例如，T-細胞、B-細胞、NK-細胞)。如在此所述的方法中所示,重建的人類HSC可以在該非人類哺乳動物體內(nèi)分化成人類NK細胞、人類單核細胞、人類巨噬細胞、人類樹突狀細胞、人類紅細胞、人類B細胞、人類T細胞或它們的組合。HSC表達細胞標(biāo)記物⑶34，并且通常被稱為“⑶34+”。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，HSC還可以表達其他細胞標(biāo)記物，例如⑶133和/或⑶90( “⑶133+”，“⑶90+”)。在一些實例中，HSC特征在于不被表達的標(biāo)記物，例如⑶38。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，在此所述的方法中使用的人類HSC是CD34+、CD90+、CD133+、CD34+CD38-、CD34+CD90+、CD34+CD133+CD38-、CD133+CD38-、CD133+CD90+CD38-、CD34+CD133+CD90+CD38-、或它們的任何組合。在一個具體實施方案中，這些HSC是⑶34 ( “CD34+”) CD 133+( “⑶133+”)兩者，在此也稱為“雙陽性”或“DP”細胞或“DPC”。在另一個實施方案中，這些HSC是⑶34+⑶133+，并且可以進一步包括⑶38-和/或⑶90+。HSC被發(fā)現(xiàn)于骨髓中，例如在供體(例如，脊椎動物，例如哺乳動物，包括人類、靈長類、豬、小鼠等)的股骨、髖骨、肋骨、胸骨、以及其他骨骼中。用于臨床和科學(xué)用途的HSC的其他來源包括臍帶血、胎盤、胎兒肝臟、動員的外周血、非動員的(或未動員的)外周血、胎兒肝臟、胎兒脾臟、胚胎干細胞、以及主動脈-性腺-中腎(AGM)、或它們的一種組合。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)理解的，動員的外周血是指富含HSC(例如，⑶34+細胞)的外周血。施用多種試劑(例如化療和/或G-CSF)將干細胞從骨髓動員到外周循環(huán)中。例如，施用粒細胞集落刺激因子(G-CSF)持續(xù)至少或大致5天將CD34+細胞動員到外周血中。觀察到循環(huán)的⑶34+細胞富集30倍，峰值出現(xiàn)在開始施用G-CSF之后第5天。在不動員外周血的情況下，循環(huán)的CD34+細胞的數(shù)量非常低，估計在全部單核血細胞的0.01%至O. 05%之間。可以從單個或多個供體體內(nèi)得到用于這些方法的人類HSC。此外，在此說明的方法中使用的HSC可以是新鮮分離的HSC、深冷保存的HSCS、或它們的一種組合。如本領(lǐng)域已知的，可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法從這些來源中得到HSC。例如，可以在用細胞因子(例如，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，該因子誘導(dǎo)細胞從骨髓小室中釋放)預(yù)治療供體之后通過使用針和注射器從骨髓中取出(例如髖骨、股骨等中)，或從血液中取出而直接地得到HSC。 在將HSC引入該非人類哺乳動物體內(nèi)之前，能夠以得到的(例如，未展開)或操作的(例如展開)形式將用于本發(fā)明方法中的HSC直接引入該非人類哺乳動物體內(nèi)。在一個實施方案中，在將HSC引入該非人類哺乳動物體內(nèi)之前該HSC被擴展。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)理解的，有多種方法可以用于擴展HSC(參見例如，Zhang, Y.，etal.，Tissue Engineering,12 (8) :2161-2170(2006) ；Zhang CC, et al.，Blood,111 (7)3415-3423 (2008)) 0在一個具體實施方案中，可以通過在生長因子(例如血管生成素樣5 (Angp115)生長因子、IGF結(jié)合蛋白2 (IGFBP2)、干細胞因子(SCF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板生成素(TPO)、或它們的一種組合)的存在下將HSC與間充質(zhì)干細胞(MSC)共同培養(yǎng)以產(chǎn)生一種細胞培養(yǎng)物而擴展HSC的一個群體。在其中生產(chǎn)HSC的一個擴展的群體的條件下(參見，例如 Maroun, K.，et al.，ISSCR, 7th Annual Meeting, AbstractNo. 1401 (July 8-11, 2009) Attorney Docket No. 4471. 1000-001，于 2010 年 5 月 28 日提交
的作為_公開的PCT申請PCT/US2010/036664，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)維
持該細胞培養(yǎng)物。在此所述的方法中，還將編碼一種或多種人類細胞因子的一種(一種或多種)核酸(例如DNA，RNA)引入該非人類哺乳動物體內(nèi)從而誘導(dǎo)這些人類HSC分化成功能性人類細胞。如本領(lǐng)域已知的，這些細胞因子是刺激或抑制免疫細胞分化、增殖或功能的蛋白。本領(lǐng)域還已知的是多種人類細胞因子的核酸序列(參見,例如WWW. ncbi. nlm. nih. gov)。用于得到編碼一種或多種細胞因子的核酸的方法是本領(lǐng)域常規(guī)方法并且包括從多種來源中(例如血清)分離該核酸(例如克隆)、重組地生產(chǎn)該核酸或從商業(yè)來源得到該核酸。存在可以用于本發(fā)明方法中的多種人類細胞因子。這類人類細胞因子的實例包括白細胞介素-12 (IL-12)、白細胞介素-15 (IL-15)、Ems-相關(guān)酪氨酸激酶3配體(Flt3L)、Flt3L/Flk2配體(FL)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4 (IL-4)、白細胞介素-3 (IL-3)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(EPO)以及它們的一種組合。用于在此所述方法中的其他適當(dāng)?shù)募毎蜃拥膶嵗杏诒碇小Ｒ朐摲侨祟惒溉閯游矬w內(nèi)的細胞因子的類型和細胞因子的數(shù)量將取決于當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)發(fā)生人類HSC分化時哪種人類血細胞譜系將被重建。例如，如實例I中所示，當(dāng)將編碼人類IL-15和Flt-3/Flk-2配體的核酸引入人源化小鼠體內(nèi)時(例如通過流體動力學(xué)尾靜脈注射)，人類細胞因子的表達持續(xù)2至3周并且誘導(dǎo)人類NK細胞水平升高持續(xù)一個月以上。細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞表達活化和抑制受體兩者，在體外殺死靶細胞，并且在體內(nèi)對病毒性感染強烈地應(yīng)答。類似地，人類GM-CSF和IL-4的表達導(dǎo)致人類樹突狀細胞的重建顯著增強；巨噬細胞集落刺激因子的表達導(dǎo)致人類單核細胞/巨噬細胞的重建顯著增強；并且促紅細胞生成素以及IL-3的表達導(dǎo)致人類紅細胞的重建顯著增強(參見Chen，Q. , et al. ,Proc.Natl. Acad. Sci.，USA, 106 :21783-21788 (2009)，通過引用將其結(jié)合在此)。如在實例2中所示，GM-CSF和IL-4的表達增強了功能性人類T細胞和人類B細胞的重建。在一些方面，將至少(包括)一種細胞因子、至少2種細胞因子、至少3種細胞因子、至少4種細胞因子、至少5種細胞因子、至少6種細胞因子、至少7種細胞因子、至少8種細胞因子、至少9種細胞因子、至少10種細胞因子、至少11種細胞因子、至少12種細胞因子、至少13種細胞因子、至少14種細胞因子、至少15種細 胞因子、至少16種細胞因子、至少17種細胞因子、至少18種細胞因子、至少19種細胞因子、或至少20種細胞因子引入該非人類哺乳動物體內(nèi)。在其他方面，將僅(組成為，基本上組成為)一種細胞因子、2種細胞因子、3種細胞因子、4種細胞因子、5種細胞因子、6種細胞因子、7種細胞因子、8種細胞因子、9種細胞因子、10種細胞因子、11種細胞因子、12種細胞因子、13種細胞因子、14種細胞因子、15種細胞因子、16種細胞因子、17種細胞因子、18種細胞因子、19種細胞因子、或20種細胞因子引入到該非人類哺乳動物體內(nèi)。可以將編碼各人類細胞因子的核酸同時地或依次地引入(例如，在其中多于一種細胞因子將被表達于該非人類哺乳動物體內(nèi)的情況下，可以將編碼各細胞因子的各核酸在它自己的單一的質(zhì)粒或載體中引入，或可以在多個質(zhì)粒或載體中引入，可替代地，可以將有待引入的編碼這些細胞因子的所有核酸在一個單一質(zhì)粒或載體中引入)。在本發(fā)明的方法中，將HSC和編碼一種或多種細胞因子的核酸引入到一種非人類哺乳動物體內(nèi)。如在此使用的，術(shù)語“哺乳動物”以及“哺乳動物”指的是包括單孔類動物、有袋類動物以及胎盤類動物的任何脊椎動物，這類動物哺乳它們的幼體并且或者產(chǎn)下活的幼體(真哺乳亞綱或有胎盤哺乳動物)亦或產(chǎn)蛋(后獸亞綱的動物或無胎盤哺乳動物)?？梢杂糜谠诖苏f明的方法中的哺乳動物物種的實例包括非人類靈長類(例如，猴類、猩猩)、嚙齒類(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)、犬類、貓類、以及反芻動物(例如，牛、豬、馬)。在一個實施方案中，該非人類哺乳動物是一個小鼠。在此所述的方法中使用的非人類哺乳動物可以是成年的、新生的(例如< 48小時齡；幼小動物)、或在子宮中。在具體實施方案中，該非人類哺乳動物是一種免疫缺陷型非人類哺乳動物，即在其免疫系統(tǒng)中具有一種或多種缺陷的一種非人類哺乳動物(例如，NSG或NOD scidY (NOD. Cg-Prkdcscid I12rgtml Wjl/SzJ)小鼠)，并且，結(jié)果是當(dāng)將人類HDC引入時允許重建人類血細胞譜系。例如，這種非人類哺乳動物缺少其自身的T細胞、B細胞、NK細胞或它們的一種組合。在具體實施方案中，該非人類哺乳動物是一種免疫缺陷型小鼠，例如一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變并且缺少針對細胞因子受體Y鏈的一種基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scidIL2Ry-/-小鼠)；以及一種 Balb/c rag-/-Y c_/_ 小鼠。