專利名稱：使用aav載體的全身給藥向視網(wǎng)膜遞送廣泛的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于將基因遞送至哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜細(xì)胞的組合物和方法。本發(fā)明還涉及通過表達(dá)治療基因來治療哺乳動(dòng)物的眼睛的病癥、特別是視網(wǎng)膜的病癥的方法。本發(fā)明源于意外的發(fā)現(xiàn)，即盡管有血-視網(wǎng)膜屏障，但雙鏈AAV載體的全身給藥仍導(dǎo)致嚴(yán)重和廣泛的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染。本發(fā)明可以使用在任何哺乳動(dòng)物、包括人類對(duì)象中。
背景技術(shù)：
視網(wǎng)膜是眼睛內(nèi)部的感光層。其由若干細(xì)胞類型形成，包括感光細(xì)胞(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。光感受器接受光并將其轉(zhuǎn)變成經(jīng)由視神經(jīng)輸送至大腦的信號(hào)。小比例的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(約2%)也是感光的，其經(jīng)由視網(wǎng)膜下丘腦束向大腦傳輸信息。這些細(xì)胞在調(diào)整瞳孔大小并控制晝夜節(jié)律中發(fā)揮作用。位于視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層外部并與下面的脈絡(luò)膜相連的色素細(xì)胞層(六角形細(xì)胞)相當(dāng)于視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)。RPE 參與感光細(xì)胞外段的吞噬作用。它還參與維生素A循環(huán)(反式視黃醇至11-順式視黃醛的異構(gòu)化)。涉及視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的絕大部分基因(諸如利伯先天性黑矇(Leber congenital amaurosis, LCA)中的 AIPL1、CRB1、CRX、GUCY2D、RPE65、LCA5 和 RPGRIP1 (對(duì)于視網(wǎng)膜色素變性而言，有56個(gè)以上的相關(guān)基因，不能檢查每個(gè)基因...從而除去該疾病，因?yàn)椴荒芨F盡并且留下作為利伯黑矇的實(shí)例))在RPE或光感受器中表達(dá)。因此，視網(wǎng)膜疾病的有效基因療法必需靶向光感受器和/或RPE，但其它細(xì)胞類型諸如雙極細(xì)胞和MUller細(xì)胞(視網(wǎng)膜的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型)也是有價(jià)值的靶細(xì)胞(參見下文)。對(duì)動(dòng)物模型中視網(wǎng)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因遞送通常需要視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)注射病毒載體。該程序可相對(duì)有效地將轉(zhuǎn)基因表達(dá)引導(dǎo)至感光細(xì)胞或RPE細(xì)胞中。然而，腺相關(guān)載體(rAAV)或慢病毒載體的視網(wǎng)膜下注射致使視網(wǎng)膜在注射的位點(diǎn)處脫離，并且可能導(dǎo)致誘發(fā)視網(wǎng)膜變薄和細(xì)胞破壞的后續(xù)局限性創(chuàng)傷，特別是在受感染的動(dòng)物中(Le Meur 等人，2007 年；Pang J.等人，2008 年，Cheng L 等人，Retina 2005)。此夕卜，視網(wǎng)膜下載體注射僅在受治療眼的注射區(qū)域中引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，向未治療眼的擴(kuò)散很有限；在AAV注射的新生小鼠中一般僅20%至30%的視網(wǎng)膜可以轉(zhuǎn)導(dǎo)，雖然載體的擴(kuò)散通常有賴于實(shí)驗(yàn)者。雖然玻璃體內(nèi)rAAV注射可有效將轉(zhuǎn)基因表達(dá)引導(dǎo)至視網(wǎng)膜細(xì)胞中，但直接用藥途徑的有創(chuàng)性質(zhì)可能表示對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)?？赡茉诮邮苈《据d體的玻璃體內(nèi)注射的眼睛中未觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)。用于對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的替代性的有效且無創(chuàng)的方法在于病毒基因載體的全身遞送。這可能是臨床應(yīng)用的最佳策略，但其受到血-視網(wǎng)膜屏障的緊密連接的妨礙，所述血-視網(wǎng)膜屏障的緊密連接阻止病毒載體從血流中進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔，尤其是在成人中。重組AAV屬于將基因轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜中的最強(qiáng)有力的基因遞送工具。它們對(duì)人并非病原性的，顯示低免疫原性，并且可在有絲分裂后的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高水平且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
然而，考慮到與玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射相關(guān)的缺點(diǎn)，則需要替代性給藥方法用于基因療法。Daly等人(PNAS, 1999)和Bostick等人(Gene Therapy, 2007)在新生小鼠中靜脈注射了分別編碼人GUSB( β-葡糖醛酸酶)基因或堿性磷酸酶(AP)報(bào)道基因的常規(guī)的、單鏈的AAV載體。在許多器官中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，包括在視網(wǎng)膜中。然而，僅在新生小鼠中轉(zhuǎn)導(dǎo)視網(wǎng)膜，所述新生小鼠中血-視網(wǎng)膜屏障并未成熟。在上述的Daly等人(1999)和Bostick等人Q007)的研究中，未提供有關(guān)視網(wǎng)膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平(DNA或RNA)的信息。由于AP和GUSB均為分泌的酶，它們?cè)谝暰W(wǎng)膜內(nèi)的存在可能是由于它們作為循環(huán)酶輸送而非它們?cè)谝暰W(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。因此，需要發(fā)展替代性策略，允許用基因轉(zhuǎn)移載體有效靶向不同的視網(wǎng)膜層，特別是RPE、感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。此外，到目前為止，尚不存在用于有效靶向視網(wǎng)膜的內(nèi)細(xì)胞諸如雙極細(xì)胞或MUller細(xì)胞(視網(wǎng)膜的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型)的有效方法。然而，將基因轉(zhuǎn)入雙極細(xì)胞也可以具有巨大的治療潛力，這由在雙極細(xì)胞中的光觸發(fā)通道表達(dá)之后失明小鼠視覺的恢復(fù)而證實(shí)(Lagali等人，Nature Neuroscience，2008，11卷(6)， 667-675頁(yè))。類似地，MUller細(xì)胞(視網(wǎng)膜的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型)也可以是有極高價(jià)值的靶標(biāo)細(xì)胞，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)致病基因(諸如利伯先天性黑矇中的CRB1)不僅在光感受器中表達(dá)，而且還在這些特定的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。因此，提供將基因遞送到雙極細(xì)胞和MUller 細(xì)胞中的方法將是非常有利的。下文所示結(jié)果證實(shí)，重組的自身互補(bǔ)型雙鏈AAV載體(scAAV)，特別是血清型9，能夠在成年小鼠中靜脈內(nèi)用藥之后對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)基因遞送。發(fā)現(xiàn)分泌蛋白(mSEAP，鼠類分泌的堿性磷酸酶)和非分泌蛋白(GFP，綠色熒光蛋白)在視網(wǎng)膜中表達(dá)，表明成年視網(wǎng)膜細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過使用定量PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中的轉(zhuǎn)基因DNA，進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。