專利名稱：血管增殖病癥的治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為分子生理學領域并涉及使用富亮氨酸α-2-糖蛋白I(Lrgl)的拮抗物， 用于治療或預防血管增殖病癥——尤其用于眼睛，和用于治療顯示血管增殖的腫瘤。
背景技術：
視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的異常改變(aberrant remodelling)是諸如糖尿病視網(wǎng)膜病變、 視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產兒視網(wǎng)膜病變、老年黃斑退行性病變和黃斑毛細血管擴張的威害視力病癥的突出特征。這些血管改變它們本身表現(xiàn)為從已有視網(wǎng)膜血管的新毛細血管生長 (血管發(fā)生)和現(xiàn)有血管的血管畸形發(fā)展(例如毛細血管擴張)。在這些疾病中該致病的血管改變是喪失視力的主要作用因素。類似的血管病理學和功能紊亂也伴隨著腫瘤生長，其中血管發(fā)生允許實體瘤增大和生長。大量資源把注意力放在了獲取對驅動這些血管反應(稱作血管發(fā)生、新生血管發(fā)生、血管增殖、血管改變、血管病理學)機制的理解上。所鑒定的在該過程中起作用的各種分子中，認為血管內皮生長因子(VEGF)和它們的受體是關鍵的成分。在眼睛血管發(fā)生中， 使用抗癌劑阿瓦斯汀(Avastin)(或非常相關的Lucentis)的靶向VEGF通路的治療，至少在短時期內，在許多危害視力的病癥中已經產生了改善的臨床結果。但是，對于長期使用抗VEGF策略治療視網(wǎng)膜血管存在擔憂，因為VEGF同時具有神經保護活性和諸如維持脈絡月莫開窗(choroidal fenestration)白勺管家作用(housekeeping role)。而且，雖然認為 VEGF是新生血管發(fā)生中的主要促血管生成因子，但是該過程需要許多因子之間的協(xié)同串擾 (coordinated crosstalk)，并且其他血管改變，諸如加寬(dilated)的和曲折的毛細血管擴張的血管的形成的生物基礎是未知的。因此，用于治療不可控的血管生長和/或改變對疾病起作用的病癥，需要識別可選的治療靶和新的藥物——其單獨或與現(xiàn)有療法結合——可更加有效并且具有更少的脫靶效果。

發(fā)明內容
我們已經鑒定了富亮氨酸α -2-糖蛋白1 (Lrgl基因標示符HGNC :29480 ；Entrez Gene :116844 ；Ensembl :ENSG00000171236 ；UniProtKB :P02750)作為藥物靶，用于調制致
病的血管改變。Lrgl在1977年被鑒定(Haupt & Baudner，1977)并且它的一級結構在1985年確定(Takahashi等，1985)。Lrgl在小鼠和人類之間是高度進化保守的，人Lrgl的多克隆抗體是商業(yè)上可獲得的，并且有報道在某些疾病中轉化生長因子i3 1(TGFi3 1)、TGFi3受體 II(TGF^RII)和Lrgl的水平(Sun等，1995 ；Li等，1997)伴隨增加。其他組已經鑒定Lrgl 作為某些疾病的生物標記(US 2005/0064516 ；WO 2008/092214)并且作為細胞色素c的配體(US 2007/0184503)。內皮細胞中TGFi^信號傳導的功能紊亂導致疾病遺傳性出血性毛細血管擴張(HHT)。在特征為包括毛細血管擴張的血管畸形的該組疾病中，TGFii內皮輔助受體內皮糖蛋白和T β RI共受體ALKl的突變分別導致HHTl (McAllister等1994)和HHT2 (Johnson 等1995)。也已經發(fā)現(xiàn)在血管改變普遍的具有糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者視網(wǎng)膜中TGF3增加(Spirin等，1999)。也已經發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤患者的血漿中Lrgl表達增加，這提示它可作為可能的腫瘤生物標記(Heo等，2007 ；Ferrero等，2009 ；Kakisaka等，2007)。但是，對Lrgl 的生物學所知很少。我們現(xiàn)在已經鑒定Lrgl作為藥物靶，用于調制致病的血管改變，尤其在眼睛中， 和顯示血管增殖的腫瘤中。使用包括血管改變的視網(wǎng)膜疾病的小鼠模型，我們首先確定，除了其他基因外， Lrgl在這些患病視網(wǎng)膜的血管中上調。這些小鼠模型的視網(wǎng)膜中增加的Lrgl表達接著通過定量PCR和蛋白質印跡驗證，并且通過原位雜交和免疫組織化學，它的視網(wǎng)膜分布確認為血管的。這些模型是標準的血管發(fā)生模型，并且可適用于在除眼睛之外的位置血管發(fā)生。我們接著調查了 Lrgl和TGFii信號通路之間的聯(lián)系。在內皮細胞中，可通過與普遍存在的TGFi3 I型受體激活蛋白受體樣激酶5 (ALK5) 或內皮細胞特異性ALKl相關的TGFii受體II發(fā)生TGFii信號傳導，細胞內反應取決于哪個通路占主導。在ALK5的情況下，在某些病癥下有增加的ECM沉積和細胞靜止，而就ALKl 而言，內皮細胞活化表現(xiàn)為增加的遷移和增殖。該不同的信號傳導部分受到TGFii的濃度 /生物利用度的控制，并受到稱為Smad的下游效應蛋白家族成員的控制，借此Smad 2和3 被ALK5活化，而Smad 1、5和8被ALKl活化。免疫沉淀顯示Lrgl與TGFi3 RII和ALKl 二者都相關，這提示Lrgl在聯(lián)系這兩個分子作為部分的TGFii信號傳導復合體方面起作用。因此，我們假設Lrgl起到TGF3信號傳導調制劑的作用，造成ALKl-活化的和 ALK5-活化的信號級聯(lián)放大之間的微調。支持該情況的是，內皮細胞中用siRNA的Lrgl敲落阻斷TGFii -介導的細胞增殖增加并降低Smad5磷酸化，而Lrgl過表達導致增強的增殖—— 這下調Smad2的表達，和增加的Smad5磷酸化。因此，這些觀察揭示了一條Lrgl可調節(jié)血管發(fā)生的途徑。而且，在Matrigel血管發(fā)生試驗中，為了研究Lrgl對“血管”形成的作用， 當添加來自Lrgl過表達細胞的條件培養(yǎng)基時血管形成的程度——如通過血管形成、管形成和索形成(cord formation)所測量的——顯著增加，并且增加的血管化作用與培養(yǎng)基中 Lrgl蛋白表達相關。這些數(shù)據(jù)與經TGFi3 RII/ALK5受體復合體通路減少的信號傳導一致，并因此朝著活化血管致病性TGFi3 RII/ALK1信號通路移動。這提示在TGFii信號傳導復合體中阻斷Lrgl具有使TGF0遠離致病的血管化作用的潛能。為了檢驗該論點，我們確定利用抗Lrgl抗體或期望可與Lrgl競爭結合ALKl的源自Lrgl的肽序列，我們是否可以阻斷由TGFii誘導的內皮Smad5磷酸化?？筁rgl抗體造成磷酸化的降低，同時肽之一展示特別大程度的磷酸化降低。因此，Smad5磷酸化可通過阻斷Lrgl抑制，并且因為Smad5與血管致病性ALKl-活化的信號級聯(lián)放大相關，所以這表明阻斷Lrgl有可能阻斷該級聯(lián)——相對于非致病性、 ALK5-活化的可選級聯(lián)。