免疫缺陷型小鼠的其他具體實例包括但不限于重度聯(lián)合免疫缺陷癥(scid)小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)-scid小鼠、IL2rg+小鼠(例如，NOD/LySz-scid IL2rg+小鼠、NOD/Shi-scid IL2rg+小鼠(NOG 小鼠)、BALB/c_ Rag+IL2rg+小鼠、H2d-Rag+IL2rg+小鼠)、N0D/Rag+IL2rg+ 小鼠。在一些實施方案中，在引入人類HSC和編該一種或多種人類細胞因子的核酸(例如用于進一步增強人類HSC的重建)之前，對該非人類哺乳動物進行治療或處理。例如，可以對該非人類哺乳動物進行處理以進一步增強人類HSC的移入和/或重建。在一個實施方案中，在引入這些HSC以及編碼該一種或多種細胞因子的核酸之前，對該非人類哺乳動物進行照射。在另一個實施方案中，在引入這些HSC以及編碼該一種或多種細胞因子的核酸之前，將一種或多種化療劑施用到該非人類哺乳動物體內(nèi)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解的，有多種方法來將HSC和編碼這些細胞因子的核酸引入到一種非人類哺乳動物體內(nèi)。這類方法的實例包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)、股內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、心內(nèi)、肝內(nèi)、骨髓內(nèi)、皮下、局部、口服以及鼻內(nèi)途徑的給藥。其他適當(dāng)?shù)囊敕椒ㄟ€可以包括子宮內(nèi)注射、流體動力學(xué)基因送遞、基因治療、可再充電的或生物可降解的設(shè)備、顆粒加速設(shè)備(“基因槍”)以及緩釋聚合物設(shè)備。 可以使用任何一種這類給藥途徑或類似途徑將HSC引入非人類動物體內(nèi)。在一個具體實施方案中，將HSC心內(nèi)地注入該非人類哺乳動物體內(nèi)。還可以使用任何一種這類給藥途徑將編碼該一種或多種細胞因子的核酸引入，只要該一種或多種核酸表達于該非人類哺乳動物體內(nèi)即可。例如，編碼該一種或多種細胞因子的核酸可以以裸核酸(裸DNA)形式、在質(zhì)粒(例如，pcDNA3. 1(+))中或在病毒載體中(例如，腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)引入。在一個具體實施方案中，使用流體動力學(xué)注射將編碼該一種或多種細胞因子的核酸引入到一種質(zhì)粒中(例如進入一種非人類哺乳動物的尾靜脈中)?？梢詫⑦@些HSC和編碼該一種或多種細胞因子的核酸同時地或依次地引入，并且如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)理解的，這將取決于多種因素，例如所使用的非人類哺乳動物的類型、所表達的細胞因子以及當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)發(fā)生人類HSC分化時哪種人血譜系細胞將被表達和/或增強。在一個具體實施方案中，將這些HSC引入新生幼小動物體內(nèi)(例如約48小時齡)，并且在約I個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月之后，將編碼這些細胞因子的核酸引入。一旦將這些HSC和編碼該一種或多種細胞因子的核酸引入，在其中該核酸被表達并且用HSC重建該非人類動物的條件下維持該非人類哺乳動物。在其下維持本發(fā)明的非人類動物的這類條件包括滿足如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的該哺乳動物的基本需要(例如，食物、/K、光)。在此所述的方法可以進一步包括確定該核酸是否被表達，該人類HSC是否存在和/或該人類HSC是否已經(jīng)分化成一種或多種人血譜系細胞。在此提供了用于確定該核酸是否被表達和/或該非人類動物是否被HSC重建的方法，并且這對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是熟知的。例如，使用對人類HSC的表面細胞標(biāo)志物具有特異性的抗體的流式細胞術(shù)分析可以用于檢測在該非人類哺乳動物體內(nèi)人類HSC的存在。此外，可以從該非人類哺乳動物體內(nèi)收集血清并且針對人類細胞因子的存在進行測定。還可以使用多種測定法對分化的HSC(例如，NK細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞、單核細胞/巨噬細胞、紅細胞)的功能進行評估。在此還說明了這類測定法并且這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如，如在此說明的，在一個體外測定中(乳酸脫氫酶測定)細胞因子誘導(dǎo)的人類NK細胞殺死靶細胞并且對體內(nèi)病毒性感染強烈地應(yīng)答。能夠以多種方式使用通過遞送編碼一種或多種人類細胞因子基因的核酸而在非人類哺乳動物體內(nèi)(例如人源化小鼠)重建一種或多種人血細胞譜系的能力。例如，一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類NK細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類NK細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成功能性人類NK細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建了功能性人類NK細胞。在一個具體實施方案中，編碼該一種或多種 細胞因子的核酸編碼人類IL-15和人類Flt-3/Flk-2配體。在另一個實施方案中，該非人類哺乳動物的外周血中約3%至約25%的白細胞是人類NK細胞(例如，功能性NK細胞)。在其他實施方案中，該非人類哺乳動物的外周血中約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、約 13%、約 14%、約 15%、約 16%、約 17%、約 18%、約 19%、約 20%、約 21%、約 22%、約 23%、約24%、或約25%的白細胞是人類NK細胞。在另外的其他實施方案中，將人類NK細胞(例如功能性NK細胞)的表達維持(并且在一些情況下，增強，與例如一個適當(dāng)?shù)膶φ障啾容^)約I天至約30天，并且在具體實施方案中，將人類NK細胞的表達維持約I天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天、或約31天。在一些實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類NK細胞表達一種或多種，并且在一些情況下，表達全部的這些在人體中發(fā)現(xiàn)的正常的(野生型)NK細胞的細胞表面標(biāo)志物。這樣的表達表明這些人類NK細胞在該非人類哺乳動物體內(nèi)確實是功能性的。例如在一個實施方案中，這些人類NK細胞是⑶56+NK細胞。在其他實施方案中，這些人類NK細胞表達 NKG2D、NKG2A、CD94、KIR、NKp46、CD7、CD69、Cdl6,或它們的組合。在另外的其他實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類NK細胞能夠殺死靶細胞并且當(dāng)適當(dāng)刺激時能夠表達IFN-Y (例如，一種Toll-樣受體3激動劑聚(I:C)、人類樹突狀細胞、腺病毒)。在另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類樹突狀細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建了這些人類樹突狀細胞。在一個具體實施方案中，編碼該一種或多種細胞因子的核酸編碼人類GM-CSF和人類IL-4。在另一個實施方案中，編碼該一種或多種細胞因子的核酸編碼人類GM-CSF、人類IL-4以及人類Flt-3/Flk-2配體。在其他實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類樹突狀細胞表達一種或多種，并且在一些情況下，表達全部的這些在人體中發(fā)現(xiàn)的正常的(野生型)樹突狀細胞的細胞表面標(biāo)志物。在一個實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)的人類樹突狀細胞是⑶Ilc+⑶209髓樣樹突狀細胞(例如，表達于血液、脾、骨髓、肺、肝中)、ILT7+⑶303+漿細胞樣樹突狀細胞或它們的一種組合。在另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類單核細胞/巨噬細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類單核細胞/巨噬細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞。在一個具體實施方案中，編碼該一種或多種細胞因子的核酸編碼人類巨噬細胞集落刺激因子。在其他實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類單核細胞/巨噬細胞表達 一種或多種，并且在一些情況下，表達全部的這些在人體中發(fā)現(xiàn)的正常的(野生型)單核細胞/巨噬細胞的細胞表面標(biāo)志物。在一個實施方案中，這些人類單核細胞/巨噬細胞表達CD14+。在另一方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類紅細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類紅細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類紅細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類紅細胞。在一個具體實施方案中，編碼該一種或多種細胞因子的核酸編碼人類促紅細胞生成素以及IL-3。在其他實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類紅細胞表達一種或多種，并且在一些情況下，表達全部的這些在人體中發(fā)現(xiàn)的正常的(野生型)紅細胞的細胞表面標(biāo)志物。