該研究首次表明，有可能在將包含目的基因的scAAV載體(特別是 scAAV9載體)單次全身給藥(特別是通過靜脈內(nèi)注射)之后，使所述目的基因有效轉(zhuǎn)移至視網(wǎng)膜細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜中廣泛的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)因此提供了用于治療眼病、且更具體來說用于治療視網(wǎng)膜病癥的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及一種包含目的治療基因的雙鏈自身互補(bǔ)型AAV(scAAV)載體， 通過將所述scAAV載體向所述對(duì)象全身給藥，用于治療眼睛的病癥、優(yōu)選是視網(wǎng)膜的病癥。本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其通過將治療基因遞送至視網(wǎng)膜細(xì)胞諸如感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、內(nèi)核層(INL)細(xì)胞(包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞，用于治療病癥。 scAAV載體的全身注射還可以將基因轉(zhuǎn)移引導(dǎo)至睫狀體。這代表一種將治療性蛋白(諸如抗VEGF因子)分泌到眼中的特別有價(jià)值的方法。本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其用于將治療性蛋白或RNA產(chǎn)生到視網(wǎng)膜的細(xì)胞中、或者從所述視網(wǎng)膜的細(xì)胞中產(chǎn)生出。例如，該治療性蛋白或RNA的產(chǎn)生可以在視網(wǎng)膜細(xì)胞中發(fā)生，諸如在感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、 內(nèi)核層(INL)細(xì)胞(包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞中。
本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其通過腹膜內(nèi)(i.p.)、肌內(nèi)(i.m.)、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi)(i.v.)注射、優(yōu)選是i. v.注射來用藥。此外，本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其中所述scAAV載體是人血清型 AAV載體，優(yōu)選選自血清型6、8和9，最優(yōu)選是血清型9。scAAV9為代表性scAAV，其可以根據(jù)本發(fā)明來使用。因此，本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其中所述scAAV載體包含AAV9衣殼。本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其中所述scAAV載體是假型scAAV載體，優(yōu)選是SCAAV2/9載體。本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其中該scAAV載體(例如scAAV9或 scAAV2/9載體)包含缺乏編碼病毒序列的功能性Rep和Cap的復(fù)制缺陷型scAAV基因組。本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，其中該基因編碼治療性RNA、或治療性蛋白，所述治療性RNA或治療性蛋白已知在眼睛的病理學(xué)病癥中、優(yōu)選在病理學(xué)病癥中是突變的或缺陷的，特別是在涉及視網(wǎng)膜細(xì)胞諸如感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、內(nèi)核層(INL)細(xì)胞(包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞中是突變的或缺陷的。本發(fā)明還涉及一種如上所述的scAAV載體，用于治療選自遺傳眼病(例如利伯氏先天性黑矇)和散發(fā)眼病(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病)的視網(wǎng)膜病癥，特別是包括脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的病癥。代表性病癥包括色素性視網(wǎng)膜炎(Retinitis pigmentosa)、黃斑變性(Macular degeneration)、視錐-視桿營(yíng)養(yǎng)不良(Cone-rod dystrophy)、視網(wǎng)膜脫離 (Retinal detachment) > ^iilJifiIlNII^I (hypertensive retinopathy)
瘤(Retinoblastoma)、利伯氏先天性黑矇(Leber' s congenital amaurosis)、黃斑水月中 (Macular edema)、鳥槍彈樣脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病(Birdshot chorioretinopathy)、卵黃形黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Vitelliform macular dystrophy)、青光眼(Glaucoma)、玻璃體和球體的病癥等等。本發(fā)明還提供了通過分泌治療性蛋白的基因轉(zhuǎn)移來治療眼睛的某些其它病癥的方法， 所述其它病癥包括鞏膜、角膜、虹膜和睫狀體的病癥、視神經(jīng)和視路的病癥(不包括利伯氏遺傳視神經(jīng)病)、眼肌的病癥等等。本發(fā)明的另一目的涉及包含目的治療基因的scAAV載體用于制造一種藥物的用途，該藥物通過將所述scAAV載體向所述對(duì)象全身給藥來治療眼睛的病癥、特別是視網(wǎng)膜的病癥。本發(fā)明還涉及一種跨越血-視網(wǎng)膜屏障遞送基因的方法，該方法包含以下步驟 將包含所述基因的sckkN載體通過全身途徑向需要其的哺乳動(dòng)物用藥。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及一種將基因、特別是治療基因遞送至需要其的哺乳動(dòng)物中視網(wǎng)膜的細(xì)胞的方法，該方法包含通過全身途徑將包含所述基因的scAAV載體對(duì)哺乳動(dòng)物用藥。所述用藥使得視網(wǎng)膜的細(xì)胞、特別是感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、內(nèi)核層(INL)細(xì)胞(包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞被所述scAAV載體感染并因此將所述基因和表達(dá)的蛋白遞送至視網(wǎng)膜的所述細(xì)胞中。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及一種將基因、特別是治療基因遞送至需要其的哺乳動(dòng)物中眼睛的睫狀體或視神經(jīng)的方法，該方法包含通過全身途徑將包含所述基因的scAAV載體用藥于該哺乳動(dòng)物。本發(fā)明因此還涉及一種下文更詳細(xì)描述的scAAV載體，通過將所述 scAAV載體全身給藥于需要其的對(duì)象，從而感染睫狀體或視神經(jīng)的細(xì)胞，用于治療眼睛的病癥。本發(fā)明還涉及一種在哺乳動(dòng)物對(duì)象中跨越血-視網(wǎng)膜屏障進(jìn)行基因療法的方法，該方法包含將scAAV載體全身給藥于對(duì)象。具體來說，可以使用、而是不僅可使用 scAAV9 (或 scAAV2/9)載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種基因修飾哺乳動(dòng)物對(duì)象中眼睛的細(xì)胞、更具體而言是視網(wǎng)膜的細(xì)胞、特別是感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、內(nèi)核層 (INL)細(xì)胞(包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞的方法，該方法包含將scAAV載體全身給藥于對(duì)象。在具體實(shí)施方式
中，被修飾的眼睛細(xì)胞為睫狀體細(xì)胞。本發(fā)明還在于一種向?qū)ο蟮囊暰W(wǎng)膜進(jìn)行基因遞送的方法，該方法包括將包含所述基因的scAAV載體全身給藥于對(duì)象?？杀槐景l(fā)明scAAV載體靶向的視網(wǎng)膜細(xì)胞的說明性實(shí)例包括感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、內(nèi)核層(INL)細(xì)胞 (包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞、或睫狀體的細(xì)胞。本發(fā)明的其它目的和應(yīng)用提供在以下詳細(xì)說明中。