一并考慮，這些數(shù)據(jù)提示(a)Lrgl與TGFi^ RII和ALKl 二者都相互作用，直接或通過一種或多種中間物促進TGFi3 RII和ALKl而不是與ALK5之間的相互作用，以便(b)阻斷Lrgl可使TGFii的活性遠離血管致病性、ALKl-活化的信號級聯(lián)放大并進入非致病性、 ALK5-活化的級聯(lián)，結果是(C)Lrgl是有效的藥物靶，用于治療在眼睛和其他地方中的致病的血管化作用。用各種Lrgl-阻斷劑，尤其是Lrgl的肽片段、Lrgl的單克隆抗體和siRNA 分子的治療，可因此面向眼睛和包括致病的組織血管化作用的其他疾病。不被理論所束縛，

圖16圖解了我們的數(shù)據(jù)所暗示的Lrgl的作用。另外，我們的數(shù)據(jù)提示，與VEGF相反，Lrgl可僅僅參與在眼睛中致病的血管化作用而不參與正常的發(fā)育血管化作用或血管內穩(wěn)態(tài)。就避免干擾不期望被打擾的過程而言， 這使它潛在地成為比VEGF優(yōu)異的靶。Lrgl作為靶的進一步吸引力是它是細胞外的并且因此通過全身治療途徑可更容易地到達。也進行了實驗以研究Lrgl體外和體內的作用。我們的實驗顯示，與對照小鼠的主動脈環(huán)相比較，Lrgl敲除小鼠的主動脈環(huán)的血管原血管出芽減少。同時，我們發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比較，Lrgl敲除小鼠視網(wǎng)膜受傷之后的脈絡膜新生血管形成(CNV)和氧誘導的視網(wǎng)膜病變(OIR)后視網(wǎng)膜新生血管形成減少。作為在人病理學中Lrgl作用的證據(jù)，我們的數(shù)據(jù)顯示遭受增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的人患者中Lrgl和TGFii表達增加，這支持從小鼠獲得的體內數(shù)據(jù)。我們也已經證明抗Lrgl的抗體在Matrigel血管發(fā)生試驗中能夠通過人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)抑制管形成。這些數(shù)據(jù)提示抗Lrgl的抗體可用于治療或預防血管增殖病癥，尤其是眼睛和顯示血管增殖的腫瘤的那些病癥。因此，本發(fā)明提供了 富亮氨酸α -2-糖蛋白1 (Lrgl)的拮抗物，用于治療或預防血管增殖病癥。本發(fā)明也提供了 鑒定Lrgl拮抗物的方法，包括提供候選拮抗物，并確定所述候選拮抗物是否阻斷Lrgl的功能或活性；其中如果觀察到阻斷Lrgl的功能或活性，那么所述候選拮抗物被鑒定為Lrgl的拮抗物。本發(fā)明也提供了 單克隆抗體，其特異性識別附錄2的氨基酸Ll-M或附錄3的氨基酸L94-117 (SEQ ID NO 3),附錄2的氨基酸L169-1922或附錄3的氨基酸L262-285 (SEQ ID NO 4)或附錄 2的氨基酸L227-252或附錄3的氨基酸L320-345 (SEQ ID NO 5)中的表位并阻斷Lrgl的活性。本發(fā)明也提供了 單克隆抗體，其特異性識別附錄2的氨基酸Ll-M或附錄3的氨基酸L94-117 (SEQ ID NO 3),附錄2的氨基酸L169-1922或附錄3的氨基酸L262-285 (SEQ ID NO 4)或附錄 2的氨基酸L227-252或附錄3的氨基酸L320-345(SEQ ID NO :5)中的表位并阻斷ALK1、 TGFβ RII和/或TGFβ和Lrgl之間的相互作用。本發(fā)明也提供了 用于生產這種抗體的方法，包括用免疫原免疫非人哺乳動物，所述免疫原包括 Lrgl的附錄2的L1-24或附錄3的L94_117(SEQ ID NO 3)，附錄2的L169-1922或附錄3的 L262-285(SEQ ID NO 4)或附錄 2 的 L227-252 或附錄 3 的 L320-345 (SEQ ID NO 5)的序列中的表位；并且從所述哺乳動物收獲抗體制劑，并從其中得到特異性識別所述表位的單克隆抗體。本發(fā)明也提供了 用于確定Lrgl中哪個位點可被靶向以阻斷Lrgl的功能或活性的方法，包括提供 Lrgl蛋白的肽片段；并確定是否所述每個所述肽片段阻斷Lrgl的功能或活性。本發(fā)明也提供了 Lrgl的拮抗物在制造用于治療或預防血管增殖病癥的藥劑中的應用。本發(fā)明也提供了 治療血管增殖病癥的方法，包括向需要其的患者施用有效量的Lrgl拮抗物附圖簡述圖 1. RCS 大鼠(20 周)、VLDLR+ 小鼠(16 周)、Curlytail-J 小鼠(13 周)和 RDl 小鼠(16周)中視網(wǎng)膜血管改變的低功率和高功率圖像。用抗膠原蛋白IV和抗密蛋白 (claudin)-5抗體染色視網(wǎng)膜鋪片(flat mount)中的血管以分別修飾血管基底層和內皮細胞結合處。圖2. A. Lrgl蛋白和它所提出的糖基化位點的示意圖。B. ROBETTA(University of Washington, USA)預測的Lrgl蛋白的結構。圖 3. Α.在 C57B16 對照小鼠(BL6) ,VLDL 受體 KO 小鼠(VLDLRvO >Curlytail-J 小鼠(CT)和視網(wǎng)膜營養(yǎng)失調1小鼠(RDl)中整個小鼠視網(wǎng)膜的Lrgl表達的定量RT PCR分析。B.來自整個視網(wǎng)膜的Lrgl蛋白表達(上)和半定量(下)的蛋白質印跡。C.顯示 Lrgl基因表達的正常視網(wǎng)膜的原位雜交。D.顯示表達的血管模式的視網(wǎng)膜鋪片(上)和視網(wǎng)膜切片(下)的Lrgl免疫組織化學染色。圖4. Α.來自GPNT內皮細胞溶解產物的Lrgl與TGF β RII和ALKl的免疫共沉淀。 B.重組體HA標記的Lrgl與TGF β和TGF β RII 二者相關聯(lián)。C. GPNT內皮細胞中Lrgl和 TGFiiRII表達的共定位。D.內皮細胞增殖試驗表明Lrgl敲落消弱了 TGFii誘導的增殖并降低了 Smadl/5磷酸化(*p < 0. 05)。Ε.內皮細胞增殖試驗表明Lrgl的過表達增強了 TGF^誘導的增殖并增加了 Smadl/5磷酸化(*p < 0. 05)。圖5.在GPNT內皮細胞中，源自C末端的Lrgl阻斷肽抑制Lrgl/TGFβ 1誘導的 Smad5磷酸化(每個情況n = 3，ρ < 0. 0001)。兩個右手線是單獨的C-末端肽，和結合的附錄2的Ll-M或附錄3的L94-117(SEQ ID NO :3)、附錄2的L169-1922或附錄3的 L262-285(SEQ ID NO 4)或附錄 2 的 L227-252 或附錄 3 的 L320-345 (SEQ ID NO 5)的三肽。圖6. A. GPNT內皮細胞中用siRNA的Lrgl敲落和GPNT細胞中Lrgl過表達的蛋白質印跡。B. Lrgl敲落降低了 TGFi3 1-介導的內皮細胞增殖(*p < 0. 0001)并且Lrgl過表達增強了 TGFi3 1-介導的內皮細胞增殖(*p < 0. 0005)(每個情況η = 3)。圖7.體外Lrgl對HUVEC “血管”形成的影響。Α.未處理的培養(yǎng)基或來自對照內皮細胞(EC)或來自EC過表達Lrgl的培養(yǎng)基添加至Matrigel血管發(fā)生試驗。Lrgl條件培養(yǎng)基提高了 HUVEC “索(cord)”形成。B.非條件培養(yǎng)基、GPNT內皮細胞條件培養(yǎng)基(7天) 和來自GPNT細胞過表達Lrgl的條件培養(yǎng)基中Lrgl的蛋白質印跡。C.不同的處理之后量