在一個實施方案中，這些人類紅細胞表達⑶235ab+。在另外的其他實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)的人類紅細胞構(gòu)成該非人類哺乳動物體內(nèi)全部紅細胞的約I %至約10 %，或約3 %至約5 %。在具體實施方案中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)的人類紅細胞構(gòu)成該非人類哺乳動物體內(nèi)全部紅細胞的約I %、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%。在一個具體方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類T細胞和人類B細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類T細胞和人類B細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類T細胞和人類B細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類T細胞和人類B細胞。在一個具體實施方案中，編碼該一種或多種細胞因子的核酸編碼GM-CSF和IL-4。該方法可以進一步包括用一種免疫原免疫該非人類哺乳動物，并且在其中該非人類哺乳動物生產(chǎn)針對該免疫原的人類抗體的條件下維持該非人類動物。
在又另一個具體方面，本發(fā)明是針對在一種非人類哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生針對一種免疫原的人類抗體的一種方法。在這種方法中，將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種非人類哺乳動物體內(nèi)，其中這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類T細胞和人類B細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些HSC分化成多種功能性人類T細胞和人類B細胞的條件下維持該非人類哺乳動物。用該免疫原免疫該非人類哺乳動物并且在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類B細胞生產(chǎn)出針對該免疫原的人類抗體的條件下進行維持，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)生產(chǎn)出針對該免疫原的人類抗體。在一個具體實施方案中，編碼該一種或多種細胞因子的核酸編碼 GM-CSF 和 IL-4。如本領(lǐng)域已知的，“免疫原”是能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并且促進抗體生產(chǎn)的一種物質(zhì)。用于這些方法中的多種免疫原是本領(lǐng)域已知的。例如，該免疫原可以是下面各項的全部或一個免疫原性部分來自人類或其他物種的一種蛋白、一種細胞表面蛋白(例如正常的或疾病細胞的，例如腫瘤細胞)、一種生物體(例如,一種生物體的免疫原性部分包括生物體 的衣殼、莢膜、細胞壁、鞭毛、纖毛、以及毒素)、一種病毒蛋白、一種細菌蛋白、一種毒素、一種多糖、一種脂蛋白、一種修飾的蛋白(例如，乙?；?、甲基化的、糖基化的)、一種核酸(例如，DNA、RNA當(dāng)與一種肽、蛋白或多糖結(jié)合時)、一種化學(xué)表位，等等。這種方法可以進一步包括從該非人類哺乳動物體內(nèi)分離生產(chǎn)該人類抗體的人類B細胞。從一種非人類哺乳動物體內(nèi)分離B細胞的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，使用流式細胞計量術(shù)的細胞分選或基于對B細胞特異性蛋白具有特異性的抗體的磁性純化(例如，參見Current Protocols in Immunology,Copyright 2010 by John Wiley and Sons,Inc.ed. John E. Coligan et al.)。如本領(lǐng)域已知的，“抗體”或“免疫球蛋白”是B細胞產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)的蛋白組分，它在血液中循環(huán)識別免疫原例如細囷和病毒，并且將它們中和。在暴露于一種免疫原之后，這些抗體在血液中繼續(xù)循環(huán)，針對未來暴露于該抗原提供保護。使用在此所述的方法可以得到由人類B細胞生產(chǎn)的任何類型的抗體。這些單克隆抗體可以是多克隆或單克隆抗體。這類抗體的實例是本領(lǐng)域熟知的并且包括IgG(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgD以及 IgA。這些方法可以進一步包括將分離的人類B細胞與無限增殖的細胞接觸，由此生成一種組合；并且在其中這些人類B細胞以及這些無限增殖的細胞融合從而形成一種雜交瘤的條件下維持該組合，該雜交瘤生產(chǎn)針對該免疫原的單克隆抗體。如本領(lǐng)域已知的，在免疫之后適當(dāng)時間，例如當(dāng)抗體滴度最高時,可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如由Kohler and Milstein,Nature 256 :495-497 (1975)最初說明的雜交瘤技術(shù)、人類B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al. , Tmmunol. Today 4 :72 (1983))、EBV雜交瘤技術(shù)(Cole etal. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96(1985))或三源雜交瘤技術(shù)從該受試者體內(nèi)得到生產(chǎn)抗體的細胞并且用于制備單克隆抗體。用于生產(chǎn)雜交瘤的技術(shù)是熟知的(通常參見Current Protocols in Immunology, Coligan etal.， (eds. ) John Wiley & Sons, Inc.，New York, NY(1994))。簡言之，將一種無限增殖細胞系(典型地一種骨髓瘤)融合到來自用上述免疫原免疫的哺乳動物的淋巴細胞上(典型地脾細胞)，并且對得到的雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上清液進行篩選以鑒別生產(chǎn)一種單克隆抗體的雜交瘤，該單克隆抗體結(jié)合本發(fā)明的一種多肽。用于融合淋巴細胞和無限增殖化細胞系的多種熟知的科學(xué)計劃中任何一種可以用于產(chǎn)生針對一種免疫原的單克隆抗體的目的(參見，例如，Current Protocolsin Immunology, supra ；Galfre et al. , Nature,266 :55052(1977) ；R. H. Kenneth, inMonoclonal Antibodies A New Dimension In Biological Analyses,Plenum PublishingCorp. , New York, New York(1980) ；and Lerner, Yale J. Biol. Med. 54 :387-402(1981))。而且，普通技術(shù)工作者應(yīng)當(dāng)理解的是存在這類方法的多種變體以及可以用于得到由人類B細胞產(chǎn)生的抗體的其他方法。例如，可以使用已知技術(shù)對編碼由這些人類B細胞表達的人類抗體的全部或一個功能性部分的序列進行克隆。典型地，該方法涉及分離抗原特異性B細胞(例如用熒光染色標(biāo)記的抗原染色，通過流式細胞儀分選)并且使用簡并引物和單細胞聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增抗體基因的VDJ部分。將抗體基因的克隆的和測序的VDJ部分與恒定區(qū)基因片段結(jié)合從而在細胞系例如一種CHO細胞系中生產(chǎn)出抗體(例如，參見，Hahn，S.，et al.，Cell Mo I. Life Sci. (2000) ,57(1) :96-105)。 用于生產(chǎn)和/或分離由該非人類哺乳動物生產(chǎn)的人類抗體的方法的另一個實例包括病毒地?zé)o限增殖這些人類B細胞。在這種方法中，可以使用例如愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)或修飾的EBV來無限增殖B細胞(例如，參見Lanzavecchia, A. , Curr. opin.Biotechnol. (2007)18(6) :523-528)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)理解的，除了細胞因子之外，其他蛋白(例如人類蛋白、人類分泌性蛋白)，例如生長因子、類固醇、和/或小分子的表達可以用在用于改善血譜系細胞之外人類細胞的重建和/或功能的方法中。例如，可以將一種或多種人類細胞因子的激動劑引入該非人類哺乳動物體內(nèi)以增強HSC的重建。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)理解的，“功能性(或“生物活性”或“成熟的”)人類NK細胞”，“功能性人類樹突狀細胞”、“功能性人類單核細胞/巨噬細胞”、“功能性人類紅細胞”、“功能性人類T細胞”以及“功能性人類B細胞”都是指以下事實，即分化的細胞(無論人類NK細胞、人類樹突狀細胞、人類單核細胞/巨噬細胞、人類紅細胞、人類T細胞還是人類B細胞)表達一種或多種，并且在一些情況下，表達全部的這些在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的對應(yīng)的正常(野生型)細胞的細胞表面標(biāo)志物，并且其結(jié)果是，在該非人類哺乳動物體內(nèi)與它們在人體中的情況類似地起作用。用于確定人血譜系細胞在非人類哺乳動物體內(nèi)功能的測定法對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是已知的并且在此進行說明。例如，可以使用已知NK細胞毒性測定法來確定在非人類哺乳動物體內(nèi)這些NK細胞的功能。在本發(fā)明的某些方面中，在該非人類哺乳動物體內(nèi)增強了人類血細胞譜系和/或一種特定人類細胞譜系(例如NK細胞、樹突狀細胞、單核細胞/巨噬細胞、血細胞、T細胞、B細胞)的重建。增強的重建是指例如與適當(dāng)?shù)膶φ障啾容^，細胞類型的增強表達(例如，該一種或多種人類血譜系細胞的數(shù)量增加；表達的細胞類型在時間方面增加(例如> 30天))。這類對照是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所清楚的。適當(dāng)?shù)膶φ盏囊粋€實例是已經(jīng)將人類HSC而沒有將編碼一種或多種細胞因子的核酸引入其中的一種非人類哺乳動物。本發(fā)明的其他方面包括多種組合物。一方面，本發(fā)明包括通過在此所述方法制造的非人類動物。