圖1.在來自I. V. AAV-mSEAP注射的成年小鼠的眼組織樣本中的mSEAP表達(dá)。(A)在尾靜脈中注射了 ssAAVl、ssAAV9、scAAVl和scAAV9的小鼠的眼組織樣本中載體基因組拷貝數(shù)。在每一組中，2個(gè)小鼠注射lxl0el2Vg，l個(gè)小鼠注射3xl0ellVg。值為平均值+/_平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。(B)在尾靜脈中注射ssAAV9和scAAV9的小鼠的眼睛組織樣本中mSEAP活性數(shù)。 在每一組中，2個(gè)小鼠注射lX10el2vg，l個(gè)小鼠注射3xl0ellVg。值為平均值+/_平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。圖2.用SCAAV9-GFP載體進(jìn)行IV注射的成年小鼠的視網(wǎng)膜的代表性橫截面在IV注射MlO12Vg的scAAV9載體之后4周經(jīng)處理用于GFP免疫熒光法的視網(wǎng)膜切片顯示若干視網(wǎng)膜層(a至b)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述視網(wǎng)膜層包括(a至d)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(GCL，箭號(hào))、(a，b，e)內(nèi)核層(INL，箭號(hào))、(f)罕見感光細(xì)胞(箭號(hào))和(a，f)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE，箭頭)。GCL 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；INL 內(nèi)核層；ONL 外核層；RPE 視網(wǎng)膜色素上皮。圖3.用SCAAV9-GFP載體-II-進(jìn)行IV注射的成年小鼠的視網(wǎng)膜的代表性橫截面在IV注射MlO12Vg的scAAV9載體之后4周進(jìn)行的GFP免疫熒光分析顯示視神經(jīng) (來自GCL)中的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維(a，b)與睫狀體(c，d)的強(qiáng)烈GFP著色。比例尺50 μ m。圖4.成年小鼠在靜脈內(nèi)遞送scAAV9之后視網(wǎng)膜中的GFP表達(dá)。小鼠8周齡時(shí)尾靜脈遞送2. IO12Vg的scAAV9-CMV-GFP之后4周的GFP免疫熒光 (A，C，E，G)、和用Dapi核標(biāo)志物復(fù)染的相同視圖(B，D，F(xiàn)，H)。在睫狀體(A和B中的CB) 中和在RGC層(A至D，G，H)的許多細(xì)胞中，以及在INL的不同細(xì)胞類型、包括具有雙極細(xì)胞 (C至F中的箭頭)和MUller細(xì)胞(G和H中的箭號(hào))的形態(tài)的細(xì)胞中存在GFP表達(dá)。還檢測(cè)到零散的光感受器(C、D、G和H中的星號(hào))和RPE細(xì)胞(E和F中箭號(hào))。(I，J)為視神經(jīng)(來自GCL)中的GFP陽(yáng)性的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維。RPE 視網(wǎng)膜色素上皮；ONL 外核層；INL 內(nèi)核層；RGC 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。圖5.全身scAAV9注射介導(dǎo)對(duì)成年小鼠視網(wǎng)膜中RCG和雙極細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移視網(wǎng)膜的(A至C)GFP/Brn-3a(RCG-特異性標(biāo)志物)和(D至F)GFP/ChxlO (雙極細(xì)胞特異性標(biāo)志物)雙重免疫染色顯示神經(jīng)節(jié)和雙極細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。在成年小鼠中尾靜脈注射scAAV-CMV-GFP載體(每只小鼠2. IO12Vg)之后4周獲得的視網(wǎng)膜的橫向恒冷切片上進(jìn)行雙重標(biāo)記。在(A至C)中箭頭指示雙重標(biāo)記的RGC而箭號(hào)指示僅表達(dá)GFP的細(xì)胞； 轉(zhuǎn)導(dǎo)的光感受器由星號(hào)突出顯示。在(D至F)中箭號(hào)指出表達(dá)高水平GFP的ChxlO陽(yáng)性雙極細(xì)胞；由于上游RGC的轉(zhuǎn)導(dǎo)，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(星號(hào))呈現(xiàn)GFP陽(yáng)性。ONL 外核層； INL 內(nèi)核層；RGC 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。
具體實(shí)施例方式對(duì)視網(wǎng)膜的廣泛基因遞送對(duì)于眼睛疾病、特別是對(duì)視網(wǎng)膜疾病的治療是重大挑戰(zhàn)，所述視網(wǎng)膜疾病諸如視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良，包括利伯先天性黑矇(LCA)或色素性視網(wǎng)膜炎 (RP)。在此，我們描述一種基于重組自身互補(bǔ)型雙鏈AAV載體(scAAV)的全身給藥的眼睛基因轉(zhuǎn)移新方法。發(fā)明人已證實(shí)，在成年小鼠中單次靜脈內(nèi)(IV)注射重組scAAV載體可以在雙眼中、包括在視網(wǎng)膜的不同層中、睫狀體中、神經(jīng)纖維層中和脈絡(luò)膜中實(shí)現(xiàn)廣泛的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這是在IV注射編碼鼠分泌型堿性磷酸酶報(bào)道基因(mSEAP)的scAAV載體之后，在DNA 和蛋白水平上首次觀察的。然后，在將表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的scAAV IV注射并且免疫檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物之后，在眼組織切片上確認(rèn)IV基因轉(zhuǎn)移至成年小鼠的眼睛中的scAAV載體的優(yōu)勢(shì)。發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜的不同層被轉(zhuǎn)導(dǎo)(雖然效率不同)。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)的層包括脈絡(luò)膜、RPE、 光感受器層和外核層(視桿/視錐)、外叢狀層和內(nèi)核層(雙極、水平和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、內(nèi)叢狀層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)、神經(jīng)纖維層(來自神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突纖維)、最內(nèi)層 (MUller細(xì)胞)。還發(fā)現(xiàn)睫狀體高度轉(zhuǎn)導(dǎo)。重要的是，這種基因遞送程序未導(dǎo)致任何視網(wǎng)膜損傷，諸如視網(wǎng)膜脫離或變薄。發(fā)明人因此首次證實(shí)，scAAV載體的無創(chuàng)全身遞送可以在成年動(dòng)物中引導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞的廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種對(duì)成年視網(wǎng)膜進(jìn)行的無先例的全身AAV介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移為絕大部分眼病、優(yōu)選視網(wǎng)膜疾病的基因療法提供了有希望的應(yīng)用。AAV 載體在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)"AAV載體"是指包含或衍生自AAV的組份并且適于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞、優(yōu)選人細(xì)胞的任何載體。術(shù)語(yǔ)AAV載體一般是指包含至少一種編碼治療性蛋白的核苷酸分子的AAV型病毒粒子(或毒粒)。如下文論述，AAV可衍生自各種血清型，包括血清型的組合(即"假型"AAV)，或衍生自各種基因組。另外，AAV載體可為復(fù)制缺陷型和/或靶向型。腺相關(guān)病毒(AAV)是依賴性細(xì)小病毒，大小為約二十納米。如其它細(xì)小病毒一樣， AAV是單鏈的非包膜DNA病毒，具有長(zhǎng)度為約5000個(gè)核苷酸的基因組，含有兩個(gè)開放讀碼框。左邊開放讀碼框編碼負(fù)責(zé)復(fù)制(Rep)的蛋白，而右邊開放讀碼框編碼衣殼(Cap)的結(jié)構(gòu)蛋白。所述開放讀碼框兩側(cè)為兩個(gè)ITR序列，它們用作病毒基因組的復(fù)制起點(diǎn)。此外，該基因組還含有包裝序列，允許將病毒基因組包裝至AAV衣殼中。
AAV需要共輔助(co-helper)功能(其可例如通過腺病毒、或通過適宜的包裝細(xì)胞或輔助質(zhì)粒提供)以經(jīng)歷在培養(yǎng)細(xì)胞中的增殖性感染。在缺乏這種輔助功能的情況下，AAV 毒?；旧线M(jìn)入細(xì)胞，作為單鏈DNA分子遷移至細(xì)胞核，并且整合至細(xì)胞基因組中。AAV具有寬宿主范圍的感染力，包括人細(xì)胞，普遍存在于人類中，并且是完全非致病性的。
AAV載體已被設(shè)計(jì)、產(chǎn)生以及用于介導(dǎo)人對(duì)象中的基因遞送，包括用于治療性目的。目前各國(guó)正在使用AAV載體進(jìn)行臨床試驗(yàn)。一般而言，用于基因轉(zhuǎn)移的AAV載體包含缺乏編碼病毒序列的功能性Rep和Cap的復(fù)制缺陷型AAV基因組。這種復(fù)制缺陷型AAV載體更優(yōu)選缺乏大多數(shù)或所有Rep和Cap編碼序列，并基本上保留一個(gè)或兩個(gè)AAV ITR序列和包裝序列。