7化Matrigel內皮索形成的復雜性(閉合血管環(huán)的數(shù)量和總血管面積)(每個情況η = 3)。 來自Lrgl過表達細胞的Lrgl條件培養(yǎng)基誘導最大的血管原血管叢，如通過閉合血管環(huán)的數(shù)量或總血管面積所測量的(P < 0. 0001)。圖8.用TGF β和Lrgl處理后，Lrgl抗體(商業(yè)上可獲得的Lrgl N-末端結構域的多克隆抗體抗)和Lrgl肽對內皮Smad5磷酸化的影響。圖9.與來自野生型小鼠的主動脈環(huán)相比較，來自Lrgl敲除小鼠的主動脈環(huán)顯示減少的血管原血管出芽。主動脈環(huán)血管發(fā)生(用同工凝集素B4染成綠色)的代表性圖表明來自Lrgl KO小鼠的主動脈中減少的血管原血管出芽和它們的量化。每組n = 30個主動脈環(huán)(**Ρ < 0. 01)。圖10.視網(wǎng)膜疾病的Curlytail-J、RDl和VLDLR-/-小鼠模型中的基因上調。圖11.A.對WT和Lrgl KO小鼠的視網(wǎng)膜通過激光燒傷誘導的脈絡膜新生血管形成的熒光素血管造影(FA)。早期(B)和晚期(C)FA的量化分別顯示損害后7天記錄的血管原生長的大小和滲漏。η = 10(**ρ < 0. 01)。圖12.(左)大腦內皮細胞系GPNT表達用于研究Lrgl對TGFii信號傳導影響的必要成分。P=細胞團；M=細胞培養(yǎng)基。(右)TGFii誘導GPNT細胞中Lrgl基因表達。圖13.氧誘導的視網(wǎng)膜病變(OIR)后，在P17小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(用同工凝集素 B4染成紅色)的代表性圖表明Lrgl KO小鼠中無血管區(qū)域增加和新生血管簇減少。量化WT 和Lrgl KO小鼠的⑶無血管區(qū)域和(C)新生血管簇(分別n = 6和9)。Lrgl敲除中無血管區(qū)域增加(*ρ<0. 05)，與野生型相比較，在敲除中可見更少的新生血管簇(#ρ0.01)。圖14.與不相關的IgG的相比，添加中和抗人Lrgl多克隆抗體后體外Matrigel 中人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的管形成減少。對Α.分枝點的數(shù)量、管數(shù)量和對B.總管長度，測量管形成(n = 3，*ρ < 0. 05，**ρ < 0. 01)。圖15. Α.對Lrgl，染色的人視網(wǎng)膜的橫截面。B.來自非糖尿病患者和具有增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的患者的玻璃體樣品中Lrgl的蛋白質印跡和量化(n = 4)。 C.來自非糖尿病患者和具有PDR的患者的玻璃體樣品中TGFi3 1的蛋白質印跡和量化(**ρ < 0. 01)。圖16.工作假設的示意圖。Α.在正常條件下，TGF^ 1信號主要涉及TGFβ RII/ ALK5/Smad2/3通路，并且Lrgl隔離在基底層中。B.在致病條件下，增加的Lrgl表達導致 TGF^ 1信號傳導朝著對血管改變起作用的TGFi3 RII/ALKl/Smadl/5/8通路重新定向。發(fā)明詳述阻斷Lrgl本發(fā)明的拮抗物阻斷Lrgl的功能。Lrgl的阻斷包括它活性或功能的任何降低，其導致降低的血管增殖作用，包括內皮細胞增殖、周細胞消失、內皮細胞死亡、血管改變、血管發(fā)生、毛細血管擴張、血管滲漏。例如，Lrgl的阻斷可通過阻斷它與ALKl、TGF β RII和/或TGF β的相互作用，我們的數(shù)據(jù)提示這促進TGF β RII與ALK5而不是ALKl之間的相互作用，從而改變TGF β的活性進入較少致病性的ALK-5活化的信號級聯(lián)放大并遠離血管致病性ALK-I相關的級聯(lián)。Lrgl 的阻斷也可以導致降低TGFii的生物利用度。阻斷包括總體和部分降低Lrgl活性或功能，例如總體或部分預防ALKl-Lrgl、TGF^RII-Lrgl和/或TGFi^-Lrgl相互作用。例如，本發(fā)明的阻斷拮抗物可降低Lrgl的活性從 10%至 50%、至少 50%或至少 70%、80%、90%、95%或 99%。
可通過任何適合的手段測量Lrgl活性或功能的阻斷。例如，ALKl-Lrgl、 TGF^RII-Lrgl和/或TGFi^-Lrgl相互作用的阻斷可通過測量對Smad5磷酸化的影響確定，這是基于Smad5磷酸化是ALKl活化通路而不是ALK5-活化通路的特征。Lrgl的阻斷也可經測量血管發(fā)生的試驗——例如體外試驗，諸如Matrigel中的血管生長、來自主動脈環(huán)的血管生長和體內試驗，諸如測量視網(wǎng)膜血管發(fā)生(例如，激光誘導的脈絡膜新生血管形成、氧誘導的視網(wǎng)膜病變)的那些——測量。取決于例如使用的拮抗物的性質(見下面)可經任何合適的機制發(fā)生阻斷，例如任何直接或間接ALKl-Lrgl、TGF^RII-Lrgl和/或TGF β-Lrgl相互作用的位阻影響或 Lrgl表達的敲除。Lrgl的拮抗物根據(jù)發(fā)明可使用任何合適的拮抗物，例如肽和模擬肽(ρ印tidomimetics)、抗體、 小分子抑制劑、雙鏈RNA、適配體和核酶。優(yōu)選的拮抗物包括Lrgl的肽片段、雙鏈RNA、適配體和抗體。肽肽拮抗物通常為與全長Lrgl競爭結合TGF β RII和/或ALKl并因此拮抗Lrgl的 Lrgl的片段。這種肽可以是線性的或環(huán)狀的。肽拮抗物長度通常從5至50，優(yōu)選10-40、 10-30或15-25個氨基酸并一般地與來自Lrgl中的連續(xù)序列相同，但可具有小于100%的同一性，例如95%或更多，90%或更多或80%或更多，只要它們保持Lrgl阻斷性能。阻斷肽可以以任何合適的方式鑒定，例如，通過系統(tǒng)篩選跨越部分或所有Lrgl序列的連續(xù)或重疊肽。也可設計模擬肽以模擬這種阻斷肽。雙鏈RNA使用已知的技術和基于Lrgl序列的知識，可通過基于序列同源性靶向Lrgl RNA 設計雙鏈RNA (dsRNA)分子以拮抗Lrgl。這種dsRNAs通常是小的干擾RNA (siRNA)——其通常為頸-環(huán)(“發(fā)卡”)結構——或微RNA(miRNA)。這種dsRNA的序列包括與編碼Lrgl 的mRNA的部分相應的部分。該部分通常與Lrgl mRNA內的靶部分100%互補，但是也可以使用更低水平的互補性(例如90%或更多或95%或更多)。適配體適配體一般是結合特異性靶分子的核酸分子。適配體可完全體外設計、容易地通過化學合成制造、具有期望的儲存性能、并且在治療應用中誘發(fā)少許或不誘發(fā)免疫原性。這些特征使得它們在藥學和治療應用中尤其有用。如本文所使用的，“適配體”一般指單鏈或雙鏈寡核苷酸或這種寡核苷酸的混合物，其中寡核苷酸或混合物能夠特異性結合靶。這里將描述寡核苷酸適配體，但是本領域讀者明白也可以使用具有相同結合特征的其他適配體，諸如肽適配體。一般而言，適配體可包括長度至少5、至少10或至少15個核苷酸的寡核苷酸。適配體可包括長度達40、達60或達100或更多核苷酸的序列。例如，適配體的長度可從5至 100個核苷酸、從10至40個核苷酸或從15至40核苷酸。如果可能，較短長度的適配體是優(yōu)選的，因為這些通常導致其他分子或材料的較少干擾。
