專利名稱：可從機體組織分離的多能干細胞的制作方法
可從機體組織分離的多能干細胞發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及機體組織來源的多能干細胞。
背景技術(shù)：
渦蟲和蠑螈即使在其身體被切割后也可再生出完整的身體。這種高再生能力有賴于間充質(zhì)組織中存在的多能干細胞的存在情況。然而，在高級生物(例如人)的情況下，組織再生能力遠低于這些動物的再生能力。哺乳動物胚泡中的內(nèi)細胞團(或ICM:內(nèi)細胞群)被公認為是能夠分化成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細胞譜系的細胞的多能干細胞集合體。然而，這種多能性隨著發(fā)育進行而受到限制，隨后進行特化性細胞分化，產(chǎn)生各種組織類型。
近年來，可促進組織再生的成體干細胞或組織干細胞引起了關(guān)注。然而，尚不清楚多能干細胞是否像在渦蟲或蠑螈的情況一樣也存在于成熟哺乳動物機體中。據(jù)報道，具有分化成骨、軟骨、脂肪細胞、神經(jīng)元細胞、骨骼肌等的能力的骨髓基質(zhì)細胞(MSC)部分為從成體獲得的具有分化潛能的細胞(參見非專利文獻I和2)。然而，骨髓基質(zhì)細胞(MSC)由各種類型的細胞群組成。MSC群的分化潛能是變化的，但尚未清楚了解其主體。此外，其需要用特定化合物刺激、基因轉(zhuǎn)移等以分化成特定細胞。準確地講，需要構(gòu)建用于誘導(dǎo)分化的系統(tǒng)。此外，據(jù)報道，iPS細胞(誘導(dǎo)多能干細胞)(參見專利文獻I、專利文獻2、非專利文獻3等)為成體來源的多能干細胞。然而，iPS細胞的建立需要使用特殊物質(zhì)進行誘導(dǎo)操作，例如將特定基因?qū)胱鳛殚g充質(zhì)細胞群的皮膚成纖維細胞部分(dermal fibroblast)或?qū)⑻囟ɑ衔飳?dǎo)入體細胞。專利文獻I日本專利號4183742專利文獻2日本專利公布(Kokai)號2008-307007 A非專利文獻I M. DEZAWA 等,The Journal of Clinical Investigation, 113，12，第 1701-1710 頁，(2004)非專利文獻2 M. DEZAWA 等，SCIENCE，2005 年 7 月 8 日，309，第 314-317 頁，(2005)
非專利文獻 3 Okita K.等 SCIENCE, 2008 年 11 月 7 日，322 (5903)，第 949-953 頁發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供從機體組織直接獲得多能干細胞的方法，以及提供通過所述方法獲得的多能干細胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在涉及骨髓基質(zhì)細胞(MSC bone marrow stromal cell)部分的研究過程中，以極低頻率由未處理的(naive)人MSC細胞形成特有的細胞團。最初細胞團的外觀酷似ES細胞的外觀。然而，與ES細胞不同，細胞團不進行無限生長。當它們在一定時間內(nèi)達到某一大小便停止生長，然后形成含有毛細胞和色素細胞等各種細胞的非均質(zhì)群。另外，對這些細胞團進行免疫細胞化學分析，分別從細胞團中檢出對外胚層、內(nèi)胚層和中胚層標記呈陽性的不同細胞。本發(fā)明人從該結(jié)果中考慮在通常保持和培養(yǎng)的未處理(naive)人MSC細胞部分中相當于多能性/多能細胞的細胞存在的可能性。因此，本發(fā)明人對該問題進行了進一步的深入研究。已知當機體暴露于應(yīng)激或傷害時，休眠狀態(tài)的組織干細胞被激活，以促進組織再生。本發(fā)明人在按照各種方法(例如無血清培養(yǎng)、使用Hank平衡鹽溶液(HBSS)培養(yǎng)、低氧培養(yǎng)、共3小時的間歇短時間胰蛋白酶培養(yǎng)和8小時或16小時的長時間胰蛋白酶培養(yǎng))培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞(MSC)部分和皮膚成纖維細胞部分等間充質(zhì)細胞時，向間充質(zhì)細胞提供刺激應(yīng)激，收集存活細胞，然后在含甲基纖維素(MC)培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)(稱為“MC培養(yǎng)”)。結(jié)果，證實了各種大小的胚狀體樣(embryoid body-like)細胞團(最大直徑高達150 μ m)的形成。特別證實了在經(jīng)歷長期胰蛋白酶培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞部分和人MSC部分中胚狀體樣細胞團形成頻率最高。本發(fā)明人分析了在如此獲得的胚狀體樣細胞團中的細胞性質(zhì)，因此發(fā)現(xiàn)這類細胞具有多能干細胞的性質(zhì)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，所獲得的胚狀體樣細胞團中的細胞具有以往已報道的多能性/多能干細胞不具備的性質(zhì)。本發(fā)明人進一步分析了由所獲得的細胞團中的 細胞表達的蛋白質(zhì)，因此發(fā)現(xiàn)細胞進行的表達模式不同于以往報道的ES細胞和iPS細胞等多能干細胞進行的表達模式。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，SSEA-3作為上述多能干細胞的表面抗原表達，并且還可使用SSEA-3表達作為標記從機體組織中分離上述多能干細胞。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，上述多能干細胞是不同于以往已報道的ES細胞和iPS細胞等多能干細胞的新的多能干細胞類型。準確地講，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可在不需要任何誘導(dǎo)操作的情況下從機體組織直接獲得多能干細胞。因此，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明稱之為多能干細胞 Muse 細胞(Multilineage-differentiating Stress gnduring 細胞(多譜系分化應(yīng)激持久細胞))。本發(fā)明如下。[I]可從機體組織中分離的SSEA-3-陽性多能干細胞。多能干細胞可從培養(yǎng)的成纖維細胞和髓樣干細胞等機體組織培養(yǎng)物中分離，而且也可以單一細胞形式分離。[2] [I]的多能干細胞，其為⑶105陽性的。[3] [I]或[2]的CDl 17 (c-Kit)陰性和CD 146陰性的多能干細胞。[4] [I]或[2]的多能干細胞，其為⑶117陰性、⑶146陰性、NG2陰性、⑶34陰性、vffF陰性和⑶271陰性的。[5] [I]或[2]的多能干細胞，其為⑶34陰性、⑶117陰性、⑶146陰性、⑶271陰性、NG2陰性、vWF陰性、SoxlO陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrpl陰性和Dct陰性的。[6] [1]-[5]中任一項的多能干細胞，其具有低端粒酶活性或無端粒酶活性。[7] [1]-[6]中任一項的多能干細胞，其能夠分化成三胚層。本發(fā)明的多能干細胞能夠通過體外貼壁培養(yǎng)分化成三胚層。準確地講，通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，多能干細胞可分化成皮膚、肝、神經(jīng)、肌肉、骨、脂肪等三胚層的代表性細胞。另夕卜，多能干細胞當體內(nèi)移植到睪丸時能夠分化成三胚層特有的細胞。此外，當通過靜脈內(nèi)注射到活體而移植到受損器官時，多能干細胞能夠存活并分化成器官(例如皮膚、脊髓、肝和肌肉)。[8] [1]-[7]中任一項的多能干細胞，其不會進行腫瘤性增殖。本發(fā)明的多能干細胞具有通過懸浮培養(yǎng)以約I. 3天/細胞分裂的生長速度生長但在約10天內(nèi)停止生長的性質(zhì)，并且還具有當移植入睪丸時至少半年不癌化的性質(zhì)。[9][1]-[8]中任一項的多能干細胞，其具有自我更新能力。本發(fā)明的多能干細胞可通過重復(fù)懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)而生長。此外，本發(fā)明的多能干細胞像其它體干細胞的情況一樣經(jīng)歷不對稱分裂。[10] [1]-[9]中任一項的多能干細胞，其對應(yīng)激有抗性。
[11] [1]-[10]中任一項的多能干細胞，其具有高吞噬能力。[12] [1]-[11]中任一項的多能干細胞，其對下列22種氣味受體的至少一種呈陽性嗅覺受體,家族8，亞家族G，成員2 (0R8G2)；嗅覺受體，家族7，亞家族G，成員3 (0R7G3)；嗅覺受體，家族4，亞家族D，成員5 (0R4D5)；嗅覺受體，家族5，亞家族AP，成員2 (0R5AP2)；嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員4 (0R10H4)；嗅覺受體，家族10，亞家族T，成員2(0R10T2)；嗅覺受體,家族2，亞家族M，成員2 (0R2M2)；嗅覺受體，家族2，亞家族T，成員5 (0R2T5)；嗅覺受體，家族7，亞家族D，成員4 (0R7D4)；嗅覺受體，家族I，亞家族L，成員3(0R1L3)；嗅覺受體，家族4，亞家族N，成員4 (0R4N4)；嗅覺受體，家族2，亞家族A，成員7 (0R2A7)；鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)，α激活活性多肽，嗅覺型(GNAL)；嗅覺受體，家族6，亞家族Α，成員2 (0R6A2)；嗅覺受體，家族2，亞家族B，成員6 (0R2B6)；嗅覺受體，家族2，亞家族C，成員1(0R2C1)；嗅覺受體，家族52，亞家族Α，成員I (0R52A1)；嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員3 (0R10H3)；嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員2 (0R10H2)；嗅覺受體，家族51，亞家族Ε，成員2(0R51E2)；嗅覺受體，家族5，亞家族P，成員2 (0R5P2);和嗅覺受體，家族10，亞家族P，成員I (0R10P1)。[13] [1]-[12]中任一項的多能干細胞，其對下列5種趨化因子受體的至少一種呈陽性趨化因子(C-C基序)受體5 (CCR5)；趨化因子(C-X-C基序)受體4 (CXCR4)；趨化因子(C-C基序)受體I (CCRl)；達菲血型，趨化因子受體(DARC);和