在其他方面，本發(fā)明包括通過在此所述的方法制造的雜交瘤(分離的雜交瘤)以及通過這些雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體(分離的單克隆抗體)。如在此使用的，“分離的”(例如“分離的B細胞”、“分離的淋巴瘤”、“分離的單克隆抗體”)是指相對于它天然存在于其中的復(fù)雜的(例如細胞的)環(huán)境或器官、身體、組織、血液、或培養(yǎng)基而言，基本上分離的。在一些實例中，該分離的物質(zhì)將形成組合物(例如，包含其他物質(zhì)的粗提取物)、緩沖液系統(tǒng)、培養(yǎng)系統(tǒng)或試劑混合物的一部分。在其他情況下，可以將該物質(zhì)純化到基本上均質(zhì)性的。一個分離的B細胞群可以構(gòu)成存在的全部細胞的至少約50 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、或至少約99 % (以總細胞數(shù)量計)。在一個實施方案中，本發(fā)明是針對通過在此所述方法生產(chǎn)的分離的、或基本上分離的(或純化的、基本上純化的)B細胞、淋巴瘤和/或單克隆抗體。
因此，如在此所示，在人源化小鼠體內(nèi)觀察到的較差的人體先天和適應(yīng)性應(yīng)答的主要原因是由于特定人類血譜系細胞的低水平重建，和/或特定人血細胞譜系的較差的功能性成熟，是由于在重建小鼠體內(nèi)缺乏適當(dāng)?shù)娜祟惣毎蜃颖磉_。在此所述的是一種有效的并且多用途方法用來在重建的非人類哺乳動物體內(nèi)(例如小鼠)表達各種人類細胞因子并且在得到的非人類哺乳動物體內(nèi)顯著地提高人血譜系細胞的重建。為了在該非人類哺乳動物體內(nèi)表達人類細胞因子，使用流體動力學(xué)注射將編碼這些人類細胞因子的DNA載體引入到該哺乳動物體內(nèi)(例如，在7秒鐘內(nèi)10%體重)。在這個實施方案中，所注射的DNA中的一些被肝細胞吸收，導(dǎo)致在小鼠體內(nèi)表達人類細胞因子。通過以這種方式引入編碼人類細胞因子的核酸，改善了特定人細胞亞群的發(fā)育，這導(dǎo)致人類細胞和免疫應(yīng)答的數(shù)量增加。具體地說，將人類細胞因子克隆到一種載體中。單獨地將工程化的人類白細胞介素15(IL-15)和Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(Flt3L)基因克隆到pcDNA3. I (+)載體中。使用pcDNA3. I (+)質(zhì)粒作為載體用于體內(nèi)基因遞送。對于體內(nèi)NK細胞誘導(dǎo)而言，構(gòu)建了 pcDNA-IL2/IL15和pcDNA_Flt3L質(zhì)粒。簡言之，用人類IL-2信號肽序列替換人類IL-15的信號肽序列，因為IL-15的信號肽是非常長的(48aa)并且它限制了 IL-15的分泌。使用早作用細胞因子flt3配體(FL)來增加應(yīng)答IL-15的NK細胞前體的頻率。將這兩種重組體基因序列插入pcDNA3. 1(+)載體中。通過基于流體動力學(xué)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)通過將大量溶液通過尾靜脈快速注射將質(zhì)粒施用于小鼠體內(nèi)。簡言之，在7秒鐘內(nèi)用I. 8ml鹽水中50 μ g每質(zhì)粒靜脈注射8至12周齡人源化小鼠。在注射之后第7天通過尾靜脈對這些小鼠放血從而主要地分析血液中人類免疫細胞的重建。然后在第9天和第16天將一些小鼠處死用來分析肝、肺、脾、骨髓以及淋巴結(jié)中人類細胞重建的動力學(xué)。在不同時間點收集血清從而通過ELISA來分析循環(huán)的血液中人類細胞因子水平。在流體動力學(xué)注射之后，在血清中檢測出顯著水平的IL-15和Flt3L持續(xù)2_3周。相應(yīng)地，在血液、脾、骨髓、肺以及肝中CD56+CD3_人類自然殺傷(NK)細胞的重建顯著地增加到比得上在人體器官中所觀察到的水平。在所有這些器官中CD45+人類細胞的絕對數(shù)字也增加。在人源化小鼠體內(nèi)通過這種方法產(chǎn)生的NK細胞具有正常NK細胞表現(xiàn)并且在體內(nèi)和體外兩者中在響應(yīng)于聚I :c和LPS刺激而生產(chǎn)干擾素Y (IFN-Y)方面具有功能性。從人源化小鼠體內(nèi)純化的NK細胞在體外顯示抗K562靶細胞的細胞毒性活性。此外，在體內(nèi)NK細胞應(yīng)答于病毒感染。使用類似方法，通過表達GM-CSF和IL-4增強了樹突狀細胞重建，通過表達MCSF增強了巨噬細胞和單核細胞重建，并且通過表達EPO和IL3增強了人類紅細
胞重建。流體動力學(xué)注射裸DNA導(dǎo)致在血清中檢測出人類細胞因子持續(xù)2-3周。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所清楚的，還可以通過病毒性載體(例如，腺病毒介導(dǎo)的基因表達、慢病毒介導(dǎo)的基因表達)來表達人類基因，這可以導(dǎo)致在小鼠體內(nèi) 高水平并且長時間的人類基因表達。由于對小鼠細胞因子環(huán)境的較差的反應(yīng)性在移植有人類造血干細胞的N0D/SCIDIL2R Y +小鼠體內(nèi)一些種類的人類免疫細胞的重建是非常低的。對于免疫細胞發(fā)育和成熟至關(guān)重要的多種細胞因子顯示出種特異性活性，例如IL-15對于NK細胞、GM-CSF/1L-4對于DC、M-CSF對于巨噬細胞等。在此所述的是一種通過施用裸細胞因子表達質(zhì)粒的基于流體動力學(xué)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法，這導(dǎo)致顯著的高水平的全身性外源性人類細胞因子表達從而促進在人源化小鼠體內(nèi)人類免疫細胞的發(fā)育。與用來自人類HSC的血細胞譜系用于重建非人類哺乳動物的現(xiàn)有方法相比較，這些方法和組合物提供了多種優(yōu)點。例如，僅需將編碼細胞因子的核酸引入一次從而實現(xiàn)希望的結(jié)果；編碼細胞因子的核酸的使用更易于大規(guī)模制備，長期存儲更加穩(wěn)定并且更便于基因工程化；基于流體動力學(xué)的注射可以導(dǎo)致3周時間的全身性人類細胞因子表達，并且有可能的是使用腺病毒和/或慢病毒載體來引入該細胞因子該表達可能持續(xù)更長時間；可以將多種基因構(gòu)建體結(jié)合在一起(參見圖17);并且這些方法提供了一種簡單并且有效的方法來在人源化小鼠體內(nèi)重建HSC (例如，髓樣細胞)。例證實例I在人源化小鼠(Humice)體內(nèi)人類細胞因子的表達顯著地提高了特異性人類血細胞譜系的重建。材料與方法HSC分離、人源化小鼠的構(gòu)建、以及流體動力學(xué)基因遞送。人類臍帶血是從新加坡臍帶血庫得到的。通過聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度分離臍帶血單核細胞(MNC)。根據(jù)制造商的科學(xué)實驗方案(Stem Cell Technologies)用RosetteSep. 系統(tǒng)來純化⑶34+細胞。CD34+細胞的純度是> 95%。為了擴展HSC，在確定的因子的存在下在無血清培養(yǎng)基中將純化的 CD34+細胞培養(yǎng) 11 至 14 天(Zhang CC，Kaba M, Iizuka S，Huynh H，Lodish HF(2008)Blood 111 :3415-3423) 0使用未擴展的和擴展的HSC來產(chǎn)生人源化的小鼠。NSG小鼠購于杰克遜實驗室并且在南洋理工大學(xué)和新加坡國立大學(xué)的動物實驗室中在無特異性病原體的條件下維持。為了重建小鼠，用Y輻射源使用IOOcGy照射新生的幼小動物(小于48小時齡)并且心內(nèi)注射⑶34+⑶133+細胞(Ix 105細胞/受體)。將人類細胞因子基因分別克隆到pcDNA3. I (+)載體(Invitrogen)中。通過Maxi-prep試劑盒(Qiagen)來純化質(zhì)粒DNA。為了流體動力學(xué)基因遞送，使用27-號針在7秒鐘內(nèi)用總計I. 8ml鹽水中50 μ g每質(zhì)粒注射12周齡humice。使用人類樣品和小鼠的所有研究都是在符合新加坡國立大學(xué)和南洋理工大學(xué)的機構(gòu)指導(dǎo)方針下進行的。單細胞制劑、抗體、以及流式細胞儀。單細胞懸浮液是通過標(biāo)準(zhǔn)方法從脾和骨髓(BM)制備的。為了從humice肝中分離MNC，將該肝擠壓通過一個200號不銹鋼篩目，并且通過在50 Xg下離心5分鐘將碎片去除。收集包含MNC的上清液，在PBS中洗滌，并且再懸浮于RPMI培養(yǎng)基1640中40% Percoll (Sigma)中。將細胞懸浮液柔和地覆蓋到70%Percoll上并且在750 Xg下離心20分鐘。從間期收集這些MNC，在PBS中洗滌兩次。為了從肺中分離MNC，將肺切碎，懸浮于包含O. 05%膠原酶(Sigma)和O. 01% DNase I (Sigma)的培養(yǎng)基中，并且在37°C下孵化20分鐘。使這些肺樣品通過一個200號不銹鋼篩目，并且如上所述用Percoll離心來分離這些MNC。使用下面這些抗體CD3(SK7)、CD34(581)、CD19(HIB19)、NKG2D (IDll)、NKp46 (9E2)、CD94(DX22)、CD16(3G8)、CD56(B159)、HLA-DR(L243)、CD14(M5E2)、CDllc (B-ly6)、CD209 (DCN46)、CD7 (M-T701)、CD45 (2D1)、CD69 (L78)、CD33 (WM53)(來自 Becton-Dickson) ;KIR2DL2/L3(DX27)、ILT7(17G10. 2)以及 CD235ab(HIR2)(來自BioLegend) ;CD303 (AC144)(來自 Miltenyi Biotec) ;CD159a (NKG2A ;Z199)(來自 Beckman Coulter);以及 CD133 (EMK08)和小鼠 mouse CD45. I (A20)(來自 eBioscience)。在冰上用包含0. 2% BSA和0. 05%疊氮化鈉的100-μ I PBS中適當(dāng)抗體將細胞染色持續(xù)30分鐘。在LSRII流式細胞儀上使用FACSDiva軟件(Becton,Dickinson and Co.)進行流式細胞計量術(shù)。每個樣品收集一萬至1，000, 000個事件并且使用Flowjo軟件進行分析。體外人類CD34+細胞的分化。從12周齡humice體內(nèi)分離出BM MNC。通過MACS