未修飾的適配體迅速地從血流清除，半衰期為數(shù)分鐘至數(shù)小時，主要是由于核酸酶降解和通過腎臟從身體清除。這種未修飾的適配體在例如治療短暫性病癥(transient condition)諸如在刺激血液凝結中有用?？蛇x地，可修飾適配體以改進它們的半衰期。幾種這樣的修飾是可得的，諸如添加2’ -氟-取代的嘧啶或聚乙二醇(PEG)連鎖?？墒褂贸Ｒ?guī)方法產生適配體，諸如指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX))方法。SELEX 是高度特異性結合靶分子的核酸分子體外進化的方法。例如，它描述在US 5,654, 15UUS 5, 503, 978,US 5，567，588 和 WO 96/38579 中。SELEX方法包括從寡核苷酸集合中選擇能夠結合期望靶的核酸適配體，并且尤其是單鏈核酸。單鏈核酸(例如，DNA、RNA或其變體)的集合在有利于結合的條件下與靶接觸，在混合物中與靶結合的那些核酸與沒有結合的那些分開，解離核酸靶復合體，擴增與靶結合的那些核酸以產生富含具有期望結合活性的核酸的集合或文庫，并且如必要接著重復這一些列的步驟，以產生對相關靶具有特異性結合親和性的核酸(適配體)文庫?？贵w本文所稱的術語“抗體”包括全抗體和其任何抗原結合片段(即，“抗原結合部分”) 或單鏈?？贵w指糖蛋白，其包括二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文簡寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文簡寫為和輕鏈恒定區(qū)組成。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結合結構域。Vh和八區(qū)可進一步細分為稱為互補性決定區(qū)域(CDR)的高變區(qū)，由稱為框架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域間隔?？贵w的恒定區(qū)可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應器細胞)和經典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并優(yōu)選地是單克隆抗體。本發(fā)明的抗體可以是嵌合抗體、CDR移植抗體、納米抗體(nanobody)、人或人源化抗體或其任何抗原結合部分。為了生產單克隆和多克隆抗體二者，實驗動物通常是非人哺乳動物諸如山羊、 兔、大鼠或小鼠，但是也可以是飼養(yǎng)的其他物種，諸如駱駝科(camelids)?？赏ㄟ^常規(guī)方法，諸如用感興趣的抗原免疫合適的動物產生多克隆抗體。隨后從該動物中取出血液并純化IgG部分。本發(fā)明的單克隆抗體(mAbs)可通過各種技術產生，其包括常規(guī)單克隆抗體方法例如，Kohler和Milstein標準體細胞雜交技術。用于制備雜交瘤的優(yōu)選動物體系是鼠科體系。在小鼠中的雜交瘤產生是非常充分確立的程序，并可使用本領域熟知的技術實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的抗體可通過包括下列的方法產生用包括下列的免疫原免疫非人哺乳動物，所述免疫原包括全長Lrgl、Lrgl肽片段、Lrgl的附錄2的L114或附錄3的 L94-117(SEQ ID NO 3)，附錄 2 的 L169-1922 或附錄 3 的 L262-285 (SEQ ID NO 4)或附錄 2的L227-252或附錄3的L320-345 (SEQ ID NO 5)的序列內表位、或Lrgl其他區(qū)域內的表位；從所述哺乳動物收獲抗體制劑；并從中得到特異性識別所述表位的單克隆抗體。術語抗體的“抗原結合部分”指保持特異性結合抗原能力的一個或多個抗體片段。 已經顯示抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段完成。術語抗體的“抗原結合部分”內所包括的結合片段的例子包括Fab片段、F(ab' )2片段、Fab，片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分離的互補性決定區(qū)域(CDR)。單鏈抗體諸如scFv抗體也打算包括在術語抗體的 “抗原結合部分”內?？墒褂帽绢I域技術人員熟知的常規(guī)技術獲得這些抗體片段，并且可以以與完整抗體相同的方式篩選片段的功能。可通過重組體手段制備、表達、制造或分離本發(fā)明的抗體，諸如(a)從感興趣的免疫球蛋白基因被轉基因的或轉染色體的動物(例如，小鼠)或從其中制備的雜交瘤分離的抗體，(b)從轉化的表達感興趣抗體的宿主細胞，例如從轉染瘤中分離的抗體，(c)從重組體、組合抗體文庫分離的抗體，和(d)通過任何其他包括剪接免疫球蛋白基因序列到其他 DNA序列的方式制備、表達、制造或分離的抗體。本發(fā)明的抗體可以是人抗體或人源化抗體。如本文所使用的術語“人抗體”打算包括可變區(qū)中的框架區(qū)和⑶R區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列的抗體。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包括不被人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。但是，如本文所使用的術語“人抗體”不意欲包括源自另一種哺乳動物種諸如小鼠種系的CDR序列已經被移植到人框架區(qū)序列的抗體。這種人抗體可以是人單克隆抗體。這種人單克隆抗體可通過包括B細胞的雜交瘤產生，所述B細胞獲得自轉基因非人動物，例如轉基因小鼠，其具有包括融合至無限增殖化細胞的人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。人抗體可通過體外免疫人淋巴細胞，隨后用愛潑斯坦(Epstein-Barr)病毒轉化該淋巴細胞制備。術語“人抗體衍生物”指人抗體的任何修飾形式，例如，抗體與另一種試劑或抗體的綴合(conjugate)。術語“人源化抗體”打算指源自另一種哺乳動物種諸如小鼠的種系的CDR序列已經移植到人框架區(qū)序列上的抗體。另外的框架區(qū)修飾可在人框架區(qū)序列內進行。如本文所描述篩選方法可用于鑒定能夠結合Lrgl的合適抗體。因此，本文描述的篩選方法可使用感興趣的抗體作為試驗化合物進行?？蓽y試本發(fā)明的抗體與Lrgl的結合，例如，通過標準的ELISA或蛋白質印跡。 ELISA試驗也可用于篩選顯示與靶蛋白陽性反應的雜交瘤?？贵w的結合特異性也可通過監(jiān)測抗體與表達靶蛋白的細胞的結合例如通過流式細胞術測定。因此，本發(fā)明的篩選方法可包括通過進行ELISA或蛋白質印跡或通過流式細胞術鑒定能夠結合Lrgl的抗體的步驟。具有需要結合性能的抗體可接著進一步被檢測，以確定它們對Lrgl活性的影響，如上面進一步所描述的。本發(fā)明的抗體具有Lrgl拮抗物(阻斷)性能，如上面所討論的。在一種實施方式中，單克隆抗體特異性識別Lrgl中的表位并阻斷Lrgl的活性。在一種實施方式中，單克隆抗體特異性識別Lrgl中的表位并阻斷ALK1、TGF^RII或TGFi^和Lrgl之間的相互作用。在一種實施方式中，單克隆抗體特異性識別附錄2的氨基酸Ll-M或附錄3的氨基酸L94-117(SEQ ID NO :3)，附錄2的氨基酸L169-1922或附錄3的氨基酸L262-285 (SEQ ID NO 4)或附錄2的氨基酸L227-252或附錄3的氨基酸L320-345(SEQ ID NO 5)中的表位并阻斷Lrgl的活性。