趨化因子(C-X-C基序)受體7 (CXCR7)。[14] [1]-[13]中任一項的多能干細胞，其來源于中胚層組織或間充質(zhì)組織。[15]細胞團或細胞部分，其含有[1]_[14]中任一項的多能干細胞。[16]用于從機體組織分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，所述方法使用下列性質(zhì)(i)-(vi)中的至少一種作為指標(i) SSEA-3 陽性;(ii)CD105 陽性；(iii)CD117 陰性和 CD 146 陰性；(iv) CDl 17 陰性、CD146 陰性、NG2 陰性、CD34 陰性、vWF 陰性和 CD271 陰性； (v)CD34 陰性、CDl 17 陰性、CD146 陰性、CD271 陰性、NG2 陰性、vWF 陰性、SoxlO 陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrpl陰性和Dct陰性；和(vi)端粒酶活性低或無端粒酶活性。[17]用于分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，所述方法包括將機體組織來源的細胞暴露于細胞應(yīng)激中，然后收集存活細胞。[18] [17]的分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，其中細胞應(yīng)激選自蛋白酶處理、低氧條件下培養(yǎng)、低磷酸鹽(phosphate)條件下培養(yǎng)、血清饑餓條件下培養(yǎng)、糖饑餓狀態(tài)下培養(yǎng)、輻射暴露下培養(yǎng)、熱激暴露下培養(yǎng)、有毒物質(zhì)存在下培養(yǎng)、活性氧存在下培養(yǎng)、機械刺激下培養(yǎng)和壓力處理下培養(yǎng)。[19] [18]的分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，其中細胞應(yīng)激是胰蛋白酶培養(yǎng)。[20]多能干細胞，其是從[1]_[14]中任一項的多能干細胞衍生或誘導(dǎo)的細胞。衍生細胞或誘導(dǎo)細胞的實例包括通過基因轉(zhuǎn)移或添加化合物誘導(dǎo)的細胞。其另一個實例是來自本發(fā)明干細胞的iPS細胞。[21]分化細胞，其是由[1]_[14]中任一項的多能干細胞衍生或誘導(dǎo)的細胞。[22]藥物組合物，其包含[1]_[14]和[20]中任一項的多能干細胞。[23]藥物組合物，其包含[21]的分化細胞。本說明書包括美國臨時申請?zhí)?1/213，788和美國臨時申請?zhí)?1/290，159的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內(nèi)容，其是本申請的優(yōu)先權(quán)文獻。附圖簡述

圖1-1表示間充質(zhì)細胞部分、Muse細胞和M團(Muse細胞來源的胚狀體樣細胞團)之間的關(guān)系。如圖I所示，直接分離出SSEA-3陽性細胞，然后將其通過在不暴露于長期應(yīng)激情況下的懸浮培養(yǎng)來培養(yǎng)，便可獲得M團。圖1-2表示使Muse細胞大量生長的方法。圖2表示這樣的因子其在M團中的表達水平與未處理細胞部分中的表達水平之t 匕 1 。圖3表示這樣的因子其在M團中的表達水平與人ES細胞中的表達水平之比高。圖4表不用于MACS分選的方案。圖5表示以下照片(染色圖像)，其顯示當對人成纖維細胞(H-fibroblast)部分進行16小時長的胰蛋白酶培養(yǎng)(圖5a)、以1800rpm-2200rpm/分鐘渦旋3分鐘(圖5b)，然后進行錐蟲藍染色時死細胞的除去。圖6表示各種細胞的照片。圖6a表示富含Muse的細胞部分中的單一細胞(比例尺=10 μ m),圖6b表示人ES細胞來源的胚狀體細胞團(比例尺=25 μ m),圖6c表示直徑約25 μ m的M團(比例尺=25 μ m),圖6d表示通過堿性磷酸酶染色進行染色的人ES來源的細胞團(第4天)(比例尺=25 μ m),圖6e_g表示M團中0ct3/4(e)、Sox2 (f)和PAR4 (g)的免疫染色圖像。圖7-1表示以下照片，其顯示來自人成纖維細胞部分和人MSC (H-MSC)部分的細胞團的特征。圖7-la和b表示通過未處理人MSC部分的普通貼壁培養(yǎng)自發(fā)形成的細胞團(比例尺=100 μ m)。圖7-lc和d表示第O天(c)和進行長期胰蛋白酶培養(yǎng)接著MC培養(yǎng)第7天(d)人成纖維細胞-I部分的狀態(tài)(比例尺=100 μ m)。圖7_ld中的箭頭表示M團。圖7-le和f表示MC培養(yǎng)第7天由人成纖維細胞-I部分形成的M團(比例尺=50 μ m)。圖7-2表示以下照片，其顯示人成纖維細胞部分和人MSC(H-MSC)部分的細胞團的 特征。圖7-2 g-Ι表示免疫染色結(jié)果；即表示由人成纖維細胞部分形成的M團(圖7-2 g、i和k)和由H-MSC部分形成的M團(圖7-2 h、j和I)中的Nanog (圖7-2 g和j)、0ct3/4 (圖7-2 h)、SSEA-3 (圖 7-2 i)、PAR4 (圖 7-2 k)和 Sox2 (圖 7-2 I)的定位(比例尺=50 μ m)。圖7-3表示以下照片，其顯示人成纖維細胞部分和人MSC(H-MSC)部分的細胞團的特征。圖7-3 m-o表示人ES細胞(圖7-3 m)、得自人成纖維細胞部分的M團(圖7_3 η)和未處理人成纖維細胞-I部分(圖7-30)的堿性磷酸酶染色結(jié)果(比例尺=50 μ m)。圖7-4表示電子顯微鏡照片，其顯示得自人成纖維細胞部分和人MSC (H-MSC)部分的細胞團的特征。圖7-4p-r表示人ES細胞胚狀體(圖7-4p，MC培養(yǎng)第3天)、人成纖維細胞-I部分來源的M團(圖7_4q和r，MC培養(yǎng)第5天)的電子顯微鏡圖片(比例尺=5 μ m) ο圖8-1表示M團的克隆性和自我更新。準確地講，圖8-1表示進行Muse細胞克隆性和自我更新測定的實驗的概要圖。圖8-2表示懸浮Muse細胞的生長速度。圖8-3表示自單一 M團(人成纖維細胞-I來源的，第一代(循環(huán)))克隆擴繁的細胞的正常核型。圖9-1表示M團的分化。圖9-la-c表示免疫染色圖像,其顯示得自人成纖維細胞-I部分的分化細胞團中α平滑肌肌動蛋白和神經(jīng)絲(圖9-la和b)及甲胎蛋白(圖9-lc)的定位(圖9_la比例尺=500 μ m ;圖9_lb和c比例尺=50 μ m)。圖9_la的箭頭表示貼壁的M團。圖9-2表示通過在明膠上培養(yǎng)未處理細胞部分和得自人成纖維細胞部分的第一代和第三代M團以誘導(dǎo)自發(fā)分化而制備的細胞群中甲胎蛋白(α-FP)表達、GATA6表達、MAP-2表達和Nkx2. 5表達的RT-PCR分析結(jié)果。作為陽性對照，對于a -FP使用人胎兒肝臟，對于GATA6、ΜΑΡ-2和Nkx2. 5使用完整人胚胎。圖9-3 e-Ι表示給予富含Muse的細胞部分的免疫缺陷小鼠的睪丸。圖9_3e表示對照無損睪丸、通過給予小鼠ES細胞(mES細胞)得到的睪丸(第8周)、通過給予MEF(飼養(yǎng)細胞)得到的睪丸(第8周)、通過給予M團(M-cluster)得到的睪丸(6個月)和通過給予富含Muse的細胞部分(Muse)得到的睪丸(6個月)。圖9_3f_i表示通過給予富含Muse的細胞部分或M團獲得的睪丸組織中神經(jīng)絲M(圖9-3f，照片中的綠色染色)、甲胎蛋白(圖9-3g，照片中的綠色染色)和平滑肌肌動蛋白(圖9-3h，照片中的紅色染色)的免疫染色圖像(比例尺=50 μ m)。圖9-3i中的3個圖表示人線粒體(綠色染色)和平滑肌肌動蛋白(紅色染色)的雙重染色圖像(比例尺=20 μ m)。圖9-3j-l表示通過給予富含Muse的細胞部分獲得的睪丸組織的圖片(圖9j和k)。圖9k中觀察到的管狀結(jié)構(gòu)用抗人線粒體抗體染色(圖9-3 j的比例尺=500 μ m ;圖9-3k-l的比例尺=50 μ m)。圖IOa表示涉及人成纖維細胞(Fibro-Ι和Fibro-2)和H-MSC (MSC-1和MSC-2)的多能性和未分化細胞狀態(tài)的因子的定量PCR結(jié)果(No. 2)。圖IOa欄中給出的各種圖案表示富含Muse的細胞部分或M團(第7天)中的基因表達水平與未處理細胞部分的基因表達水平進行比較的結(jié)果。白色圖案表示富含Muse的細胞部分或M團的基因表達水平與未處理細胞部分的基因表達水平的比率大于1/3(1 3)但低于3(3 I)?；疑珗D案表示富含Muse的細胞部分或M團的基因表達水平與未處理細胞部分的基因表達水平的比率大于3(3 I)。斜線圖案表示富含Muse的細胞部分或M團的基因表達水平與未處理細胞部分的基因表達水平的比率低于1/3(1 3)。圖IOb表示H-MSC來源的未處理細胞部分(Naive)、富含Muse的細胞部分(Muse)和M團(第7天)的端粒酶活性。使用熱滅活樣品(Heat)作為陰性對照。圖11表示人成纖維細胞部分來源的未處理細胞部分和H-MSC部分來源的未處理細胞部分、富含Muse的細胞部分和M團的DNA微陣列分析結(jié)果。圖12表示以下照片，其顯示通過對自人骨髓單核細胞組分作為SSEA-3/⑶105 二重陽性細胞直接收集的Muse細胞進行MC培養(yǎng)形成的胚狀體樣細胞團。圖12a表示通過對由人骨髓分離的單核細胞部分進行MC培養(yǎng)(8小時-hBM-MC，7天)，然后進行8小時長的胰蛋白酶培養(yǎng)而形成的M團(比例尺=100 μ m)。圖12b表示由8小時_hBM_MC(7天)形成的M團的堿性磷酸酶染色圖像(比例尺=50 μ m)。
圖13表示細胞群的甲胎蛋白(a -FP)、GATA6、ΜΑΡ-2和Nkx2. 5的RT-PCR分析結(jié)果，所述細胞器通過在明膠上培養(yǎng)由未處理H-MSC-I部分(未處理I)、未處理H-MSC-2部分(未處理2)(兩個部分為陰性對照)和進行8小時胰蛋白酶培養(yǎng)的人骨髓來源的單核細胞部分(8小時-hBM)或未進行胰蛋白酶培養(yǎng)的人骨髓來源的單核細胞部分(未處理hBM)形成的M團從而誘導(dǎo)其自發(fā)分化而制備。圖14表示人成纖維細胞部分(未處理細胞)和H-MSC部分(未處理細胞)的FACS分析結(jié)果。圖15-1表示以下照片，其顯示未處理細胞部分的SSEA_3(+)細胞(15_la左)的染色圖像；及自通過FACS分選收集的SSEA-3(+)細胞的單一 M團克隆擴繁的SSEA-3 (+)細胞(15-la右)的染色圖像。該圖中的每個比例尺表示100 μ m。圖15-2表示染色圖像照片,其顯示Numblike (綠色)的定位,該因子在Muse細胞(人成纖維細胞)的細胞分裂期間參與不對稱分裂。該圖中的每個比例尺表示100 μ m。圖15-3表示電子顯微鏡照片，其顯示人成纖維細胞來源的SSEA_3(_)細胞(圖
15-3c)和SSEA-3(+)細胞(圖15_3d)。該圖中的每個比例尺表示5 μ m。圖15-4表示染色圖像照片，其顯示人成纖維細胞來源的Muse細胞中的0ct3/4 (綠色)(圖 15-4e)、Sox2 (綠色)(圖 15_4f)和 SSEA-3 (紅色)(圖 15_4g)。
圖16-1表示以下照片，其顯示嚴重免疫缺陷小鼠(Nog小鼠)受損組織中GFP標記的SSEA-3 (+)Muse細胞部分的分化。圖16-1N和O表示壓迫損傷脊髓(4周后)的GFP (+)細胞，其表達神經(jīng)絲(紅色)和人高爾基復(fù)合體(白色)。圖16-10表示圖16-1N中正方形圈起部分的放大圖。圖16-1P表示受損肝臟(4周后)的GFP(+)靶細胞，其表達人白蛋白(紅色)和人聞爾基復(fù)合體(白色)。圖16-2表示以下照片，其顯示通過RT-PCR檢查的植入SSEA-3(+)Muse細胞的肝臟中人白蛋白的表達。圖16-3表示以下照片，其顯示嚴重免疫缺陷小鼠(Nog小鼠)受損組織中GFP標記的SSEA-3(+)MUse細胞部分的分化。準確地講，照片顯示表達人肌養(yǎng)蛋白(紅色)的肌肉的GFP⑴細胞(3周后)。圖17-1表示以下照片，其顯示自由單一 Muse細胞形成的M團生長的細胞的分化。圖17-1 A-D表示中和結(jié)果。圖17-1A表示由此形成的球體(sphere)。此外，作為對球體 的免疫染色數(shù)據(jù)，圖17-1B表示巢蛋白的表達，圖17-1C表示Musashi的表達，圖17-1D表 示NuroD的表達。圖17-1E表示通過使這些球體進一步分化成神經(jīng)細胞獲得的MAP-2 (+)細胞。圖17-1F-G表示骨細胞誘導(dǎo)結(jié)果，更準確地說表示骨鈣蛋白(F)和ALP(G)的表達。圖17-1H和I表示脂肪細胞誘導(dǎo)的結(jié)果。圖17-1H表示含脂滴的細胞，圖17-11表示油紅染色結(jié)果。圖17-1J表示肝細胞誘導(dǎo)結(jié)果；即甲胎蛋白(+)細胞。圖17-2表示以下照片，其顯示經(jīng)RT-PCR檢查，通過肝細胞誘導(dǎo)而誘導(dǎo)的細胞中人白蛋白和人甲胎蛋白的表達。圖18-1表示以下照片，其顯示經(jīng)RT-PCR檢查，SSEA-3 (+) Muse細胞中SoxlO、SnailU Slug、Tyrpl 和 Dct 的表達。圖18-2表示經(jīng)？