產(chǎn)生這種AAV載體的方法已公開于文獻(xiàn)中，包括使用包裝細(xì)胞、輔助病毒或質(zhì)粒、和 / 或桿狀病毒系統(tǒng)(Samulski 等人，(1989) J. Virology 63,3822 ；Xiao 等人，(1998) J. Virology 72,2224 ； Inoue 等人，(1998) J. Virol. 72, 7024 ；W098/22607 ； W02005/072364)。應(yīng)注意，這些方法中有幾種涉及無輔助AAV產(chǎn)生，其在本發(fā)明范圍之內(nèi)為優(yōu)選的產(chǎn)生方法。還報(bào)道了產(chǎn)生假型AAV載體的方法(例如W000/28004)，以及AAV載體的各種修改形式或制劑，用于降低它們?cè)隗w內(nèi)用藥之后的免疫原性(參見如W001/23001 ； W000/73316 ；W004/112727 ；W005/005610 ；W099/06562)。
本發(fā)明實(shí)施雙鏈AAV載體，即AAV基因組為雙鏈的自身互補(bǔ)型(scAAV)核酸 (McCarty等人，Gene Therapy, 2003)。通過從一個(gè)AAV末端重復(fù)序列上刪除末端分解位點(diǎn) (trs)產(chǎn)生scAAV載體。這些修飾的載體，其復(fù)制基因組為野生型的長(zhǎng)度的一半，具有包裝 DNA 二聚體的傾向(McCarty等人，Gene Therapy，2003)。簡(jiǎn)單來說，在AAV的復(fù)制周期期間，R印內(nèi)切核酸酶對(duì)trs切口以引發(fā)產(chǎn)生單體基因組的第二次DNA復(fù)制過程。當(dāng)R印未能對(duì)trs切口時(shí)，產(chǎn)生scAAV的二聚體基因組(McCarty，Molecular Therapy 2008)。復(fù)制繼續(xù)經(jīng)過ITR以產(chǎn)生二聚體模板，該模板引發(fā)新一輪的DNA合成，產(chǎn)生二聚體單鏈基因組(二聚體逆向重復(fù)基因組)。兩條鏈因此作為單分子包裝至AAV毒粒中。該單鏈DNA分子的兩半然后可以折疊，并且堿基配對(duì)以形成dsDNA分子。上文提及的McCarty等人的文章詳細(xì)描述scAAV的產(chǎn)生過程，并可按照其來獲得根據(jù)本發(fā)明的載體。
AAV載體可由各種血清型的AAV制備或衍生，所述各種血清型的AAV甚至可混合在一起或者與其它類型的病毒混合以產(chǎn)生嵌合型(例如假型)AAV病毒。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明中使用的scAAV載體衍生自人AAV病毒。這種人AAV (衣殼和ITR)可衍生自任何已知血清型，例如衍生自血清型1至11的任一種，優(yōu)選衍生自AAV2、AAV4、AAV6、AAV8和 AAV9，更優(yōu)選衍生自AAV6、AAV8和AAV9，更甚優(yōu)選衍生自AAV9。這種AAV載體的特定實(shí)例為在AAV2衍生的衣殼中包含AAV2衍生的基因組(一種核酸分子，其包含AAV2衍生的ITR 和AAV2衍生的包裝序列，操作性連接至編碼治療性蛋白的核酸，優(yōu)選包含兩個(gè)AAV2衍生的 ITR位于AAV2衍生的包裝序列和編碼治療性蛋白的核酸的兩側(cè))的載體；在AAV4衍生的衣殼中包含AAV4衍生的基因組的載體；在AAV6衍生的衣殼中包含AAV6衍生的基因組的載體；在AAV8衍生的衣殼中包含AAV8衍生的基因組的載體；在AAV9衍生的衣殼中包含AAV9衍生的基因組的載體。
在另一具體實(shí)施方式
中，AAV載體為假型AAV載體，即該載體包含源自至少兩個(gè)不同AAV血清型的序列或組份。在具體實(shí)施方式
中，假型AAV載體包含衍生自一個(gè)AAV血清型(例如AAM)的AAV基因組和至少部分衍生自不同AAV血清型的衣殼。這種假型AAV載體的特定實(shí)例包括但不限于在AAV6、AAV8或AAV9衍生的衣殼中包含衍生自任何AAV血清型(例如自AAVl至AAVl 1)的基因組的載體。優(yōu)選地，scAAV基因組衍生自AAV2基因組。 這種其基因組衍生自AAV2基因組的假型scAAV的特定實(shí)例包括但不限于包含AAV6、AAV8 或AAV9衍生的衣殼的載體。在另一具體實(shí)施方式
中，假型scAAV載體在AAV9衍生的衣殼中包含衍生自任何上文提及的AAV血清型(例如血清型1至11)的基因組。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，scAAV載體為在AAV9衍生的衣殼中包含AAV2衍生的基因組的載體(也稱作 scAAV2/9)。
在可與任何上述實(shí)施方式組合的另一具體實(shí)施方式
中，scAAV載體可包含修飾的衣殼，包括非病毒來源或結(jié)構(gòu)性修飾的蛋白或肽，以改變載體(衣殼突變體或"雜化"血清型)的向性。這些載體的重定向可以基于不同類型的修飾，諸如轉(zhuǎn)衣殼、特異性抗體吸附至衣殼表面(包括具體受體的配體、具體配體的受體，以將載體靶向至分別表達(dá)所述受體或配體的細(xì)胞類型)、鑲嵌型衣殼、嵌合型衣殼(Vivian W. Choi, Curr Gene Ther. 2005)。
如上文所論述，AAV衍生的基因組包含特別編碼治療性蛋白的治療基因。一般在該實(shí)施方式中，該核酸還包含允許表達(dá)并優(yōu)選分泌編碼蛋白的調(diào)控序列，諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ、編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)的序列等等。就此而言，該核酸最優(yōu)選包含與編碼序列可操作連接的啟動(dòng)子區(qū)，以促使或提高在感染細(xì)胞中治療性蛋白的表達(dá)。這種啟動(dòng)子可以是普遍存在的、組織特異性的、強(qiáng)的、弱的、受調(diào)控的、 嵌合型的、可誘導(dǎo)的等等，以允許在感染組織中有效且適宜地產(chǎn)生蛋白。該啟動(dòng)子可以與編碼蛋白同源或異源，包括細(xì)胞的、病毒的、真菌的、植物的或合成的啟動(dòng)子。本發(fā)明中使用的最優(yōu)選的啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)在細(xì)胞或視網(wǎng)膜中、更優(yōu)選在視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中或在 RPE的細(xì)胞中為功能性的。這種調(diào)控的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于含有Tet開/關(guān)元件的啟動(dòng)子、納巴霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子。普遍存在的啟動(dòng)子的實(shí)例包括病毒啟動(dòng)子，特別是CMV啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等等，以及細(xì)胞啟動(dòng)子，諸如PGK (磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可以是神經(jīng)特異性啟動(dòng)子，諸如突觸蛋白或NSE(神經(jīng)元特異性烯醇酶)啟動(dòng)子(或位于普遍存在的PGK啟動(dòng)子上游的NRSE (神經(jīng)元限制性沉默子元件)序列)，或者是各種視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的特異性啟動(dòng)子，諸如RPE65、VMD2、視紫紅質(zhì)或視錐抑制蛋白啟動(dòng)子。
如果治療基因編碼治療性RNA，則經(jīng)典RNA聚合酶pol III啟動(dòng)子可以用于shRNA 表達(dá)(例如人或鼠Hl或TO啟動(dòng)子)。核酶和反義序列通常由標(biāo)準(zhǔn)聚合酶II啟動(dòng)子表達(dá)。 如本領(lǐng)域已知，誘導(dǎo)型表達(dá)盒還可以適合于AAV介導(dǎo)的shRNA表達(dá)。
核酸也可包含在非目標(biāo)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的miRNA的靶序列。例如，在造血譜系中抑制表達(dá)(“去靶向”)能夠通過降低轉(zhuǎn)基因特異性免疫應(yīng)答的發(fā)生率和程度來穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移(Brown BD，Nature Medicine 2008)。
在具體實(shí)施方式
中，核酸包含允許分泌編碼蛋白的前導(dǎo)序列。目的轉(zhuǎn)基因與編碼分泌信號(hào)肽的序列(通常位于分泌多肽的N末端)的融合能允許產(chǎn)生可從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分泌的形式的治療性蛋白。這種信號(hào)肽的實(shí)例包括白蛋白、β葡糖醛酸酶、堿性蛋白酶或纖連蛋白分泌信號(hào)肽。
根據(jù)另一特定實(shí)施方式，轉(zhuǎn)基因與PTD序列諸如Tat或VP22序列融合，以便促使或提高治療性蛋白從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分泌和被相鄰轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞再攝取。
在具體實(shí)施方式
中，核苷酸包含可操作地連接的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列，以允許表達(dá)和分泌編碼蛋白。
在另一具體實(shí)施方式
中，核酸包含可操作地連接的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和PTD序列， 以允許表達(dá)和分泌編碼蛋白。
在最優(yōu)選實(shí)施方式中，啟動(dòng)子在視網(wǎng)膜的細(xì)胞中、特別是在視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中或在RPE中為特異性或功能性的，S卩，允許(優(yōu)先)在所述細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。
在具體實(shí)施方式
