專利名稱：：作為ssl替代品的烘焙酶組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新烘焙酶組合物、通過使用所述組合物生產(chǎn)的面團和由此獲得的烘焙產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及新烘焙酶組合物的用途，以在面團或由此獲得的烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)中替代SSL或CSL。
背景技術(shù)：
：為改進面團的處理性質(zhì)和/或烘焙產(chǎn)品的最終性質(zhì)，人們進行連續(xù)的努力來開發(fā)具有改進性質(zhì)的加工助劑。加工助劑在本文中被定義為改進面團的處理性質(zhì)和/或烘焙產(chǎn)品的最終性質(zhì)的化合物?？杀桓倪M的面團性質(zhì)包括穩(wěn)定性、可加工性、氣體保留能力、減小的粘性、彈性、延展性、成型性等等?？杀桓倪M的烘焙產(chǎn)品的性質(zhì)包括條塊(loaf)體積、面包皮脆性、減少起泡、碎屑結(jié)構(gòu)、碎屑柔軟性、風(fēng)味、相關(guān)的陳化(Staleness)和保質(zhì)期。改進這些面團和/或烘焙產(chǎn)品的加工助劑可被分為兩組化學(xué)添加劑和酶(也被稱為烘焙酶)。具有改進性質(zhì)的化學(xué)添加劑包括氧化劑(例如抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二碳酸鹽)、還原劑(例如L-半胱氨酸和谷胱甘肽)、作為面團調(diào)節(jié)劑(例如雙乙酰酒石酸單甘油酯/二甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸鈉(SSL)或硬脂酰乳酸鈣(CSL))或作為碎屑軟化劑(例如甘油一硬脂酸酯(GMS)等等)的乳化劑、脂肪物質(zhì)(例如甘油三酯(脂肪)或卵磷脂)和其他添加劑。在烘焙工業(yè)中應(yīng)用的乳化劑可被粗略分為碎屑軟化劑和面團強化劑。蒸餾單甘油酯主要被用于碎屑軟化。單甘油酯與淀粉的復(fù)合防止淀粉完全再結(jié)晶，所述復(fù)合導(dǎo)致烘焙產(chǎn)品的初始碎屑柔軟和/或保質(zhì)期期間碎屑固化速率降低。對于面團強化，應(yīng)用一些不同的合成的極性脂質(zhì)類似物，例如DATEM、CSL和SSL。它們在面包制造中的作用主要是改進面團穩(wěn)定性。其他面團特征(例如減小的面團粘性、改進的面團可加工性)和改進的烘焙產(chǎn)品特征(例如增大的條塊體積、改進的碎屑結(jié)構(gòu)、改進的碎屑柔軟性和保質(zhì)期)以及改進的面包皮脆性也可得到。DATEM主要在硬皮、條塊型面包中用作化學(xué)乳化劑，而SSL或CSL則在軟面包(例如模制面包、三明治面包和軟卷面包(softrollbun))中發(fā)現(xiàn)其主要應(yīng)用。由于使用更為天然的產(chǎn)品來替代化學(xué)添加劑的消費者驅(qū)使的需要，正在開發(fā)取決于特定的烘焙應(yīng)用情況而具有改進面團和/或烘焙產(chǎn)品性質(zhì)的若干烘焙酶。消費者對化學(xué)添加劑的抵制不斷增強，并因而有使用消費者友好的添加劑和/或酶替代乳化劑的持久需要，所述添加劑和/或酶被認為是加工助劑。但是，當(dāng)省略乳化劑時，面包質(zhì)量被大大降低，例如，對于沒有使用乳化劑(比如SSL或單甘油酯)的非硬皮型面包(例如三明治面包)而言，難以實現(xiàn)3到5天的保質(zhì)期。對面包陳化的研究已表明，在儲存期間面包中的淀粉部分再結(jié)晶，因而引起碎屑硬度增加。淀粉酶和半纖維素酶被廣泛用在面包改進劑中，以改進碎屑柔軟性和條塊體積。α-淀粉酶增加碎屑柔軟性并在烘焙期間部分降解淀粉部分。半纖維素酶分解小麥面粉的半纖維素部分，因而釋放出通常與面粉部分結(jié)合在一起的水進入面團中。在面包改進劑中使用半纖維素酶導(dǎo)致在烘焙期間面團的烘烤膨脹性(ovenspring)改進，烘焙的焙烤產(chǎn)品的條塊體積、細粒結(jié)構(gòu)改進和更好的保持烘焙的焙烤產(chǎn)品的特性。但是，由淀粉酶和半纖維素酶賦予的組合的改進是有限的，并因而仍需要乳化劑——為了獲得可接受的面包特性的保持。DeMaria等人在Appl.Microbiol.Biotechnol.Q007)74:290-300中描述了可用在烘焙工業(yè)中的磷脂酶，特別用來在烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)中部分或全部替代乳化劑例如DATEM、SL或SSL。W002/03805描述了具有不同底物特異性的兩種脂肪分解酶的組合對面團或從面團制得的烘焙產(chǎn)品產(chǎn)生協(xié)同作用并產(chǎn)生了具有改進的體積的烘焙產(chǎn)品和/或在烘焙期間具有更好的形狀保持的烘焙產(chǎn)品。EP0585988描述了一種面包改進劑組合物，其包含脂肪酶、半纖維素酶和淀粉酶，所述組合物優(yōu)選與起酥油組合。所述酶制劑和優(yōu)選地起酥油的組合可替代乳化劑，比如SSL和單甘油酯。由于在烘焙產(chǎn)品制造中減少使用化學(xué)乳化劑(例如SSL或CSL)的新動力，對可在烘焙工藝中替代這些化學(xué)乳化劑的備選或改進的烘焙酶組合物有需要。本發(fā)明的目標(biāo)是提供新烘焙酶組合物，其可在面團和因此產(chǎn)生的烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)中部分或全部替代乳化劑特別是SSL或CSL。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明的第一方面中，公開了包含脂肪分解酶的烘焙酶組合物，所述脂肪分解酶是經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含(a)從根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或該成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少60、70、80或90%同源的氨基酸序列；或(b)由多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸包含(a)如在SEQIDNO=I中展示的核苷酸序列；或核苷酸序列功能等同物，其與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%的同源性；或(b)核苷酸序列，其與是SEQIDNO1的互補體的多核苷酸雜交，并且其中所述核苷酸序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；或(c)核苷酸序列，其編碼從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物與從SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性；或(d)作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，與如在(a)、(b)、(c)的任一中定義的序列簡并的序列；或(e)核苷酸序列，其是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定義的核苷酸序列的互補體；并且其中組合物還包含三酰基甘油脂肪酶，優(yōu)選地從lihizopusoryzae得到的脂肪酶。該烘焙酶組合物還可包含纖維素酶或半纖維素酶，和淀粉葡糖苷酶或這些酶的一種或多種的混合物。根據(jù)本發(fā)明的烘焙組合物還可包含一種或多種其他酶、一種或多種面團改進添加劑和/或面包改進添加劑。在第二方面中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的第一方面的烘焙酶、面粉和一種或多種面團添加劑或面包添加劑的預(yù)混合物。在另一方面中，本發(fā)明提供了包含面粉、水、酵母和根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物或預(yù)混合物的面團。已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，包含根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物的面團具有優(yōu)異的穩(wěn)定性、免遭機械損傷的抗沖擊性和其他性質(zhì)例如良好的延展性和低粘性。根據(jù)本發(fā)明的烘焙組合物的使用消除了面粉可變性的影響，其通過自動緩沖由于季節(jié)變化面粉中的不同脂質(zhì)狀況的變化來實現(xiàn)。在第四方面中，本發(fā)明提供了通過烘焙根據(jù)本發(fā)明的面團可獲得的烘焙產(chǎn)品。還已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的烘焙產(chǎn)品可具有改進的體積和非常良好的碎屑結(jié)構(gòu)(特別是精細的碎屑結(jié)構(gòu))、碎屑柔軟性并因而延長的保質(zhì)期。在另一方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的面團和烘焙產(chǎn)品的方法。本發(fā)明還提供了在面團或因此得到的烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)中使用根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物或預(yù)混合物來替代乳化劑的用途，優(yōu)選替代SSL或CSL的用途。省略SSL和/或CSL形成預(yù)混合物，導(dǎo)致在烘焙產(chǎn)品生產(chǎn)期間成分的處理和儲存工作量減少并允許花費減少，這是由于本發(fā)明的烘焙組合物可以遠低于SSL或CSL的劑量使用。發(fā)明詳述因而，在本發(fā)明的第一方面中，公開了包含脂肪分解酶(下文表示為根據(jù)本發(fā)明的脂解酶)的烘焙組合物，所述脂肪分解酶是經(jīng)分離的多肽，所述經(jīng)分離的多肽包含(a)從根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或該成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少60、70、80或90%同源的氨基酸序列；或(b)由多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸包含(a)如在SEQIDNO=I中展示的核苷酸序列；或核苷酸序列功能等同物，其與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%的同源性；或(b)核苷酸序列，其與是SEQIDNO1的互補體的多核苷酸雜交，并且其中所述核苷酸序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；或(c)核苷酸序列，其編碼從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物與從SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性；或(d)作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，與如在(a)、(b)、(c)的任一中定義的序列簡并的序列；或(e)核苷酸序列，其是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定義的核苷酸序列的互補體；并且其中該組合物還包含三?；视椭久?，優(yōu)選地得自Miizopusoryzae的三?；视椭久?。在烘焙酶組合物中使用的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可在焙烤應(yīng)用中對若干類型的脂起作用，所述脂范圍為甘油酯(例如甘油三酯)、磷脂和糖脂(例如半乳糖脂)。優(yōu)選地，在焙烤應(yīng)用中例如在面團條件下，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶具有對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。該脂肪分解酶被與SEQIDNO=I的核苷酸序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%或最優(yōu)選90%同源性的核苷酸序列所編碼；或者該脂肪分解酶是從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或與從SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%或最優(yōu)選至少90%同源性的成熟多肽功能等同物。將被用在本發(fā)明的烘焙組合物中的優(yōu)選脂肪分解酶是對應(yīng)于從根據(jù)SEQIDNO2(表示為L01)的氨基酸序列得到的成熟多肽的脂肪分解酶，即在SEQIDNO:2中的氨基酸34-304，并且所述氨基酸序列被SEQIDNO=I的核苷酸序列所編碼。更具體地，當(dāng)在面團中現(xiàn)場使用時，用在根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物中的脂肪分解酶顯示了至少一種下述性質(zhì)，優(yōu)選地所有下述性質(zhì)對非極性脂質(zhì)的相對低的活性。對極性二?；|(zhì)(例如二酰基半乳糖脂和/或二?；字?的相對高的活性。對極性單?；衔?例如溶血半乳糖脂(lysogalactolipid)和溶血磷脂)的相對低的活性。當(dāng)在面團中用作化學(xué)乳化劑的替代品時，這些意想不到的性質(zhì)都被發(fā)現(xiàn)是極其有益的。甘油酯是甘油和脂肪酸的酯。甘油三酯(也稱為三酰基甘油或三?；视王?主要在植物油和動物脂肪中存在。脂肪酶(也稱為三?；视椭久?(EC3.1.1.3)在本文中被定義為這樣的酶，其水解在甘油三酯中存在的一種或多種脂肪酸，更具體地，它們水解脂肪酸和甘油部分的羥基之間的酯鍵。糖脂(例如半乳糖脂)由甘油骨架組成，具有在外部(sn-Ι)和中間(sn-2)位置中的兩個酯化的脂肪酸，而第三個羥基與糖殘基(例如半乳糖脂的情況下為半乳糖)結(jié)合，所述糖脂例如單半乳糖甘油二酯(MGDG)或雙半乳糖甘油二酯(DGDG)。半乳糖脂酶(EC3.1.1.26)分別催化來自半乳糖甘油二酯的在sn-Ι和sn-2位置中的一個或兩個脂肪?；乃狻Ａ字筛视凸羌芙M成，具有在外部(sn-Ι)和中間(sn-2)位置中的兩個酯化的脂肪酸，而甘油的第三個羥基被磷酸酯化。磷酸可依次被酯化為例如氨基醇比如乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)、膽堿(磷脂酰膽堿)。磷脂酶在本文中被定義為參與在磷脂中的一個或多個鍵的水解的酶。若干類型的磷脂酶活性可被區(qū)分，所述磷脂酶水解將脂肪酰基部分連接到甘油骨架上的酯鍵磷脂酶Al(EC3.1.1.32)和A2(EC3.1.1.4)分別催化來自二?；视土字脑趕n-Ι和sn-2位置中的一個脂肪?；擋＃援a(chǎn)生溶血磷脂。這對于乳化劑替代品而言是期望的活性。參溶血憐月旨Sl(EC3.1.1.5-也被NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(EnzymeNomenclature,AcademicPress,NewYork,1992)稱為磷脂酶B)催化在溶血磷脂中的剩余脂肪?；乃擒姟Ａ自轮济窧已從Penicilliumnotatum(Saitoetal.,1991,MethodsinEnzymology197:446-456)中報道，其催化來自二?；视土字膬煞N脂肪酸都脫酰并且本質(zhì)上具有溶血磷脂酶活性。就乳化劑替代而言，較不期望溶血磷脂酶活性，因為其會導(dǎo)致極性頭和非極性尾的結(jié)合刪除，使產(chǎn)生的產(chǎn)物失去影響表面性質(zhì)的能力。令人吃驚地顯示，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在面團中顯示相對低的溶血磷脂酶活性。對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂有活性的根據(jù)本發(fā)明的脂解酶可如此用來在面團中替代乳化劑，優(yōu)選替代SSL和/或CSL。相對于其中未被摻進多肽的面團或烘焙產(chǎn)品，當(dāng)脂肪分解酶被以有效量被摻進面團中時，對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂有活性的脂肪分解酶可改進面團或因此獲得的烘焙產(chǎn)品的一種或多種性質(zhì)。術(shù)語“改進的性質(zhì)”在本文中被定義為面團和/或從面團獲得的產(chǎn)品(特別是烘焙產(chǎn)品)的任何性質(zhì)，所述性質(zhì)相對于未被摻進根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶或組合物的面團或產(chǎn)品而言，被根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的作用改進或被根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物改進。改進的性質(zhì)可包括但不限于，增加的面團強度、增加的面團彈性、增加的面團穩(wěn)定性和增加的面團抗沖擊性、減小的面團粘性、改進的面團延展性、改進的面團可加工性、增加的烘焙產(chǎn)品體積、改進的烘焙產(chǎn)品風(fēng)味、改進的烘焙產(chǎn)品碎屑結(jié)構(gòu)、改進的烘焙產(chǎn)品的碎屑柔軟性，減少的烘焙產(chǎn)品起泡和/或改進的烘焙產(chǎn)品的抗陳化性。