微珠粒(Miltenyi Biotec)來富集⑶34+細胞。在37°C以及5% CO2下將純化的細胞培養(yǎng)在RPMI 1640，10% FCS中。為了 NK細胞、DC、單核細胞/巨噬細胞、以及紅細胞的分化，對應(yīng)地使用 50ng/ml SCF、50ng/ml FL 和 50ng/mlIL_15 ;50ng/ml SCF、20ng/ml GM-CSF 和50ng/mlIL-4 ；50ng/ml SCF 和 30ng/ml M-CSF ;以及 lOOng/ml SCF，5ng/ml IL-3 和 3U/mlEPO0所有這些細胞因子都購于安迪生物(R&D Systems)。NK細胞細胞毒性測定以及刺激。在基因遞送之后九天，使用干細胞PE選擇試劑盒(干細胞技術(shù)公司(Stem Cell Technologies))通過陽性選擇從脾和BM中純化出CD56+NK細胞。將細胞洗滌并且再懸浮于包含2% FCS的MDM中，并且在一個4小時乳酸脫氫酶釋放測定中(CytoTox 96 ；Promega)確定針對NK敏感性靶物質(zhì)K562 (ATCC)的細胞毒性。為了體外刺激，在37°C以及5% CO2下在RPMI 1640、10% FCS、2_mM L-谷氨酰胺、Ι-mM丙酮酸鈉、青霉素、以及鏈霉素(具有或不具有人類DC)中將純化的NK細胞培養(yǎng)24小時。如所說明的從臍帶血⑶34+細胞中分化出人類DC (Rosenzwajg M, Canque B, GluckmanJC (1996) Blood 87 :535-544)。接著，將50pg/ml聚(I:C) (Sigma)添加到培養(yǎng)物中用來體外刺激NK細胞。為了體內(nèi)刺激，用SOOyg聚(I:C)靜脈注射humice。用ELISA試劑盒(安迪生物(R&D Systems))測量血清中或培養(yǎng)物上清液中IFN-Y水平。腺病毒感染、ALT、以及組織學(xué)。表達綠色熒光蛋白的復(fù)制缺陷型、El和E3缺失的、類型5腺-X病毒(AdGFP)購于Clontech。將AdGFP在HEK293中進行繁殖并且通過CsCl不連續(xù)密度梯度離心進行純化。通過流體動力學(xué)注射通過尾靜脈用4X IO9Pfu AdGFP病毒攻擊Humice。腺病毒感染之后五天,收集血清并且使用cobas c 111分析儀(羅氏診斷有限公司(Roche Diagnostics Ltd.))對ALT活性進行分析。
為了組織學(xué)分析，去除肝、包埋與石蠟中并且制備5-μπι厚切片。用Η&Ε將這些石蠟切片染色并且通過光學(xué)顯微鏡進行分析。為了雙色免疫熒光染色，在阻斷非特異性染色之后，用最佳稀釋的PE結(jié)合的抗人類⑶56抗體(MEM-188 ；Biolegend)將去石蠟的切片染色。用MIRAX MIDI熒光顯 微鏡(蔡司(Zeiss))對這些切片進行分析。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。通過t檢驗對組間差異進行分析。P-值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計顯著的。所有計算都是使用Origin 8. O軟件包完成的。結(jié)果體外通過人類細胞因子刺激NK細胞分化。為了構(gòu)建人源化小鼠，將從人類臍帶血分離的CD34+HSC過繼性轉(zhuǎn)移到亞致命照射的NSG幼小動物體內(nèi)。重建之后十二周，用對于人類CD45和小鼠CD45具有特異性的抗體將來自外周血的單核細胞(MNC)染色(圖6A-6B)。在血液中平均重建比率是約50% [重建比率=%⑶45+人類細胞/(%⑶45+人類細胞+%⑶45+小鼠細胞)]。在這些⑶45+人類白細胞中，⑶19+B細胞的水平范圍從40%至85%并且⑶3+T細胞的水平范圍從10%至50%。雖然在血液、BM、脾、肺、以及肝中檢測出NK細胞，它們的頻率顯著地低于在對應(yīng)的人類組織或小鼠組織中的情況(參見圖6A-6B)。為了確定humice體內(nèi)較差的NK細胞重建背后的原因，我們對來自humice BM的人類CD34+細胞是否可以被人類IL-15和FL刺激從而體外分化成NK細胞進行了測試。FL刺激了多種造血細胞譜系的分化，包括可以應(yīng)答IL-15的CD34+NK祖細胞(Yu H等人(1998)Blood 92 =3647-3657)。預(yù)期FL和IL-15的組合有助于CD34+前體朝向NK細胞分化。因此，在存在FL和IL-15下將從humice BM中純化的人類⑶34+細胞(> 80% )(圖1A)培養(yǎng)7天，并且針對NK細胞標(biāo)志物⑶56和NKp46的表達進行分析。在細胞因子存在下，約11%的細胞對于CD56和NKp46兩者是陽性的，而在缺少細胞因子下，非常少的細胞是陽性的(圖1B)。這些結(jié)果表明如果提供適當(dāng)?shù)募毎蜃迎h(huán)境，humice的BM中CD34+人類細胞能夠分化成NK細胞。通過流體動力學(xué)注射質(zhì)粒DNA在小鼠體內(nèi)表達人類細胞因子。在IL-15和FL存在下人類NK細胞體外發(fā)育的發(fā)現(xiàn)表明這些人類細胞因子還可以在humice體內(nèi)刺激NK細胞發(fā)育。將人類細胞因子引入小鼠體內(nèi)的一種方式是每日注射重組體蛋白。因為這種方式較麻煩并且耗資，我們通過流體動力學(xué)遞送編碼細胞因子的DNA質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)表達人類細胞因子。人類IL-15具有非常長的信號肽序列(45aa殘基)，這被認(rèn)為導(dǎo)致IL-15較差的分泌(Meazza R 等人(1997) Eur J Immunol 27 :1049-1054)。為了增加 IL-15 分泌水平，我們構(gòu)建了一種表達IL-15的載體，其中IL-15信號肽被人類IL-2的信號肽替換(圖7A-7B)。這種替換將IL-15的血清水平增加了約100倍(圖7B)。通過單次流體動力學(xué)注射50 μ g編碼IL-15的質(zhì)粒，注射之后I天在血清中檢測出高水平的IL-15并且維持一個顯著的水平持續(xù)14天(圖2)。類似地，單次注射編碼FL的質(zhì)粒導(dǎo)致血清中表達FL持續(xù)21天。因此，流體動力學(xué)遞送細胞因子基因是用于將人類細胞因子引入小鼠體內(nèi)的一種簡單并且有效的方法。在IL-15和FL基因遞送之后人類NK細胞的重建增強。為了確定IL-15和FL表達對NK細胞發(fā)育的作用，在基因遞送之后9天，通過流式細胞儀針對不同器官中NK細胞重建對humice進行分析。注射空pcDNA載體或編碼FL的載體不顯著地影響⑶56+NK細胞的頻率(圖3A)。然而，IL-15的表達顯著地增加了血液、脾、BM、肺、以及肝中⑶56+NK細胞的頻率(圖3A以及3B)。當(dāng)IL-15和FL兩者都表達于humice體內(nèi)時，NK細胞頻率增加是甚至更顯著的，達到在正常人外周血(5% -21%白細胞)(Maurice RG, O’ Gorman ADD (2008)Handbook of Human Immunology (CRC Press, Boca Raton))以及正常小鼠組織(Zhang J,et al. (2005) Cell Mol Immunol 2:271-280)中觀察到的水平。相應(yīng)于NK細胞頻率增加，在脾和BM中NK細胞絕對數(shù)顯著增加(圖3B)。而且，在基因遞送之后保持血液中⑶56+NK細胞的高頻率持續(xù)至少30天(圖3C)。此外，細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞表達了已知對于NK細胞功能重要的多種細胞表面受體(圖9)，包括活化受體NKG2D，抑制受體NKG2A、⑶94、以及KIR，天然細胞毒性觸發(fā)受體NKp46，NK細胞標(biāo)志物⑶7，早期活化標(biāo)志物⑶69，以及FC受體CD16。這些結(jié)果表明細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞顯示正常NK細胞的特征性表面表型。除了刺激NK細胞發(fā)育之外，已知FL和IL-15兩者在其他造血細胞譜系上起作用(Diener KR, Moldenhauer LM, Lyons AB, Brown MP, Hayball JD(2008)Exp Hematol 36 51-60 ；Dong J, McPherson CM, Stambrook PJ (2002)Cancer Biol Ther I :486-489 ；Blom B，Ho S,Antonenko S,Liu YJ(2000)J Exp Med 192:1785-1796 ；Armitage RJ,Macduff BM,Eisenman J, Paxton R, Grabstein KH (1995) J Tmmunol 154:483-490)。因此，通過流式細胞儀對來自humice的脾、BM、肺、以及肝的細胞進行計數(shù)并且進行分析。IL-15和FL的表達還在脾和BM中誘導(dǎo)⑶14+單核細胞/巨噬細胞、⑶Ilc+⑶Ic+髓樣樹突狀細胞、ILT7+⑶303+漿細胞樣樹突狀細胞、以及CD19+B細胞顯著增加(參見圖8A-8G)。這些結(jié)果證明在人源化小鼠體內(nèi)人類IL-15和FL的表達顯著地改善了 NK細胞以及其他髓樣細胞和淋巴細胞的重建。細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞是功能性的。我們對細胞因子誘導(dǎo)的人類NK細胞是否具有功能性進行了研究(即能夠殺死靶細胞并且在適當(dāng)刺激之后能夠表達IFN- Y )。