中，核酸包含內(nèi)含子(例如嵌合內(nèi)含子)以增強(qiáng)mRNA和編碼蛋白的表達(dá)。在該實(shí)施方式的特定變體中，本發(fā)明涉及scAAV9(或SCAAV2/9)載體，其包含受到啟動(dòng)子(優(yōu)選在視網(wǎng)膜細(xì)胞中為特異性或功能性的啟動(dòng)子)控制的目的基因(即轉(zhuǎn)基因， 例如如下所述的治療基因之一)，其中在所述啟動(dòng)子和所述目的基因之間存在異源的或嵌合的內(nèi)含子。已有報(bào)道，在啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)基因之間插入異源內(nèi)含子可提高表達(dá)O^lmiter等人，1991，PNAS，88，478-482)。嵌合內(nèi)含子可從例如!Iomega商購(gòu)獲得。本發(fā)明的載體中可用的舉例說明性的嵌合內(nèi)含子由人β珠蛋白內(nèi)含子1的5'供體剪接位點(diǎn)以及分支點(diǎn)、和免疫球蛋白基因重鏈可變區(qū)的內(nèi)含子衍生的3'受體剪接位點(diǎn)組成。
如上文所論述，scAAV載體可以通過本領(lǐng)域本來已知的技術(shù)產(chǎn)生，如在實(shí)施例中進(jìn)一步說明。
全身給藥
本發(fā)明是基于意外的發(fā)現(xiàn)，S卩，可通過AAV載體的全身給藥來實(shí)現(xiàn)在視網(wǎng)膜的細(xì)胞中有效且廣泛的基因表達(dá)。這種全身給藥包括但不限于任何用藥途徑，其不意味直接注射至視網(wǎng)膜中，諸如視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)注射。更具體來說，全身給藥包括scAAV載體的全身注射，諸如肌內(nèi)(i.m.)、血管內(nèi)即動(dòng)脈內(nèi)(i.a.)或靜脈內(nèi)(i.v.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、 皮下或經(jīng)皮注射。外周用藥還包括AAV載體的口服用藥(W096/40%4)，使用植入物遞送 (W001/91803)，或通過呼吸系統(tǒng)滴注(例如通過鼻內(nèi)途徑)用藥，例如使用噴霧劑、氣溶膠或任何其它適當(dāng)制劑。最優(yōu)選的全身給藥包括scAAV載體的全身注射，最優(yōu)選經(jīng)由i.m.、 i.p.、i.a.或i.v.注射。最優(yōu)選地，scAAV載體經(jīng)由i.v.注射用藥。
scAAV載體一般以"治療有效"量用藥，即，所述量為足以減輕(例如減少、降低) 與疾病狀態(tài)相關(guān)的至少一種癥狀、或提供對(duì)象的病況改善的量。應(yīng)當(dāng)指出的是，如果需要， 可以使用相同或不同的全身給藥途徑和/或相同或不同的scAAV血清型進(jìn)行重復(fù)用藥?；蛘?，也可進(jìn)行scAAV單次用藥。
例如，取決于病況、對(duì)象(例如根據(jù)其體重、代謝等)、治療計(jì)劃等等，scAAV載體的劑量可以由熟練技術(shù)人員容易調(diào)適。本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選有效劑量為使得視網(wǎng)膜的細(xì)胞 (感光細(xì)胞或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或RPE的細(xì)胞)最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)的劑量。一般而言，小鼠每劑用藥IO9至 IOw個(gè)病毒基因組(轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)，優(yōu)選約IO11至IO13個(gè)。一般而言，對(duì)人用藥的AAV載體的劑量范圍可以是IO11至IO17個(gè)病毒基因組，優(yōu)選IO13至1016個(gè)，最優(yōu)選IO14至IO15個(gè)。
scAAV載體可以用任何適宜形式用藥，如作為液體溶液劑或懸浮劑、作為適于在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式、作為凝膠劑或作為乳劑。scAAV載體一般用任何適當(dāng)且藥學(xué)上可接受的賦形劑、載劑、佐劑、稀釋劑等等配制。對(duì)于注射來說，賦形劑可以是液體、等滲溶液、緩沖液，諸如無菌且無熱原的水或無菌且無熱原的磷酸鹽緩沖鹽溶液。對(duì)于吸入來說，賦形劑可以呈粒子形式。
眼睛/視網(wǎng)膜疾病
本發(fā)明首次表明，scAAV載體的單次全身給藥致使雙眼的細(xì)胞顯著轉(zhuǎn)導(dǎo)。具體來說，已觀察到睫狀體、神經(jīng)纖維層、視神經(jīng)以及視網(wǎng)膜的不同細(xì)胞層的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
具體來說，本發(fā)明表明，全身給藥的scAAV載體(特別是scAAV9載體、更特別是 scAAV2/9)載體可能通過跨過血-視網(wǎng)膜屏障而致使顯著轉(zhuǎn)導(dǎo)視網(wǎng)膜的細(xì)胞，特別是感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、內(nèi)核層(INL)細(xì)胞(包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞。本文所示結(jié)果表明，從視網(wǎng)膜的最內(nèi)層至RPE的轉(zhuǎn)導(dǎo)是有效的，從而向視網(wǎng)膜中提供廣泛基因遞送。
本發(fā)明因此提供一種將基因遞送至這些特定細(xì)胞類型中每一種的方法，所述方法包含在其基因組中攜帶所述基因的scAAV載體(特別是scAAV9、更特別是scAAV2/9載體) 的全身給藥。
本發(fā)明因此可通過將治療性產(chǎn)物遞送至上述細(xì)胞中、特別是視網(wǎng)膜的細(xì)胞中，用來治療各種病癥。治療性產(chǎn)物可以是任何蛋白、肽或RNA，所述蛋白、肽或RNA能減輕或減少由于對(duì)象的細(xì)胞中蛋白的不存在、缺陷或過表達(dá)所致的癥狀，或者以其它方式賦予對(duì)象有益效果(例如通過從視網(wǎng)膜產(chǎn)生分泌型營(yíng)養(yǎng)因子，其可以治療由遠(yuǎn)離視網(wǎng)膜的細(xì)胞引起的病理狀態(tài))。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過對(duì)其領(lǐng)域中的科學(xué)文獻(xiàn)的了解而知道哪一些基因可能更適合包括在本發(fā)明的scAAV載體中以治療特定疾病。治療性蛋白的實(shí)例包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、酶、抗凋亡因子、血管生成因子或抗血管生成因子、和已知在病理學(xué)病癥中突變的任何蛋白，所述病理學(xué)病癥諸如色素性視網(wǎng)膜炎(例如，由視網(wǎng)膜色素上皮特異性蛋白65kDa(RPE65)或ATP結(jié)合盒的亞家族A(ABCl)的成員4(ABCA4)基因編碼的蛋白)和利伯先天性黑矇(例如，由視網(wǎng)膜色素上皮特異性蛋白65kDa(RPE6Q或鳥苷酸環(huán)化酶2D——膜(視網(wǎng)膜特異性)(⑶CY2D)基因編碼的蛋白)。
靶向雙極細(xì)胞的巨大治療潛力已通過在ON型雙極細(xì)胞中表達(dá)光觸發(fā)通道之后失明小鼠視覺的恢復(fù)而證實(shí)(Lagali 等人，2008，Nature Neuroscience，11，6，667-675)。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方式
涉及用scAAV載體(特別是SCAAV2/9)來靶向雙極細(xì)胞，所述 scAAV載體包含用于恢復(fù)視覺的基因，特別是視紫紅質(zhì)通道-2基因(ChR2)。
本發(fā)明進(jìn)一步更具體涉及如上文所定義的方法和使用，包含施用scAAV載體(特別是SCAAV2/9)，所述scAAV載體包含用于治療利伯氏先天性黑矇或色素性視網(wǎng)膜炎的基因，例如RPE65基因。
本發(fā)明還涉及scAAV載體、特別是scAAV9或scAAV2/9載體，其編碼至少一種上述治療性蛋白。
治療性RNA的實(shí)例包括對(duì)任何以下所提及的疾病具有治療性意義的反義RNA或 siRNA (或 shRNA)或微小 RNA (miRNA)(諸如 VEGF mRNA 靶向性 siRNA 或 miRNA)。本發(fā)明因此涉及scAAV載體、特別是scAAV9或scAAV2/9載體，其編碼對(duì)眼病、諸如下文提及的疾病具有治療性意義的siRNA或miRNA。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及scAAV載體、特別是 scAAV9 或 scAAV2/9 載體，其編碼 VEGF mRNA 靶向性 siRNA (或 sh-RNA)或 miRNA。
取決于治療性產(chǎn)物，本發(fā)明可用于治療各種眼睛疾病，包括可通過將治療性蛋白表達(dá)至視網(wǎng)膜的細(xì)胞中或從視網(wǎng)膜的細(xì)胞中表達(dá)所述治療性蛋白來治療或預(yù)防的任何疾病。這樣的疾病包括遺傳(例如利伯氏先天性黑矇)和散發(fā)(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病)眼病，特別包括包括脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的病癥。這些疾病中的一些包括色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、視錐-視桿營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜變性、高血壓性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、 利伯氏先天性黑矇、黃斑水腫、鳥槍彈樣脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病、卵黃形黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、青光眼、玻璃體和球體的病癥等等。本發(fā)明還提供(通過分泌型治療性蛋白的基因轉(zhuǎn)移)治療眼睛的其它病癥的手段，所述其它病癥包括鞏膜、角膜、虹膜和睫狀體的病癥、視神經(jīng)和視路的病癥(不包括利伯氏遺傳視神經(jīng)病)、眼肌的病癥等等。