根據(jù)下述的本發(fā)明的方法，可將添加和不添加本發(fā)明的脂肪分解酶或烘焙酶組合物而制備的面團和/或烘焙產(chǎn)品進行對比來測定改進的性質(zhì)。感官特性可使用在烘焙工業(yè)中明確的流程進行評價，并可包括例如使用一組受過訓(xùn)練的味道測驗人員。術(shù)語“增加的面團強度”在本文中被定義為一般具有更有彈性的面團性質(zhì)和/或需要更多的勞動輸入來制模并成型的面團性質(zhì)。術(shù)語“增加的面團彈性”在本文中被定義為面團在經(jīng)受某些物理張力之后，恢復(fù)其原始形狀的更高趨勢的面團性質(zhì)。術(shù)語“增加的面團穩(wěn)定性”在本文中被定義為對機械損傷更不敏感因而更好地保持其形狀和體積的面團性質(zhì)，其通過正常和/或延長醒發(fā)試驗后的條塊的截面的高度寬度的比率來評價。術(shù)語“減小的面團粘性”在本文中被定義為具有更小的與表面(例如在面團生產(chǎn)機器中)粘附的趨勢的面團性質(zhì)，并如本領(lǐng)域所已知的，由熟練的測試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗評價或通過使用質(zhì)地分析儀(例如TAXD)測量。術(shù)語“改進的面團延展性”在本文中被定義為可經(jīng)受增加的張力或拉伸而不會破裂的面團性質(zhì)。術(shù)語“改進的面團可加工性”在本文中被定義為一般更不粘和/或更堅實和/或更有彈性的面團性質(zhì)。術(shù)語“增加的面團抗沖擊性”在本文中被定義為在經(jīng)歷機械沖擊后保持其形狀和體積的面團性質(zhì)。其通過測定獲得自經(jīng)沖擊的面團的烘焙產(chǎn)品與獲得自沒有經(jīng)歷機械沖擊的同一面團的烘焙產(chǎn)品相比較的體積變化百分比來評價。如果較之由沒經(jīng)沖擊的同一面團獲得的烘焙產(chǎn)品，當(dāng)由沖擊的面團獲得烘焙產(chǎn)品的體積損失盡可能的小或沒有損失時，面團是充分穩(wěn)定的。面團可通過為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法沖擊，例如用在實驗部分中報道的方法。術(shù)語“改進的烘焙產(chǎn)品的體積”是如下測量的使用如本領(lǐng)域中已知的超聲或激光檢測法，通過自動面包體積分析儀(例如BVM-3，TexVolInstrumentsAB,Viken,Sweden)測定給定面包條塊的體積。術(shù)語“減少的烘焙產(chǎn)品的起泡”在本文中被定義為在烘焙面包的面包皮上的起泡可視測定減少。術(shù)語“改進的烘焙產(chǎn)品的碎屑結(jié)構(gòu)”在本文中被定義為在碎屑中具有更細小的氣囊(cell)和/或更薄的氣囊壁和/或在碎屑中具有更均勻/均一的氣囊分布的烘焙產(chǎn)品性質(zhì)，并且如本領(lǐng)域中已知的，其由烘焙者或通過數(shù)字圖像分析(例如C-cell，CalibreControlInternationalLtd，Appleton，Warrington，UK)可視評價。術(shù)語“改進的烘焙產(chǎn)品的柔軟性”是“硬度”的反義詞，并且其在本文中被定義為更容易壓縮的烘焙產(chǎn)品性質(zhì)，并且如本領(lǐng)域中已知的，其由有技術(shù)的測試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗評價或通過使用質(zhì)地分析儀(例如來自MableMicroSystemsLtd,surrey,UK的TAXT2或TA-XTPlus)測量。術(shù)語“改進的烘焙產(chǎn)品風(fēng)味”是通過經(jīng)過訓(xùn)練的測試組評價。術(shù)語“改進的烘焙產(chǎn)品的抗陳化性”在本文中被定義為在儲存期間烘焙產(chǎn)品具有特性參數(shù)(例如柔軟性和/或彈性)劣化速率降低的性質(zhì)。術(shù)語“改進的脆性”在本文中被定義為這樣的烘焙產(chǎn)品性質(zhì)如本領(lǐng)域中已知的，給出比參照產(chǎn)品更脆的感覺，以及比參照產(chǎn)品保持更長時間的該更脆感受?？墒褂美缳|(zhì)地分析儀TA-XTPlus(StableMicroSystemsLtd,Surrey，UK)，通過在壓縮實驗中測量在固定速度下的力對距離的曲線并從該壓縮曲線中獲得物理參數(shù)來量化該性質(zhì)，所述參數(shù)即(i)第一個峰的力，(ii)第一個峰的距離，(iii)初始斜率，(iv)最高峰的力，(ν)曲線圖下的面積和(vi)斷裂事件(力降大于某一預(yù)定值)的數(shù)量。改進脆性的指征是第一個峰的更大的力、第一個峰的更短的距離、更高的初始斜率、最高峰的更大的力、曲線圖下的更大的面積和斷裂事件的更多的數(shù)目。較之參照產(chǎn)品，更脆的產(chǎn)品應(yīng)在這些參數(shù)的至少兩個上統(tǒng)計學(xué)上顯著更好的得分。在本領(lǐng)域中，“脆性”還指脆、松脆(crimchiness)或硬皮(crustiness)，表示具有脆的、松脆的或硬皮的斷裂行為的材料。當(dāng)對甘油酯、磷脂和半乳糖脂有活性的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶被以有效量如此摻進面團中時，面團的若干性質(zhì)(例如面團的強度)和因此獲得烘焙產(chǎn)品的若干性質(zhì)(例如面包體積)可被改進。但是這些改進可能不是完全充分地，特別是當(dāng)烘焙產(chǎn)品是軟的、非硬皮類型例如模制面包或三明治面包、卷面包(rolls)、圓面包(buns)例如漢堡包圓面包或酵母發(fā)酵的圈餅時。因而，SSL或CSL仍需要作為成分被添加至面包，以獲得期望的面團特征和烘焙產(chǎn)品特征。已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)三?；视椭久负透鶕?jù)本發(fā)明的脂肪分解酶被以有效量添加至用來生產(chǎn)烘焙產(chǎn)品(例如模制面包)的面團時，可獲得有良好強度、改進的穩(wěn)定性和可加工性的面團，而相應(yīng)的烘焙產(chǎn)品可顯示改進的面包體積和細小的碎屑結(jié)構(gòu)。包含有效量的三酰基甘油脂肪酶和根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的面團可具有穩(wěn)定性質(zhì)，所述性質(zhì)類似于其中被摻進SSL或CSL的那些面團。三?；视椭久竷?yōu)選地是真菌脂肪酶，優(yōu)選地得自lihizopus、Aspergillus、Candida、Penicillum、Thermomyces或Rhizomucor。更優(yōu)選地，使用得自Rhyzopus的三酉先基甘油脂肪酶，更優(yōu)選地，使用得自Miyzopusoryzae的三?；视椭久浮Ｈ芜x地，可使CN102549150A用兩種或多種三?；视椭久傅慕M合。因而，在本發(fā)明的另一實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物還包含兩種或多種三酰基甘油脂肪酶的組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物還包含半纖維素酶或纖維素酶，優(yōu)選包含纖維素酶。任選地，可使用兩種或多種半纖維素酶的組合和/或兩種或多種纖維素酶的組合和/或一種或多種半纖維素酶與一種或多種纖維素酶的組合。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，相對于包含三?；视椭久负透鶕?jù)本發(fā)明的脂肪分解酶而沒有半纖維素酶或纖維素酶的面團而言，當(dāng)包含三?；视椭久?、半纖維素酶或纖維素酶(優(yōu)選地纖維素酶)和根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的烘焙組合物被以有效量添加至用來生產(chǎn)烘焙產(chǎn)品(例如模制面包、三明治面包、圓面包例如漢堡包圓面包、卷面包和酵母發(fā)酵的圈餅)的面團時，面團和從面團獲得的烘焙產(chǎn)品的性質(zhì)可被進一步改進。特別可獲得進一步改進的體積和/或更細小的碎屑結(jié)構(gòu)和/或碎屑柔軟性。特別地，使用得自A.niger或得自Trichodermareesei的纖維素酶可獲得好的結(jié)^ο在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物還包含淀粉葡糖苷酶，優(yōu)選地，得自Aspergillus(例如得自A.oryzae或A.niger)的淀粉葡糖苷酶，更優(yōu)選地得自A.niger的淀粉葡糖苷酶。令人吃驚地，相對于包含三?；视椭久浮肜w維素酶或纖維素酶和根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶而沒有淀粉葡糖苷酶的面團而言，當(dāng)包含三酰基甘油脂肪酶、半纖維素酶或纖維素酶(優(yōu)選地纖維素酶)、淀粉葡糖苷酶和根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的烘焙酶組合物被以有效量摻進面團時，面團和因此獲得的烘焙產(chǎn)品的特性可被進一步改進。產(chǎn)生的面團可具有優(yōu)越特性例如改進的穩(wěn)定性和/或增大的抗沖擊性，改進的可加工性、良好蓬松性并且相應(yīng)的產(chǎn)品可具有極好的體積、細小碎屑結(jié)構(gòu)和/或碎屑柔軟性，并且因而其可具有延長的保質(zhì)期。這些改進允許在面團中完全替換SSL或CSL。根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物還可包含額外的酶和/或面團添加劑和/或面包添加劑。額外的酶可以是任何來源，包括哺乳動物和植物，并且優(yōu)選地是微生物(細菌、酵母或真菌)來源，并可通過本領(lǐng)域中常規(guī)使用的技術(shù)獲得。額外的酶可以是淀粉酶(例如α-淀粉酶(用于通過酵母可發(fā)酵地提供糖并延緩陳化)、β-淀粉酶、生麥芽糖淀粉酶或非生麥芽糖淀粉酶)、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶、肽酶特別是外肽酶(在風(fēng)味增強中有用)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、半纖維素酶(例如特別是戊聚糖酶，例如木糖酶(用于戊聚糖，更具體地阿拉伯木聚糖的部分水解，其增加面團的延展性))、蛋白酶(用于麩質(zhì)弱化，特別是使用硬面粉時)、蛋白二硫化異構(gòu)酶(例如在WO95/00636中公開的蛋白二硫化異構(gòu)酶)、糖基轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶(用于改進面團稠度)、漆酶或氧化酶、己糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶)、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶或L-氨基酸氧化酶(在改進面團稠度中有用)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的烘焙組合物還包含生麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)時，將組合物添加至面團導(dǎo)致因此獲得的烘焙產(chǎn)品具有改進的碎屑柔軟性并因而提高保質(zhì)期。在面團和面包制造中，根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物可與其他面包或面團成分或添加劑結(jié)合使用，所述面包或面團成分或添加劑例如鹽、化學(xué)加工助劑比如氧化劑(例如抗壞血酸)、還原劑(例如L-半胱氨酸)和/或乳化劑(例如DATEM、SSL和/或CSL)和/或酶加工助劑例如氧化還原酶(例如葡糖氧化酶)、多糖修飾酶(例如α-淀粉酶、半纖維素酶、支鏈酶等等)和/或蛋白修飾酶(內(nèi)切蛋白酶、外切蛋白酶、支鏈酶等等)。優(yōu)選地，用來制造烘焙產(chǎn)品或面團的添加劑不包含SSL和/或CSL，更優(yōu)選地，它們不包含選自SSL、CSL、DATEM、GMS的乳化劑，更優(yōu)選地不包含乳化劑。在第二方面中，本發(fā)明提供了包含面粉、一種或多種如本文前文所述的面包或面團添加劑和根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物的預(yù)混合物。術(shù)語“預(yù)混合物”在本文中具有以其常規(guī)意思所理解的定義，即烘焙劑的混合物，所述混合物通常包括面粉，其不僅可被用在工業(yè)面包烘焙車間/設(shè)備中，還被用在零售面包店中?？赏ㄟ^將本發(fā)明的烘焙酶組合物與合適的載體例如面粉、淀粉、糖、復(fù)合糖(例如麥芽糊精)或鹽混合來制備預(yù)混合物。預(yù)混合物可含有其他面團和/或面包添加劑，例如上述的任何添加劑，包括酶。在另一方面中，本發(fā)明公開了制備面團的方法，其包括將根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物或預(yù)混合物添加到至少包含面粉、水和酵母的面團成分中。從上述成分和面包或面團添加劑制備面團是本領(lǐng)域熟知的，所述制備包括將所述成分和添加劑混合以及一步或多步制模(moulding)和發(fā)酵步驟。在另一方面中，本發(fā)明提供了包含面粉、水、酵母和有效量的根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物或預(yù)混合物的面團。本發(fā)明還涉及制備面團或烘焙產(chǎn)品的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的烘焙酶組合物摻進面團中，相對于其中未被摻入多肽的面團或烘焙產(chǎn)品而言，所述烘焙酶組合物改進了面團或從面團獲得的烘焙產(chǎn)品的一種或多種性質(zhì)。短語“摻進面團中”在本文中被定義為將根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物添加至面團、面團將從中制備的任何成分和/或面團將從中制備的面團成分的任何混合物。換句話說，本發(fā)明的烘焙酶組合物可在面團制備的任何步驟中添加并可在一個、兩個或多個步驟中添力口。使用本領(lǐng)域熟知的方法，將組合物添加至被揉捏并被烘焙的面團成分中，以制造烘焙產(chǎn)品。見，例如，美國專利No.4，567，046、EP-A-426,211,JP-A-60-78529,JP-A-62-111629和JP-A-63-258528o術(shù)語“有效量”在本文中被定義為根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物的量，所述量足以就面團和/或烘焙產(chǎn)品的感興趣的至少一種性質(zhì)提供可測量的作用。術(shù)語“面團”在本文中被定義為面粉和其他成分的混合物，其足夠堅實，以進行揉捏或卷。面團可以是新鮮的、冷凍的、制備的或預(yù)烘焙的。冷凍面團的制備由Kulp和Lorenz在“Frozen禾口RefrigeratedDoughs禾口Batters”，K.Kulp,K.Lorenz,J.Brummer,Editors,AmericanAssociationofCerealChemists，Publisher(1995)中描述。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以每kg面粉至少3.57DLU單位的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶(例如L01)，優(yōu)選地至少7.15DLU/kg面粉，更優(yōu)選地至少14.30DLU/kg面粉的量添加至面團。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以至多143DLU/kg面粉的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶，優(yōu)選地至多71.50DLU/kg面粉、更優(yōu)選地至多35.75DLU/kg面粉的量添加至面團。以DLU單位形式表述的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的活性可如在“材料和方法”中所示的測量。根據(jù)本發(fā)明，面團還包含三酰基甘油脂肪酶。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，三?；视椭久缚梢悦縦g面粉至少80PLI單位的三酰基甘油脂肪酶，優(yōu)選地至少160PLI/kg面粉，更優(yōu)選地至少320PLI/kg面粉的量被添加至面團。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，三?；视椭久缚梢灾炼?200PLI/kg面粉的三?；视椭久?，優(yōu)選地至多1600PLI/kg面粉、更優(yōu)選地至多800PLI/kg面粉的量添加至面團。以PLI單位形式表述的三?；视椭久傅幕钚钥扇缭凇安牧虾头椒ā敝兴镜臏y量。根據(jù)本發(fā)明的面團還可包含纖維素酶。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，纖維素酶可以每kg面粉至少2.34CXU單位的纖維素酶，優(yōu)選地至少4.68CXU/kg面粉、更優(yōu)選地至少7.5CXU/kg面粉、甚至更優(yōu)選地至少9.36CXU/kg面粉、甚至更優(yōu)選地至少15CXU/kg面粉、最優(yōu)選地至少23.4CXU/kg面粉的量被添加至面團。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，纖維素酶可以至多300CXU/kg面粉的纖維素酶的量、優(yōu)選地以至多150CXU/kg面粉、更優(yōu)選地至多93.6CXU/kg面粉、甚至更優(yōu)選地至多75CXU/kg面粉、甚至更優(yōu)選地至多46.8CXU/kg面粉、最優(yōu)選地至多30CXU/kg面粉的量被添加至面團。