八05分析，吣2、0)34、￥'^、0)117、0)146和0)271的表達。在未處理人皮膚成纖維細胞中，發(fā)現(xiàn)作為周細胞標記的NG2和作為內(nèi)皮祖細胞標記的CD34和vWF呈陰性。還發(fā)現(xiàn)它們在SSEA-3(+)細胞中為陰性的。發(fā)現(xiàn)少數(shù)未處理人皮膚成纖維細胞對作為成黑素細胞標記的⑶117、作為周細胞標記的⑶146和作為NCSC標記的⑶271呈陽性(分別為O. 2%,O. 2%和O. 8% )，但不被視為Muse細胞，因為它們是SSEA-3㈠細胞。圖18-3表示Muse細胞吞噬鐵酸鹽。圖19表示以下照片，其顯示由Muse細胞制備的iPS細胞的形成。圖19a表示由皮膚成纖維細胞(NHDF)來源的Muse細胞誘導(dǎo)的人iPS細胞的狀態(tài)。圖19b_f表示多能細胞標記的表達(“b”表示Nonog的表達，“c”表示0ct3/4的表達，“d”表示Sox2的表達，“e”表示SSEA-3的表達，“f”表示Tra-1-60的表達)。圖20 表示以下照片，其顯示 Nonog(E)、0ct3/4(F)、Sox2(G)和 Tra-1-81(H)的免疫組織化學分析結(jié)果。圖21表示以下照片，其顯示通過RT-PCR檢查，自Muse來源的iPS細胞(Mi_l和Mi-2)和SSEA-3(_)細胞生長的集落((-)_1和(-)-2)中多能性標記的表達。圖22-1表示以下照片，其顯示用反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc后在MEF飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)后30天，由SSEA-3(+)和(-)細胞形成的集落的Tra_l_81免疫染色結(jié)果。人ES細胞用作對照。得自SSEA-3(+)細胞(al)和人ES細胞(a2)的集落為Tra_l_81陽性的，但得自SSEA-3(_)細胞的所有集落為Tra-1-81陰性的。
圖22-2表示以下照片，其顯示在與22-1 —樣在MEF上培養(yǎng)30天后的階段，SSEA-3 (+)和(-)細胞的多能性標記(內(nèi)源 0ct3/4(endo Oct)、內(nèi)源 Sox2 (endo Sox2)、Nanog、內(nèi)源Klf4(endo Klf4)、Rexl和UTF1)的表達。在SSEA-3 (-)細胞群中，未觀察到Sox2 和 Nanog 信號。圖22-3表示以下照片，其顯示由從Muse細胞誘導(dǎo)的iPS細胞(Muse細胞來源的iPS細胞)(圖22-3C和Cl)和SSEA-3㈠細胞生長的集落(圖22-3D和Dl)。圖23-1表示以下照片，其顯示自皮膚成纖維細胞(NHDF)來源的Muse細胞誘導(dǎo)的iPS細胞的體外分化。圖23-li表示作為內(nèi)胚層標記的甲胎蛋白(綠色)和作為中胚層標記的平滑肌肌動蛋白(紅色(藍色表示DNA))的表達。圖23-1 j表示作為外胚層標記的神經(jīng)絲(綠色)的表達。圖23-2表示由Muse細胞誘導(dǎo)的iPS細胞的體外分化的RT-PCR分析結(jié)果。準確地說，圖23-2表示三胚層的標記的表達。 圖23-3表示以下照片，其顯示由皮膚成纖維細胞(NHDF)來源的Muse細胞誘導(dǎo)的iPS細胞形成的畸胎瘤的組織結(jié)構(gòu)。圖23-3明確顯示通過HE (蘇木精和伊紅)染色揭示的iPS細胞分化成各種類型的組織。圖23-3m表示軟骨，圖23_3n表示肌肉，圖23_3o表示神經(jīng)上皮，圖23_3p表不色素上皮，圖23_3q表不柱狀上皮。圖24表示SSEA_3(_)細胞部分、M團和Muse來源的iPS細胞的Nanog基因和0ct3/4基因的亞硫酸氫鹽(bisulfite/hydrogensulfite)測序結(jié)果。各欄的數(shù)值表明轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)下游的CpG位置?？招膱A表明未甲基化胞嘧啶，實心圓表明甲基化胞嘧啶。圖25表示參與未處理成纖維細胞(未處理)、M團和iPS細胞的細胞周期的因子的定量PCR結(jié)果。在標為“/未處理”的欄中，空心欄表不Muse部分或M團與未處理細胞的比率小于2(2 I)且大于1/2(1 2)。另外，實心欄表示該比率大于2(2 I)。斜線陰影欄表示該比率小于1/2(1 2)。在標為“/iPS”的欄中，符號表示M團中的基因表達水平高于iPS細胞中的基因表達水平。符號“**”表示iPS細胞中的基因表達水平高于M團中的基因表達水平。圖26表示參與未處理成纖維細胞(未處理)、M團和iPS細胞的多能性和未分化細胞狀態(tài)的因子的定量PCR結(jié)果。各欄的含義如圖25中的定義。圖27表示有關(guān)在人和小鼠模型中制備的iPS細胞系的誘導(dǎo)效率的研究報告概要。圖27表示誘導(dǎo)核重編程的轉(zhuǎn)錄因子的組合。優(yōu)選實施方案詳述下面將對本發(fā)明進行詳述描述。本發(fā)明涉及可直接從活體(體內(nèi))機體組織獲得的多能干細胞或多能干細胞部分、用于分離多能干細胞或多能干細胞部分的方法以及通過所述方法獲得的機體組織來源的多能干細胞或多能干細胞部分。本發(fā)明的多能干細胞稱為Muse細胞(多譜系分化應(yīng)激持久細胞)。在本發(fā)明中，術(shù)語“細胞部分”是指含有至少一定量的待分離的細胞的細胞群。例如，術(shù)語“多能干細胞部分”是指含有量相當于I %以上、10%以上、30%以上、50%以上、70%以上、90%以上或95%以上的多能干細胞的細胞群。其實例包括通過培養(yǎng)多能干細胞得到的細胞團和通過富集多能干細胞獲得的細胞群。此外，細胞部分還可稱為基本均質(zhì)細胞部分。術(shù)語“活體”是指活的哺乳動物體，具體是指發(fā)育到某種程度的動物體。在本發(fā)明中，這類活體的實例不包括受精卵或囊胚期之前的發(fā)育期的胚胎，卻包括囊胚期和囊胚期之后的發(fā)育期的胚胎，例如胎兒和囊胚。哺乳動物的實例包括但不限于人和猴等靈長類、小鼠、大鼠、兔和豚鼠等嚙齒動物、貓、狗、綿羊、豬、牛、馬、驢、山頭和白鼬。本發(fā)明的多能干細胞與胚胎干細胞(ES細胞)或胚胎生殖干細胞(EG細胞)明確區(qū)分開來，因為它們來自活的機體組織。術(shù)語“中胚層組織”是指在動物初期發(fā)育過程中出現(xiàn)的中胚層起源的組織。中胚層組織的實例包括肌肉系統(tǒng)組織、結(jié)締組織、循環(huán)系統(tǒng)組織、排泄系統(tǒng)組織和生殖系統(tǒng)組織。例如，本發(fā)明的多能干細胞可獲自骨髓液或真皮結(jié)締組織等皮膚組織。術(shù)語“間充質(zhì)組織”是指骨、軟骨、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韌帶、腱等組織和心臟組織。例如，本發(fā)明的多能干細胞可獲自骨髓或皮膚。另外，多能干細胞還可獲自臍帶。 表述“細胞可直接獲自組織”意指細胞不需要任何人工誘導(dǎo)操作(例如導(dǎo)入外源基因或外源蛋白或用化合物處理(例如給予化合物))便可從組織中分離出來。這種外源基因可以是例如但不限于能夠?qū)w細胞核進行重編程的基因。這種外源基因的實例包括0ct3/4基因等Oct家族基因、Klf基因等Klf家族基因、c-Myc基因等Myc家族基因和Sox2基因等Sox家族基因。另外，外源蛋白的實例包括由這些基因編碼的蛋白質(zhì)和細胞因子。此外，化合物的實例包括能夠誘導(dǎo)可對體細胞核重編程的上述基因的表達的低分子量化合物、DMS0、可起還原劑作用的化合物和DNA甲基化劑。本發(fā)明的多能干細胞與iPS細胞(誘導(dǎo)多能干細胞)和ES細胞明確區(qū)分開來，因為本發(fā)明的多能干細胞可直接獲自活體或組織。此外，在本發(fā)明中，細胞培養(yǎng)、使用細胞表面標記作為指標分離細胞或細胞部分、使細胞暴露于細胞應(yīng)激及對細胞提供物理沖擊都不包括在人工誘導(dǎo)操作的實例中。另外，本發(fā)明的多能細胞的特征還可在于它們不需要重編程或誘導(dǎo)去分化便可獲得。一般認為本發(fā)明的多能干細胞存在于活體的中胚層組織或間充質(zhì)組織等。在本發(fā)明中，將存在于這些類型的組織中的細胞或細胞部分分離出來。本發(fā)明的多能干細胞存在于例如骨髓中，使得通過血液等可從骨髓供應(yīng)到活體的各個組織中。因此，可從骨髓、活體的各個組織(例如皮膚甚至血液)中分離出多能干細胞。術(shù)語“多能干細胞”是指具有多能性和具有下列性質(zhì)的細胞。(I)多能干細胞表達Nanog、0ct3/4、SSEA-3、PAR_4和Sox2等多能性標記。(2)多能干細胞具有從單一細胞擴繁并持續(xù)產(chǎn)生自身的克隆的克隆性。(3)多能干細胞具有自我更新能力。(4)多能干細胞可在體外和體內(nèi)分化成三胚層(內(nèi)胚層細胞譜系、中胚層細胞譜系和外胚層細胞譜系)。(5)多能干細胞當移植入小鼠睪丸或皮下組織時分化成三胚層。(6)多能干細胞通過堿性磷酸酶染色呈陽性。本發(fā)明的多能干細胞與成體干細胞和組織干細胞明確區(qū)分開來，因為本發(fā)明的多能干細胞具有多能性。此外，本發(fā)明的多能干細胞與骨髓基質(zhì)細胞(MSC)等細胞部分明確區(qū)分開來，因為本發(fā)明的多能干細胞以具有多能性的單一細胞或大量細胞的形式分離。
此外，本發(fā)明的多能干細胞具有下列性質(zhì)。(i)生長速度相對較緩，分裂周期需時I天以上，例如I. 2-1. 5天。然而，多能干細胞不會以類似于ES細胞或iPS細胞的方式進行無限增殖。(ii)當移植入免疫缺陷小鼠時，多能干細胞分化成內(nèi)胚層細胞譜系、中胚層細胞譜系和外胚層細胞譜系。多能干細胞的特征在于與ES細胞或iPS細胞(畸胎瘤由此在短時間內(nèi)癌化)不同，它們不會癌化達半年以上。(iii)多能干細胞由于懸浮培養(yǎng)而形成胚狀體樣細胞團。(iv)多能干細胞由于懸浮培養(yǎng)形成胚狀體樣細胞團，并在約10天內(nèi)停止生長。隨 后，當將細胞團轉(zhuǎn)移到貼壁培養(yǎng)時，它們再次開始生長。(V)不對稱分裂與生長有關(guān)。(vi)細胞核型正常。(vii)多能干細胞無端粒酶活性或具有低端粒酶活性。表述..無端粒酶活性或具有低端粒酶活性”是指當使用例如TRAPEZE XL端粒酶檢測試劑盒(Millipore)檢測這種活性時，未檢出端粒酶活性或檢出低端粒酶活性。術(shù)語“低端粒酶活性”是指其中細胞具有的端粒酶活性與人成纖維細胞的端粒酶活性為同一程度或者具有的端粒酶活性是Hela細胞端粒酶活性的1/5以下和優(yōu)選1/10以下的情況。(viii)關(guān)于甲基化狀態(tài),在由Muse細胞誘導(dǎo)的iPS細胞中Nanog和0ct3/4啟動子區(qū)的甲基化水平低。(ix)多能干細胞具有高吞噬能力。(x)多能干細胞無腫瘤性生長。此處的表述細胞無腫瘤性生長”是指其中當進行懸浮培養(yǎng)時，細胞在其團塊達到預(yù)定大小的時候停止生長并且不進行無限生長的情況。此外，這個表述是指其中當把這種細胞移植入免疫缺陷小鼠睪丸時不形成畸胎瘤的情況。此外，上述(i)-(iv)等還涉及相關(guān)細胞(細胞團)不進行腫瘤性生長的事實。準確地講，本發(fā)明的細胞為例如下列多能干細胞(A)從活體的中胚層組織、間充質(zhì)組織等獲得，并且可在不將化學物質(zhì)、外源基因或外源蛋白導(dǎo)入這類細胞中的情況下直接獲得的多能干細胞；(B)具有上述(I)的性質(zhì)的多能干細胞，其中活體的中胚層組織或間充質(zhì)組織選自骨髓、皮膚、血液、臍帶和脂肪；(C)不需要重編程或誘導(dǎo)去分化便可獲得的上述(A)或(B)的多能干細胞；(D)移植入睪丸后至少半年內(nèi)不會癌化的上述(A)或(B)的多能干細胞；(E)與ES細胞和iPS細胞不同，不進行無限生長的上述㈧或⑶的多能干細胞；或(F)來自活體的中胚層組織或間充質(zhì)組織的多能干細胞，其用蛋白酶處理時保持存活，因此有蛋白酶抗性。此外，可通過將細胞應(yīng)激施于活體中胚層組織或間充質(zhì)組織細胞然后收集存活細胞來分離本發(fā)明的多能干細胞。