CD56+NK細胞是從IL-15-和FL處理的小鼠的BM和脾中純化的。當(dāng)與MHC類型I缺陷型靶細胞K562混合時，我們觀察到隨著添加的NK細胞的數(shù)量增加，靶細胞溶解水平增加(圖10A)。當(dāng)用Toll樣受體3激動劑聚(I:C)(它已知活化NK細胞來產(chǎn)生促炎細胞因子(SchmidtKN等人(2004) J Immunol 172 :138-143))來刺激純化的細胞時，在培養(yǎng)物上清液中檢測出IFN-Y (圖10B)。在人類DC存在下，IFN-Y分泌水平進一步增加。當(dāng)將聚(I:C)注入人源化小鼠體內(nèi)時，與未注射的humice相比較，在注射有編碼細胞因子DNA的humice的血清中檢測出顯著增加水平的IFN-Y (圖10C)。我們還用腺病毒攻擊了 humice，這它們被認(rèn)為引起NK細胞依賴性肝損傷(ChenQ, Wei H, Sun R, Zhang J, Tian Z (2008) Hepatology 47:648-658)。細胞因子基因遞送之后九天，將復(fù)制缺陷型腺病毒靜脈注入humice體內(nèi)。三天后，收集肝并且用H&E來染色。在IL-15-和FL-處理的腺病毒感染的humice的肝中觀察到大量白細胞滲透以及大面積的壞死。然而，用腺病毒感染的未處理的humice僅顯示輕度的細胞滲透以及損傷(圖4A)。相應(yīng)地，在IL-15-和FL-處理的腺病毒感染的humice體內(nèi)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平顯著地升高(圖4B)。這種增加與血清IFN- Y水平大致四倍增加(圖4C)以及肝中浸潤的人類白細胞大致五倍增加(圖4D)相關(guān)聯(lián)。肝切片的免疫組織化學(xué)分析證實了這些損傷中⑶56+NK細胞的位置(圖4E)。這些結(jié)果強烈表明這些細胞因子誘導(dǎo)的人類NK細胞具有功能性。改善其他人類血細胞譜系的重建。我們對細胞因子基因遞送是否可以用作一般性方法用來在humice體內(nèi)改善特定人類血細胞譜系的重建進行了測試。在培育期間，通過GM-CSF和IL-4刺激從humice的BM中純化的人類CD34+細胞從而分化成CDllc+CD209+DC，通過M-CSF刺激從而分化成⑶14+單核細胞/巨噬細胞，并且通過EPO和IL-3刺激從而分化成⑶235ab+紅細胞(圖11)。在體內(nèi)，將表達GM-CSF、IL-4、和FL的DNA載體流體動力學(xué)遞送到humice體內(nèi)導(dǎo)致血液、脾、BM、肺、以及肝中⑶Ilc+⑶209+DC的頻率顯著增加(圖5A)。類似地，M-CSF表達導(dǎo)致在淋巴器官和非淋巴器官兩者中⑶14+單核細胞/巨噬細胞的重建增加(圖5B)。EPO和IL-3的表達導(dǎo)致血液中出現(xiàn)⑶235ab+人類紅細胞(圖5C)，達到全部紅細胞的3 %至5 %。因此，通過流體動力學(xué)注射DNA質(zhì)粒來表達細胞因子基因是一種常用的并且有效的方法用來在humice體內(nèi)改善特定人類血細胞譜系的重建。討論使用NSG或BALB/c-RagZ+ 112rg+小鼠作為受體在人源化小鼠模型體內(nèi)NK細胞和髓樣細胞的重建通常是較差的。在BLT小鼠體內(nèi)，雖然DC和單核細胞/巨噬細胞顯著重 建，人類NK細胞和RBC不存在。我們注意到在人類和小鼠之間對于NK細胞或多種髓樣細胞發(fā)育和維持所要求的許多細胞因子(包括IL-15、GM-CSF, IL_4、M-CSF,以及IL-3)顯示出顯著的序列趨異。前面的研究已經(jīng)證明這些鼠類細胞因子對適當(dāng)?shù)娜祟惣毎愋途哂袠O少影響。因為這些細胞因子主要是由非造血細胞生產(chǎn)的，缺少這些人類細胞因子可以解釋humice體內(nèi)NK細胞和髓樣細胞的較差重建。支持這種解釋的是，我們顯示了可以體外刺激從humice的BM中分離的人類⑶34+前體細胞以分化成NK細胞、DC、單核細胞/巨噬細胞、以及紅細胞。當(dāng)通過流體動力學(xué)遞送編碼細胞因子的質(zhì)粒DNA將適當(dāng)?shù)娜祟惣毎蜃右肴嗽椿∈篌w內(nèi)時，誘導(dǎo)了 NK細胞、DC、單核細胞/巨噬細胞、以及紅細胞水平顯著升高。當(dāng)細胞因子的血清水平下降時，重建水平也下降。因此，humice體內(nèi)NK細胞和髓樣細胞較差的重建是由于缺少對于它們分化和維持所通常要求的適當(dāng)?shù)娜祟惣毎蜃?。引入適當(dāng)?shù)募毎蜃訉?dǎo)致humice體內(nèi)這些人類血細胞譜系的重建水平顯著增加。流體動力學(xué)基因遞送廣泛用于在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平瞬時肝和全身轉(zhuǎn)基因表達(Suda T, Liu D(2007)Mol Ther 15:2063-2069)。這種方法涉及短時間內(nèi)(6-8 秒)大量(10%體重)地尾靜脈注射DNA。這種動力學(xué)壓力引起肝損傷，導(dǎo)致肝細胞吸收DNA(Suda T，Liu D (2007)Mol Ther 15 :2063-2069)。在轉(zhuǎn)錄和翻譯之后，細胞因子分泌到循環(huán)系統(tǒng)中并且可以到達BM或其他器官中的靶細胞。因此，通過單次注射編碼細胞因子的DNA，在血清中檢測出IL-15持續(xù)2周并且檢測出FL持續(xù)3周。IL-15和FL血清持續(xù)時間之間的差異可能是由于蛋白質(zhì)半衰期的不同或IL-15通常通過IL-15Ra鏈結(jié)合到細胞表面上(Mortier E，Woo T, Advincula R, Gozalo S，Ma A (2008) J Exp Med 205:1213-1225)。從一個單次 DNA注射生產(chǎn)的IL-15和FL的數(shù)量顯然足以誘導(dǎo)NK細胞水平顯著升高持續(xù)至少30天。當(dāng)在循環(huán)系統(tǒng)中不再檢測出細胞因子時，這些NK細胞持久性表明在分化的早期階段這些細胞因子起到關(guān)鍵性作用。一旦產(chǎn)生，在循環(huán)系統(tǒng)中細胞因子變得不能檢出之后NK細胞能夠存活延長的時間。因為它們在多種血細胞譜系上的作用，F(xiàn)L和IL-15的表達還導(dǎo)致脾和BM中單核細胞/巨噬細胞、DC、以及B，但不是T水平升高。此外，通過流體動力學(xué)基因遞送表達適當(dāng)?shù)募毎蜃舆€顯著地增強了特定髓樣譜系細胞(包括DC、單核細胞/巨噬細胞、以及紅細胞)的重建，證明了這種方法是廣泛應(yīng)用。與NK細胞、DC以及單核細胞/巨噬細胞改善的重建相比較(在遞送人類細胞因子基因之后7天它們變得清楚)，直至細胞因子基因遞送之后30天，紅細胞的改善的重建也沒有到達峰值水平。這一方面可以通過人類WBC與小鼠WBC的比率差異來解釋，并且另一方面可以通過人類RBC與小鼠RBC的比率差異來解釋。因為小鼠RBC巨大數(shù)量，生產(chǎn)足夠數(shù)量的人類RBC需要較長的時間才能達到類似百分比。以前，已經(jīng)報道了兩個組通過將重組體人類IL-15注入NOD-scid小鼠或BALB/c-RagZ+IUrg+小鼠體內(nèi)增強了 NK 細胞發(fā)育(Huntington ND 等人(2009) J Exp Med 206 :25-34 ；KalbererCP, Siegler U, Wodnar-Filipowicz A (2003) Blood 102 :127-135)。與每日細胞因子注射相比較(這是麻煩和耗資的)，通過流體動力學(xué)基因遞送來表達細胞因子基因是一種可負(fù)擔(dān)的、簡單的并且有效的方法，因為一個單次注射導(dǎo)致特定血細胞譜系重建升高持續(xù)超過30天。這些細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞顯示出正常表面表型和功能。與前面的觀察相反(其中在將重組體IL-15每日注入NOD-scid小鼠體內(nèi)之后產(chǎn)生人類NK細胞)，這些細胞表達NKp46 但不表達 NKG2D 和 NKG2A (Kalberer CP, Siegler U, Wodnar-Filipowicz A (2003) Blood 102 :127-135)。在本研究中，這些細胞因子誘導(dǎo)的人類NK細胞表達所有三種主要家族的NK受體，包括活化受體NKG2D、抑制受體NKG2A和KIR、以及自然細胞毒性受體NKp46。相一致地，在體外和體內(nèi)兩者中細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞能夠溶解MHC類型I缺陷型靶細胞并且經(jīng)聚(I:C)刺激時能夠分泌FN-Y。此外，細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞能夠建立對腺病毒感染的強勁應(yīng)答(如通過IL-15-和FL-處理的小鼠體內(nèi)擴大的肝壞死以及血清ALT高水平所指示)。與小鼠體內(nèi)野生型NK細胞類似(它們通過IFN- Y分泌介導(dǎo)肝炎)(Chen Q，Wei H, Sun R, Zhang J, Tian Z (2008) Hepatology 47 :648-658 ；Rosenberger CM, ClarkAE,Treuting PM, Johnson CD,Aderem A(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105:2544-2549)，IL-15-和FL-處理的腺病毒感染的humice的血清IFN- Y水平顯著地升高。這些發(fā)現(xiàn)表明在表面表型和功能兩方面細胞因子誘導(dǎo)的NK細胞是正常的。實例2在人源化小鼠體內(nèi)人類細胞因子的表達提高了人類T細胞和B細胞的重建和功能在人源化小鼠體內(nèi)人類T細胞和B細胞的重建是適當(dāng)?shù)?，但它們未顯示最佳功能。例如，雖然在病毒攻擊之后已經(jīng)檢測出人類CD8+T細胞應(yīng)答，這些CD4+T細胞的功能是異常的；在人源化小鼠體內(nèi)不存在人類B細胞介導(dǎo)的抗體應(yīng)答。如在此顯示，人類T細胞和B細胞應(yīng)答的異常還由于在小鼠體內(nèi)小鼠細胞因子與人類細胞的較差的交叉反應(yīng)性。在此顯示的是將編碼人類GM-CSF和IL-4的質(zhì)粒注射到humice體內(nèi)導(dǎo)致人類⑶209+樹突狀細胞的重建提高，它被認(rèn)為是針對T細胞的主要抗原呈遞細胞。此外，IL-4還顯示在人類B細胞中促進細胞增殖、存活以及免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換成IgG和IgE，并且由幼稚CD4+T細胞獲取Th2表型。使用類毒素(TT)疫苗來免疫GM-CSF和IL-4處理的humice從而確定這些小鼠是否可以產(chǎn)生TT特異性抗體應(yīng)答。如在此說明的，用編碼人類GM-CSF和IL_4的質(zhì)?；蚩誴cDNA載體(載體)流體動力學(xué)地注射具有類似人類白細胞重建(50-80% )的12周齡的人源化小鼠。在7天之后，用破傷風(fēng)類毒素(TT)免疫這些小鼠三次，其中給藥之間間隔3周(圖12A)。在第三次免疫之后2周收集脾和血清。圖12B顯示出與載體處理的小鼠相比較，來自GM-CSF和IL-4處理的小鼠的脾顯著地增大。相應(yīng)地，在GM-CSF和IL-4處理的小鼠的脾中存在顯著擴展的人類單核細胞(MNC)(約20倍)(圖12C)。從脾中人類B細胞和T細胞的細胞表面表型分型結(jié)果中，還可以指示的是人類B細胞發(fā)展到生產(chǎn)成熟抗體階段(CD19ffiCD20_)，這與貫穿細胞因子治療和免疫的整個過程的正常的人類曲線一致(圖13);同時通過上調(diào)HLA-DR和⑶40L的表達來活化人類T細胞(圖14)。