以CXU單位形式表述的纖維素酶的活性可如在“材料和方法”中所示的測量。根據(jù)本發(fā)明，面團還可包含淀粉葡糖苷酶。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，淀粉葡糖苷酶可以每kg面粉至少130AGI單位的淀粉葡糖苷酶、優(yōu)選地至少^OAGI/kg面粉、更優(yōu)選地至少520AGI/kg面粉的量添加至面團。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，淀粉葡糖苷酶可以至多5200AGI/kg面粉的淀粉葡糖苷酶，優(yōu)選地至多^00AGI/kg面粉、更優(yōu)選地至多1300AGI/kg面粉的量被添加至面團。以AGI單位形式的淀粉葡糖苷酶的活性可如在“材料和方法”中所示的測量。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的面團基本上不含SSL和/或CSL，優(yōu)選地，其基本上不含選自SSL、CSL、DATEM、GSM的乳化劑，更優(yōu)選地，其基本上不含乳化劑。一般而言，在面團中常用的SSL和/或CSL的量為0.1-0.5%w/w，所述量基于面團中存在的面粉。根據(jù)本發(fā)明的烘焙組合物特別是以上述的量被添加至面團時，所述烘焙組合物可完全替代在面團中存在的上述量的SSL或CSL。在其中SSL主要被用作碎屑軟化劑和抗陳化劑而沒有其他軟化體系被添加至面包制造工藝的應(yīng)用中，通過根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物與生麥芽糖淀粉酶組合使用，可實現(xiàn)益處，并且對于替代的每0.1%SSL，使用l_2ppm的生麥芽糖淀粉酶可以是有用的。在另外方面中，本發(fā)明提供了制備烘焙產(chǎn)品的方法，其包括烘焙根據(jù)本發(fā)明的面團的步驟。本發(fā)明還提供了通過烘焙根據(jù)本發(fā)明的面團可獲得的烘焙產(chǎn)品。從此類面團制備烘焙產(chǎn)品也是本領(lǐng)域熟知的，并且其可包括面團的制模和成型和進一步發(fā)酵，隨后在需要的溫度和烘焙時間下烘焙。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了制備烘焙產(chǎn)品的方法，其包括烘焙根據(jù)本發(fā)明的面團的步驟。本發(fā)明還提供了根據(jù)該方法可獲得的烘焙產(chǎn)品。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的烘焙產(chǎn)品是面包，更優(yōu)選地，烘焙產(chǎn)品是軟性的烘焙產(chǎn)品，例如模制面包、三明治面包、圓面包或卷面包。術(shù)語“烘焙產(chǎn)品”在本文中被定義為從面團制備的任何產(chǎn)品，其或者是軟性的產(chǎn)品或者是脆性的產(chǎn)品。優(yōu)選地，烘焙產(chǎn)品是軟性的烘焙產(chǎn)品，優(yōu)選地是軟性的面包，例如模制面包、三明治面包、圓面包或卷面包。可通過本發(fā)明有利地進行生產(chǎn)的烘焙產(chǎn)品的其他例子，不論是白色的、淺色的或深色類型，是面包(特別是白面包、粗面粉面包或黑麥面包)——典型地以塊或卷的形式、法國棍子面包、油酥面(pastries)、羊角面包、面糊、面條(煮熟的或(炒的)油炸的)、皮塔餅、玉米餅、玉米面豆卷、蛋糕、松餅、薄烤餅、餅干、小甜餅、圈餅、妙脆角(bagles)、派皮(piecrust)、饅頭和薄脆餅干(crispbread)等等。本發(fā)明還提供了在面團或因此得到的烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)中使用根據(jù)本發(fā)明的烘焙組合物或預(yù)混合物來替代SSL或CSL的用途，優(yōu)選地替代選自SSL、CSL、DATEM、GMS的乳化劑的用途，優(yōu)選地替代所有乳化劑的用途。下文還描述了在焙烤應(yīng)用中對三酰甘油酯、磷脂和半乳糖脂有活性的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶以及編碼脂肪分解酶的多核苷酸(下文表示為根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸)。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸包含選自下述的核苷酸序列(a)如在SEQIDNO1中展示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%的同源性；(b)核苷酸序列，其與是SEQIDNO1的互補體的多核苷酸雜交，并且其中所述序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；(c)核苷酸序列，其編碼根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物與SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少具有60、70、80或90%的同源性；(d)作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，與如在(a)、(b)、(c)的任一定義的序列簡并的序列；(e)核苷酸序列，是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定義的核苷酸序列的互補體。特別地，本發(fā)明提供了具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下與SEQIDNO1的互補體的多核苷酸雜交，并且其中所述序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源。因此，本發(fā)明提供了與根據(jù)SEQIDN0:1的序列至少90%，優(yōu)選地至少91%，更優(yōu)選地至少92%、93%、94%、95%，甚至更優(yōu)選地至少96%、97^^98%或99%同源的多核苷酸。在一種實施方式中，例如通過固相合成或通過為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法合成獲得此類經(jīng)分離的多核苷酸。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)SEQIDNO1的脂肪分解酶基因或仍然編碼活性脂肪分解酶的功能等同物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸是DNA序列。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列的載體以及用來擴增或探測根據(jù)本發(fā)明的DNA的引物、探針和片段。在另外優(yōu)選的實施方式中，提供了這樣的載體，在載體中根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作地連接，所述調(diào)節(jié)序列允許多核苷酸序列在合適的宿主細胞中表達。優(yōu)選地，所述合適的宿主細胞是絲狀真菌，更優(yōu)選地是Aspergillus物種。合適的菌株屬于Aspergillusniger、oryzae或nidulans。優(yōu)選地，宿主細胞是Aspergillusniger。本發(fā)明還涉及重組產(chǎn)生的宿主細胞，所述宿主細胞含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明還提供了用于制備根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和載體的方法。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了這樣的重組宿主細胞，其中根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的表達顯著增加或其中脂肪分解活性的生產(chǎn)水平被顯著改進。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了重組生產(chǎn)的宿主細胞，所述宿主細胞含有根據(jù)本發(fā)明的異源或同源DNA并且其中所述細胞能生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的功能性脂肪分解酶，即其能表達或優(yōu)選地過表達編碼根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的多核苷酸，所述宿主細胞例如包含增加拷貝數(shù)目的根據(jù)本發(fā)明的基因的Aspergillus菌株。還在本發(fā)明的另一方面中，提供了具有脂肪分解活性的經(jīng)分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽包含選自下述的氨基酸序列(a)從根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或該成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有與從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽至少60、70、80或90%同源的氨基酸序列。在一種實施方式中，本發(fā)明還涉及具有脂肪分解活性的經(jīng)分離的多肽，其是從SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的功能等同物，其與所述成熟多肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%同源。包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的融合蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了制造根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法。本發(fā)明還涉及在根據(jù)本發(fā)明的烘焙酶組合物中使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。多核苷酸本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多核苷酸，其包含選自下述的核苷酸序列(a)如在SEQIDNO1中展示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%同源性；(b)核苷酸序列，其與是SEQIDNO1的互補體的多核苷酸雜交，并且其中所述序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；(c)核苷酸序列，其編碼從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物與從SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性；(d)作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，與如在(a)、(b)、(c)的任一中定義的序列簡并的序列；(e)核苷酸序列，是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定義的核苷酸序列的互補體。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了編碼脂肪分解酶的多核苷酸，所述脂肪分解酶具有對應(yīng)于從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列或氨基酸序列功能等同物，所述功能等同物與對應(yīng)于從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列具有至少60、70、80或90%同源性。在本發(fā)明上下文中，“成熟多肽”在本文中被定義為具有脂肪分解酶活性的多肽，所述多肽是翻譯和任何翻譯后修飾(N末端處理、C末端截短、糖基化、磷?；鹊?后的其最終形式。成熟化工藝可取決于使用的特定表達載體、表達宿主和生產(chǎn)工藝。優(yōu)選地，成熟多肽是氨基酸序列SEQIDNO:2中的氨基酸34到304?！熬幋a成熟多肽的核苷酸序列”在本文中被定義為編碼成熟多肽的多核苷酸序列。優(yōu)選地，編碼成熟多肽的核苷酸序列是SEQIDNO1中的核苷酸100到912。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及編碼具有脂肪分解活性的經(jīng)分離的下述多肽的經(jīng)分離的多核苷酸，所述多肽是從SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的功能等同物，其與所述成熟多肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%同源。本發(fā)明提供了這樣的多核苷酸序列，其包含編碼脂肪分解酶的基因以及脂肪分解酶編碼序列。因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列的經(jīng)分離的多核苷酸，或涉及與SEQIDN0:1具有至少60、70、80或90%同源性的多核苷酸變體，例如多核苷酸功能等同物。特別地，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其包含優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選地在高度嚴(yán)格條件下與根據(jù)SEQIDNO:1的多核苷酸的互補體雜交的核苷酸序列，并且其中優(yōu)選地，所述序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源。更具體地，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列或基本上由根據(jù)SEQIDNO1的核苷酸序列組成。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過合成獲得此類經(jīng)分離的多核苷酸。如本文中使用的，術(shù)語“基因”和“重組基因”指可從染色體DNA中分離、包括編碼蛋白(例如脂肪分解酶)的開放閱讀框的核酸分子。基因可包括編碼序列、非編碼序列、內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列。此外，基因是指如本文所定義的經(jīng)分離的核酸分子或多核苷酸。可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息來分離本發(fā)明的核酸分子(例如具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子或其功能等同物)。例如，使用SEQIDNO:1的所有或部分核酸序列作為雜交探針，可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如，如在Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,andManiatis,Τ.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY，1989中描述的)分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來分離包括SEQIDNO:1的全部或部分的核酸分子，所述引物以SEQIDNO1中包含的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計?？墒褂胏DNA、mRNA或基因組DNA作為模板，并使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锔鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增技術(shù)，來擴增本發(fā)明的核酸。這樣擴增的核酸可被克隆進適當(dāng)?shù)妮d體中并通過DNA序列分析被表征。另外，可通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如使用自動DNA合成儀)制備下述寡核苷酸，所述寡核苷酸對應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的互補體或可與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的互補體雜交。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含根據(jù)SEQIDNO1的核苷酸序列。SEQIDNO1的序列編碼根據(jù)SEQIDNO2的多肽和根據(jù)SEQIDNO2中的成熟多肽的脂肪分解酶。根據(jù)在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的脂肪分解酶被表示為LOl。根據(jù)SEQIDNO1的核苷酸序列被表示為DNALOl。在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列的互補體或這些核苷酸序列的功能等同物。與其他核苷酸序列互補的核酸分子是與該其他核苷酸序列足夠互補，從而其能夠與該其他核苷酸序列雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分子。