此處的術(shù)語“細胞應(yīng)激”是指外部應(yīng)激。準確地講，通過蛋白酶處理、低氧條件下培養(yǎng)、低磷酸鹽條件下培養(yǎng)、血清饑餓條件下培養(yǎng)、糖饑餓狀態(tài)下培養(yǎng)、輻射暴露下培養(yǎng)、熱激暴露下培養(yǎng)、有毒物質(zhì)存在下培養(yǎng)、活性氧存在下培養(yǎng)、機械刺激下培養(yǎng)、壓力處理下培養(yǎng)等，將細胞暴露于這類應(yīng)激中。這些實例中，優(yōu)選蛋白酶處理，準確地講，優(yōu)選在蛋白酶存在下培養(yǎng)。蛋白酶沒有限制?？梢允褂靡鹊鞍酌负鸵饶榈鞍酌傅冉z氨酸蛋白酶、胃蛋白酶等天冬氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等金屬蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、N端蘇氨酸蛋白酶等。待加入用于培養(yǎng)的蛋白酶的濃度沒有限制。本文一般可采用用于除去培養(yǎng)在培養(yǎng)皿等中的貼壁細胞的濃度。本發(fā)明的多能干細胞可以說是對上述外部應(yīng)激具有抗性的干細胞，例如對胰蛋白酶具有抗性的細胞?；铙w的中胚層組織和間充質(zhì)組織的實例包括但不限于骨髓單核細胞、皮膚細胞等成纖維細胞部分、牙髓組織、眼球組織和毛根組織。至于細胞，可以使用培養(yǎng)細胞和從組織中收集的細胞兩者。在這些細胞中，骨髓細胞和皮膚細胞是合乎要求的。這種細胞的實例包括人骨髓基質(zhì)細胞(MSC)部分和人皮膚成纖維細胞部分?？赏ㄟ^培養(yǎng)骨髓穿刺液2-3周來獲得骨髓基質(zhì)細胞(MSC)部分。進行多種上述應(yīng)激的組織中大多數(shù)細胞將死亡。存活細胞包括本發(fā)明的多能干細胞。在將應(yīng)激施于細胞后，應(yīng)除去死細胞。然而，當使用蛋白酶時，這些死細胞通過蛋白酶 的作用而被裂解。此外，將應(yīng)激施于細胞后，給細胞提供物理沖擊使之易被破壞，然后可除去細胞。物理沖擊可通過激烈吸打、激烈攪拌、渦旋等來提供。將細胞應(yīng)激施于細胞，必要時提供物理沖擊，然后對所得細胞群進行離心。獲取所得存活細胞，并以沉淀收集，使得可分離出本發(fā)明的多能干細胞。此外，利用下列表面標記作為指標，可從由此得到的細胞中分離出本發(fā)明的多能干細胞或多能細胞部分。還可通過培養(yǎng)遭受創(chuàng)傷或燒傷等應(yīng)激的機體的中胚層組織、間充質(zhì)組織等(體內(nèi))，然后收集遷移的細胞，來分離本發(fā)明的多能干細胞或多能細胞部分。將受損組織細胞暴露于應(yīng)激。因此，在本發(fā)明中，表述“培養(yǎng)受損機體的中胚層組織或間充質(zhì)組織(體內(nèi))”另指將細胞應(yīng)激施于活體中胚層組織、間充質(zhì)組織等的細胞。例如，下面描述了用胰蛋白酶處理這類細胞的方法。此時胰蛋白酶的濃度不受限制。例如，在貼壁細胞普通培養(yǎng)中，胰蛋白酶的濃度可以是用于除去附著在培養(yǎng)瓶上的貼壁細胞的濃度，范圍為例如O. 1% -1%，優(yōu)選范圍為O. 1% -0.5%。例如，可通過將得自活體中胚層組織、間充質(zhì)組織等的細胞(100，000-500, 000個細胞)在5ml上述濃度的胰蛋白酶溶液中培養(yǎng)，來將細胞暴露于外部應(yīng)激。胰蛋白酶培養(yǎng)的時間范圍為約5-24小時，優(yōu)選范圍為約5-20小時。在本發(fā)明中，8小時以上的胰蛋白酶培養(yǎng)，例如處理8小時或16小時，是長期胰蛋白酶培養(yǎng)。在胰蛋白酶培養(yǎng)后，合意地通過上述吸打、攪拌、渦旋等提供物理沖擊。進行這種物理沖擊以除去死細胞或瀕死細胞。當在胰蛋白酶培養(yǎng)后進行懸浮培養(yǎng)時，合意地在凝膠例如甲基纖維素凝膠中進行培養(yǎng)，以防止細胞與細胞間聚集。此外，細胞培養(yǎng)瓶預(yù)先合意地用聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)等包被，以防止細胞附著在培養(yǎng)瓶上，保持懸液狀態(tài)。當將細胞暴露于外部應(yīng)激時，通過離心收集，然后培養(yǎng)，細胞形成細胞團。這種細胞團的大小的直徑范圍為約25μπι-150μπι。在暴露于外部應(yīng)激后存活的細胞群內(nèi)包括富集狀態(tài)的本發(fā)明的多能干細胞(Muse細胞)。這種細胞群稱為富含Muse的細胞部分(Muse富集群)。這種富含Muse的細胞部分中Muse細胞的百分比隨應(yīng)激處理方法而變化。
本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分在暴露于應(yīng)激后存活的事實表明，本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分對這類應(yīng)激有抗性。至于用來培養(yǎng)得自活體中胚層組織、間充質(zhì)組織等的細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，可以采用一般用于培養(yǎng)動物細胞的任何培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。此外，可以使用用于培養(yǎng)干細胞的已知培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可適當補充胎牛血清等血清、青霉素和鏈霉素等抗生素和各種生物活性物質(zhì)。此外，本發(fā)明還包括作為可從活體中胚層組織、間充質(zhì)組織等中直接獲得的本發(fā)明多能干細胞的衍生細胞或誘導(dǎo)細胞的多能干細胞。術(shù)語“衍生細胞或誘導(dǎo)細胞”是指通過培養(yǎng)多能干細胞而得到的細胞或細胞群或者通過對多能干細胞進行人工誘導(dǎo)操作(例如導(dǎo)入外源基因)而獲得的細胞。本文還包括子代細胞。此外，據(jù)稱在本發(fā)明時已報道的iPS細胞因重編程(例如將外源基因?qū)肫つw成纖維細胞等機體組織中的分化細胞)而從多能干細胞誘導(dǎo)出。將通過對細胞(可直接獲自本發(fā)明的組織且已具有作為多能干細胞的性質(zhì))進行人工誘導(dǎo)操作(例如導(dǎo)入外源基因)獲得的細胞與iPS細胞區(qū)分開來。
通過懸浮培養(yǎng)本發(fā)明的多能干細胞獲得胚狀體樣(EB body-like)細胞團。本發(fā)明還包括這類胚狀體樣細胞團和包含在這類胚狀體樣細胞團中的細胞。通過懸浮培養(yǎng)本發(fā)明的多能干細胞形成作為細胞團的胚狀體。此時，在本發(fā)明中，通過培養(yǎng)本發(fā)明的多能干細胞而獲得的這類胚狀體亦稱為M團(Muse細胞來源的胚狀體樣細胞團)。用于懸浮培養(yǎng)以形成胚狀體樣細胞團的方法的實例包括使用含有甲基纖維素等水溶性聚合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)(Nakahata，T.等，Blood 60,352-361(1982))和懸滴培養(yǎng)(Keller, J. Physiol. (Lond) 168 131-139，1998)。本發(fā)明還包括通過由胚狀體樣細胞團自我更新獲得的胚狀體樣細胞團、包含在這種胚狀體樣細胞團中的細胞和多能干細胞。此處術(shù)語“自我更新”是指其中培養(yǎng)包含在胚狀體樣細胞團中的細胞使得導(dǎo)致再次形成胚狀體樣細胞團的情況?？赏ㄟ^重復(fù)循環(huán)一次到若干次來進行自我更新。此外，本發(fā)明還包括從上述胚狀體樣細胞團或包含在這種胚狀體樣細胞團中的細胞分化的細胞和組織。圖1-1表示間充質(zhì)細胞(人成纖維細胞、人骨髓基質(zhì)細胞(MSC)和新鮮骨髓液)部分、Muse細胞和M團間的關(guān)系。當向間充質(zhì)細胞樣細胞團強加應(yīng)激刺激(例如長期胰蛋白酶培養(yǎng)(LTT))時，Muse細胞富集，然后得到含有許多Muse細胞的細胞部分(稱為富含Muse的細胞部分)。通過懸浮培養(yǎng)細胞部分中的Muse細胞，得到胚狀體樣細胞團(M團)。在將胚狀體樣細胞團培養(yǎng)在包被有明膠的培養(yǎng)皿中時，細胞分化成三胚層的細胞。另外，如圖1-1所示，直接分離SSEA-3(+)細胞，然后在不把細胞暴露于長期應(yīng)激的情況下進行懸浮培養(yǎng)，以便可獲得M團。一旦通過懸浮培養(yǎng)Muse細胞生長便停止，當轉(zhuǎn)移到貼壁培養(yǎng)時，Muse細胞開始生長。通過使用懸浮培養(yǎng)-貼壁培養(yǎng)-SSEA-3表達作為指標的重復(fù)分離，Muse細胞可大量生長(圖1-2)。此外，還可在不暴露于細胞應(yīng)激的情況下，將本發(fā)明的多能干細胞或多能細胞部分從機體組織中直接分離。準確地講，可通過下列方法在不需要導(dǎo)入外源基因等誘導(dǎo)操作的情況下，從活體中胚層組織、間充質(zhì)組織等中分離本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分。機體組織的實例包括但不限于活體的中胚層組織和間充質(zhì)組織，例如骨髓、皮膚和臍帶組織。當使用骨髓時，可使用骨髓的單核細胞部分?？衫迷贛use細胞表面大量表達的細胞表面標記進行分離。例如，可利用SSEA-3表達作為指標進行分離。本發(fā)明的多能干細胞亦可稱為SSEA-3(+)Muse細胞。此外，Muse細胞表達作為多能干細胞標記的CD105。Muse細胞為SSEA-3陽性和CD105陽性的。因此，可利用SSEA-3和CD105兩者的表達作為指標分離Muse細胞。使用這些細胞表面標記，可以單一細胞形式分離本發(fā)明的多能干細胞。由此分離的單一細胞可通過培養(yǎng)生長。此外，本發(fā)明包括可利用相當于SSEA-3的標記，從人以外的哺乳動物機體組織中分離的多能干細胞。同時，Muse細胞為NG2、CD34、vffF(馮維勒布蘭德因子(von Willebrandfactor))、c-kit(CD117)、CD146 和 CD271 (NGFR)陰性的。此外，Muse 細胞為 SoxlO,SnaiUSlug、Tyrpl 和 Dct 陰性的。可通過顯微鏡下觀察細胞是否被顯色酶、熒光化合物等標記的抗體(抗表面抗原的抗體)染色，來確定細胞是否對NG2、⑶34、vffF,⑶117、⑶146和⑶271等表面抗原呈陰性或者其表達是弱還是不弱。例如，細胞用這些抗體免疫染色，使得可測定表面抗原存在與否。也可使用抗體結(jié)合的磁珠測定所述表面抗原存在與否。同樣，可利用FACS或 流式細胞儀測定表面抗原存在與否?？刹捎美鏔ACSAria(Becton Dickinson)、FACSvantage (Becton Dickinson)、FACS Calibur (Becton Dickinson)等流式細胞儀。至于SoxlO、Snail、Slug、Tyrpl和Dct等轉(zhuǎn)錄因子,還可通過RT-PCR等技術(shù)檢查其表達。表述..對這些表面抗原呈陰性”是指以下情況，其中當按上述方法進行FACS分析時，細胞不被分選為陽性細胞，或者當通過RT-PCR檢查表達時無法證實其表達。即使這類表面抗原以無法被這類技術(shù)檢出的程度表達，但在本發(fā)明中仍將細胞稱為陰性的。此外，同時用已知對上述標記呈陽性的細胞(例如造血干細胞)進行測量。當檢出幾乎無表達或與這類陽性細胞相比表達水平顯著較低時，細胞可稱為陰性的?？筛鶕?jù)上述細胞表面抗原的性質(zhì)分離本發(fā)明的細胞。如上所述，可利用“SSEA-3陽性”作為指標分離Muse細胞。此外，可利用⑶105的表達作為指標分離Muse細胞。可進一步利用選自以下的至少I種，例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或11種標記的無表達作為指標來分離Muse細胞NG2、⑶34、vffF(馮維勒布蘭德因子)、c-kit (CDl 17)、CD146、CD271 (NGFR)、SoxlO、Snail、Slug、Tyrpl和Dct。