來自免疫的、GM-CSF和IL_4處理的小鼠的血清中人類IgG和IgM的總水平對應(yīng)地達到高達1.3mg和140 μ g (圖15A、15B)，這類似于人體中的水平(對應(yīng)地4mg和Img)。最重要的是，首次在humice體內(nèi)成功建立起抗原特異性人類抗體應(yīng)答。在載體處理的小鼠體內(nèi)不能檢測出人類TT特異性IgG，而在細胞因子處理的小鼠體內(nèi)，它達到平均O. 16IU/ml (圖15C)。免疫之后在人體內(nèi)O. lIU/ml抗破傷風(fēng)類毒素抗體足以保護該個體免受感染。此外，在GMXSF+IL-4處理的小鼠體內(nèi)人類T細胞應(yīng)答還顯示它們對TT抗原的特異性(圖16A-16B)。使用破傷風(fēng)毒素肽(830-843)來刺激這些脾T細胞。與來自載體處理的小鼠的細胞相比較，在TT特異性刺激之后來自GMXSF+IL-4處理的小鼠的T細胞可能產(chǎn)生顯著水平的人類IFN-Y和IL-4。使用在此所述的方法，抗原在小鼠體內(nèi)建立起顯著水平的人類抗原-特異性抗體應(yīng)答。因此，在此所述的方法提供了一種有用的平臺用于測試疫苗并且生產(chǎn)人類抗體以用于治療目的。表細胞因子以及細胞因子的功能
細胞因子功能
IL-Ia^
IL-I β^
IL-2T細胞/調(diào)節(jié)性T細胞
IL-3HSC
IL-4Th2、B細胞、樹突狀細胞
IL-5嗜酸性細胞
IL-6炎癥、血細胞生成
IL-7胸腺細胞、T細胞
IL-8嗜中性細胞
IL-9T細胞
IL-IOTh2、自身免疫炎癥
IL-IlHSC、B 細胞
權(quán)利要求
1.一種在非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血細胞譜系的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類血細胞譜系的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血細胞譜系。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中在將HSC引入該非人類哺乳動物體內(nèi)之后引入編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以裸DNA的形式或在一種載體中引入。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其中該載體是一種質(zhì)粒、一種病毒載體、或它們的一種組口 ο
5.如權(quán)利要求4所述的方法,其中該病毒載體是一種慢病毒或一種腺病毒載體。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以質(zhì)粒DNA的形式使用流體動力學(xué)注射方法引入。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是選自下組，該組由以下各項組成白細胞介素_12(IL-12)、白細胞介素-15(IL-15)、Flt3L(Fms-相關(guān)酪氨酸激酶3配體)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-3 (IL-3)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(EPO)以及它們的一種組入口 ο
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該非人類哺乳動物是一個小鼠。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該小鼠是選自下組，該組由以下各項組成一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變并且缺少針對細胞因子受體Y鏈的一種基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scidIL2R Y + 小鼠)以及一種 Balb/c rag+ y c+ 小鼠。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其中被重建的該功能性人類血細胞譜系是功能性人類髓樣細胞、功能性人類淋巴樣細胞或它們的組合。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中這些人類髓樣細胞是人類單核細胞、人類巨噬細胞、人類樹突狀細胞、人類紅細胞、以及它們的組合；并且該人類淋巴樣細胞是人類NK細胞、人類B細胞、人類T細胞、以及它們的組合。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是白細胞介素-15(IL-15)以及Fms-相關(guān)酪氨酸激酶3配體(Flt3L)，并且在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建的這些功能性血細胞譜系是人類NK細胞。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白細胞介素4 (IL-4)，并且在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建的這些功能性血細胞譜系是人類樹突狀細胞。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該一種或多種細胞因子是巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)，并且在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建的這些功能性血細胞譜系是人類單核細胞/巨噬細胞。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該一種或多種細胞因子是促紅細胞生成素(EPO)以及白細胞介素3 (IL-3)，并且在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建的這些功能性血細胞譜系是人類紅細胞。
16.一種在非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類NK細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)表達于該非人類哺乳動物體內(nèi)時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類NK細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類NK細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內(nèi)人類NK細胞的重建。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該核酸編碼人類IL-15以及人類Flt-3/Flk-2配體。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中該非人類哺乳動物的外周血中約5%至約21%的白細胞是人類NK細胞。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)將人類NK細胞的表達維持約30天。
20.一種在非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類樹突狀細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)表達于該非人類哺乳動物體內(nèi)時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類樹突狀細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內(nèi)功能性人類樹突狀細胞的重建。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該核酸編碼人類GM-CSF以及人類IL-4。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中進一步包括引入編碼人類Flt-3/Flk-2配體的核酸。
23.一種在非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)表達于該非人類哺乳動物體內(nèi)時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類單核細胞/巨噬細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類單核細胞/巨噬細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內(nèi)功能性人類單核細胞/巨噬細胞的重建。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該核酸編碼人類巨噬細胞集落刺激因子。