本發(fā)明的一個方面涉及經(jīng)分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的多肽或其變體，例如其功能等同物，例如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域，以及涉及足夠用作雜交探針(以鑒定編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子)的核酸分子，和適于用作PCR引物(用于擴增或突變核酸分子)的此類核酸分子的片段?！敖?jīng)分離的多核苷酸”或“經(jīng)分離的核酸”是與DNA或RNA來源的天然存在的生物基因組中緊鄰的兩條編碼序列(一個在5’端，一個在3’端)不是都緊鄰的DNA或RNA。因此，在一個實施方式中，經(jīng)分離的核酸包含與編碼序列緊鄰的部分或所有5’非編碼(例如啟動子)序列。該術(shù)語因此包括例如被整合進載體、整合進自主復(fù)制的制粒或病毒、或整合進原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或作為不依賴于其它序列的獨立分子(例如通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括編碼下述額外多肽的雜交基因的一部分的重組DNA，所述額外多肽基本不含細胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基(通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時)或化學(xué)前體或其它化學(xué)品(化學(xué)合成時)。另外，“經(jīng)分離的核酸片段”是天然不作為片段存在并且在天然狀態(tài)下不被發(fā)現(xiàn)的核酸片段。如本文中使用的，術(shù)語“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA?？梢允褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)來合成核酸。這類寡核苷酸可被用于例如制備核酸，所述核酸具有改變的堿基配對能力或提高的核酸酶抗性。本發(fā)明的另一實施方式提供了經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸分子與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子是反義的，例如根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的編碼鏈。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的補體鏈也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。核酸片段、探針和引物根據(jù)本發(fā)明的引物核酸分子可僅包含根據(jù)SEQIDNO:1的核酸序列的部分或片段，例如可用作探針或引物的片段或編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的部分的片段。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列允許產(chǎn)生探針和引物，所述探針和引物被設(shè)計用于鑒定和/或克隆根據(jù)本發(fā)明的蛋白的功能等同物，所述功能等同物與根據(jù)SEQID而2的蛋白具有至少60、70、80或90%同源性。探針/引物典型地包含基本上被純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列區(qū)域，所述核苷酸序列區(qū)域優(yōu)選地在高度嚴(yán)格條件下與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的至少大約12或15，優(yōu)選地大約18或20，優(yōu)選地大約22或25，更優(yōu)選地大約30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多個相鄰的核苷酸雜交。以根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列為基礎(chǔ)，更優(yōu)選地以SEQIDNO1為基礎(chǔ)的探針可被用來探測轉(zhuǎn)錄本或基因組序列，所述轉(zhuǎn)錄本或基因組序列編碼例如生物中的相同蛋白或同源蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，探針還包含與之結(jié)合的標(biāo)簽基團，例如標(biāo)簽基團可以是放射性同位素、熒光化合物、酶、輔酶因子。此類探針還可被用作診斷測試試劑盒的部分，所述試劑盒用于鑒定表達根據(jù)本發(fā)明的蛋白的細胞。同一性&同源性術(shù)語“同源性”或“百分比同一性”在本文中可互換使用。針對本發(fā)明的目的，在CN102549150A這里定義，為測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分比同源性，為最佳比較目的而比對序列。為了優(yōu)化兩個序列之間的比對，在被比較的兩個序列中的任一序列中引入缺口(gap)。此類比對可在將被比較的序列的全長上進行?；蛘?，比對可在較短的長度上進行，例在大約20，大約50，大約100或更多的核酸/堿基或氨基酸上進行。同一性是在報告的比對區(qū)域上的兩個序列之間的相同匹配的百分比?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法完成兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白下述事實可利用若干種不同的計算機程序來比對兩條序列并測定兩條序列之間的同源性(Kruskal,J.B.(1983)AnoverviewofsquencecomparisonInD.Sankoff禾口J.B.Kruskal,(ed.),Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison,pp.1-44AddisonWesley)可使用用于兩條序列比對的Needleman和Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)，測定兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列之間的百分比同一性。氨基酸序列和核苷酸序列兩者都可通過算法比對。Needleman-Wunsch算法已在計算機程序NEEDLE中實現(xiàn)。針對本發(fā)明目的，使用了來自EMBOSS包(版本2.8.O或更高版本，EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)Rice,P.Longden,I.禾口Bleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)pp276-277,http://emboss,bioinformatics.nl/)的NEEDLE程序。針對蛋白序列，EBL0SUM62被用做替換矩陣。針對核苷酸序列，使用了EDNAFULL。使用的任選參數(shù)是缺口空白罰分10和缺口延伸罰分0.5。技術(shù)人員會意識至IJ，所有這些不同的參數(shù)將產(chǎn)生稍微不同的結(jié)果，但是當(dāng)使用不同的算法時，兩個序列的整體百分比同一性不被顯著改變。如上述的，通過程序NEEDLE進行比對后，查詢序列和本發(fā)明的序列之間的同一性的百分比如下計算在兩個序列中都顯示相同的氨基酸或相同的核苷酸的比對中的對應(yīng)位置的數(shù)目除以減去比對中的總?cè)笨跀?shù)目后的總比對長度。通過使用N0BRIEF選項，本文中定義的同一性可從NEEDLE中獲得并在程序的輸出中被標(biāo)記為“最長的同一性”。本發(fā)明的核酸和蛋白序列還可以被用作“查詢序列”，針對公開數(shù)據(jù)庫進行搜索，以例如鑒定其它家族成員或相關(guān)序列。這類搜索可以使用AltschuLetal.(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行?？梢允褂肗BLAST程序(計分=100，字長=20)進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(計分=50，字長=3)進行BLAST蛋白搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得加缺口的比對用于比較的目的，可以如Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述使用GappedBLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序時，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數(shù)。見http://wwwncbi.nlm.nih.gov下的NationalCenterforBiotechnologyInformation的主頁。雜交如本文使用的，術(shù)語“雜交”旨在描述用于下述雜交和洗滌的條件，典型地，在所述條件下彼此至少大約60%，65%，80%，85%，90%，優(yōu)選地至少93%，更優(yōu)選地至少95%和最優(yōu)選地至少98%同源的核苷酸序列保持與彼此的互補體雜交。這類雜交條件的一個優(yōu)選的非限制性例子是于約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50°C、優(yōu)選55°C、優(yōu)選60°C和甚至更優(yōu)選65°C下，在IXSSC、0.1%SDS中洗滌一次或多次。高度嚴(yán)格條件包括例如于68°C下在切SSC/5xDenhardt，s溶液/1.0%SDS中雜交并于室溫下在0.2xSSC/0.1%SDS中洗滌?；蛘?，洗滌可以在42°C進行。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對于嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件而言應(yīng)用何種條件。涉及這類條件的其它指示在該領(lǐng)域能夠容易地獲得，例如在Sambrooketal.，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.；禾口Ausubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當(dāng)然，僅與多聚A(polyΑ)序列(例如mRNA的3’末端多聚(A))或互補的T(或U)殘基段雜交的多核苷酸不應(yīng)被包括于用來與本發(fā)明的核酸部分特異雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因為這類多核苷酸會與含有多聚(A)段或其補體的任何核酸分子(例如尤其是任何雙鏈cDNA克隆)雜交。從其它生物獲得全長DNA以一種典型的途徑，來篩選從其它生物(例如絲狀真菌，尤其是來自Fusarium的種)構(gòu)建的cDNA文庫。例如，可以通過Northern印跡針對SEQIDNO:1的同源多核苷酸篩選Fusarium菌株。檢測到與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄物后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從分離自適當(dāng)菌株的RNA構(gòu)建cDNA文庫?；蛘?，可以使用能夠與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸雜交的探針來篩選總基因組DNA文庫?？梢岳缤ㄟ^進行PCR分離同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計的兩個簡并寡核苷酸引物池。用于反應(yīng)的模板可以是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA，所述mRNA從已知或懷疑表達本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備。可以對PCR產(chǎn)物進行亞克隆和測序，以確保被擴增的序列代表了根據(jù)本發(fā)明的新核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通過多種已知方法，使用PCR片段來分離全長cDNA克隆。例如，被擴增的片段可以被標(biāo)記，并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫?；蛘?，被標(biāo)記的片段可以被用于篩選基因組文庫。也可以用PCR技術(shù)來從其它生物中分離全長cDNA序列。例如，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟從合適的細胞或組織來源中分離RNA?？梢允褂锰禺愑诒粩U增片段最5’端的寡核苷酸引物，引導(dǎo)第一鏈合成，針對RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)將得到的RNA/DNA雜交體“加尾”(例如用鳥嘌呤)，可以用RNaseH消化所述雜交體，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二鏈合成。因此，被擴增片段上游的cDNA序列可以容易地被分離。有用的克隆策略的綜述，參閱例如上文Sambrooketal.禾口上文的Ausubeletal.。載體本發(fā)明的另一方面涉及包括克隆的載體和涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列的表達載體，所述多核苷酸序列編碼根據(jù)本發(fā)明的具有脂肪分解活性的多肽或其功能等同物。本發(fā)明還涉及，例如在其中本發(fā)明的多肽的表達發(fā)生的情況下，在合適的宿主細胞中培育、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染此類載體的方法。如本文中使用的，術(shù)語“載體”指能夠轉(zhuǎn)運與之連接的另一核酸的核酸分子。本發(fā)明的多核苷酸可被整合進重組可復(fù)制載體，例如克隆或表達載體中。載體可用來在適宜的宿主細胞中復(fù)制核酸。因而，在其他實施方式中，本發(fā)明提供了制造本發(fā)明的多核苷酸的方法，其通過將本發(fā)明的多核苷酸引進可復(fù)制載體、將載體引進適宜的宿主細胞并在致使載體復(fù)制的條件下培育宿主細胞來實現(xiàn)。載體可從宿主細胞回收。下文描述了合適的宿主細胞。被表達盒或本發(fā)明的多核苷酸插入的載體可以是可方便地經(jīng)受重組DNA程序的任何載體，并且載體的選擇通常取決于其將被引入的宿主細胞。根據(jù)本發(fā)明的載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是這樣的載體，當(dāng)被引進宿主細胞時，其被整合進宿主細胞基因組中并與已被整合進載體的染色體一起復(fù)制。一種類型的載體是“質(zhì)粒”，質(zhì)粒是指其中可以連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可以被連接進病毒基因組中。某些載體在它們被引入的宿主細胞中能夠自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動物載體)在引入宿主細胞時被整合進宿主細胞的基因組中，從而隨宿主細胞的基因組一起被復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達。這類載體在本文中被稱作“表達載體”。一般而言，重組DNA技術(shù)中使用的表達載體通常是以質(zhì)粒的形式存在的。術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”在本文中可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這類表達載體的起等同作用的其它形式，例如粘粒(cosmid)、病毒載體(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)和噬菌體載體。根據(jù)本發(fā)明的載體可在體外使用，例如用于產(chǎn)生RNA或用來轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。本發(fā)明的載體可包含兩種或多種，例如三種、四種或五種本發(fā)明的多核苷酸，例如用于過表達。本發(fā)明的重組表達載體以適合核酸在宿主細胞中表達的形式包含本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達載體包括一個或多個與待表達的核酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，以要用于表達的宿主細胞為基礎(chǔ)選擇所述調(diào)節(jié)序列。在重組表達載體中，“可操作地連接”旨在表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中或當(dāng)載體被引入宿主細胞中時在宿主細胞中)的方式連接，即術(shù)語“可操作地連接”是指這樣的結(jié)合，其中所述的元件處于以它們期望的方式允許它們發(fā)揮作用的關(guān)系中。與編碼序列“可操作地連接的”調(diào)節(jié)序列(例如啟動子、增強子或其他表達調(diào)節(jié)信號)以這樣的方式放置，使得在與對照序列相容的條件下實現(xiàn)編碼序列的表達，或該序列被排列使得它們共同發(fā)揮期望的目的，例如在啟動子處開始轉(zhuǎn)錄并繼續(xù)進行貫穿編碼多肽的整個DNA序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel；GeneExpressionTechnology=MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。