例如，利用不表達⑶117和⑶146進行分離是可行的。此外，可利用不表達⑶117、⑶146、NG2、⑶34、vffF和⑶271作為指標進行分離。此外，可利用不表達上述11種標記作為指標進行分離。當利用表面標記進行分離時，可在不需要培養(yǎng)等的情況下直接從活體中胚層組織、間充質(zhì)組織等中分離出一種或多種本發(fā)明的多能干細胞。此外，可使用顯微鏡等通過肉眼觀察細胞形態(tài)來鑒定和分離本發(fā)明的多能干細胞。在向活體中胚層組織、間充質(zhì)組織等提供細胞應(yīng)激后，還可利用表面標記從存活細胞群中進行分離。此外，除了利用上述標記以外，可通過另一種特殊因子的高水平表達來表征本發(fā)明的多能干細胞或多能細胞部分?？蓮奈刺幚砉撬杌|(zhì)細胞(MSC)部分或皮膚成纖維細胞部分獲得作為本發(fā)明的多能干細胞的Muse細胞。將Muse細胞進一步培養(yǎng)，從而獲得Muse細胞來源的胚狀體(EB)樣細胞團。通過對在Muse細胞、未處理細胞、Muse來源的胚狀體樣細胞團和人ES細胞中表達的因子進行比較和檢查，可檢出Muse細胞中以高水平表達的因子。這類因子的實例包括基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類。圖2表示其在M團中的表達水平與在未處理細胞中的表達水平的比率高的因子。具體來講，下列18種因子的比率高。(i) SSEA-3(ii)v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(iii)溶質(zhì)載體家族16,成員6 (—元羧酸轉(zhuǎn)運蛋白7)
(iv)酪氨酸酶相關(guān)蛋白I(V)鈣通道，電壓依賴性，P/Q型，a IA亞基(vi)染色體16可讀框81(vii)幾丁質(zhì)酶3樣1(軟骨糖蛋白-39)(viii)蛋白酶，絲氨酸，35(ix)犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶)(X)溶質(zhì)載體家族16,成員6( —元羧酸轉(zhuǎn)運蛋白7)(xi)脫脂載脂蛋白E(xii)突觸結(jié)合蛋白樣5(xiii)幾丁質(zhì)酶3樣1(軟骨糖蛋白-39)(xiv) ATP 結(jié)合盒，亞家族 A (ABCl)，成員 13(XV)促血管生成素(angiopoietin)樣 4(xvi)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2 (前列腺素G/Η合酶和環(huán)加氧酶)(xvii)司腺I丐蛋白I(xviii)含有卷曲螺旋域的102B本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分的特征在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18種上述因子以高水平表達。因此，可利用至少2種因子的高水平表達作為指標分離多能干細胞或多能干細胞部分。圖3表示其在M團中的表達水平與在人ES細胞中的表達水平的比率高的因子。具體來講，下列20種因子的比率高。(a)基質(zhì)金屬肽酶I (間質(zhì)膠原酶)(b)上皮調(diào)節(jié)蛋白(C)幾丁質(zhì)酶3樣1(軟骨糖蛋白-39)(d)轉(zhuǎn)錄基因座(Transcribed locus)(e)幾丁質(zhì)酶3樣1(軟骨糖蛋白-39)(f)絲甘蛋白(g)MRNA 全長插入片段 cDNA 克隆 EUR0IMAGE 1913076(h) Ras 和 Rab 相互作用因子(interactor) 2⑴腔蛋白聚糖(j) CLCA家族成員2，氯通道調(diào)節(jié)因子
(k)白介素 8(I)類似于 L0C166075(m)皮膚橋蛋白(dermatopontin)(n)EGF, Iatrophilin 和含有 7 個跨膜域的蛋白 I (seven transmembrane domaincontaining I)(o)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白I(ρ)溶質(zhì)載體家族16,成員4( 一元羧酸轉(zhuǎn)運蛋白5)
(q)絲甘蛋白(r) gremlin 2,半胱氨酸結(jié)超家族，同源物(有爪蟾蜍(Xenopus Iaevis))(s)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(t)硫化物醌還原酶樣(酵母)本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分的特征在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種上述因子以高水平表達。因此，可利用至少2種因子
的高水平表達作為指標來分離多能干細胞或多能干細胞部分。此外，在本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分中，上述因子(i)-(xviii)的至少2種和上述因子(a)-(t)的至少2種可同時以高水平表達。因此，可利用這些基因的高水平表達作為指標來分離多能干細胞或多能干細胞部分。此外，本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分的特征在于除多能性標記之外，還表達氣味受體(嗅覺受體)群的因子和趨化因子受體群的因子；也就是說它們對特定的氣味受體或趨化因子受體呈陽性。在本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分中表達的氣味受體的實例包括下列22種受體。嗅覺受體，家族8，亞家族G，成員2 (0R8G2)；嗅覺受體，家族7，亞家族G，成員3 (0R7G3)；嗅覺受體，家族4，亞家族D，成員5(0R4D5)；嗅覺受體，家族5，亞家族AP，成員2 (0R5AP2)；嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員4 (0R10H4)；嗅覺受體，家族10，亞家族T，成員2 (0R10T2)；嗅覺受體,家族2，亞家族M，成員2 (0R2M2)；嗅覺受體，家族2，亞家族T，成員5 (0R2T5)；嗅覺受體，家族7，亞家族D，成員4 (0R7D4)；嗅覺受體，家族I，亞家族L，成員3(0R1L3)；嗅覺受體，家族4，亞家族N，成員4 (0R4N4)；嗅覺受體，家族2，亞家族A，成員7 (0R2A7)；鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)，α激活活性多肽，嗅覺型(GNAL)；嗅覺受體，家族6，亞家族Α，成員2 (0R6A2)；嗅覺受體，家族2，亞家族B，成員6 (0R2B6)；嗅覺受體，家族2，亞家族C，成員I (0R2C1)；嗅覺受體，家族52，亞家族Α，成員I (0R52A1)；
嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員3 (0R10H3)；嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員2 (0R10H2)；嗅覺受體，家族51，亞家族E，成員2(0R51E2)；嗅覺受體，家族5，亞家族P，成員2 (0R5P2);和嗅覺受體，家族10，亞家族P，成員I (0R10P1)在本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分中表達的趨化因子受體的實例包括下列5種受體。趨化因子(C-C基序)受體5 (CCR5)；
趨化因子(C-X-C基序)受體4 (CXCR4)；趨化因子(C-C基序)受體I (CCRl)；達菲血型，趨化因子受體(DARC);和趨化因子(C-X-C基序)受體7 (CXCR7)。本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分表達至少一種上述嗅覺受體或表達至少一種上述趨化因子受體。因為這些氣味受體或趨化因子受體和與受體結(jié)合的遷移因子的作用，所以本發(fā)明的多能干細胞遷移到受損組織，然后在組織中存活并分化。例如，當肝臟、皮膚、脊髓或肌肉受損時，在細胞表面表達的特殊遷移因子和氣味受體起作用引起多能干細胞遷移到相關(guān)組織，在該組織中存活，然后分化成肝臟(內(nèi)胚層)、皮膚(外胚層)、脊髓(外胚層)或肌肉(中胚層)細胞，使得該組織可再生。在富含作為本發(fā)明多能干細胞的Muse細胞的富含Muse的細胞部分中，Rexl、Sox2、KLF-4、c-Myc、DPPA2、ERAS、GRB7、SPAG9、TDGFl 等被增量調(diào)節(jié)。在 Muse 細胞的細胞團中，DAZL、DDX4、DPPA4、Stella、HoxbI、PRDMl、SPRY2 等被增量調(diào)節(jié)。此外，在本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分中，從未觀察到⑶34和⑶117造血干細胞標記的表達，或者只觀察到極低水平。本發(fā)明不僅僅包括Muse細胞,而且還包括由Muse細胞富集產(chǎn)生的細胞群、由Muse細胞生長而產(chǎn)生的細胞群和由Muse細胞分化而產(chǎn)生的細胞群。本發(fā)明還包括裝有Muse細胞或Muse細胞來源的細胞的研究試劑盒、細胞芯片和治療裝置。本發(fā)明的多能干細胞具有多能性，因此能夠分化成所有類型的組織。多能干細胞或多能細胞部分可用于再生醫(yī)療等。例如，這種細胞和細胞部分可用于各種類型的組織、各種器官等的再生。其具體實例包括皮膚、腦脊髓、肝臟和肌肉。將本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分直接給予受傷或受損組織、器官等或者給予受傷或受損組織、器官等附近區(qū)域，使得多能干細胞進入該組織或器官，并分化成相關(guān)組織或器官特有的細胞。這樣的話，多能干細胞可促進組織和器官的再生或再建。此外，可通過靜脈內(nèi)給予等全身給予多能干細胞或多能干細胞部分。在這種情況下，將多能干細胞通過歸巢等定向至受損組織或器官，到達并進入組織或器官，然后分化成組織或器官細胞，從而能夠促進組織或器官再生和再建。給藥可通過胃腸外給予例如皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射來進行，通過口服給予或子宮內(nèi)注射入例如胚胎來進行。此外，本文中也可進行局部給予或全身給予。局部給予可使用例如導(dǎo)管進行?？筛鶕?jù)待再生的器官、組織類型或大小適當確定劑量。待再生的器官的實例包括但不限于骨髓、脊髓、血液、脾臟、肝臟、肺、腸、眼、腦、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、骨、結(jié)締組織、肌肉、心臟、血管、胰腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、腎、膀胱、皮膚、上皮附屬器、乳房-乳腺、脂肪組織和例如口、食管、陰道和肛門的黏膜。此外，其中待治療的疾病的實例包括癌癥、心血管疾病、代謝疾病、肝病、糖尿病、肝炎、血友病、血液系統(tǒng)疾病、脊髓損傷等變性或創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病、自身免疫疾病、遺傳缺陷、結(jié)締組織疾病、貧血、感染性疾病、移植排斥、缺血、炎癥和皮膚或肌肉損傷。細胞可與藥學上可接受的基料一起給予。這種基料可由具有高生物相容性的物質(zhì)(例如膠原)或生物可降解的物質(zhì)制成。其可呈粒子、板、管、容器等形式?？稍诩毎c基料結(jié)合后或在將細胞包含在基料內(nèi)后給予所述細胞。此外，對本發(fā)明的多能干細胞進行體外分化誘導(dǎo)，利用進一步分化的細胞構(gòu)建組織，然后可移植分化的細胞或組織。