在一種實施方式中，單克隆抗體特異性識別附錄2的氨基酸Ll-M 或附錄3的氨基酸L94-117(SEQ ID NO 3)，附錄2的氨基酸L169-1922或附錄3的氨基酸L262-285(SEQ ID NO 4)或附錄 2 的氨基酸 L227-252 或附錄 3 的氨基酸 L320-345 (SEQ ID NO 5)中的表位并阻斷ALKl、TGF β RII或TGF β和Lrgl之間的相互作用。本發(fā)明的抗體特異性識別Lrgl，即Lrgl中的表位。當抗體或其他化合物優(yōu)先或高親和性地結合其特異性的蛋白但基本上不結合或低親和性地結合其他蛋白時，它“特異性結合”或“特異性識別”該蛋白。本發(fā)明的抗體對靶蛋白的特異性可通過確定抗體是否結合其他相關蛋白——如上面所討論的——或它是否區(qū)分它們而被進一步研究。例如，本發(fā)明的抗體可結合人Lrgl，但不結合小鼠或其哺乳動物的Lrgl。本發(fā)明的抗體期望地以高親和性結合Lrgl，優(yōu)選地在皮摩爾范圍內，例如親和常數(shù)(KD)為IOnM或更小、InM或更小、500pM或更小或IOOpM或更小，這通過表面等離子體共振或任何其他合適的技術測量。一旦合適的抗體已經被鑒定并選擇，可通過本領域已知的方法鑒定抗體的氨基酸序列?？墒褂煤啿⒁锟寺【幋a抗體的基因?？赏ㄟ^常規(guī)方法重組產生抗體?？赏ㄟ^本領域已知的和本文所討論的方法，尤其通過經由“PEPSCAN”方法的連續(xù)或重疊肽系統(tǒng)篩選或通過形成對已經顯示阻斷Lrgl的肽片段的抗體(見上面)，鑒定Lrgl 中的表位。這種肽——其中可鑒定用于抗體產生的表位——的例子為本文討論的附錄2的 L1-24 或附錄 3 的 L94-117(SEQ ID NO 3)，附錄 2 的 L169-1922 或附錄 3 的 L262-285 (SEQ ID NO 4)和附錄2的L227-252或附錄3的L320-345 (SEQ ID NO 5)肽。這些和其他包含表位的肽可用作產生抗體的免疫原。治療適應癥根據(jù)本發(fā)明，原則上可治療、預防或改善其中發(fā)生Lrg-I-介導的血管增殖的任何病癥。如本文所使用的“血管增殖”、“血管增生”、“血管增殖病癥”和類似的術語包括任何和所有與異常的或有害的血管或血管組織或細胞發(fā)育有關的病狀。例如，致病的血管發(fā)生 (例如經由從現(xiàn)有的血管中毛細血管生長形成新血管)和血管畸形(例如毛細血管擴張，加寬的、曲折的和機能不全的血管的形成，微動脈瘤性紫癜的特征)都可被預防或減少，如可預防或減少新生血管形成和血管內皮細胞增殖。同樣地，如本領域已知的，瘤生長需要形成新血管以為生長的腫瘤供血。因此，發(fā)生Lrgl-介導的血管增殖的腫瘤也是可根據(jù)本發(fā)明治療、預防或改善的病癥。優(yōu)選地，對正常的例如發(fā)育的血管化作用，尤其對視網(wǎng)膜中發(fā)育的血管化作用沒有影響或有最小的影響。治療眼睛血管增殖病癥是優(yōu)選的實施方式?？杀恢委煹牟“Y包括的是糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產兒視網(wǎng)膜病變、黃斑毛細血管擴張、老年黃斑退行性病變或脈絡膜新生血管形成。也可以實現(xiàn)治療腫瘤一典型地是實體瘤，因為預防腫瘤中血管發(fā)生控制 (derive)腫瘤的血供。腫瘤治療靶包括腦、乳腺、腎、結直腸、肺、前列腺、頭和頸、胃、胰腺、 皮膚、宮頸、骨、卵巢、睪丸和肝腫瘤。 本發(fā)明的拮抗物通常與藥學上可接受的載體一起配制成藥學組合物。如本文所使用的，“藥學上可接受的載體”包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、 抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、和類似物。優(yōu)選地，載體適合腸胃外，例如靜脈內、肌肉內、皮下、眼內或玻璃體內給藥(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，調制劑
12(modulator)可用材料包衣以保護化合物免受可使化合物失活的酸和其他自然條件的作用。本發(fā)明的藥學化合物可包括一種或多種藥學上可接受的鹽?！八帉W上可接受的鹽” 指保持母體化合物的期望生物活性并且不賦予任何不期望的毒性作用的鹽。這種鹽的例子包括酸添加鹽和堿添加鹽。優(yōu)選的藥學上可接受的載體包括水性載體或稀釋劑?？杀槐景l(fā)明的藥學組合物采用的適合的水性載體的例子包括水、緩沖水和鹽水。其他載體的例子包括乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇和類似醇)和其合適的混合物、植物油諸如橄欖油、和可注射有機酯諸如油酸乙酯。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇諸如甘露醇、山梨糖醇、或氯化鈉。治療組合物通常必須是消毒的并且在制造和存儲條件下穩(wěn)定。組合物可配制為溶液、微乳液、脂質體或其他適合高藥物濃度的有序結構。本發(fā)明的藥學組合物可包括另外的活性成分，尤其是本文討論的VEGF拮抗物。也在本發(fā)明范圍內的是包括本發(fā)明的拮抗物和使用說明書的試劑盒。該試劑盒可進一步包含一種或多種另外的試劑，諸如另外的治療或預防試劑，如上面所討論的?？墒┯帽景l(fā)明的拮抗物和組合物用于預防和/或治療處理。在治療應用中，調制劑或組合物以足夠治愈、緩解或部分控制該病癥或它一個或多個癥狀的量，施用至已經遭受上述疾病或病癥的對象。這種治療處理可導致疾病癥狀嚴重性的降低，或無癥狀時期的頻率或持續(xù)時間增加。適合實現(xiàn)這一點的量定義為“治療有效
里O在預防應用中，以足夠預防或降低該病癥或它一個或多個癥狀的隨后作用的量， 將制劑施用至處在上述疾病或病癥風險中的對象。適合實現(xiàn)這一點的量定義為“預防有效量”。對于每個目的的有效量取決于疾病或損傷的嚴重性以及對象的體重和一般狀態(tài)。在本發(fā)明的內容中，可預防處理的病癥的例子是濕型AMD(老年黃斑退行性病變)；一只眼睛可能在另一只之前發(fā)生該病癥，一旦該問題被確認治療第一只眼并且預防第二只眼。施用本發(fā)明拮抗物的對象可以是人或非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬行類等等。施用給人是優(yōu)選的。本發(fā)明的的拮抗物可經由一個或多個給藥途徑，使用本領域已知的各種方法的一種或多種給藥。如本領域技術人員可認識到，給藥途徑和/或模式隨著期望的結果而改變。 本發(fā)明調制劑優(yōu)選的給藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、眼內、腹膜內、皮下、脊椎或其他腸胃外給藥途徑，例如通過注射或輸注。如本文所使用的短語“腸胃外給藥”意思是非腸和局部給藥的給藥模式，通常通過注射。可選地，本發(fā)明的抗體可經非腸胃外途徑，諸如局部、 表皮或粘膜給藥途徑給藥。本發(fā)明調制劑合適的劑量可由專業(yè)藥劑師確定。本發(fā)明藥學組合物中活性成分的實際劑量水平可被改變以獲得的一定量的活性成分，其有效地實現(xiàn)對具體患者、組合物和給藥模式期望的治療反應，而對患者沒有毒性。選擇的劑量水平取決于各種藥物代謝動力學因素，包括本發(fā)明采用的具體組合物的活性、給藥途徑、給藥時間、被采用的具體化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與采用的具體組合物結合使用的其他藥物、化合物和/或材