術(shù)語調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達的那些序列和僅在某種宿主細胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達的那些序列(例如組織特異調(diào)節(jié)序列)。針對給定宿主細胞，載體或表達構(gòu)建體可因而包含，以相對于編碼第一個發(fā)明多肽的序列的編碼鏈的從5’-末端到3’-末端的連續(xù)順序彼此可操作地連接的下述元件(1)啟動子序列，其能指導(dǎo)編碼多肽的核苷酸序列在給定宿主細胞中轉(zhuǎn)錄；(任選地，信號序列，其能指導(dǎo)多肽從給定宿主細胞分泌進培養(yǎng)基中；C3)編碼成熟多肽并且優(yōu)選地編碼多肽的活性形式的DNA序列，所述多肽具有根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解活性；和優(yōu)選地(4)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(終止子)，其能終止編碼多肽的下游核苷酸序列轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明的下游核苷酸序列可以是含有一個或多個轉(zhuǎn)錄終止位點(例如終止子)的3’非翻譯區(qū)。終止子的來源不太關(guān)鍵。終止子可以是例如編碼多肽的DNA序列的天然終止子。但是，優(yōu)選地，酵母終止子被用在酵母宿主細胞中，絲狀真菌終止子被用在絲狀真菌宿主細胞中。更優(yōu)選地，終止子對宿主細胞(其中編碼多肽的核苷酸序列將被表達)而言是內(nèi)源的。在轉(zhuǎn)錄區(qū)，可存在用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。構(gòu)建體表達的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分應(yīng)包含位于起點的翻譯起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥诖g多肽末端的終止密碼子?？赏ㄟ^選擇異源性調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子、分泌前導(dǎo)區(qū)和/或終止子區(qū))來實現(xiàn)本發(fā)明的多核苷酸的增強表達，所述異源性調(diào)節(jié)區(qū)可用來增加表達并且必要時來增加感興趣的蛋白從表達宿主中的分泌水平和/或用作提供對本發(fā)明的多肽的表達的可誘導(dǎo)的控制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對表達載體的設(shè)計可取決于下述因素待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、期望的蛋白表達水平等。本發(fā)明的表達載體可以被引入宿主細胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的核酸編碼的蛋白或肽(例如具有根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解活性的多肽、蛋白的突變體形式，其片段、變體或功能等同物、融合蛋白等)。本發(fā)明的重組表達載體可以被設(shè)計，以用于根據(jù)本發(fā)明的多肽在原核細胞或真核細胞中的表達。例如根據(jù)本發(fā)明的多肽可以在細菌細胞如E.coli和Bacilli、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、真菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞中生產(chǎn)。合適的宿主細胞在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego,CA(1990)中進一步討論?；蛘?，可以例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達載體。對于大多數(shù)絲狀真菌和酵母而言，載體或表達構(gòu)建體優(yōu)選地被整合進宿主細胞的基因組中，以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。但是，對于某些酵母而言，表達構(gòu)建體可被整合進的用于穩(wěn)定和高水平表達的同樣合適的游離型載體是可獲得的，其例子包括分別得自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKDl質(zhì)粒，或含有AMA序列(例如來自Aspergillus的AMA1)的載體。在表達構(gòu)建體被整合進宿主細胞基因組的情況下，構(gòu)建體在基因組中的隨機基因座上或使用同源重組在預(yù)定的靶基因座(在這樣的情況下，靶基因座優(yōu)選地包含高表達基因)上整合。因此，用于本發(fā)明中的表達載體包括得自染色體、附加體和病毒的載體，例如得自細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)的載體和得自其組合的載體，如得自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體(如粘粒和噬菌粒)。核苷酸插入物應(yīng)與合適的啟動子可操作地連接，除了編碼本發(fā)明的多肽的基因的天然的啟動子，其他啟動子可用來指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的表達。在指導(dǎo)本發(fā)明的多肽在期望的表達宿主中表達中，針對其效率，可選擇啟動子?？稍诒景l(fā)明中有用的啟動子的例子包括噬菌體λPL啟動子，Ε.colilac、trp和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和反轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動子，但不限于這些。其它合適的啟動子是技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道的。在一個特定的實施方式中，能夠在真菌或酵母中指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的多肽的高水平表達的啟動子是優(yōu)選的。這類啟動子是本領(lǐng)域已知的。可使用能夠指導(dǎo)在本發(fā)明的宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的各種啟動子。優(yōu)選地，啟動子序列得自高表達基因。啟動子優(yōu)選得自和/或包含在優(yōu)選的預(yù)定靶基因座中用于表達構(gòu)建體的整合的優(yōu)選的高表達基因的的例子是，包括但不限于，編碼糖酵解酶的基因，所述糖酵解酶例如磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PI或H(I)、醇脫氫酶(ADH)；以及編碼淀粉酶(例如葡糖淀粉酶)、蛋白酶、木聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、乙醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白的基因。合適的高表達基因的具體例子包括例如來自Kluyveromycessp.的LAC4基因、分別來自Hansenula和Pichia的甲醇氧化酶基因(Α0Χ和Μ0Χ)、來自A.niger和A.awamori的葡糖淀粉酶(glaA)基因、A.oryzaeTAKA-淀粉酶基因、A.nidulansgpdA基因和Τ.reesei纖維二糖水解酶基因。用在真菌表達宿主中的優(yōu)選的強組成型和/或誘導(dǎo)型啟動子的例子是從針對木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亞基9(oliC)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、a-淀粉酶(amy)、淀粉葡糖苷酶(AG-來自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和3_磷酸甘油醛脫氫酶(gpd)啟動子的真菌基因可獲得的那些。強酵母啟動子的例子是從針對醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸酯酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因可獲得的那些。強細菌啟動子的例子是α-淀粉酶和SPo2啟動子以及來自胞外蛋白酶基因的啟動子。適于植物細胞的啟動子包括胭脂堿合成酶(nos)、章魚堿合成酶(ocs)、甘露堿合成酶(mas)、核酮糖小亞基(rubisco大小亞基)、組蛋白、水稻肌動蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花葉病毒(CMV)35S以及19S和圓環(huán)病毒啟動子。所有上述啟動子是本領(lǐng)域內(nèi)容易得到的。載體還可包括引起RNA的多核苷酸側(cè)翼的序列，其包含與真核基因組序列或病毒基因組序列同源的序列。這將允許本發(fā)明的多核苷酸引進宿主細胞基因組中。載體可含有以反義方向定向的本發(fā)明的多核苷酸，以提供反義RNA的生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細胞中。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在表示用于向宿主細胞中引入外源核酸(例如DNA)的多種本領(lǐng)域公知的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的合適方法可見于Sambrook，etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed·ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它實驗室手冊中。對于哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，下述是已知的取決于使用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有非常小部分的細胞可以將外源DNA整合進它們的基因組中。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(例如抗性或抗生素)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細胞中。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括，但不限于，賦予藥物或在宿主細胞中補充缺陷的那些。(例如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的基因。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括但不限于，賦予抗藥性或補充宿主細胞缺陷的那些。它們包括，例如用于轉(zhuǎn)化大部分絲狀真菌和酵母的通用標(biāo)記基因，例如，乙酰胺酶基因或cDNA(來自A.nidulans，A.oryzae或A.niger的amdS，niaD,facA基因或cDNA)，或提供抗抗生素樣G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、腐草霉素或苯菌靈抗性(benA)基因?？蛇x擇地，可使用具體的選擇標(biāo)記，例如需要對應(yīng)的突變宿主菌的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記例如URA3(來自S.cerevisiae或來自其他酵母的類似基因),pyrG或pyrA(來自A.nidulans或A.niger),argB(來自A.nidulans或A.niger)或trpC.在優(yōu)選的實施方式中，在引入表達構(gòu)建體之后，從轉(zhuǎn)化的宿主細胞中刪除選擇標(biāo)記，以便獲得沒有選擇標(biāo)記基因的能夠生產(chǎn)多肽的轉(zhuǎn)化宿主細胞。其他標(biāo)記包括ATP合成酶，亞基9(oliC)，乳清苷-5’-磷酸脫羧酶(pvrA)，細菌G418抗性基因(這也可用在酵母中，但不能用在真菌中)，氨芐青霉素抗性基因(E.coli),新霉素抗性基因(Bacillus)和編碼β-葡萄糖甘酸酶(⑶S)的Ε.coliuidA基因。載體可在體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。用指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白表達的包含組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體，通常在E.coli中進行原核生物中的蛋白的表達。融合載體添加許多氨基酸至其中編碼的蛋白質(zhì)，例如至重組蛋白的氨基末端。這種融合載體典型地用作三個目的1)增加重組蛋白的表達；2)增加重組蛋白的溶解性；和幻通過用作親和純化的配體幫助重組蛋白純化。通常，在融合表達載體中，溶蛋白性位點被引入在融合部分和重組蛋白的結(jié)合處，以使得重組蛋白能夠從融合部分分開，隨后純化融合蛋白。如所示的，表達載體可優(yōu)選地含有選擇標(biāo)記。這種標(biāo)記包括用于真核細胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性和用于在E.coli中和其他細菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。合適宿主的代表性例子包括細菌細胞，例如E.coli，StreptomycesSalmonellatyphimurium禾口某些Bacillus種；真菌細胞，例如Aspergillus種，例如A.niger,A.oryzae禾口A.nidulans,例如酵母，例如Kluyveromyces，例如K.Iactis禾口/或Puchia,例如P.pastoris；昆蟲細胞例如DrosophilaS2和SpodopteraSf9；動物細胞例如CHO、COS和Bowesmelanoma；和植物細胞。用于上述宿主細胞的合適的培養(yǎng)基和條件在本領(lǐng)域是已知的。優(yōu)選在細菌中使用的載體是，例如在W0-A1-2004/074468所公開的，其通過引用包括在本文中。其他合適的載體對技術(shù)人員是顯而易見的。適合在本發(fā)明中使用的已知細菌啟動子包括在W0-A1-2004/074468中公開的啟動子，其通過引用包括在本文中?？梢酝ㄟ^向載體中插入增強子序列，來提高高等真核生物對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10到300bp，其作用于提高啟動子在給定的宿主細胞類型中的轉(zhuǎn)錄活性。增強子的例子包括SV40增強子(其位于復(fù)制起點下游的bp100到270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、復(fù)制起點下游的多瘤增強子和腺病毒增強子。為了將翻譯的蛋白分泌進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中、進入壁膜間隙中或進入細胞外環(huán)境中，可以向被表達的多肽中整合進適當(dāng)?shù)姆置谛盘枴Ｋ鲂盘枌Χ嚯目梢允峭吹幕蛩鼈兛梢允钱愒葱盘?。多肽可以以?jīng)修飾的方式被表達，例如融合蛋白，并可不僅含有分泌信號而且含有額外的異源功能區(qū)。因此，例如額外氨基酸區(qū)(尤其是帶電荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以改進純化期間或隨后的操作和儲存期間在宿主細胞中的穩(wěn)定性和持久性。還可向多肽添加肽基元，以便于純化。根據(jù)本發(fā)明的多肽本發(fā)明提供了具有脂肪分解活性的經(jīng)分離的多肽，其包含(a)得自根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽或其功能等同物，所述多肽功能等同物具有與得自根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽至少60，70，80或90%同源的氨基酸序列；(b)由根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸編碼的氨基酸序列。因而，發(fā)明提供了具有脂肪分解活性的經(jīng)分離的多肽，其包含得自根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽，優(yōu)選地包含SEQIDNO2的氨基酸34-304，和通過在合適的宿主細胞中表達SEQIDNO:1的多核苷酸可獲得的氨基酸序列。本發(fā)明還包含是功能等同物并與根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽至少60，70，80或90%同源的肽或多肽。在另一實施方式中，本發(fā)明還涉及具有脂肪分解活性的經(jīng)分離的多肽，其是得自SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽的功能等同物，其與所述多肽至少60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%同源。