本發(fā)明還可以用于感染可產(chǎn)生分泌產(chǎn)物的細(xì)胞。具體來說，包含編碼分泌蛋白的目的基因的scAAV(特別是scAAV9、更特別是scAAV2/9)可用于感染上文描述的細(xì)胞、特別是睫狀體的細(xì)胞。在感染之后，這些細(xì)胞可在眼睛的眼內(nèi)組織中釋放分泌產(chǎn)物(特別是分泌蛋白)并因此可以治療范圍很廣的眼病。例如，本發(fā)明通過全身給藥包含編碼分泌型抗 VEGF抗體的基因的scAAV載體(例如scAAV9或scAAV2/9載體)來治療眼病。本發(fā)明因此還涉及scAAV載體、特別是scAAV9或scAAV2/9載體，其編碼抗VEGF抗體。
本發(fā)明可用于任何哺乳動(dòng)物、特別是人對(duì)象、包括成人中，以用于預(yù)防性或治愈性治療。
本發(fā)明還可以用于診斷方法中，以檢測(cè)哺乳動(dòng)物對(duì)象中視網(wǎng)膜的細(xì)胞或亞組織切片的狀態(tài)、活性或生長(zhǎng)。對(duì)于這種情況，載體一般包含可檢測(cè)的基因(熒光、發(fā)光等等)并用作標(biāo)志物。
本發(fā)明還可以用于動(dòng)物對(duì)象中，例如用于輔助研究治療眼睛病癥、特別是視網(wǎng)膜病癥的候選藥物，和/或用于了解視網(wǎng)膜的細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、活性等等的機(jī)制。
本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)在下面實(shí)驗(yàn)部分中公開，應(yīng)認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)部分僅是說明性的，并不限制本申請(qǐng)的范圍。
實(shí)施例
材料和方法
動(dòng)物
從Charles River實(shí)驗(yàn)室(Les Oncins，法國(guó))購(gòu)買成年C57B1/6小鼠(6至8周齡，雌性，16個(gè)小鼠)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的歐洲準(zhǔn)則進(jìn)行，并通過當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)(CREEA)批準(zhǔn)。
載體
在巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動(dòng)子控制下，AAV載體表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)或小鼠分泌型堿性磷酸酶(mSEAP)。血清型9AAV的產(chǎn)生先前已有描述(Duque等人，2009)。 簡(jiǎn)單來說，假型AAV2/9載體是通過將基于AAV2的重組單鏈(ss)或自身互補(bǔ)型(sc)基因組包裝至AAV9衣殼中而產(chǎn)生的。該載體是在HEK293細(xì)胞中通過無輔助病毒的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的，使用了(1)腺病毒輔助質(zhì)粒(PXX6-80) ； (2)編碼r印2和capl或9基因的AAV包裝質(zhì)粒(用于AAVl的pLTRC02和用于AAV9的p5E18_VD2/9) ； (3) AAV2穿梭質(zhì)粒，其含有在sc基因組中編碼GFP (在巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV IE)啟動(dòng)子的控制下)的基因或者在ss 或sc基因組中編碼mSEAP(鼠分泌型堿性磷酸酶)的基因。含有sc基因組的質(zhì)粒是通過從一個(gè)反向末端重復(fù)序列上刪除D序列和末端分解位點(diǎn)(trs)而構(gòu)成。通過雙重CsCl超速離心隨后經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水透析(五次緩沖液改變，每輪透析3小時(shí))來凈化重組載體 (rAAV)。通過對(duì)注射至小鼠中的載體進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR和通過對(duì)注射至小貓中的載體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，對(duì)物理粒子定量。載體滴定度表達(dá)為每毫升的病毒基因組(vg/ml)。
體內(nèi)rAAV注射
12 個(gè)成年小鼠用 ssAAVl-mSEAP、scAAVl-mSEAP、ssAAV9_mSEAP 和 scAAV9_mSEAP 注射至尾靜脈中G個(gè)小鼠每只小鼠注射3x10^^,8個(gè)小鼠每只小鼠注射IO12Vg)。
四個(gè)成年小鼠(6周齡)用體積500 μ 1的MlO12Vg scAAV9_GFP注射至尾靜脈中。 與Iml注射器相連的30號(hào)針頭插入尾靜脈中，在約30秒內(nèi)注射500 μ 1病毒溶液。
mSEAP定量測(cè)定
將冷凍組織在700μ 1細(xì)胞核裂解緩沖液內(nèi)裂解，該緩沖液包含在含有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich)的Wizard基因組DNA提取試劑盒(Promega公司)中。組織首先用Ultra-Turrax勻漿30秒，然后經(jīng)受連續(xù)三次勻漿以實(shí)現(xiàn)完全裂解。細(xì)胞膜和碎片通過在4°C下以10，OOOg離心2分鐘來沉淀。mSEAP活性在上清液中用化學(xué)發(fā)光分析來測(cè)量。簡(jiǎn)單來說，根據(jù)制造商的說明書(Tropix，Applied Biosystems)，使內(nèi)源性堿性磷酸酶在65°C 下熱失活5分鐘，并通過加入反應(yīng)緩沖液和CPSD化學(xué)發(fā)光底物來測(cè)量耐熱mSEAP。使用光度計(jì)(Perkin Elmer)定量化學(xué)發(fā)光。表達(dá)/活性水平根據(jù)凈化的人胎盤堿性磷酸酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線表達(dá)為每一裂解液的mSEAP ng數(shù)，并使用納米橙蛋白定量分析 (nano-orang印rotein quantitation assay ) (Invitrogen)標(biāo)準(zhǔn)化每 Pg 蛋白。
載體基因組拷貝數(shù)定量
對(duì)眼裂解液進(jìn)行基因組DNA提取(Wizard基因組DNA提取試劑盒，Promega)。通過實(shí)時(shí)PCR分析，使用對(duì)應(yīng)于AAV載體基因組的反向末端重復(fù)序列區(qū)(ITR)的引物和探針來定量病毒基因組。用于引物對(duì)的序列為AAV-Fw 5，-CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG-3，(SEQ ID NO 1) ,AAV-Rev 5，-GTAGATAAGTAGCATGGC-3，(SEQ ID NO :2)，并且用于 MGB 探針的序列為 AAV-p5，-TAGTTAATGATTAACCCAAV-3，(SEQ ID NO :3)。使用對(duì)每一細(xì)胞歸一化的肌聯(lián)蛋白 (titin)基因擴(kuò)增反應(yīng)，將數(shù)據(jù)表達(dá)為每一細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)。用于titin擴(kuò)增的引物對(duì)和 iTaqman 探針為=Titin-Fw 5，-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3，(SEQ ID NO :4)、Titin-Rev 5，-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3，(SEQ ID NO :5)、Titin Vic/TAMRA 探針 5，-TGCACGGAAGCGT CTCGTCTCAGTC-3，(SEQ ID NO :6)。對(duì)于分析，將72ng基因組DNA用作模板。使用rAAV載體質(zhì)粒的稀釋液以產(chǎn)生測(cè)定載體基因組拷貝的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用Applied Biosystems 7700 進(jìn)行 PCR,用序列檢測(cè)系統(tǒng)(Sequence Detection System) (Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
組織學(xué)分析
在注射之后30天麻醉小鼠(10mg/kg甲苯噻嗪，100mg/kg氯胺酮)，并用0. IM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)繼以4%多聚甲醛(PFA)的PBS溶液進(jìn)行心臟內(nèi)灌注。取下眼睛，并通過在4% PFA內(nèi)過夜溫育來后固定。然后在4°C下15%蔗糖中溫育過夜，冷凍在冷異戊烷 (-500C )內(nèi)，并在恒冷器上切割(14_切片)。
GFP免疫熒光