由于本發(fā)明的多能干細胞不進行致瘤轉(zhuǎn)化，細胞癌化的 可能性低，并且可以說是安全的，即使上述移植的分化細胞或組織中包含本發(fā)明未分化的多能干細胞。為了防止在這種再生醫(yī)療中接受者對移植的細胞或組織的排斥，需要從待接受再生醫(yī)療的患者中收集中胚層組織、間充質(zhì)組織等，然后從相關(guān)組織中分離出本發(fā)明的多能干細胞或多能細胞部分備用。此外，本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分可用于治療因組織變性或功能障礙所致的疾病。在這種情況下，例如，將本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分離體富集，生長或使之分化，然后再輸回體內(nèi)。例如，使多能干細胞分化成特定的組織細胞，然后將細胞移植入待治療的組織中。此外，可通過移植這種細胞進行原位細胞治療。在這種情況下，靶細胞的實例包括肝細胞、神經(jīng)元細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞等神經(jīng)細胞、皮膚細胞和骨骼肌細胞等肌肉細胞。使本發(fā)明的多能干細胞分化成這些細胞，移植分化細胞，然后原位進行治療。通過這種治療，可以治療例如帕金森病(Parkinson’s disease)、腦梗塞、脊髓損傷、肌營養(yǎng)不良等。由于本發(fā)明的多能干細胞不經(jīng)歷致瘤轉(zhuǎn)化，因此即使用于這種治療，它們也未必癌化，而且是安全的。此外，使本發(fā)明的多能干細胞分化形成血液或血液組分，使得可離體或體外形成血液或血液組分。這種血液組分的實例包括紅細胞、白細胞和血小板。由此形成的血液或血液組分可用于自體輸血或交叉輸血。如上所述，當本發(fā)明的多能干細胞或多能干細胞部分用于治療時，可離體、體內(nèi)或體外使之分化。本發(fā)明的多能干細胞分化成例如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、骨髓間質(zhì)、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼、內(nèi)皮、上皮、肝臟、胰腺、造血系統(tǒng)、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元細胞或少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞。本發(fā)明的多能干細胞的分化可通過在分化因子存在下對其進行培養(yǎng)而獲得。分化因子的實例包括堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、二甲亞砜(DMSO)和異丙腎上腺素；或成纖維細胞生長因子4(FGF4)和肝細胞生長因子(HGF)。本發(fā)明還包括由本發(fā)明的多能干細胞分化的細胞。當本發(fā)明的多能干細胞用于治療時，可引入編碼蛋白質(zhì)抗癌物質(zhì)、生物活性物質(zhì)等的基因。因此，可以說，本發(fā)明的多能干細胞具有遞送治療藥的功能。這類物質(zhì)的實例包括抗血管生成藥。本發(fā)明包括用于細胞移植治療的材料或用于細胞移植治療的組合物或用于再生醫(yī)療的材料或用于再生醫(yī)療的組合物，其含有Muse細胞、由Muse細胞形成的胚狀體樣細胞團和從Muse細胞或上述胚狀體樣細胞團經(jīng)由分化獲得的細胞或組織/器官。除Muse細胞、由Muse細胞形成的胚狀體樣細胞團或者自Muse細胞或上述胚狀體樣細胞團經(jīng)由分化獲得的細胞或組織和/或器官以外，這類組合物還含有藥學上可接受的緩沖液、稀釋劑等。此外，從患者中收集細胞，分離出Muse細胞，然后可將Muse細胞用于各種診斷。例如，從Muse細胞中收集患者的基因，然后獲取基因信息，使得反映該信息的準確診斷成為可能。例如，通過使患者的細胞來源的Muse細胞分化,可獲得具有與受試者相同的特征(例如遺傳背景)的各種組織和/或器官的細胞。因此，至于疾病診斷、闡明病理狀態(tài)、診斷藥物的效果或副作用等，可根據(jù)各受試者的特征，作出適當診斷。準確地講，Muse細胞、由Muse細胞形成的胚狀體樣細胞團和通過分化Muse細胞或上述胚狀體樣細胞團獲得的細胞或組織和/或器官可用作診斷材料。例如，本發(fā)明包括用于利用從受試者分離的Muse細胞或利用具有與受試者的遺傳背景相同的遺傳背景的組織或器官(通過分化自Muse細胞獲得)，診斷受試者的疾病等的方法。此外，可通過分化Muse細胞獲得大量體細胞。因此，可進行基礎(chǔ)研究，例如闡明疾病機制、開發(fā)治療藥、針對藥物效果或毒性進行篩選、藥物評價等。準確地講，Muse細胞、由 Muse細胞形成的胚狀體樣細胞團和通過分化Muse細胞或上述胚狀體樣細胞團獲得的細胞或組織和/或器官，可用作藥物評價或藥物篩選的材料。例如，本發(fā)明包括篩選藥物或評價藥物的方法，所述方法包括使Muse細胞分化和/或生長,獲得體細胞,將候選藥物給予體細胞，然后檢查體細胞的反應(yīng)。此外，通過構(gòu)建各種(例如各種類型的HLA)Muse細胞文庫，來構(gòu)建Muse細胞庫，使得可實現(xiàn)能夠按需將Muse細胞供應(yīng)至Muse細胞應(yīng)用部位的系統(tǒng)。例如，除了上述目的以外，還可進行例如向急需細胞移植治療提供無(或幾乎無)排斥的細胞。準確地講，本發(fā)明包括用于構(gòu)建具有不同遺傳性質(zhì)的Muse細胞文庫即Muse細胞庫的方法，所述方法包括分離并收集具有不同遺傳性質(zhì)的Muse細胞。此外，不僅僅可使用Muse細胞，還可使用由Muse細胞形成的胚狀體樣細胞團和通過分化自Muse細胞或上述胚狀體樣細胞團獲得的細胞或組織和/或器官，來構(gòu)建文庫或庫。在本發(fā)明中，通過獲得由這些Muse細胞形成的胚狀體樣細胞團以及通過分化Muse細胞或上述胚狀體樣細胞團獲得的細胞或組織和/或器官而構(gòu)建的文庫或庫，亦稱為細胞文庫或細胞庫。本發(fā)明包括由此構(gòu)建的細胞文庫或細胞庫。這類細胞文庫或細胞庫包括容器例如多種管，其裝有具有不同遺傳特征的細胞等。還可將這類細胞凍結(jié)。例如，當將組織或器官移植入受試者或需要其再生時，從上述細胞文庫或細胞庫中選出就受試者的遺傳背景等而言是適當?shù)牡募毎?。因此，可利用所述細胞進行移植或再生治療。本發(fā)明包括治療方法，所述方法包括將治療有效劑量的本發(fā)明的多能干細胞、其細胞部分或從這類細胞衍生或誘導(dǎo)的細胞，給予需要治療的患者以治療疾病。有效劑量可根據(jù)例如待給予的細胞數(shù)來確定，并且可根據(jù)疾病類型或嚴重程度適當決定。在上述治療方法中，本發(fā)明的多能干細胞不形成任何畸胎瘤，使得不在患者中形成畸胎瘤。此外，當給予自體細胞來源的Muse細胞時，無需通過對患者進行放射線照射、化學療法等引起骨髓功能障礙。當使用不是自體細胞的Muse細胞時,仍進行上述處理。此外，Muse細胞可以是iPS細胞(誘導(dǎo)多能干細胞)的來源。與使用另一類型細胞(例如非利用SSEA-3表達作為指標分級分離的皮膚成纖維細胞)作為來源的情況相比，利用Muse細胞作為來源制備iPS細胞的效率高得多(至少為25倍以上)?？赏ㄟ^將特定基因或特定化合物導(dǎo)入Muse細胞從而改變細胞質(zhì)來制備iPS細胞。細胞質(zhì)的變化包括重編程或癌化，對此可采用目前已知的方法或未來將建立的所有方法。例如，按照日本專利號4182742的描述或圖27的描述，將基因?qū)隡use細胞，使得可從Muse細胞建立iPS細胞。此外，除了圖27中描述的方法以外，可以說可通過導(dǎo)入化學物質(zhì)、外源基因或外源蛋白來建立iPS細胞。例如，IPS細胞自Muse細胞的建立可用后面所述實施例中描述的方法進行。如上所述自Muse細胞獲得的iPS細胞也可稱為“Muse來源的iPS細胞(Muse-iPSC) ”。本發(fā)明包括這種Muse來源的iPS細胞?？梢哉fMuse來源的iPS細胞是具有Muse細胞來源的增殖能力的多能干細胞。下面參照下列實施例更詳細地對本發(fā)明進行描述，雖然本發(fā)明不限于這些實施例。 實施例I.富含Muse的細胞部分和M團的制備和表征材料與方法實施例中使用下列細胞。2個人皮膚成纖維細胞部分(人成纖維細胞)品系和4個人MSC (骨髓基質(zhì)細胞)部分(Η-MSC部分)品系用作間充質(zhì)細胞。人成纖維細胞部分是(I)人成纖維細胞-I (正常人成纖維細胞(NHDF)，Lonza)和(2)人成纖維細胞_2 (成人皮膚成纖維細胞(HDFA，ScienCell，Carlsbad，CA))。人MSC 部分、H-MSC-1、H-MSC_2 和 H-MSC-3 獲自 Lonza，H-MSC-4獲自 ALLCELLS。人 MSC 部分具體披露于 Pittenger，M. F.等，Science 284,143-147(1999)；Dezawa, Μ.等，J Clin Invest 113，1701-1710 (2004);以及 Dezawa，M.等，Science 309，314-317(2005)。將細胞在含有10% FBS和O. lmg/ml卡那霉素的a -MEM (α -極限必需培養(yǎng)基)中在37°C、5% 0)2下培養(yǎng)。在運輸后直接培養(yǎng)的細胞被視為第I代培養(yǎng)物。當細胞達到95%匯合時，以I : 2(細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)基)的比率使細胞擴繁。在該研究中，使用來自第4代到第10代繼代培養(yǎng)物的細胞。本文使用的人ES細胞(hESC)是獲自Kyoto University的kyotohESC-1(KhES-I)。小鼠ES細胞(TT2細胞)和人ES細胞(KhES-I)在由C57BL/6小鼠12. 5天胚胎建立的小鼠胚胎飼養(yǎng)(MEF)細胞上維持。通過下列方法進行實驗。I.間充質(zhì)細胞的應(yīng)激條件為了進行包括低營養(yǎng)下培養(yǎng)、低血清下培養(yǎng)、低O2下培養(yǎng)、重復(fù)胰蛋白酶培養(yǎng)和長期胰蛋白酶培養(yǎng)在內(nèi)的應(yīng)激條件暴露，采用下列6種條件I)在不含血清的培養(yǎng)基(STEMPR0 MSC SFM, Invitrogen)中培養(yǎng)2天(無血清)；2)在Hank平衡鹽溶液(HBSS)緩沖液(Invitrogen)中培養(yǎng)2天(HBSS)；3)在含 10% FBS 的 a -MEM 中結(jié)合低 O2(I% O2)中培養(yǎng) 2 天(10% FBS+ 低 O2)；4)在胰蛋白酶(0. 25%胰蛋白酶-HBSS)中連續(xù)3次I小時培養(yǎng)(胰蛋白酶培養(yǎng)共3小時)(Try 3X1小時)；