上述多肽一同包含在術(shù)語“根據(jù)本發(fā)明的多肽”中。術(shù)語“肽”和“寡肽”被認為是同義的(如其通常被認為的那樣)，且當(dāng)上下文需要表示通過肽鍵偶合的至少兩個氨基酸鏈時，每個術(shù)語可以互換使用。詞語“多肽”(或蛋白)在本文中使用時表示含有多于七個氨基酸殘基的鏈。所有的寡肽和多肽表達式或序列在本文中從左到右且從氨基端到羧基端的方向書寫。本文使用的單字母氨基酸代碼是本領(lǐng)域普遍已知的，并可見于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)。“經(jīng)分離的”多肽或蛋白表示被從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白。例如，就本發(fā)明的目的而言，在宿主細胞中表達的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白被認為是經(jīng)分離的，與通過任何合適的技術(shù)已基本純化的天然或重組多肽一樣，所述合適的技術(shù)例如SmithandJohnson,Gene67:31-40(1988)中公開的單步驟純化方法。為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是，因為在成熟化期間的加工錯誤，SEQIDNO2的N末端或在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的N末端以及SEQIDNO:2的C末端或在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的C末端可以是異源的。特別地，此類加工錯誤可在多肽過表達時發(fā)生。此外，外蛋白酶活性可引起異源性。異源性發(fā)生的程度取決于使用的宿主和發(fā)酵方案。此類C末端加工產(chǎn)物可導(dǎo)致如用SEQIDNO:2所表示的或在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽所表示的更短的多肽或更長的多肽。作為CN102549150A此類錯誤的結(jié)果，N末端也可以是異源的。在其他實施方式中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)SEQIDNO:2的多肽的至少一個功能結(jié)構(gòu)域或在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的至少一個功能結(jié)構(gòu)域，其含有額外的殘基并在-1、"2或-3等位置上開始?；蛘撸淇扇鄙倌承埢⒁蚨?或3或4等位置上開始。額外的殘基還可在C末端，例如在347、348等位置上存在。或者，C末端可缺少某些殘基并因而在345或344位置上結(jié)束?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的方法，從重組細胞培養(yǎng)基中回收并純化根據(jù)本發(fā)明的脂肪分角軍酶(ProteinPurificationProtocols，MethodsinMolecularBiologyseriesbyPaulCutler，HumanaPress，2004)。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)物，和通過重組技術(shù)從原核或真核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。取決于重組生產(chǎn)步驟中使用的宿主，可以將本發(fā)明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本發(fā)明的多肽也可以包含初始被修飾的甲硫氨酸殘基——在一些情況下由宿主介導(dǎo)的過程產(chǎn)生。多肽片段本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的多肽的生物活性片段。本發(fā)明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列(例如，得自SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽)足夠同一或得自后者，其包括比全長蛋白更少的氨基酸但其表現(xiàn)對應(yīng)的全長蛋白的至少一種生物活性，優(yōu)選地其表現(xiàn)脂肪分解活性。典型地，生物活性片段包含具有根據(jù)本發(fā)明的蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序(motif)。本發(fā)明的蛋白的生物活性片段可以是多肽，所述多肽的長度比SEQIDNO:2中的成熟多肽短5、10、15、20、25或更多個氨基酸，并且其與SEQIDN0:2中的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性。另外，其它生物活性部分(其中蛋白的其它區(qū)域被刪除)可以通過重組技術(shù)被制備，并針對本發(fā)明多肽的天然形式的一種或多種生物活性做出評價。本發(fā)明還包括編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的上述生物活性片段的核酸片段。融合蛋白根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能等同物，例如其生物活性部分，可被可操作地連接到并非根據(jù)本發(fā)明的多肽(例如，異源氨基酸序列)上，以形成融合蛋白?！安⒎歉鶕?jù)本發(fā)明的多肽”指一種多肽，其具有對應(yīng)于與根據(jù)本發(fā)明的蛋白不基本同源的蛋白的氨基酸序列。此類“并非根據(jù)本發(fā)明的多肽”可得自相同或不同的生物體。在融合蛋白內(nèi)，本發(fā)明的多肽可對應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明脂肪分解酶的全部或生物活性片段。在優(yōu)選的實施方式中，融合蛋白包含根據(jù)本發(fā)明的蛋白的至少兩個生物活性部分。在融合蛋白中，術(shù)語“可操作地連接”用來表示根據(jù)本發(fā)明的多肽和并非根據(jù)本發(fā)明的多肽以符合讀碼框的方式相互融合。并非根據(jù)本發(fā)明的多肽可以被融合到多肽的N-末端或C-末端上。例如，在一種實施方式中，融合蛋白是這樣的融合蛋白，其中，氨基酸序列被融合到GST序列的C-末端上。此類融合蛋白可以協(xié)助對根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白的純化。在另一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白是在其N-末端含有異源信號序列的蛋白。可以通過使用異源信號序列，來增加根據(jù)本發(fā)明的蛋白在某些宿主細胞(例如，哺乳動物宿主細胞和酵母宿主細胞)中的表達和/或分泌。在另一個例子中，桿狀病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可被用作異源信號序列(CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubeletal.，eds.，JohnWiley&Sons，1992)。真核異源信號序列的其它例子包括蜂毒肽的分泌序列和人類胎盤堿性磷酸酶的分泌序列(Stratagene;LaJolla，California)。在又一個例子中，有用的原核異源信號序列包括PhoA分泌信號(前述的Sambrooketal.)和蛋白A分泌信號(PharmaciaBiotech；Piscataway,NewJersey)。信號序列可被用于協(xié)助本發(fā)明的蛋白或多肽的分泌及分離。典型地，信號序列的特征為具有疏水氨基酸核心，分泌期間，在一次或多次切割事件中，通?？蓪⑺鲂盘栃蛄袕某墒斓鞍咨锨懈畹?。此類信號肽含有加工位點，允許信號序列在通過分泌途徑之時被從成熟蛋白上切割掉。信號序列指導(dǎo)蛋白的分泌，例如從轉(zhuǎn)化進表達載體的真核宿主中分泌，信號序列隨后或同時被切割掉。然后通過本領(lǐng)域已知的方法，可以容易地從胞外培養(yǎng)基中純化出多肽?；蛘撸梢杂媚軈f(xié)助純化的序列，例如用GST結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘栃蛄羞B接到人們感興趣的蛋白上。因此，例如，編碼多肽的序列可與標(biāo)記物序列(例如編碼能促進融合多肽的純化的肽的序列)融合。在本發(fā)明這一方面的某些優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記物序列是六組氨酸肽，例如PQE載體Oiiagendnc.)中提供的標(biāo)簽；很多標(biāo)記物序列都是可以購買到的。例如，如Gentzetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，例如，六組氨酸為融合蛋白提供了方便的純化。HA標(biāo)簽是另一種有利于純化的肽，其對應(yīng)于來自流感血凝素蛋白的表位，這已例如被Wilsonetal.,Cell37:767(1984)進行了描述。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白可通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生。例如，按照傳統(tǒng)技術(shù)，將編碼不同多肽序列的DNA片段以符合讀碼框的方式連接到一起，例如，通過采用平末端或交錯切口末端用于連接；采用限制性酶消化以提供合適的末端，或根據(jù)需要填平粘末端；采用堿性磷酸酶處理，以避免人們不想要的結(jié)合或酶連接。在另一種實施方式中，可以通過傳統(tǒng)技術(shù)(包括自動DNA合成儀)來合成融合基因。或者，可以使用錨定引物(anchorprimer)來對基因片段進行PCR擴增，所述引物能在兩段連續(xù)的基因片段之間產(chǎn)生互補突出端(overhang)，隨后可以進行退火和再次擴增，以產(chǎn)生出嵌合基因序列(例如，見CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal.JohnWiley&Sons1992)。此外，還可以商業(yè)途徑獲得很多已經(jīng)編碼有融合部分(例如，GST多肽)的表達載體。編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸可被克隆進此類表達載體，以使得融合部分以符合讀碼框的方式與根據(jù)本發(fā)明的蛋白連接起來。功能等同物術(shù)語“功能等同物”和“功能變體”在本文可互換使用。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的功能等同物是下述經(jīng)分離的多核苷酸，其與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、優(yōu)選地至少90%同源性并且編碼下述多肽，所述多肽至少表現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的一種特定功能，優(yōu)選地，所述多肽具有脂肪分解活性。優(yōu)選地，在烘焙應(yīng)用中，例如在面團條件下，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶或具有脂肪分解活性的多肽具有對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能等同物是下述多肽，所述多肽與得自SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、優(yōu)選地至少90%同源性，并且在烘焙應(yīng)用中，例如在面團條件下，其表現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的至少一種功能，優(yōu)選地，其表現(xiàn)脂肪分解活性，更優(yōu)選地，其表現(xiàn)對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。因此，所述的功能等同物還包括具有如上所述的脂肪分解活性的生物活性片段。根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能等同物可含有與得自根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽相比的一個或多個氨基酸取代或不會影響酶的特定功能的氨基酸取代、插入或缺失。功能上無作用的氨基酸取代是在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽中的取代，其本質(zhì)上不會改變其特定功能性。例如，在本發(fā)明的蛋白間保守的氨基酸殘基被預(yù)測為尤其對改變不敏感。另外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白和其它脂肪分解酶中的保守氨基酸可能對改變不敏感。典型地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的功能等同物可含有沉默突變或不改變所編碼的多肽的生物功能的突變。因此，本發(fā)明提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的下述多肽的核酸分子，所述多肽含有對于具體生物活性并非必需的氨基酸殘基改變。這類蛋白在氨基酸序列上與得自根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽不同，但仍保留其至少一種生物活性，優(yōu)選地，它們保留脂肪分解活性。在一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的功能等同物包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中成熟多肽至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、優(yōu)選地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。在一種實施方式中，具有至少90%同源性的在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，是具有根據(jù)從根據(jù)SEQIDN0:4(下文表示為⑶幻的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列的多肽。在另一實施方式中，所述功能等同物是具有根據(jù)下述成熟多肽的氨基酸序列的多肽，所述成熟多肽得自根據(jù)SEQIDNO:6(下文表示為L(XB)的氨基酸序列，并且還在另一實施方式中，所述功能等同物是具有根據(jù)下述成熟多肽的氨基酸的多肽，所述成熟多肽得自根據(jù)SEQIDN0:8(下位表示為L04)的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，得自分別根據(jù)SEQIDNO4,SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列的成熟多肽是分別根據(jù)SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的氨基酸序列中的氨基酸序列34到304。編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的功能等同物將包含與根據(jù)SEQIDNO1的核酸序列至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%，優(yōu)選地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源的多核苷酸序列。在一種實施方式中，根據(jù)SEQIDNO1的多核苷酸的功能等同物(其具有根據(jù)SEQIDNO:1的多核苷酸的至少90%同源性)是具有根據(jù)SEQIDN0:3(表示為DNAL02)的多核苷酸序列的多肽，在另一實施方式中，所述功能等同物是具有根據(jù)SEQIDN0:5(表示為DNAL03)的核苷酸序列的多核苷酸，還在另一實施方式中，所述功能等同物是具有根據(jù)SEQIDN0:7(表示為DNAL04)的核苷酸序列的多核苷酸。根據(jù)SEQIDNO:3的多核苷酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO4的多肽，根據(jù)SEQIDNO5的多核苷酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO6的多肽，根據(jù)SEQIDNO:7的多核苷酸序列編碼根據(jù)SEQIDNO:8的多肽。在優(yōu)選的實施方式中，在SEQIDNO:3、5、7中的多核苷酸100-912分別編碼在SEQIDNO:4、6、8中的成熟多肽?？梢匀缦挛乃鰜碇圃炀幋a與得自根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽同源的蛋白的經(jīng)分離的核酸分子向根據(jù)SEQIDNO1的編碼核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失，使得一個或多個氨基酸取代、缺失或插入被引入所編碼的蛋白中。這類突變可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入，如定點誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。