冷凍切片用含10%山羊血清和0.4% Triton X-100的PBS培育1小時(shí)，然后用兔多克隆抗GFP抗體(Abcam，l 800)溫育過夜。切片在PBS內(nèi)清洗并隨后用生物素化抗兔IgG(Vector Laboratories, 1 200)在室溫下溫育1小時(shí)。通過用鏈親和素-A488 (Molecular Probes, 1 200)溫育，檢測(cè)GFP免疫熒光。切片在PBS內(nèi)清洗，安裝在Fluoromount-G內(nèi)并通過共焦顯微鏡(Leica，激光發(fā)射488nm，綠色)觀察。
進(jìn)一步組織學(xué)處理
進(jìn)一步使用以下方案來進(jìn)行受處理動(dòng)物的眼睛的組織學(xué)分析，特別雙重免疫熒光分析。
小鼠用10mg. kg-Ι甲苯噻嗪和IOOmg. kg-Ι氯胺酮深度麻醉，并用0. IM磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ繼以冰冷的4%多聚甲醛的PBS溶液經(jīng)心臟灌注。在摘出眼睛之后，通過在相同固定劑中過夜溫育將眼睛后固定，在15%蔗糖的PBS溶液中冷凍保護(hù)過夜，冷凍在冷異戊烷(_50°C)中，并在恒冷器上切割成14μπι厚的切片，該切片儲(chǔ)存在-80°C下直至進(jìn)一步處理。為了免疫熒光標(biāo)記，將切片在PBS中漂洗兩次，在含有10%標(biāo)準(zhǔn)山羊血清(NGS)和 0. 2% triton X-100的PBS中封閉一個(gè)小時(shí)，與一級(jí)抗體在含有NGS和0. 2% triton X-100 的 PBS 中 4°C 下溫育過夜。使用抗 GFP 抗體(1 800 ；Abeam, Cambridge, UK)、抗 Brn-3a 抗體(1 l'OOO ；Millipore,Billerica MA，USA)和抗 ChxlO 抗體(1 300 ；Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz CA, USA)。切片隨后在PBS中漂洗，用熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體(Alexa-Fluor 接合物，1 1，000 ；Invitrogen, Cergy-Pontoise，法國(guó))溫育，用 4'， 6' - 二脒基-2-苯基吲哚(dapi)標(biāo)記，并用 mowiol 4-88 試劑(Sigma-Aldrich，Lyon，法國(guó))安裝在蓋玻片下，然后在DM6000-B落射熒光顯微鏡(Leica Microsystemes,Nanterre, 法國(guó))上檢查。用顯微鏡的20倍物鏡人工計(jì)數(shù)Brn-3a和GFP陽(yáng)性細(xì)胞。
結(jié)果
載體基因組拷貝數(shù)定量
為分析在成年小鼠視網(wǎng)膜中不同AAV載體全身性基因轉(zhuǎn)移的效率，將編碼mSEAP 的ssAAVl、scAAVl、ssAAV9和scAAV9載體注射至12個(gè)成年小鼠的尾靜脈中(每組2個(gè)小鼠注射SxlO1Vg,每組1個(gè)小鼠注射IxlO12Vg)。
在所有AAV注射小鼠的眼睛組織樣本中評(píng)估每一細(xì)胞的vg粒子數(shù)。一般說來， 無論衣殼的血清型如何，對(duì)于介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)而言scAAV優(yōu)于ssAAV。在注射的小鼠中，相比 scAAVl, scAAV9載體甚至為每一細(xì)胞介導(dǎo)更高數(shù)量的vg粒子(圖1A)。
這些結(jié)果清楚地表明對(duì)于I. V.眼睛轉(zhuǎn)導(dǎo)而言scAAV、且最特別是SCAAV9的優(yōu)勢(shì)。
mSEAP活性的定量
為驗(yàn)證SCAAV9對(duì)于全身性眼睛轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，通過對(duì)ssAAV9和scAAV9注射小鼠的組織樣本進(jìn)行生化分析，分析mSEAP活性。
同樣，與注射單鏈載體的小鼠的眼睛相比，注射scAAV9載體的小鼠的眼睛表現(xiàn)出高度轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖1B)。
GFP免疫熒光
為了分析IV注射scAAV9載體的小鼠的視網(wǎng)膜中的轉(zhuǎn)基因分布，4個(gè)成年小鼠用 2xl012vg scAAV9-GFP注射至尾靜脈中。
對(duì)處理過的小鼠的組織學(xué)切片進(jìn)行的GFP免疫熒光分析顯示在若干視網(wǎng)膜層中顯著的GFP表達(dá)(圖2a、b)，所述若干視網(wǎng)膜層包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)(圖加-d)、內(nèi)核層(INL)(圖a、b、e)、感光細(xì)胞(圖2f)和RPE (圖加)。在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中表達(dá)最為強(qiáng)烈 (圖2c、d)。GFP表達(dá)還發(fā)現(xiàn)于視神經(jīng)(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突)中(圖3a、b)，并且在睫狀體中尤為強(qiáng)烈(圖3c、d)。
轉(zhuǎn)基因表達(dá)在接近睫狀體的區(qū)域中表現(xiàn)最強(qiáng)烈，表明聚集在這些非視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)中的載體可以擴(kuò)散至視網(wǎng)膜細(xì)胞層。綜上所述，SCAAV9-GFP在成年小鼠中的IV用藥導(dǎo)致視網(wǎng)膜和非視網(wǎng)膜細(xì)胞的廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)。
發(fā)明人還將其結(jié)果描述如下并提供雙重免疫熒光實(shí)驗(yàn)。
為解決神經(jīng)組織中載體生物分布的問題，使用在CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)報(bào)道基因mSEAP (鼠堿性磷酸酶的分泌形式)的AAV構(gòu)建體。比較scAAV9和ssAAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)眼睛組織的效率。動(dòng)物接受編碼mSEAP報(bào)道基因的10el2個(gè)ssAAV9或scAAV9載體基因組的靜脈內(nèi)注射。在注射之后四周，摘出眼睛以用于在整個(gè)眼睛上定量AAV載體基因組和mSEAP 活性。通過內(nèi)源性基因Titin進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)的歸一化證實(shí)了 ssAAV注射動(dòng)物(n = 3)每一細(xì)胞的載體基因組拷貝數(shù)為0. 010+/-0. 003，表明ssAAV9能夠在全身遞送之后到達(dá)眼組織。該參數(shù)在scAAV注射動(dòng)物(n = 3)中增加至0. 318+/-0. 198，表明相比其單鏈對(duì)應(yīng)物，自身互補(bǔ)型AAV載體提供了轉(zhuǎn)導(dǎo)增進(jìn)。為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，我們?cè)谘劢M織裂解液中定量 mSEAP活性。已測(cè)得ssAAV9注射小鼠每mg蛋白的mSEAP活性為1. 7+/-0. 9pg。按照每一細(xì)胞增加的載體基因組拷貝數(shù)，mSEAP活性在scAAV9用藥之后高了 6倍，導(dǎo)致在處理的動(dòng)物中每 mg 蛋白 10. 1+/-3. 4pg 的 mSEAP。
基于這些結(jié)果，我們將研究集中于scAAV9，并分析用在CMVie啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)GFP的scAAV9載體進(jìn)行靜脈注射的小鼠的視網(wǎng)膜中GFP蛋白的表達(dá)模式。八周齡小鼠用SCAAV9-GFP以每一動(dòng)物2. IO12載體基因組的劑量注射至尾靜脈中。在注射之后四周，通過對(duì)恒冷切片的免疫熒光標(biāo)記來檢測(cè)GFP表達(dá)。在所有視網(wǎng)膜的層中都檢測(cè)到GFP 表達(dá)細(xì)胞(圖4)?；诩?xì)胞形態(tài)學(xué)，在光感受器中(圖4C、D、4G和H)、在RPE細(xì)胞中(圖 4E、H)、在MUller細(xì)胞中、在內(nèi)核層細(xì)胞中(圖4C-H)、在神經(jīng)纖維層和視神經(jīng)中(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突纖維中)(圖4I、J)發(fā)現(xiàn)GFP表達(dá)。值得注意地，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)層表現(xiàn)出最大轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯示了眾多的GFP陽(yáng)性細(xì)胞體(圖4A-H)。
為精確確定GFP表達(dá)細(xì)胞的表現(xiàn)型，我們使用特異性識(shí)別不同視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的抗體進(jìn)行雙重免疫染色分析(諸如，Brn-3a、特異性表達(dá)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的細(xì)胞核中的POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Nadal-Nicolas等人，2009)或特異性表達(dá)于雙極細(xì)胞的細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子ChxlO (Liu等人，1994))。