13料、被治療患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康狀況和之前醫(yī)療史、和藥學領域已知的類似因素。例如，合適的劑量范圍可以是從約0. 1 μ g/kg至約100mg/kg待被治療患者的體重。例如，合適的劑量可以從約1 μ g/kg至約10mg/kg體重每天或從約10g/kg至約5mg/kg 體重每天。對于眼內給藥，合適的劑量通常每28天可從約1 μ g-lmg?？烧{整給藥方案以提供最佳的期望反應(例如，治療反應)。例如，可給藥單次劑量，可隨時間給藥數(shù)個分份劑量或根據(jù)治療情況的緊急事件指示的按比例減少或增加劑量。如本文所使用的劑量單位形式指適合作為待被治療對象的單一劑量的物理離散單元； 每個單元包含計算產生期望治療效果的預定量的活性化合物連同必要的藥學載體?？梢詥未蝿┝炕蚨啻蝿┝拷o藥。可經相同的或不同的途徑給藥多次劑量并且可給藥至相同的或不同的位置?？蛇x地，在需要更少給藥頻率的情況下，可經緩釋制劑給藥。劑量和頻率可根據(jù)拮抗物在患者中的半衰期和期望治療的持續(xù)時間而變化。如上面所提到的，本發(fā)明的調制劑可與一種或其他多種其他治療劑共同給藥。例如，其他劑可以是止痛劑、麻醉劑、免疫抑制劑或抗炎劑；或VEGF拮抗物。可以以許多不同的方式實現(xiàn)兩種或多種劑的組合給藥。二者可在單個組合物中一起給藥，或它們可在分開的組合物中作為組合治療的一部分給藥。例如，一個可以在另一個之前、之后或同時給藥。聯(lián)合治療如上面所述，本發(fā)明的Lrgl拮抗物可與任何其他合適的活性化合物組合給藥。 具體而言，因為Lrgl和VEGF的拮抗作用都減少致病的血管化作用，Lrgl拮抗物，尤其是抗VEGF抗體諸如阿瓦斯汀和/或Lucentis和/或基于受體的VEGF捕獲(trap)諸如 Aflibercept0下面實施例闡釋了本發(fā)明。 實施例1.異常視網(wǎng)膜血管的基因表達分析。有各種視網(wǎng)膜疾病的動物模型，盡管該疾病具有不同的遺傳性起點和細胞起源， 但是其顯示不但包括血管發(fā)生而且包括其他諸如毛細血管擴張(加寬的、曲折的和機能不全的血管)的血管改變的異常血管反應。為了獲得對視網(wǎng)膜血管改變的生物學基礎的新理解，我們在四個這樣的模型(圖1)中進行了研究，借此我們研究了與來自正常對照的微血管相比較，致病的視網(wǎng)膜微血管中不同的基因表達。研究了在相應于存在血管異常的階段的時間點從野生型(WT)小鼠、視網(wǎng)膜營養(yǎng)失調(RD) PjHtCurlytail(CT)小鼠和極低密度脂蛋白受體(VLDLR)敲除小鼠中分離和純化的微血管片段。對從三個小鼠模型分離的RNA 的微列陣基因表達分析(Affymetrix)揭示對所有在來自患病視網(wǎng)膜的微血管中被上調或下調的基因有63個共同基因(圖10)。在血管改變的三個小鼠模型的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中差別表達的63個基因中，富亮氨酸α-2-糖蛋白I(Lrgl)列為最顯著的(根據(jù)FDR分析)。 Lrgl是蛋白質富亮氨酸重復家族——其參與蛋白-蛋白相互作用、信號傳導以及細胞粘附和發(fā)育——的分泌糖蛋白(圖2)。2.驗證在微列陣數(shù)據(jù)中觀察到的Lrgl過表達。
首先通過定量PCR驗證小鼠模型的視網(wǎng)膜中增加的Lrgl表達。提取來自WT、RD1、 CT和VLDLR-/-小鼠的全視網(wǎng)膜的mRNA，并進行定量實時PCR(qRTPCR)。如微列陣分析所指示的，qRTPCR顯示當與對照小鼠比較時，在視網(wǎng)膜血管病理學的三個模型中Lrgl的轉錄表達顯著增加(P < 0. 05)(圖3A)。為了確定mRNA的增加翻譯成蛋白表達的增加，我們接下來在和基因表達研究相同的時間點分離視網(wǎng)膜，并準備組織用于通過蛋白質印跡進行蛋白分析(圖:3B)。通過密度計分析半定量蛋白質印跡數(shù)據(jù)(η >幻，與管家蛋白(GAPDH)比較揭示Lrgl蛋白表達顯著增加(ρ <0.05)。為了測定Lrgl在視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中的分布并確定是否視網(wǎng)膜的其他細胞表達Lrgl，我們進行原位雜交和免疫組織化學以分別檢測Lrgl mRNA和蛋白質。在正常小鼠中，血管系統(tǒng)主要地表達Lrgl mRNA(圖3C)和蛋白質(圖3D)。3. Lrgl 與 TGFβ 受體 TGFβ RII 和 ALKl 相關聯(lián)。實際上，關于Lrgl的生物學一無所知。幾個報道已經描述了在許多疾病中 TGFii 1、TiiR-II和Lrgl的表達伴隨增加(Sun等，1995 ;Li等，2007)。這是特別密切相關的，因為內皮細胞中TGFii信號傳導的功能紊亂導致疾病遺傳性出血性毛細血管擴張 (HHT)。在特征為包括毛細血管擴張的血管畸形的該組疾病中，TGFii內皮輔助受體內皮糖蛋白和TGF β I型受體ALKl的突變分別導致HHTl (McAllister等1994)和HHT2 (Johnson 等1995)。而且，我們具有在VLDLR-/-小鼠中的先導數(shù)據(jù)(pilot data)以證實(effect) 在視網(wǎng)膜組織中TGF β mRNA顯著增加，而RPE或微血管不是。進一步相關的，已經發(fā)現(xiàn)在血管改變普遍的具有糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者視網(wǎng)膜中TGFii增加(Spirin等，1999)。在內皮細胞中，可通過與普遍存在的TGFi3 I型受體激活蛋白受體樣激酶5 (ALK5) 或主要在內皮細胞中表達的ALKl相關的TGFii受體II發(fā)生TGFii信號傳導，細胞內反應取決于那條通路占主導。在ALK5的情況下，存在ECM沉積和細胞靜止增加，而對于ALK1，內皮細胞活化表現(xiàn)為增加的遷移和增殖。該差別的信號傳導部分受到TGFii的濃度/生物利用度的控制，并受到稱為Smad的下游效應蛋白家族成員的控制，借此Smad 2和3與ALK5 相關聯(lián)，而Smad 1、5和8與ALKl相關聯(lián)。我們已經探究了 Lrgl和TGF信號通路之間的聯(lián)系。我們首先確定大鼠腦內皮細胞系(GPNT)表達Lrgl、TGFi3 RII 二者以及TGFii信號傳導的其他組分(見附錄1)。我們表明來自GPNT細胞溶解產物的Lrgl的免疫沉淀導致受體 TGF β RII和ALKl的共沉淀(圖4Α)。類似地，產生Lrgl共沉淀的TGF β RII或ALKl的免疫沉淀指示Lrgl與兩個受體相關聯(lián)(圖4Α)。我們也已經顯示來自細菌的HA標記的重組體Lrgl蛋白與TGF^RII和TGF β相關聯(lián)(圖4Β)。另外，在GPNT細胞上Lrgl和TGF β RII 表達的免疫細胞化學可視化證明共定位(圖4C)。因此，我們假設Lrgl起到TGF β信號傳導的調制劑的作用，造成TGF β RII與ALKl活化的信號級聯(lián)放大和ALK5活化的信號級聯(lián)放大之間的微調。我們也已經顯示在GPNT細胞中TGFii誘導Lrgl基因表達，這提示可能的反饋機制(圖16).4.通過差別Smad磷酸化，Lrgl修飾TGF β信號傳導。