編碼其它具有脂肪分解活性的家族成員的核酸，其因而具有與SEQIDN0:l、3、5、7不同的核苷酸序列但其滿足上述的條件，其也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，編碼具有脂肪分解酶活性的下述蛋白的核酸，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述蛋白具有與氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、8中的成熟多肽不同的氨基酸序列但其滿足上述的條件。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可在其密碼子使用方面被優(yōu)化，優(yōu)選地根據(jù)W02006/077258和/或W02008/000632中描述的方法。W02008/000632提出了密碼對優(yōu)化。密碼對優(yōu)化是這樣的方法，其中編碼多肽的核苷酸序列就其密碼使用特別是被使用的密碼對而被修飾，以獲得編碼多肽的核苷酸序列的表達改進和/或所編碼的多肽的生產(chǎn)改進。密碼對被定義為在編碼序列中的一組兩個連續(xù)的三聯(lián)體(密碼子)?？梢愿鶕?jù)它們與本文公開的核酸的同源性，使用本文公開的cDNA或其合適的片段作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)，優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下，來分離對應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的變體(例如天然等位基因變體)或同源物的核酸分子。在本發(fā)明的另一方面中，提供了經(jīng)改進的蛋白。如果與具有根據(jù)SEQIDN0:2的氨基酸序列的多肽的生物活性比較，經(jīng)改進的蛋白是其中至少一種生物活性被改進的蛋白。這類蛋白可以如下獲得沿全部或部分編碼序列SEQIDNO:1隨機地引入突變，例如通過飽和誘變，并且重組表達得到的突變體并針對生物活性進行篩選。例如，本領(lǐng)域提供了用于測量脂肪分解酶的酶活性的標(biāo)準(zhǔn)檢驗，因而經(jīng)改進的蛋白可以容易地被選擇。在一個優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多肽具有根據(jù)SEQIDNO2中的氨基酸34到304的氨基酸序列。在另一實施方式中，多肽與得自根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽至少90%同源，并且在烘焙應(yīng)用中，例如在面團條件下，其保留得自根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽的至少一種生物活性，優(yōu)選地，其保留脂肪分解活性，更優(yōu)選地，其保留對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性，但是由于如上所述的天然變異或誘變而在氨基酸序列上有差異。在又一個優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白具有由下述經(jīng)分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述經(jīng)分離的核酸片段與為SEQIDNO:1的互補體的多核苷酸優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下雜交，并且其中根據(jù)所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的核苷酸序列至少90%同源。因而，根據(jù)本發(fā)明的蛋白優(yōu)選地是下述蛋白，其包含與得自根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽至少約90%、91%92%93%94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源的氨基酸序列，并且其保留在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的至少一種功能活性，優(yōu)選地，其保留脂肪分解活性，更優(yōu)選地，在烘焙應(yīng)用中，例如在面團條件下，其保留對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。也可以如下文所述來鑒定根據(jù)本發(fā)明的蛋白的功能等同物例如，針對脂肪分解酶活性，篩選本發(fā)明蛋白的突變體(例如截短突變體)的組合文庫。在一個實施方式中，通過核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生多樣性文庫(variegatedlibrary)?？梢酝ㄟ^例如將合成的寡核苷酸混合物酶連接為基因序列來產(chǎn)生變體的多樣性文庫，從而可能的蛋白序列的簡并集合(degenerateset)可作為個體多肽或者作為一組較大的融合蛋白(例如噬菌體展示)表達。存在可用于從簡并寡核苷酸生產(chǎn)本發(fā)明多肽的可能變體文庫的多種方法。用于合成簡并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如Narang(1983)Tetrahedron393；Itakuraetal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；ltakuraetal.(1984)Science1981056；Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.11:477)。另外，本發(fā)明多肽的編碼序列的片段文庫可以被用于產(chǎn)生多樣性的多肽群，用于篩選隨后的變體選擇。例如，可以如下產(chǎn)生編碼序列片段的文庫在每個分子僅發(fā)生約一次切割的條件下用核酸酶處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，將DNA復(fù)性形成雙鏈DNA(其可包含來自被不同切割的產(chǎn)物的有義/反義對)，通過用Sl核酸酶處理從再形成的雙鏈體上去除單鏈部分，并將得到的片段文庫連接進表達載體中。通過該方法，可以得到下述表達文庫，所述表達文庫編碼感興趣的蛋白的不同大小的N-末端和內(nèi)部片段。本領(lǐng)域已知有若干種技術(shù)可用于篩選組合文庫(其通過截短的點突變制造)的基因產(chǎn)物，和用于篩選cDNA文庫以獲得具有選定特性的基因產(chǎn)物。用于篩選大基因文庫的、適用于高通量分析的、最廣泛使用的技術(shù)典型地包括將基因文庫克隆進可復(fù)制的表達載體中，用得到的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細胞，和在下述條件下表達組合基因，所述條件下想要的活性的檢測簡化了編碼基因(其產(chǎn)物被檢測)的載體的分離。循環(huán)總體誘變(Recursiveensemblemutagenesis,REM)，一種增強文庫中功能突變體頻率的技術(shù)，可以與篩選檢驗組合使用以鑒定本發(fā)明蛋白的變體(ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815；Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可作為PCR反應(yīng)的探針或引物作用。根據(jù)本發(fā)明的核酸無論是編碼功能多肽還是無功能的多肽，均可被用作雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途尤其包括(1)從cDNA文庫分離編碼蛋白的基因或其等位基因變體(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如FISH)以提供基因的精確染色體定位，如Vermaetal.,HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques，PergamonPress，NewYork(1988)所述；(3)Northern印跡分析，用于檢測mRNA在特定組織和/或細胞中的表達；和4)能夠被用作診斷工具來分析給定的生物(例如組織)樣品中核酸存在的探針和引物，所述核酸能與跟定生物(例如組織)樣品中的探針雜交。本發(fā)明還包括獲得根據(jù)本發(fā)明的基因的功能等同物的方法。這類方法需要獲得被標(biāo)記的含有被分離的核酸的探針，所述被分離的核酸編碼下述蛋白序列的全部或部分，所述蛋白序列是根據(jù)在根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽或它們的任何的變體的蛋白序列；在允許探針與文庫中的核酸片段雜交從而形成核酸雙鏈體的條件下，用被標(biāo)記的探針篩選核酸片段文庫，和從任何被標(biāo)記的雙鏈體中的核酸片段制備全長的基因序列，以獲得與根據(jù)本發(fā)明的基因相關(guān)的基因。宿主細胞在另一實施方式中，本發(fā)明包括細胞，例如含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或含有根據(jù)本發(fā)明的載體的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞或重組宿主細胞?！敖?jīng)轉(zhuǎn)化的細胞”或“重組細胞”是其中(或其祖先中)已經(jīng)借助于重組DNA技術(shù)引入了本發(fā)明核酸的細胞。原核和真核細胞均包括在內(nèi)，例如細菌、真菌、酵母等等。宿主細胞還包括，但不限于哺乳動物細胞系如CH0、VER0、BHK、HeLa、C0S、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡(luò)叢細胞系。公眾可獲得多種適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的載體，用于構(gòu)建這類細胞系的方法也是公眾已知的，例如Ausubeletal.(上文)中。特別優(yōu)選的是來自絲狀真菌的細胞，特別是Aspergillus禾中，例如Aspergillusniger或oryzaeorawamori?？蛇x用調(diào)控插入序列表達并以特異的、期望的方式修飾或加工基因產(chǎn)物的宿主細胞。蛋白產(chǎn)物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進蛋白發(fā)揮最佳功能。多種宿主細胞具有用于翻譯前加工和修飾蛋白和基因產(chǎn)物的特性和特異機制。可選用分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的適當(dāng)細胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對所表達的外源蛋白的想要的和正確的修飾與加工。為此，可以使用具有下述細胞機制的真核宿主細胞，所述細胞機制用于適當(dāng)?shù)丶庸ぴ嫁D(zhuǎn)錄本、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物。這類宿主細胞是本領(lǐng)域公知的。如果想要的話，如上述的細胞可被用在根據(jù)本發(fā)明的多肽的制備中。典型地，此種方法包括在以提供編碼多肽的編碼序列表達(通過載體)的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞(例如用上述的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)；和任選地，從細胞或培養(yǎng)基中回收，更優(yōu)選地回收并純化產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可被整合進重組可復(fù)制載體，例如表達載體中。載體可被用來在適宜的宿主細胞中復(fù)制核酸。因而，在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了制造本發(fā)明的多核苷酸的方法，其通過將本發(fā)明的多核苷酸引進可復(fù)制載體中，將載體引進適宜的宿主細胞中并在致使載體復(fù)制的條件下培育宿主細胞。載體可從宿主細胞中回收。優(yōu)選地，多肽是作為分泌蛋白產(chǎn)生的，在這種情況下，在表達構(gòu)建體中的編碼多肽成熟形式的核苷酸序列可操作地與編碼信號序列的核苷酸序列連接。優(yōu)選地，信號序列對編碼多肽的核苷酸而言是天然的(同源的)?；蛘?，信號序列對編碼多肽的核苷酸而言是夕卜來(異源的)，在這種情況下，信號序列優(yōu)選地對其中根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列被表達的宿主細胞而言是內(nèi)源的。針對酵母宿主細胞的合適的信號序列的例子是得自酵母α因子基因的信號序列。類似地，針對絲狀真菌的合適的信號序列是例如得自絲狀真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因的信號序列，例如A.nigerglaA基因。這可結(jié)合淀粉葡糖苷酶(還被稱為葡萄糖淀粉酶)自身，以及結(jié)合其他啟動子使用。就本發(fā)明上下文，還可使用雜交信號序列。優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(18和M個氨基酸的兩個版本的glaA，例如來自Aspergillus)、α因子基因(酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或α淀粉酶基因(Bacillus)的那些。載體可被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進如上述的合適的宿主細胞中，以提供對本發(fā)明的多肽的表達。該方法可包括在以提供通過編碼多肽的編碼序列的載體表達的條件下，培育用上述的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明因而提供了下述宿主細胞，所述宿主細胞用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或者包含本發(fā)明的多核苷酸或載體。優(yōu)選地，多核苷酸被帶進載體，用于多核苷酸的復(fù)制和表達。選擇與所述載體適宜的細胞，所述細胞是例如原核(例如細菌)、真菌、酵母或植物細胞。還可選擇異源宿主，其中本發(fā)明的多肽以基本不含可能干擾應(yīng)用的酶活性(例如無淀粉降解、纖維素降解或半纖維素降解酶)的方式生產(chǎn)。這可通過選擇不會正常生產(chǎn)此類酶的宿主實現(xiàn)。本發(fā)明包括生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，其通過重組表達編碼多肽的DNA序列的方式實現(xiàn)。針對該目的，本發(fā)明的DNA序列可用于基因擴增和/或表達信號的交換，例如啟動子、分泌信號序列，以允許多肽在合適的同源或異源宿主細胞中經(jīng)濟的生產(chǎn)。同源宿主細胞是這樣的宿主細胞，其是與DNA序列所源自的物種相同的物種或是相同物種內(nèi)的變種。合適的宿主細胞優(yōu)選地是原核微生物例如細菌，或更優(yōu)選地是真核生物，例如真菌，例如酵母或絲狀真菌或植物細胞。總之，酵母細胞比真菌細胞更優(yōu)選，因為它們更易于操作。但是，一些蛋白或者從酵母中分泌貧乏或者在一些情況下不被正確處理(例如酵母中的過糖基化)。在這些情況下，應(yīng)選擇真菌宿主生物。宿主細胞可過表達多肽，用于設(shè)計過表達的技術(shù)是熟知的。宿主可因而具有編碼的多核苷酸的兩個或多個拷貝(并且載體可因而具有相應(yīng)的兩個或多個拷貝)。因而，在本發(fā)明的一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細胞能表達或過表達根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或載體。根據(jù)本發(fā)明，可通過在常規(guī)營養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞，來實現(xiàn)本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)，所述宿主細胞已用本發(fā)明的一個或多個多核苷酸轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細胞可使用本領(lǐng)域已知的程序培養(yǎng)。針對啟動子和宿主細胞的每個組合，有益于編碼多肽的DNA序列的表達的培養(yǎng)條件是可獲得的。在達到期望的細胞密度或多肽效價后，使用已知的程序停止培養(yǎng)并回收多肽。發(fā)酵培養(yǎng)基可包含已知的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等等)、氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等等)和有機氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等等)和無機養(yǎng)分源(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等等)。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基的選擇可基于表達宿主的選擇和/或基于表達構(gòu)建體的調(diào)節(jié)需求。此類培養(yǎng)基是為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如果需要的話，培養(yǎng)基可含有其他成分，所述成分對于其他潛在的污染微生物而言利于經(jīng)轉(zhuǎn)化的表達宿主。