5)長期胰蛋白酶培養(yǎng)(LTT)持續(xù)8小時(LTT 8小時)；和6) LTT 持續(xù) 16 小時(LTT 16 小時)。對于陰性對照，使用人外周單核細胞部分。對于條件4)、5)和6)，將約1χ105-5χ105個細胞懸浮于5ml胰蛋白酶溶液中后進行培養(yǎng)。通過5分鐘胰蛋白酶培養(yǎng)收集來自應(yīng)激條件I)-3)的細胞，將應(yīng)激條件4)-6)的細胞直接轉(zhuǎn)移到管中。通過渦旋破壞由應(yīng)激條件產(chǎn)生的大批死細胞。準確地講，將5ml含有最多500，000個細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15-ml Falcon管中，接著使用潤旋混合器(IKA Works, Inc.)以1800-2200rpm/分鐘渦旋3分鐘。以2000rpm進行離心15分鐘，以除去上清液。渦旋后活細胞的收集效率范圍為約70% -80%。2. MC 培養(yǎng) 在實施例中，使細胞在含甲基纖維素的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)。在含甲基纖維素的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)稱為“MC培養(yǎng)”。MC培養(yǎng)披露于Nakahata，T.等，Blood 60，352-361(1982)。培養(yǎng)皿首先用PoIy-HEMA(聚(甲基丙烯酸2_羥乙酯))包被以避免細胞附著在培養(yǎng)皿底部。簡而言之，通過在37°C下攪拌使600mgpoly-HEMA (SIGMA)溶于40ml 95% EtOH,加到培養(yǎng)皿(例如對于96孔培養(yǎng)皿為40 μ I/孔，對于12孔培養(yǎng)皿為200 μ I/孔)中后，將培養(yǎng)皿風干過夜。將MC(MethoCult H4100, StemCell Technologies)懸浮于 20 % FBS+a-MEM 至2%的終濃度。在該濃度下調(diào)節(jié)半固體MC培養(yǎng)基中細胞的濃度為8Χ IO3個細胞/ml，使得細胞與細胞間距離足夠大以使細胞聚集最小化。通過輕輕吸打?qū)⒓毎蚆C培養(yǎng)基充分混合，將混合物轉(zhuǎn)移到polyHEMA包被培養(yǎng)皿中。為了防止干燥，每3天將相當于含10% FBS的a -MEM的最初MC培養(yǎng)1/10的體積緩緩加到培養(yǎng)皿中。在第7天對細胞團(稱為Muse細胞來源的胚狀體樣細胞團=M團，因為細胞團是得自本發(fā)明的多能干細胞Muse細胞的團塊)進行克隆。將0.01Μ PBS加到培養(yǎng)基中，將細胞以2000rpm離心20分鐘，棄去上清液。重復(fù)該步驟3次以洗滌細胞。最終將收集的細胞沉淀懸浮于含有錐蟲藍的10 μ I 0.01Μ PBS中，加到載玻片上，利用相差顯微鏡自動拍攝整個區(qū)域。僅將大于25 μ m的錐蟲藍陰性且外觀類似于hES細胞的多細胞團統(tǒng)計為M團。M團的形成頻率計算為M團數(shù)除以所有活細胞數(shù)(全為錐蟲藍陰性細胞)。因為難以測定各M團中細胞的準確數(shù)目，所以每個聚集體不論其大小均按I個細胞計數(shù)。對于從hES細胞制備細胞團，小心地從飼養(yǎng)細胞中將其分離以便不包括飼養(yǎng)細胞，如上所述轉(zhuǎn)移至MC培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天時用相差顯微鏡拍照。3.單一細胞懸浮培養(yǎng)如上所述，將96孔培養(yǎng)皿用polyHEMA包被。在細胞用含10% FBS的a -MEM有限稀釋之后，將單一細胞接種到各孔中。接種后，利用相差顯微鏡經(jīng)肉眼檢查確定置于各孔中的細胞的實際數(shù)目。對空白孔或具有多于一個細胞的孔進行標記，并從分析中剔除。在培養(yǎng)第10天進行M團形成的計算。對每個品系根據(jù)3次實驗計算出M團的形成頻率，其中每次實驗最少250孔。4.堿性磷酸酶染色
得自人成纖維細胞部分和H-MSC部分的M團用足夠體積的鹽水洗滌幾次。使用Leukocyte Alkaline Phosphatase 試劑盒(Sigma)進行染色。5. M團的體外分化在MC培養(yǎng)或單一細胞懸浮培養(yǎng)7-10天后，用玻璃微量移液管挑選出得自人成纖維細胞部分和H-MSC部分的單一 M團，并轉(zhuǎn)移在明膠包被的培養(yǎng)皿或蓋玻片上。再培養(yǎng)7天后，從細胞團中分散細胞。對細胞進行免疫組織化學和RT-PCR分析以確定細胞分化存在與否。6.免疫組織化學細胞用O. OlM PBS中的4%低聚甲醛固定。富含Muse的細胞部分以及得自人成纖維細胞和H-MSC部分兩者的M團通過離心收集，包埋在OCT化合物中，并切下8 μ m厚的冷凍切片。將細胞團固定在明膠包被的蓋玻片上，然后進行免疫組織化學分析。 使用針對以下抗原的第一抗體Nanog(I: 500, Chemicon)、0ct3/4(I : 800,Dr. H. Hamada 惠贈，Osaka University, Japan) > Sox2(l : 1000, Abeam)、PAR4 (I : 100，Santa Cruz), SSEA-3 (I 20，DSHB)、平滑肌肌動蛋白(I 100，Lab Vision)、神經(jīng)絲M(1 200，Chemicon)、甲胎蛋白(I : 100，DAK0)、小鼠 Numblike (I 500, Dr. Yuh-NungJang 惠贈，University of California San Francisco)和 I 型膠原(I : 20, SouthernBiotech)。Alexa 488或Alexa 568綴合的抗兔IgG、抗小鼠IgG或抗小鼠IgM抗體(Molecular Probes, Carlsbad, CA)用作免疫組織化學分析的第二抗體。7.測定核型通過喹吖因-Hoechst染色測定由人成纖維細胞部分和H-MSC部分兩者來源的M團(通過重復(fù)從M團收集單一細胞然后使細胞再次形成細胞團的循環(huán)(1-3次)獲得)克隆擴繁的細胞的核型。8.將細胞注射到免疫缺陷小鼠睪丸使用未處理細胞部分和富含Muse的細胞部分及人成纖維細胞部分和H-MSC部分兩者來源的M團。在LTT后將血清加到細胞中，接著用0. OlM PBS洗滌3次來制備富含Muse的細胞部分。從MC培養(yǎng)收集M團，同樣用PBS洗滌3次。將IxlO5個細胞懸浮于PBS中，并使用玻璃微管注射到NOG小鼠(注冊商標，小鼠NOD/Shi-scid，IL-2R y KO Jic，8周齡，日本實驗動物科學國際理事會監(jiān)測中心(International Council for Laboratory AnimalScience (ICLAS)Monitoring Center Japan)睪丸中。使用隨激光共焦顯微鏡提供的3D圖形分析軟件測量M團中細胞的平均體積(測量了 50個M團，并將團塊總體積除以核數(shù))，得到每I μ I體積的收集的M團沉淀為I. 5x IO5個細胞。然后給NOG小鼠的每個睪丸注射相當于IxlO5個細胞的體積，注射后6個月對小鼠進行分析實驗。作為對照，將IxlO6個小鼠ES細胞(對于陽性對照，η = 3)和絲裂霉素C處理的MEF細胞(小鼠胚胎飼養(yǎng)細胞，用于陰性對照，η = 3)注射入SCID小鼠睪丸，注射后8周對小鼠進行實驗。9.通過光學顯微鏡對細胞進行高分辨率分析利用用于人MSC、成纖維細胞和神經(jīng)元細胞等細胞類型的穩(wěn)定的高分辨率光學顯微鏡觀察得自人成纖維細胞部分和H-MSC部分的Muse細胞和M團。10.用于電子顯微鏡術(shù)的超薄切片
將人成纖維細胞部分和H-MSC部分兩者來源的M團、SSEA-3 (+)和SSEA-3 (-)細胞以及由hES細胞形成的細胞團離心。沉淀用IOOmM磷酸緩沖液(pH 7. 2)中的2. 5%戊二醛固定30分鐘。將固定樣品包埋在I %瓊脂中。修整包埋樣品至1mm3，用PBS洗滌，在4°C下用IOOmM磷酸緩沖液(pH 7. 2)中的2% OsO4染色10分鐘。樣品用蒸餾水洗滌，然后在4°C下用5滴2%乙酸雙氧鈾(UA)染色20分鐘。用蒸餾水洗滌后，在4°C下將染色樣品各用50%、70%和90%乙醇遞增脫水10分鐘，然后更換3次100%乙醇進行完全脫水。將樣品與環(huán)氧丙烷溫育5分鐘(用于置換)，并在環(huán)氧丙烷中的50%環(huán)氧樹脂中包埋60分鐘，接著在100%環(huán)氧樹脂中包埋并在60°C下硬化過夜。切下厚度為70-80nm的超薄切片，在IOOkV電子顯微鏡中利用CXD攝影機進行觀察。11. M團的生長速度為了計算人成纖維細胞部分和H-MSC部分兩者來源的M團中細胞群倍增時間，將團塊各轉(zhuǎn)移到96孔板中，用胰蛋白酶處理15分鐘，接著用玻璃微量移液管吸打。統(tǒng)計各孔中的細胞數(shù)。在預(yù)定時間點(第1、3、5、7、9、10、11、12、13和14天)對至少20-30個M團進行分析。 12. RT-PCR采用未處理細胞部分(24孔板，約10，000個細胞/孔)和人成纖維細胞部分和H-MSC部分(24孔板，約10，000個細胞/孔)兩者來源的單一 M團(1_3個循環(huán))體外分化的細胞。采用 NucleoSpin RNA XS (Macherey-Nagel)提取并純化總 RNA。采用 SuperScriptVILO cDNA合成試劑盒(Invitrogen)形成第一鏈cDNA。使用設(shè)計的合適引物和ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Bio Inc.)進行PCR反應(yīng)。所用引物如下。米用NucleoSpin RNA XS (Macherey-Nagel)提取并純化總 RNA。米用 SuperScriptVILO cDNA Synthesis試劑盒(Invitrogen)產(chǎn)生第一鏈cDNA。使用設(shè)計的合適引物和ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Bio Inc.)進行PCR反應(yīng)。作為陽性對照，對于甲胎蛋白引物使用人胎肝(Clonetech)，對于其它引物使用人完整胚。13.定量 PCR(Q-PCR)采用RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH)從未處理細胞部分、富含Muse的細胞部分及人成纖維細胞-I、人成纖維細胞_2、H-MSC-I和H-MSC-2來源的M團中收集總RNA，采用RT2 First Strand Kit (SA Biosciences)合成 cDNA。訂制引物購自 SA Biosciences, DNA用7300實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)通過定量PCR擴增。數(shù)據(jù)應(yīng)用Λ Λ Ct方法處理(Livak KJ 等，Methods 25 :402-408, 2001)。14. DNA微陣列分析使用未處理細胞部分、富含Muse的細胞部分及人成纖維細胞_1、人成纖維細胞-2、H-MSC-I和H-MSC-2來源的M團以及獲自4名健康志愿者的人外周單核細胞的混合物?？?RNA采用 RNeasy Mini Kit (Qiagen)收集，并用 DNA微陣列(TaKaRa Bio Inc.)分析。陣列信號應(yīng)用Affymetrix Expression Console VI. I軟件處理并歸一化。應(yīng)用PathwayStudio 6. O (Ariadne Genomics)將差異表達基因指派到Gene Ontology中的功能類別中。通過 MeV4(Saeed Al 等，Biotechniques 34(2) =374-378,2003)用平均連鎖聚類以根據(jù)差異表達基因的歐幾里得距離進行分級群聚(Hierarchical clustering)。15.端粒酶活性的檢測