GFP/Brn-3a雙重免疫熒光法證實(shí)了視網(wǎng)膜中大比例的GFP陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(圖5A-C)。此外，GFP/ChxlO共著色分析表明在scAAV9注射的動(dòng)物中的內(nèi)核層內(nèi)的某些GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞為雙極細(xì)胞(圖5D-F)。
對(duì)位于視神經(jīng)水平上的三個(gè)橫切片進(jìn)一步定量RGC層中的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移效率，并且計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞、Brn-3a陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和共表達(dá)兩個(gè)標(biāo)志物的細(xì)胞的數(shù)量。我們的結(jié)果表明，在成年小鼠中全身SCAAV9-GFP遞送導(dǎo)致每個(gè)RCG層視網(wǎng)膜切片轉(zhuǎn)導(dǎo)了平均222. 4+/-20. 1個(gè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞。在它們之中，122. 4+/-9. 1為用Brn_3a雙重標(biāo)記的，證實(shí)45% +/-3的轉(zhuǎn)導(dǎo)RGC細(xì)胞為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(六個(gè)不同眼睛的平均值+/-SD)。
總而言之，這些結(jié)果示出了 scAAV在成年小鼠中全身遞送之后轉(zhuǎn)導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞的效率，表明有效跨越血-視網(wǎng)膜屏障。還可以表明載體從高度轉(zhuǎn)導(dǎo)的非視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)諸如睫狀體的擴(kuò)散(圖3)。
與Bostick和共同研究者的先前實(shí)驗(yàn)(Bostick等人，2007)相反，我們證實(shí)IV scAAV注射在成年小鼠的視網(wǎng)膜中有效遞送轉(zhuǎn)基因，所述成年小鼠中的血-視網(wǎng)膜屏障是成熟的。不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型通過形態(tài)和位置標(biāo)準(zhǔn)、或者通過雙重免疫熒光分析來識(shí)別。對(duì)成年視網(wǎng)膜的有效基因轉(zhuǎn)移對(duì)于未來在有癥狀患者中的臨床應(yīng)用具有高度價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種包含目的治療基因的雙鏈自身互補(bǔ)型AAV(scAAV)載體，通過將所述scAAV載體全身給藥于需要其的對(duì)象用于治療眼睛的病癥、優(yōu)選視網(wǎng)膜的病癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的scAAV載體，其通過將治療基因遞送至感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(特別是MUller細(xì)胞)、內(nèi)核層(INL)細(xì)胞(包括雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無長(zhǎng)突細(xì)胞)、或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的細(xì)胞，用于治療病癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的scAAV載體，通過將所述scAAV載體全身給藥于需要其的對(duì)象，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)睫狀體或神經(jīng)纖維層或視神經(jīng)的細(xì)胞，用于治療眼睛的病癥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其用于將治療性蛋白或RNA產(chǎn)生在視網(wǎng)膜、睫狀體或神經(jīng)纖維層或視神經(jīng)的細(xì)胞中，或者從視網(wǎng)膜、睫狀體或神經(jīng)纖維層或視神經(jīng)的細(xì)胞產(chǎn)生治療性蛋白或RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其中所述全身給藥是腹膜內(nèi) (i.p.)、肌內(nèi)(i.m.)、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi)(i.v.)注射，優(yōu)選是靜脈內(nèi)注射。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其中所述scAAV載體是人血清型 AAV載體，優(yōu)選自血清型6、8和9，最優(yōu)選AAV9載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其中的scAAV載體包含來自AAV9 的衣殼。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其中的scAAV載體是假型scAAV 載體，優(yōu)選是SCAAV2/9載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其中的scAAV載體包含缺乏編碼病毒序列的功能性R印和Cap的復(fù)制缺陷型scAAV基因組。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其中的基因編碼治療性RNA或治療性蛋白，所述治療性RNA或治療性蛋白已知在眼睛的病理學(xué)病癥、特別是視網(wǎng)膜的病理學(xué)病癥中為突變的或缺陷的。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的scAAV載體，其中所述病癥選自遺傳的和散發(fā)的眼睛病癥，特別包括利伯氏先天性黑矇、糖尿病性視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的病癥、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、視錐-視桿營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜脫離、高血壓性視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、黃斑水腫、鳥槍彈樣脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病、卵黃形黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、青光眼、視神經(jīng)病、玻璃體和球體的病癥、鞏膜、角膜、虹膜和睫狀體的病癥、視神經(jīng)和視路的病癥例如利伯氏遺傳視神經(jīng)病、以及眼肌的病癥。
12.—種scAAV9載體，其編碼治療性RNA、或治療性蛋白，所述治療性RNA或治療性蛋白在眼睛的病理學(xué)病癥中為突變的或缺陷的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的scAAV9載體，其編碼ChR2或抗-VEGF抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的scAAV9載體，其編碼VEGFmRNA靶向性siRNA(shRNA)或 miRNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的scAAV9，其為假型scAAV2/9。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述的scAAV9，其包含啟動(dòng)子、特別是視網(wǎng)膜特異性啟動(dòng)子，以及嵌合型內(nèi)含子，其中所述內(nèi)含子被提供在所述啟動(dòng)子與編碼治療性RNA或蛋白的基因之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及組合物和方法，特別是基于scAAV的全身給藥的方法，用于將基因遞送至哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜的細(xì)胞，并且特別是遞送至感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)核層細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/864GK102498213SQ201080040187
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者馬丁·巴卡茨 申請(qǐng)人:吉尼松公司, 巴黎第六大學(xué), 法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生及研究醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì), 法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心, 肌肉學(xué)研究協(xié)會(huì)