發(fā)酵可在0.5-30天的時間上進行。其可以是合適地在例如從大約0到45°C的范圍內(nèi)的溫度下和/或在例如從大約2到大約10的pH下的分批、連續(xù)或補料分批工藝。優(yōu)選的發(fā)酵條件是在從大約20°C到大約37°C的范圍內(nèi)的溫度和/或從大約3到大約9的pH。選擇適當(dāng)?shù)臈l件通?；诒磉_宿主的選擇和將被生產(chǎn)的蛋白。發(fā)酵后，必要時，可通過離心或過濾手段從發(fā)酵液中去除細胞。在發(fā)酵已停止后或細胞去除后，可接著回收本發(fā)明的多肽，并且必要的話，通過常規(guī)手段純化并分離所述多肽。本發(fā)明現(xiàn)將通過實施例的方式進一步闡釋，但不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。實施例材料和方法體脂肪分解活性(DLU)單位定義一個DLU被定義為在測試條件(pH8.5，37°C)下每分鐘釋出1微摩爾對硝基苯酚的酶的量。檢驗用發(fā)色底物棕櫚酸對硝基苯酯(pNPP)在檢驗中測定脂肪分解活性。將底物(SigmaN2752)溶解在2-丙醇(3mg/mL)中。劇烈攪拌同時，將3.5mL的該溶液逐滴添加至含有TritonX-100的pH8.5的46.5mL100毫摩爾/1TRIS緩沖液中。在t=0的時亥IJ，將50μL樣品與ImL底物溶液混合。當(dāng)在37°C下孵育時，對照樣品空白，在405nm下測量吸收改變。曲線的線性部分的斜率(ΔOD/時間)用作活性的測量。以DLU(DSMLipaseUnits)表示活性。脂肪酶活性(PLI)單位定義一個PLI脂肪酶單位是在37°C和pH7.5下每分鐘從經(jīng)中和的橄欖油乳液中釋放Iymol游離脂肪酸的酶的量。_在酶孵育期間，產(chǎn)生的游離脂肪酸用氫氧化鈉滴定至7.5的恒定pH。使用的氫氧化鈉的量與形成的游離脂肪酸的量成正比并因而與脂肪酶活性成正比。為獲得可靠數(shù)據(jù)，應(yīng)使用低酸度的橄欖油(Sigmacatnr01514)并且橄欖油乳液應(yīng)滿足特定的液滴大小需求。利用UltraTurrax通過將50ml的橄欖油與50ml的聚乙烯醇溶液(來自Iihone-Poulenc的Rhodoviol25/140/Prolabocatnr20954295)和25ml的水混合獲得乳液。不應(yīng)該存在超過10微米直徑的油滴，10到20%的液滴應(yīng)具有在4到9微米之間的直徑并且80%的液滴應(yīng)具有小于4微米的直徑。最終孵育混合物含有7.5ml橄欖油乳液、5.OmlCaCl2溶液(3.675gCacl2.2H20/250ml)、1.Oml白蛋白溶液O00g/1)和11.5ml水。在pH-恒定計裝置(Radiometer,Copenhagen,Denmark)中方便地進行測量。纖維素酶活性(CXU)單位定義一個CXU是在給出還原糖的量相當(dāng)于0.5mg葡萄糖的測試條件下，每小時水解一個羧甲基纖維素(CMC)的量的酶的量?！鲇枚趸畻钏岫繙y定形成的還原糖的量。通過將18g的CMC(BlanoseR.110，NovacelParis,France)在加有IOOml的pH4.6乙酸鹽緩沖液的900ml水中懸浮1小時來制備CMC底物，隨后過濾顆粒物。二硝基水楊酸溶液如下制備。(A)將13.5g的NaOH顆粒溶解在300ml水中。(B)將8.8g的二硝基水楊酸在60°C下溶解在400ml水中，添加溶解在400ml水中的225g的KNa-酒石酸鹽并混合。(C)然后將300mlNaOH溶液與二硝基水楊酸/KNa-酒石酸鹽溶液混合。(D)制備溶液使2.2gNaOH顆粒和IOg100%苯酚摻在IOOml的水中，并且另外制備亞硫酸鹽溶液使37.5gNaHSO3摻在IOOml的水中。為制備二硝基水楊酸工作溶液，將69ml的溶液(D)與溶液(C)混合并添加23.2ml的NaHSO3溶液。制備后5天可使用該混合物。通過將Iml的CMC溶液添加到ImL的樣品溶液中進行酶孵育并在37°C下孵育60分鐘。通過將Iml的lmol/1NaOH添加至Iml的孵育混合物來終止反應(yīng)。然后添加3ml的二硝基水楊酸工作溶液，混合并在沸水中加熱5分鐘，在自己冷卻后，將19ml的水添加至混合物中。最后，在MOnm下在分光光度計中測量吸光度。淀粉葡糖苷酶活性(AGI)CN102549150A單位定義一個淀粉葡糖苷酶單位(AGI)是在測試條件下每分鐘釋出1微摩爾葡萄糖的酶的量。_為測定淀粉葡糖苷酶的活性，制備了下述試劑。淀粉底物1.6g的淀粉(Merckcat.No.1252)懸浮在IOmL的冷水中。隨后，其被倒進50mL的沸水中。煮沸2分鐘后冷卻至室溫，添加2mL的乙酸緩沖液Omol/L，pH4.3)。檢查PH并且必要的話，用4mol/L乙酸或4mol/L的NaOH調(diào)至pH4.3。鄰甲氧基苯胺溶液將660mg鄰甲氧基苯胺鹽酸鹽(SigmaB3252)溶解在IOOmL水中。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶試劑5000單位葡萄糖氧化酶(SigmaG6125)和1200單位過氧化物酶(SigmaP8125)溶解在900mL的水中。連續(xù)添加并溶解13.8g的磷酸氫二鈉(hq)、6.42g磷酸二氫鈉(Iaq)和6.IOg三(羥甲基)氨基甲烷。通過添加100g/L磷酸，將溶液的pH調(diào)至7.0。在用水將體積配至IOOOmL后，再次混合溶液。顯餼試布丨將99份的葡萄糖氧化酶-過氧化物酶試劑與1份的鄰甲氧基苯胺溶液混合。檢驗混有2mL淀粉底物的2mL樣品在60°C下孵育15分鐘。通過添加20mL0.005mol/LNaOH溶液停止反應(yīng)。通過ImL的孵育物與4mL的顯色試劑混合，測定葡萄糖含量。在37°C下孵育10分鐘后，通過添加5mL的5mol/L硫酸停止反應(yīng)。在540nm下測量吸光度。用在25-150μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)溶液使用葡萄糖標(biāo)定線來計算葡萄糖含量。標(biāo)準(zhǔn)溶液直接用用顯色試劑顯色。實施例1生產(chǎn)本發(fā)明的脂肪酶通過構(gòu)建構(gòu)建含有DNA序列的表達質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Aspergillusniger菌株并以下述方式培育A.niger菌株，來獲得由本文中提供的核苷酸序列SEQIDN0:1(DNAL01)、SEQIDNO:3(DNAL02)、SEQIDNO:5(DNAL03)、SEQIDNO:7(DNAL04)編碼的月旨肪分解酶L01、L02、L03、L04。將A.niger菌株的新鮮孢子(IO6-IO7)在20mlCSL-培養(yǎng)基(100ml長頸瓶，隔板)中接種并在34°C和170rpm下培育20-小時。將5_10mlCSL預(yù)培養(yǎng)基在IOOml的CSM培養(yǎng)基(500ml長頸瓶，隔板)中孵育后，將菌株在34°C和170rpm下發(fā)酵3_5天。通過在4°C下在5000xg下離心發(fā)酵液30分鐘獲得無細胞的上清液。無細胞的上清液在_20°C下存儲直到使用。任選地，將上清液在GF/AWhatmarm玻璃纖維濾紙(150mm0)上進一步過濾，以去除較大的微粒物。如果必要的話，用4NKOH將上清液的pH調(diào)至pH為5并用抽吸在0.2μm(真空(bottle-top))過濾器上無菌過濾，以去除真菌材料。CSL培養(yǎng)基由(每升的量)100gCornSteepSolids(Roquette)UgNaH2P04*H20、0.5gMgS04*7H20、IOg葡萄糖*H20和0.25gBasildon(消泡劑)組成。將各成分溶解在去礦物水中并用妝0!1或壓504將？!1調(diào)至pH5.8；將具有隔板和泡沫球的100ml長頸瓶用20ml發(fā)酵液裝填并在120°C下滅菌20分鐘，之后將含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的200μ1無菌溶液添加至冷卻至室溫后的每個長頸瓶。CSM培養(yǎng)基由(每升的量)150g麥芽糖*H20、60gSoytone(蛋白胨)、IgNaH2P04*H20、15gMgS04*7H20、0.08gTween80、0·02gBasildon(消泡劑)、20gMESUgL-精氨酸組成。將各成分溶解在去礦物水中并用NaOH或?qū)H調(diào)至pH為6.2；將具有隔板和泡沫球的500ml長頸瓶用IOOml發(fā)酵液裝填并在120°C下滅菌20分鐘，之后將含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的Iml無菌溶液添加至冷卻至室溫后的每個長頸瓶。實施例2純化本發(fā)明的脂肪分解酶實施例1中獲得的冷凍的無細胞上清液融化后，上清液在4°C下徹底離心以去除任何固體。為去除低分子量污染物，使用裝備有具有IOkDa截留分子量(cut-off)的過濾器的MilliporeLabscaleTFF系統(tǒng)超濾上清液。用40ml體積的包含0.5mMCaCl2,pH為6.0的冷的IOOmM磷酸緩沖液洗滌3-5次樣品。酶溶液的最終體積為30ml并且其還被稱為“超濾液”。為進一步純化，可將超濾液應(yīng)用至MonoQ陰離子交換柱。在20個柱體積上鹽梯度被設(shè)為IMNaCL0緩沖液是70mMBis-TRIS和50mMTRIS的混合物。pH用0.IMHCl設(shè)定。令人吃驚地，觀察到，當(dāng)在pH=9下進行純化，獲得最佳結(jié)果，其中在35mS/cm的電導(dǎo)率下洗脫脂肪酶。使用Bradford方法(TheProteinProtocolsHandbook,2ndedition,EditedbyJ.M.Walker,HumanaPressInc,Totowa2002，pl5_21)測定樣品的總蛋白含量。實施例3烘焙實駘——荷S樽制面何L01、三酰基甘油H旨肪_、鄉(xiāng)千維素Sl禾苷Sl的組合4勿對面團禾ng^V件質(zhì)的作用荷蘭模制面包如下制備。將3500g的面粉Q800gKolibri+700gIbis)、基于面粉的58%w/w的水、80g壓縮酵母、90g的面包改進劑(包含35%酶活化豆粉、30%面粉、18%乳清粉、7%油、10%右旋糖)、70g的鹽(NaCl)、40ppm抗壞血酸(基于面粉重量)、7ppm(基于面粉重量)BakezymeP500(真菌α-淀粉酶)、20ppm(基于面粉重量)BakezymeHSP6000(真菌半纖維素酶)和各種如在表1中示出的酶或SSL在Diosna混合器上在速度1下混合2分鐘并在速度2下125kWh，達到最終面團溫度為約^°C。將880g的面團塊弄成圓形并在34°C和85%的相對濕度下發(fā)面(proof)40分鐘。隨后在38°C和85%相對濕度(R.H.)下將面團制模、成型、放入平底鍋并發(fā)面75分鐘。將完全發(fā)面的面團在下的烤箱中烘焙30分鐘。在冷卻至室溫后，通過自動面包體積分析儀(BVM-3，TexVolInstruments)測定條塊的體積?？瞻酌姘臈l塊體積被定義為100%。如在表2中示出的，由有經(jīng)驗的烘焙者用手和在視覺上評價其他效果。表1在實驗中使用的其他酶或SSL的量權(quán)利要求1.一種烘焙酶組合物，其包含脂肪分解酶，所述脂肪分解酶是經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含(a)從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或該成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有與從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽至少80或90%同源的氨基酸序列；或(b)由多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸包含(a)如在SEQIDNO1中展示的核苷酸序列；或其功能等同物，所述功能等同物與SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少80或90%的同源性；或(b)核苷酸序列，其與SEQIDNO:1的互補體的多核苷酸雜交，并且其中所述核苷酸序列與SEQIDNO1的核苷酸序列至少80或90%同源；或(c)核苷酸序列，其編碼從根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物與SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少80或90%的同源性；或(d)作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，與如在(a)、(b)、(c)的任一中定義的序列簡并的序列；或(e)核苷酸序列，其是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定義的核苷酸序列的互補體；并且其中所述組合物還包含三酰基甘油脂肪酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1的烘焙酶組合物，其還包含半纖維素酶或纖維素酶，優(yōu)選地包含纖維素酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的任一項的烘焙酶組合物，其還包含淀粉葡糖苷酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項的烘焙酶組合物，其還包含兩種或多種三?；视椭久傅慕M合物。5.包含根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項的烘焙酶組合物、面粉和一種或多種面團添加劑或面包添加劑的預(yù)混合物。6.制備面團的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項的烘焙組合物或預(yù)混合物添加到至少包含面粉、水和酵母的面團成分中。7.包含面粉、水、酵母和有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至6的任一項的烘焙酶組合物或預(yù)混合物的面團。8.根據(jù)權(quán)利要求7的面團，其包含相對于每kg面粉至少3.57DLU單位的脂肪分解酶，優(yōu)選地至少7.15DLU/kg面粉，更優(yōu)選地至少14.30DLU/kg面粉，并優(yōu)選地包含至多143DLU/kg面粉的脂肪分解酶，更優(yōu)選地至多71.50DLU/kg面粉，最優(yōu)選地至多35.75DLU/kg面粉的脂肪分解酶。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的任一項的面團，其包含相對于每kg面粉至少80PLI單位的三?；视椭久福瑑?yōu)選地至少160PLI/kg面粉，更優(yōu)選地至少320PLI/kg面粉，并優(yōu)選地包含至多3200PLI/kg面粉的三?；视椭久福鼉?yōu)選地至多1600PLI/kg面粉，最優(yōu)選地至多800PLI/kg面粉的三酰基甘油脂肪酶。10.根據(jù)權(quán)利7至9的任一項的面團，其包含相對于每kg面粉至少2.34CXU單位的纖維素酶，優(yōu)選地至少4.68CXU/kg面粉，更優(yōu)選地至少7.5CXU/kg面粉，甚至更優(yōu)選地至少9.36CXU/kg面粉，甚至更優(yōu)選地至少15CXU/kg面粉，最優(yōu)選地至少23.4CXU/kg面粉，并優(yōu)選地包含至多300CXU/kg面粉的纖維素酶，優(yōu)選地至多150CXU/kg面粉，更優(yōu)選地至多93.6CXU/kg面粉，甚至更優(yōu)選地至多75CXU/kg面粉，甚至更優(yōu)選地至多46.8CXU/kg面粉，最優(yōu)選地至多30CXU/kg面粉的纖維素酶。11.根據(jù)權(quán)利要求7至10的任一項的面團，其包含相對于每kg面粉至少130AGI單位的淀粉葡糖苷酶，優(yōu)選地至少^OAGI/kg面粉，更優(yōu)選地至少520AGI/kg面粉，并優(yōu)選地包含至多5200AGI/kg面粉的淀粉葡糖苷酶，更優(yōu)選地至多^00AGI/kg面粉，最優(yōu)選地至多1300AGI/kg面粉的淀粉葡糖苷酶。12.根據(jù)權(quán)利要求7至10的任一項的面團，其基本不含SSL和/或CSL。13.制備烘焙產(chǎn)品的方法，其包括烘焙根據(jù)權(quán)利要求7至12的任一項的面團的步驟。14.通過烘焙根據(jù)權(quán)利要求7至13的任一項的面團可獲得的烘焙產(chǎn)品。15.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項的烘焙組合物或預(yù)混合物在面團或因此得到的烘焙產(chǎn)品的生產(chǎn)中替代乳化劑的用途，優(yōu)選地替代SSL的用途。全文摘要本發(fā)明涉及烘焙酶組合物，所述烘焙酶組合物包含對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂具有活性的脂肪分解酶、三?；视椭久负蛢?yōu)選地選自半纖維素酶或纖維素酶和淀粉葡糖苷酶的至少另一種酶，所述烘焙酶組合物可被用來完全替代面團和烘焙產(chǎn)品中的SSL和/或CSL或其他乳化劑。其中該烘焙酶組合物被以有效量添加的面團和因此獲得的烘焙產(chǎn)品具有改進的性質(zhì)(例如極好的面團穩(wěn)定性和抗沖擊性)和烘焙產(chǎn)品的改進的體積、碎屑結(jié)構(gòu)和碎屑柔軟性以及改進的抗陳化性。文檔編號C12N9/20GK102549150SQ201080039562公開日2012年7月4日申請日期2010年9月2日優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日發(fā)明者卡羅琳·漢德林·瑪麗亞·本斯朝珀·范,簡·德克·雷內(nèi)·希勒,阿利亞·格瑞特·特魯申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司