25.—種在非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類紅細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)表達于該非人類哺乳動物體內(nèi)時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類紅細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類紅細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內(nèi)功能性人類紅細胞的重建。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中該核酸編碼人類促紅細胞生成素以及人類IL-3。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中這些紅細胞構(gòu)成該非人類哺乳動物體內(nèi)全部紅細胞的約3%至約5%。
28.—種在非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類T細胞以及人類B細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)，其中當(dāng)表達于該非人類哺乳動物體內(nèi)時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類T細胞以及人類B細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類T細胞和人類B細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類T細胞和人類B細胞。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中在將HSC引入該非人類哺乳動物體內(nèi)之后引入編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以裸DNA的形式或在一種載體中弓I入。
31.如權(quán)利要求30所述的方法,其中該載體是一種質(zhì)粒、一種病毒載體、或它們的一種組合。
32.如權(quán)利要求31所述的方法,其中該病毒載體是一種慢病毒或一種腺病毒載體。
33.如權(quán)利要求28所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以質(zhì)粒DNA的形式使用流體動力學(xué)注射方法引入。
34.如權(quán)利要求28所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白細胞介素-4(IL-4)。
35.如權(quán)利要求28所述的方法，其中該非人類哺乳動物是一個小鼠。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中該小鼠是選自下組，該組由以下各項組成一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變并且缺少針對細胞因子受體Y鏈的一種基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scidIL2R Y + 小鼠)以及一種 Balb/c rag+ y c+ 小鼠。
37.如權(quán)利要求28所述的方法，其中該人類抗體是人類IgG、人類IgM或它們的一種組合。
38.如權(quán)利要求28所述的方法，進一步包括 c)用一種免疫原將該非人類哺乳動物免疫；并且 d)在其中該非人類哺乳動物生產(chǎn)針對該免疫原的人類抗體的條件下維持該非人類動物。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，進一步包括從該非人類哺乳動物體內(nèi)分離出生產(chǎn)該人類抗體的人類B細胞，由此生產(chǎn)出分離的人類B細胞。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，進一步包括將這些分離的人類B細胞與無限增殖的細胞接觸，由此生成一種組合；并且在其中這些人類B細胞以及這些無限增殖的細胞融合從而形成一種雜交瘤的條件下維持該組合，該雜交瘤生產(chǎn)針對該免疫原的單克隆抗體。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，進一步包括對編碼由這些人類B細胞表達的人類抗體的全部或一個功能性部分的序列進行克隆。
42.一種在非人類哺乳動物體內(nèi)生成針對一種免疫原的人類抗體的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)并且將編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入該非人類哺乳動物體內(nèi)，其中這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類T細胞以及人類B細胞； b)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類T細胞和人類B細胞的條件下維持該非人類哺乳動物； c)用該免疫原將該非人類哺乳動物免疫；并且 d)在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)這些人類B細胞產(chǎn)生針對該免疫原的人類抗體的條件下維持該非人類動物， 由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生針對該免疫原的人類抗體。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中在將HSC引入該非人類哺乳動物體內(nèi)之后引入編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以裸DNA的形式或在一種載體中弓I入。
45.如權(quán)利要求44所述的方法,其中該載體是一種質(zhì)粒、一種病毒載體、或它們的一種組合。
46.如權(quán)利要求45所述的方法,其中該病毒載體是一種慢病毒或一種腺病毒載體。
47.如權(quán)利要求42所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以質(zhì)粒DNA的形式使用流體動力學(xué)注射方法引入。
48.如權(quán)利要求42所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白細胞介素-4(IL-4)。
49.如權(quán)利要求42所述的方法，其中該非人類哺乳動物是一個小鼠。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中該小鼠是選自下組，該組由以下各項組成一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一種攜帶重度聯(lián)合免疫缺陷突變并且缺少針對細胞因子受體Y鏈的一種基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scidIL2R Y +小鼠)以及一種 Balb/c rag+ Yc+小鼠。
51.如權(quán)利要求42所述的方法，其中該人類抗體是人類IgG、人類IgM或它們的一種組
52.如權(quán)利要求42所述的方法，進一步包括從該非人類哺乳動物體內(nèi)分離出生產(chǎn)非人類的人類抗體的人類B細胞，由此生產(chǎn)出分離的人類B細胞。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，進一步包括將這些分離的人類B細胞與無限增殖的細胞接觸，由此生成一種組合；并且在其中這些人類B細胞以及這些無限增殖的細胞融合從而形成一種雜交瘤的條件下維持該組合，該雜交瘤生產(chǎn)針對該免疫原的單克隆抗體。
54.如權(quán)利要求42所述的方法，其中該免疫原是破傷風(fēng)類毒素。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，進一步包括對編碼由這些人類B細胞表達的人類抗體的全部或一個功能性部分的序列進行克隆。
56.一種由權(quán)利要求I所述的方法制造的非人類哺乳動物。
57.一種由權(quán)利要求16所述的方法制造的非人類哺乳動物。
58.一種由權(quán)利要求20所述的方法制造的非人類哺乳動物。
59.一種由權(quán)利要求23所述的方法制造的非人類哺乳動物。
60.一種由權(quán)利要求25所述的方法制造的非人類哺乳動物。
61.一種由權(quán)利要求28所述的方法制造的非人類哺乳動物。
62.一種由權(quán)利要求40所述的方法制造的雜交瘤。
63.一種由權(quán)利要求62所述的雜交瘤分泌的單克隆抗體。
64.一種由權(quán)利要求53所述的方法制造的雜交瘤。
65.一種由權(quán)利要求64所述的雜交瘤分泌的單克隆抗體。
全文摘要
在此提供了在一種非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血細胞譜系的方法，包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內(nèi)。在其中在該非人類哺乳動物體內(nèi)該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類血細胞譜系的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內(nèi)重建功能性人類血細胞譜系。還提供了在一種非人類哺乳動物體內(nèi)生產(chǎn)出針對一種免疫原的人類抗體的多種方法、分泌這些單克隆抗體的雜交瘤以及由這些B細胞生產(chǎn)的抗體(例如多克隆抗體、單克隆抗體)以及由這些方法生產(chǎn)的非人類哺乳動物。
文檔編號C12N5/071GK102725400SQ201080038847
公開日2012年10月10日 申請日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者陳建竹, 陳清風(fēng) 申請人:麻省理工學(xué)院