為了確定Lrgl是否影響TGFii-介導的血管內皮細胞反應，我們接下來用siRNA 在GPNT細胞中敲落Lrgl并測定它對TGFii-介導的細胞增殖的影響。在2個小時內，在對照細胞中，TGFii誘導內皮細胞增殖顯著增加(70%匯合細胞)(ρ < 0. 05)。用siRNA在GPNT 內皮細胞中敲落Lrgl阻斷了該TGFii-介導的細胞增殖的增加(圖6A和B)。這與Smad5 磷酸化的減少相關聯(lián)(圖4D)。相反地，在用Lrgl基因轉染的GPNT細胞中，我們顯示Lrgl過表達導致響應TGFii增加內皮細胞增殖(圖6A和B)。該提高的反應與Smad2表達下調和增加的Smad5磷酸化相關聯(lián)(圖4E)。這些數(shù)據(jù)與經TGFi3 RII/ALK5受體復合體通路降低的信號傳導一致，并因此轉向活化血管致病性TGFi3 RII/ALK1信號通路。5. Lrgl條件培養(yǎng)基增強體外血管發(fā)生。已經確定Lrgl在內皮細胞中修飾TGF0信號傳導并影響TGFii-介導的細胞增殖，我們接下來使用標準的體外血管發(fā)生試驗測定Lrgl是否影響血管發(fā)生。人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在Matrigel中生長，并經歷非條件生長培養(yǎng)基，通過GPNT細胞(其組成性分泌Lrgl)的條件培養(yǎng)基和通過GPNT細胞過表達Lrgl的條件培養(yǎng)基。對照培養(yǎng)基不包含 Lrgl，而GPNT和Lrgl過表達GPNT培養(yǎng)基分別包含中等水平和高水平的Lrgl (圖7B)。當添加來自Lrgl過表達細胞的條件培養(yǎng)基時，血管形成程度最好(圖7A和C)。增加的血管化作用與培養(yǎng)基中Lrgl蛋白表達相關聯(lián)。6.源自Lrgl的附錄2的肽序列L227-252或附錄3的L320-345修飾GPNT細胞中的TGF β信號傳導。我們接下來確定我們是否能夠用抗Lrgl抗體或通過源自Lrgl的肽序列阻斷 TGF^誘導的內皮Smad5磷酸化。產生源自Lrgl序列的富亮氨酸重復區(qū)域(附錄2的Ll-M 和L169-1922或附錄3的L94-117和L262-285)的肽——其被認為參與蛋白-蛋白相互作用，和源自高度保守富亮氨酸C末端結構域(附錄2的L227-252或L320-345 of附錄3) 的肽(附錄2)。GPNT細胞中Lrgl過表達不導致Smad5磷酸化。用5ng/ml TGF^處理對照細胞導致Smad5磷酸化顯著增加。在Lrgl過表達細胞中，TGF β對Smad5磷酸化的影響顯著增加。當Lrg-I過表達內皮細胞被抗Lrgl多克隆抗體共同處理時，Smad5磷酸化水平降低，這提示該抗體能夠干擾Lrgl相互作用。用該肽共同處理具有不同的效果，附錄2 的Ll-M (附錄3的L94-117)肽對Smad5磷酸化沒有影響，附錄2的L169-1922 (附錄3的 L262-285)肽有部分效果，而附錄2的L227-252 (附錄3的L320_3^)肽(圖幻具有明顯的抑制效果。所有三種肽的組合幾乎完全停止了 TGFii介導的Smad5磷酸化。這些數(shù)據(jù)支持了下述假設=Lrgl修飾TGFii介導的信號傳導，并且Lrgl拮抗物可用作治療劑。7.來自Lrgl敲除小鼠主動脈環(huán)顯示減少的血管原血管出芽。接著檢查Lrgl在體內血管發(fā)生中的作用。從通過頸脫位法殺死的PHLrgl 敲除小鼠或野生型同窩對照中移出胸主動脈，并立即轉移至包含冰冷無血清 OPTI-MEM(Invitrogen)的培養(yǎng)皿中。用精細微型解剖鑷子小心地移出主動脈周纖維脂肪性組織。切片1毫米長的主動脈環(huán)并包埋在PH 7. 4的DMEM中制備的大鼠尾膠原蛋白I凝膠中(1.5mg/ml)。包含主動脈環(huán)的膠原蛋白凝膠37°C下保存在96孔板中7天。每個孔包含補充有2. 5% FCSUOOU/ml青霉素和ΙΟΟμ g/ml鏈霉素的內皮細胞基礎培養(yǎng)基。用奧林巴斯顯微鏡成像。量化來自每個主動脈環(huán)的血管原血管出芽的數(shù)量。與來自野生型小鼠的主動脈環(huán)相比較，分離自對Lrgl基因敲除雜合和純合的小鼠的主動脈環(huán)顯示顯著減少的血管原血管出芽(p < 0.01)(圖9)。8. Lrgl敲除小鼠中視網(wǎng)膜損傷之后脈絡膜新生血管形成(CNV)減少。在Lrgl敲除小鼠或野生型同窩對照的每只眼睛中，通過激光在圍繞視神經的三個位置破裂布魯赫膜。在激光處理1周后，通過體內基底熒光素血管造影(FA)測量在布魯赫膜破裂位點處的CNV損傷。通過腹膜內注射輸送熒光素。以7分鐘的間隔獲得早期和晚期的基底血管造影照片。注射后90秒獲得早期血管造影照片，其指示脈絡膜新生血管形成的大小。晚期血管造影表明從脈絡膜新生血管膜的滲漏。FA清楚地顯示在Lrgl敲除小鼠中脈絡膜新生血管形成減少(圖11A)。脈絡膜新生血管系統(tǒng)的量化揭示當與野生型小鼠相比較時，在Lrgl敲除中血管原生長和滲漏的面積的大小顯著減少(圖IlB和C) (**ρ < 0. 01)。9. Lrgl敲除小鼠中氧誘導的視網(wǎng)膜病變(OIR)后視網(wǎng)膜新生血管形成減少。有乳母(nursing mother)的P7Lrgl敲除小鼠和野生型同窩對照經歷高氧 (75%氧)5天，其導致在新生兒中顯著抑制視網(wǎng)膜血管發(fā)育。對P12，小鼠恢復正常氧， 因此含氧量低的無血管視網(wǎng)膜激發(fā)正常的血管再生和病理學新生血管形成，其在P17達到頂峰。視網(wǎng)膜被分離、固定并使用同工凝集素-B4進行整裝免疫染色(whole mount immunostaining)(圖13A)。通過比較無血管面積與總視網(wǎng)膜面積，量化血管再生。通過手工測量新生血管簇的面積，量化新生血管形成。發(fā)現(xiàn)在Lrgl敲除小鼠視網(wǎng)膜中無血管區(qū)域顯著增加(*p < 0. 05)(圖13B)。同樣地，當與野生型小鼠相比較時，在Lrgl敲除小鼠中新生血管簇的數(shù)量顯著減少(**p < 0. 002)(圖 13C)。10.通過添加多克隆抗Lrgl抗體，體外在Matrigel中人臍靜脈內皮細胞(HUVEC) 的管、索和血管形成減少。在Matrigel中，使用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)進行體外管形成試驗。用60 μ 1 的Matrigel每孔包被96孔板。在37°C，5% CO2下，在存在IOOnM的抗人多克隆Lrgl抗體(對全Lrgl糖蛋白培養(yǎng))UOOnM同型IgG或等體積抗體洗脫緩沖液情況下，每個孔用 100 μ 1的包含15，000HUVEC的EGM2培養(yǎng)基處理16小時。洗滌并固定細胞。與添加抗體洗脫緩沖液相比(P < 0.01)或與添加不相關的IgG抗體相比(ρ < 0.05)，添加中和抗人 Lrgl多克隆抗體顯著減少管形成。通過分枝點的數(shù)量(圖14Α)、管數(shù)量(圖14Α)和總管長度(圖14Β)測量管形成。11.在遭受增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的人患者中玻璃體液中Lrgl和TGF β 表達增加。進行人視網(wǎng)膜的免疫組織化學分析，染色視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中檢測的Lrgl (圖 15Α)。從非糖尿病患者和遭受PDR的患者獲取玻璃體液樣品。使用蛋白質印跡確定玻璃體樣品中Lrgl的存在，并通過密度計分析量化(圖15Β)。與非糖尿病患者相比，遭受PDR的患者玻璃體中的Lrgl顯著增加(ρ <0.01)。也通過蛋白質印跡確定玻璃體樣品中TGFii的存在，并如對Lrgl —樣量化(圖15C)。在遭受PDR的患者中TGF^也顯著增加(ρ < 0. 01)。因此，本發(fā)明人已經表明Lrgl表達減少與對視網(wǎng)膜創(chuàng)傷的血管原反應減少相關聯(lián)。Lrgl和TGFii也已經顯示在遭受PDR——其是特征為視網(wǎng)膜新生血管形成增加的病癥——的患者中上調。這支持了下述假設Lrgl經TGFi3-介導的信號傳導參與刺激血管增殖，并且Lrgl拮抗物，尤其是抗體，可用作對抗不期望血管增殖的治療劑。附錄權利要求