使用富含Muse的細胞部分及人成纖維細胞部分和H-MSC部分來源的M團以及Hela細胞。采用TRAPEZE XL端粒酶檢測試劑盒(Millipore)和Ex Taq聚合酶(TaKaRaBio Inc.)檢測端粒酶活性。用微板讀數(shù)器(Tecan)測定熒光強度。16.亞硫酸氫鹽測序采用CpGenome DNA修飾試劑盒(Chemicon)對未處理細胞部分、富含Muse的細胞部分或人成纖維細胞部分和H-MSC部分來源的M團的基因組DNA(Iyg)進行處理。采用QIAquick柱(Qiagen)對DNA進行純化。人0ct3/4和Nanog基因的啟動子區(qū)通過PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物亞克隆至pCR2. I-TOPO0使用M13通用引物通過測序驗證了各樣品多達10個克隆，從而檢出各啟動子區(qū)的甲基化。披露于Shimazaki T等，EMBO J, 12 =4489-4498,1993的引物用于PCR擴增。17.從人骨髓穿刺液形成M團健康供體的3份人骨髓穿刺液購自ALLCELLS。單核細胞部分采用Lymphopr印 Tube (Axis-Shield PoC AS)收集，并如上所述直接(不包括胰蛋白酶培養(yǎng))或8小時LTT后進行MC培養(yǎng)。第7天統(tǒng)計M團。18. MACS 分選首先使3名健康供體的人骨髓穿刺液(ALLCELLS)的單核細胞部分與微珠綴合的抗CD105抗體反應(yīng)后，采用MS Columns (Miltenyi Biotech)分選。收集CD105(+)細胞作為部分I (間充質(zhì)細胞群)。將⑶105 (-)細胞與微珠綴合的抗⑶34和抗⑶117抗體的混合物一起溫育，再次分選得到CD34(+)/CD117(+)細胞(部分2，相當于造血干細胞群)和CD105(-)/CD34(-)/CDl 17(-)細胞(部分3)(圖4)。對由此收集的樣品進行8小時LTT，然后測定M團的形成。19.免疫組織化學小鼠睪丸用0.02M PBS中的4%低聚甲醛固定，使用低溫恒溫器切取IOym厚的切片。樣品用0.02M PBS洗滌，與含有20% BlockAce (Yukijirushi)的緩沖液一起溫育用于封閉，然后與第一抗體一起溫育用于免疫組織化學分析。所用第一抗體為平滑肌肌動蛋白抗體(I : 200, Lab Vision)、抗MAP-2抗體(I : 200, Biogenesis)和抗甲胎蛋白抗體(I 10，DAK0)。在DAPI存在下將用作第二抗體的與Alexa488或Alexa568綴合的抗兔IgG抗體和與Alexa568綴合的抗小鼠IgG抗體一起溫育。樣品用Clsi Nikon共焦顯微鏡系統(tǒng)(NikonCorporation)觀察。20.流式細胞術(shù)和細胞分選將細胞與藻紅蛋白標記的抗⑶I Ic抗體、抗⑶29抗體、抗⑶34抗體、抗⑶44抗體、抗⑶45抗體、抗⑶49f抗體、抗⑶54抗體、抗⑶71抗體、抗⑶90抗體、抗⑶105抗體、抗CD166 抗體、抗 CD271 或抗 vWF 抗體(Becton Dickinson)或與抗 SSEA-3 抗體(Millipore)一起溫育。在用抗SSEA-3抗體標記的情況下，進一步將細胞與FITC綴合的抗大鼠IgM抗體一起溫育。不含鈣和鎂的補充了 2mM EDTA和O. 5%牛血清白蛋白的O. 02M PBS用作FACS抗體稀釋液。用 FACSCalibur (Becton Dickinson)和 CellQuest 軟件或者用 FACSAria 和DIA軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。對于細胞分選，將細胞與FACS抗體稀釋液中的抗SSEA-3抗體一起溫育，并采用低流速并以4通路純度(4-way purity)分選模式通過FACSAria (BectonDickinson)進行分選。21.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)用平均值土 SEM表示。應(yīng)用ANOVA按照Bonferroni方法通過成對比較對數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果A.人成纖維細胞部分和H-MSC部分的應(yīng)激條件人成纖維細胞部分和H-MSC部分暴露于應(yīng)激條件的結(jié)果的實例見表I。將細胞暴露于應(yīng)激條件并渦旋后，利用錐蟲藍染色統(tǒng)計活細胞數(shù)，從 中計算生存率。收集存活細胞，在MC培養(yǎng)中生長7天。應(yīng)激條件2)產(chǎn)生大量死細胞，且存活細胞收集效率低。因此不可能正確測定形成的M團的數(shù)目，因此，應(yīng)激條件2)的M團的數(shù)目在表I中表不為ND(未確定的)。在測試的6種應(yīng)激條件中，人成纖維細胞部分的16小時胰蛋白酶培養(yǎng)和H-MSC部分的8小時胰蛋白酶培養(yǎng)最有效。當使用2個人成纖維細胞部分品系和4個H-MSC部分品系重復(fù)本實驗時，觀察到相同的趨勢。使用人外周單核細胞的陰性對照中無法識別M團。代表性觀察值的實例見表I。表I暴露于應(yīng)激條件后的生存率和MC培養(yǎng)中人成纖維細胞、H-MSC和人外周單核細胞的M團形成。人成纖維細胞-I
~起始細胞數(shù)應(yīng)激后生存率(％)MC培養(yǎng)中的細胞團形
成(>25 μπι)
(與存活細胞的％)
I無血清30,000757
HBSS2,000,0006ND
~3 10%FBS+低 0230,000998~
4Tryp 3x1 小時 2,000,0000.36
~5 LTT 8 小時2,000,000 15
~6 LTT16 小時500,000520H-MSC-I
"Τ 無血清30,000445
~2HBSS2,000,0002ND
~310%FBS+低 02300,000998
~4Tryp 3 x I 小時380,000099
~5LTT 8 小時380,0001021
~6LTT16 小時500,000314人外周單核細胞
權(quán)利要求
1.一種SSEA-3(+)多能干細胞，其可從機體組織中分離。
2.權(quán)利要求I的多能干細胞，其為⑶105陽性的。
3.權(quán)利要求I或2的多能干細胞，其為⑶117陰性和⑶146陰性的。
4.權(quán)利要求I或2的多能干細胞，其為⑶117陰性、⑶146陰性、NG2陰性、⑶34陰性、vffF陰性和⑶271陰性的。
5.權(quán)利要求I或2的多能干細胞，其為⑶34陰性、⑶117陰性、⑶146陰性、⑶271陰性、NG2陰性、vWF陰性、SoxlO陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrpl陰性和Dct陰性的。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的多能干細胞，其具有低的端粒酶活性或無端粒酶活性。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的多能干細胞，其能夠分化成三胚層。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的多能干細胞，其不出現(xiàn)腫瘤性增殖。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的多能干細胞，其具有自我更新能力。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的多能干細胞，其對應(yīng)激有抗性。
11.權(quán)利要求ι- ο中任一項的多能干細胞，其具有高吞噬能力。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的多能干細胞，其對下列22種氣味受體的至少一種呈陽性 嗅覺受體，家族8，亞家族G，成員2(0R8G2)； 嗅覺受體，家族7，亞家族G，成員3(0R7G3)； 嗅覺受體，家族4，亞家族D，成員5(0R4D5)； 嗅覺受體，家族5，亞家族AP，成員2 (0R5AP2)； 嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員4(0R10H4)； 嗅覺受體，家族10，亞家族T，成員2(0R10T2)； 嗅覺受體，家族2，亞家族M，成員2(0R2M2)； 嗅覺受體，家族2，亞家族T，成員5(0R2T5)； 嗅覺受體，家族7，亞家族D，成員4 (0R7D4)； 嗅覺受體，家族I，亞家族L，成員3(0R1L3)； 嗅覺受體，家族4，亞家族N，成員4 (0R4N4)； 嗅覺受體，家族2，亞家族A，成員7(0R2A7)； 鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)，α激活活性多肽，嗅覺型(GNAL)； 嗅覺受體，家族6，亞家族Α，成員2(0R6A2)； 嗅覺受體，家族2，亞家族B，成員6 (0R2B6)； 嗅覺受體，家族2，亞家族C，成員1(0R2C1)； 嗅覺受體，家族52，亞家族A，成員1(0R52A1)； 嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員3(0R10H3)； 嗅覺受體，家族10，亞家族H，成員2(0R10H2)； 嗅覺受體，家族51，亞家族E，成員2(0R51E2)； 嗅覺受體，家族5，亞家族P，成員2(0R5P2);和 嗅覺受體，家族10，亞家族P，成員I (0R10P1)。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的多能干細胞，其對下列5種趨化因子受體的至少一種呈陽性趨化因子(C-C基序)受體5 (CCR5)； 趨化因子(C-X-C基序)受體4(CXCR4)； 趨化因子(C-C基序)受體I(CCRl)； 達菲血型，趨化因子受體(DARC);和 趨化因子(C-X-C基序)受體7 (CXCR7)。
14.權(quán)利要求1-13中任一項的多能干細胞，其來源于中胚層組織或間充質(zhì)組織。
15.—種細胞團或細胞部分，其含有權(quán)利要求1-14中任一項的多能干細胞。
16.一種用于從機體組織分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，所述方法使用下列性質(zhì)(i)-(vi)中的至少一種作為指標(i)SSEA-3 陽性；(ii)CD105陽性； (iii)CD117陰性和 CD146 陰性； (iv)⑶117陰性、⑶146陰性、NG2陰性、⑶34陰性、vWF陰性和⑶271陰性； (v)CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、SoxlO陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrpl陰性和Dct陰性；和 (vi)端粒酶活性低或無端粒酶活性。
17.一種用于分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，所述方法包括將機體組織來源的細胞暴露于細胞應(yīng)激中，然后收集存活細胞。
18.權(quán)利要求17的用于分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，其中細胞應(yīng)激選自蛋白酶處理、低氧條件下培養(yǎng)、低磷酸鹽條件下培養(yǎng)、血清饑餓條件下培養(yǎng)、糖饑餓狀態(tài)下培養(yǎng)、輻射暴露下培養(yǎng)、熱激暴露下培養(yǎng)、有毒物質(zhì)存在下培養(yǎng)、活性氧存在下培養(yǎng)、機械刺激下培養(yǎng)和壓力處理下培養(yǎng)。
19.權(quán)利要求18的用于分離多能干細胞或多能細胞部分的方法，其中所述細胞應(yīng)激為胰蛋白酶培養(yǎng)。
20.一種多能干細胞，其是由權(quán)利要求1-14中任一項的多能干細胞衍生或誘導(dǎo)的細胞。
21.一種分化細胞，其是由權(quán)利要求1-14中任一項的多能干細胞衍生或誘導(dǎo)的細胞。
22.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-14和20中任一項的多能干細胞。
23.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求21的多能干細胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供從機體組織直接獲得多能干細胞的方法及由此得到的多能干細胞。本發(fā)明涉及可從機體組織分離的SSEA-3(+)多能干細胞。
文檔編號C12N5/00GK102858951SQ201080041908
公開日2013年1月2日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月15日
發(fā)明者出澤真理, 藤吉好則, 鍋島陽一, 若尾昌平 申請人:出澤真理, 藤吉好則, 鍋島陽一, 若尾昌平, 北田容章