1.富亮氨酸α-2-糖蛋白I(Lrgl)拮抗物，用于治療或預防血管增殖病癥。
2.根據(jù)權利要求1所述的Lrgl拮抗物，其中所述拮抗物阻斷TGFβ信號傳導復合體中下列之間的相互作用(a)激活蛋白受體樣激酶1(ALKl)和Lrgl ；(b)Lrgl 禾口 TGF β 受體 II (TGF β RII)；禾口 / 或(c)Lrgl禾口 TGF β。
3.根據(jù)權利要求2所述的Lrgl拮抗物，其中通過所述拮抗物的所述阻斷減少ALK和 Lrgl之間的相互作用，從而減少ALKl和TGFi^受體II (TGF β RII)之間的相互作用并促進TGFi3 RII和激活蛋白受體樣激酶5(ALK5)之間的相互作用，以便相對于TGFi^在所述 ALK5-活化的信號級聯(lián)放大中的作用，減少TGF β在所述ALKl-活化的信號級聯(lián)放大中的作用。
4.根據(jù)前述權利要求任一項所述的Lrgl拮抗物，其包括阻斷Lrgl功能的抗體、雙鏈 RNA、適配體、或肽或模擬肽。
5.根據(jù)權利要求4所述的拮抗物肽，其是Lrgl的片段。
6.根據(jù)權利要求5所述的拮抗物肽片段，其包括下述序列的一個或多個L1-M(SEQ ID NO :3)、L169-192(SEQ ID NO 4)和 L227-252(SEQ ID NO :5)。
7.根據(jù)權利要求6所述的拮抗物肽片段，其包括Lrgl的氨基酸227-252或由其組成。
8.根據(jù)權利要求4所述的拮抗物抗體，其是單克隆抗體。
9.根據(jù)權利要求8所述的拮抗物單克隆抗體，其特異性識別Lrgl的L1-24(SEQID NO 3)、L169-192(SEQ ID NO :4)或 L227-252 (SEQ ID NO :5)的序列中的表位。
10.根據(jù)權利要求9所述的拮抗物單克隆抗體，其特異性識別Lrgl的L227-252(SEQID NO:5)中的表位。
11.根據(jù)權利要求4所述的拮抗物雙鏈RNA，其是短干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。
12.根據(jù)前述權利要求任一項所述的Lrgl拮抗物，用于治療疾病，其中所述血管增殖病癥包括新生血管形成、血管內皮細胞增殖、血管發(fā)生、毛細血管擴張或微動脈瘤。
13.根據(jù)前述權利要求任一項所述的Lrgl拮抗物，用于治療眼睛的血管增殖病癥。
14.根據(jù)權利要求13所述的Lrgl拮抗物，用于治療選自下列的所述眼睛的疾病糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產兒視網(wǎng)膜病變、黃斑毛細血管擴張、老年黃斑退行性病變或脈絡膜新生血管形成。
15.根據(jù)權利要求1至12任一項所述的Lrgl拮抗物，用于治療顯示血管增殖的腫瘤。
16.根據(jù)權利要求15所述的Lrgl拮抗物，用于治療選自下列的腫瘤腦腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、結直腸腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、頭和頸腫瘤、胃腫瘤、胰腺腫瘤、皮膚腫瘤、宮頸腫瘤、骨腫瘤、卵巢腫瘤、睪丸腫瘤和肝腫瘤。
17.根據(jù)前述權利要求任一項所述的Lrgl拮抗物，聯(lián)合抗血管原化合物使用。
18.根據(jù)權利要求17所述的Lrgl拮抗物，其中所述抗血管原化合物是血管內皮生長因子(VEGF)的拮抗物。
19.根據(jù)權利要求18所述的Lrgl拮抗物，其中所述VEGF拮抗物是抗VEGF抗體。
20.鑒定Lrgl的拮抗物方法，包括(a)提供候選拮抗物，和(b)確定所述候選拮抗物是否阻斷所述Lrgl的功能或活性；其中如果觀察到所述Lrgl的功能或活性被阻斷，則所述候選拮抗物被鑒定為Lrgl的拮抗物。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中所述Lrgl拮抗物阻斷下列之間的相互作用(a)激活蛋白受體樣激酶1(ALKl)和Lrgl ；(b)Lrgl 禾口 TGF β 受體 II (TGF β RII)；禾口 / 或(c)Lrgl禾口 TGF β。
22.單克隆抗體，其特異性識別氨基酸Ll-24(SEQ ID NO :3)、氨基酸L169-192 (SEQ ID NO 4)或氨基酸L227-252(SEQ ID NO 5)中的表位并阻斷Lrgl活性。
23.單克隆抗體，其特異性識別氨基酸Ll-24(SEQ ID NO :3)、氨基酸L169-192 (SEQ ID NO 4)或氨基酸L227-252(SEQ ID NO 5)中的表位并阻斷下列之間的相互作用(a)ALKl禾口 Lrgl ；(b)Lrgl 禾口 TGF β 受體 II (TGF β RII)；禾口 / 或(c)Lrgl禾口 TGF β。
24.生產根據(jù)權利要求22或23所述抗體的方法，包括(a)用包括Lrgl ^ L1-24 (SEQ ID NO :3)、L169-192 (SEQ ID NO 4)或 L227-252 (SEQ ID NO 5)的序列中的表位的免疫原免疫非人哺乳動物；和(b)從所述哺乳動物收獲抗體制劑并從其中得到特異性識別所述表位的單克隆抗體。
25.確定Lrgl中哪個位點可被靶向以阻斷Lrgl的功能或活性的方法，包括(a)提供所述Lrgl蛋白的肽片段；和(b)確定所述每個所述肽片段是否阻斷所述Lrgl的功能或活性。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，進一步包括獲得在步驟(b)中發(fā)現(xiàn)的特異性識別肽片段的抗體或適配體以阻斷Lrgl的功能或活性；和任選地進一步包括確定所述抗體或適配體是否阻斷所述Lrgl的功能或活性。
27.所述Lrgl的拮抗物在制造用于治療或預防血管增殖病癥的藥劑中的應用。
28.治療血管增殖病癥的方法，包括向需要其的患者給藥有效量的Lrgl拮抗物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生理學領域。具體而言，本發(fā)明涉及預防和/或治療血管增殖病癥——尤其是眼睛的那些病癥，和治療顯示血管增殖的腫瘤。已經表明在遭受這種病癥的患者中和這種病癥的動物模型中富亮氨酸α-2-糖蛋白(Lrg1)的水平增加。Lrg1的拮抗物可用于預防和/或治療血管增殖病癥。
文檔編號C12N15/113GK102596998SQ201080039413
公開日2012年7月18日 申請日期2010年9月6日 優(yōu)先權日2009年9月4日
發(fā)明者J·格林伍德, S·莫斯, X·王 申請人:Ucl商業(yè)有限公司