專利名稱：與疾病相關的kir單元型的測定的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子診斷的方法，更具體地，涉及測定個體的基因型，其中已知特定的基因型與疾病相關聯(lián)。
背景技術：
本發(fā)明是一種測定單個個體內(nèi)或同時被測試的多個個體的每一個內(nèi)天然殺傷細胞免疫球蛋白樣受體或“KIR”基因的序列的方法。天然殺傷細胞
天然殺傷(NK)細胞是先天免疫系統(tǒng)的一部分，是為了針對感染以及腫瘤的早期防衛(wèi)而特化的。作為它們殺傷腫瘤細胞靶點的能力的結果首次發(fā)現(xiàn)了 NK細胞。不同于細胞溶解性T細胞，NK細胞可以以非主要組織相容性復合體(非-MHC)限制性的方式殺傷靶點。作為先天免疫系統(tǒng)的重要部分，NK細胞占人體中總循環(huán)淋巴細胞的約10%。由于它們殺傷其他細胞的能力，NK細胞通常處于緊密的控制之下。身體中的所有正常細胞在它們的表面表達MHC I類分子。這些分子保護正常細胞免于被NK細胞殺傷，因為它們充當NK細胞上存在的許多受體的配體。在它們的表面缺乏足夠的I類MHC的細胞被NK細胞識別為“異常的”并被殺傷。與殺傷異常細胞同時地，NK細胞也引發(fā)細胞因子應答。天然殺傷細胞構成了對抗癌癥和病毒感染的快速響應力量。這些特化的白細胞起源于骨髓，在血液中循環(huán)，在脾臟和其他淋巴組織中濃縮。NK細胞的活性關鍵在于人類白細胞抗原(HLA)蛋白質(zhì)的子集，所述蛋白質(zhì)在健康細胞的表面上出現(xiàn)，但是在病毒和癌癥削弱的細胞上脫落。HLA蛋白質(zhì)由主要組織相容性復合體(MHC)基因編碼。當NK細胞遭遇缺乏 HLA蛋白質(zhì)的細胞時，它們攻擊并破壞這些細胞，從而防止細胞進一步傳播病毒或癌癥。NK 細胞通過它們的保護性應答的迅速性和廣度不同于其他免疫系統(tǒng)細胞。其他白細胞更慢地起作用，并且靶向特定的病原體——癌癥、病毒或細菌，而不是一般受損的細胞。KIR 某因
天然殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因家族是編碼天然殺傷(NK)細胞上存在的重要蛋白質(zhì)的幾種受體家族之一。MR基因的子集，即抑制性KIR與I類HLA分子相互作用，I類HLA分子是在人類MHC內(nèi)編碼的。這樣的相互作用容許NK細胞與身體的其他細胞之間的通信，所述其他細胞包括正常的、病毒感染的或癌性的細胞。NK細胞上的IQR分子與所有其他細胞上的I類HLA分子之間的這種通信幫助確定身體內(nèi)的細胞是否被NK細胞識別為自身的或是非自身的。被認為“非自身的”細胞被NK細胞靶向殺傷。KIR基因和蛋白質(zhì)結構
KIR 基因家族由 16 種基因組成(JIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、 KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、 KIR3DL3、KIR2DP1 MKIR3DP1)。MR基因簇位于染色體19上定位的白細胞受體復合體 (LRC)的 100-200kb 區(qū)域內(nèi)(19ql3. 4) (Trowsdale J. (2001) Genetic and functional relationships between MHC and NK receptor genes. Immunity, Sep ;15(3):363_374)?；驈秃象w被認為是通過哺乳動物和嚙齒動物之間的進化分離之后發(fā)生的基因多重化 (duplication)事件而出現(xiàn)(Barten R. , et al. (2001) Divergent and convergent evolution of NK-cell receptors. Trends Immunol. , Jan ；22 (1):52_57)。KIR 基因以頭對尾的方式排列，除了 3DP1和2DL4之間的一個14 kb序列之外，僅2. 4 kb的序列來分隔基因。由于MR基因通過基因多重化而出現(xiàn)，它們在序列上是非常相似的，相互顯示了 90-95%的同一性。人類個體在他們所遺傳的MR基因的數(shù)量和類型方面不同；個體和種群內(nèi)的 KIR 基因型可以是十分不同的(Parham P. (2005) Immunogenetics of killer cell immunoglobulin-like receptors. Molecular immunology, Feb ；42 (4) :459-462 ；禾口 Single RM, et al. (2007) Global diversity and evidence for coevolution of KIR and HLA, Nature genetics, Sep ；39 (9) : 1114-1119)。在染色體水平上，存在著兩種截然不同的KIR單元型(參見附

圖1，改編自Martin ei a人Immunogenetics. (2008) Dec ； 60 (12) :767-774)。A單元型除了 2DS4之外不含有刺激基因(2DS和3DS1)，沒有2DL5基因并且沒有2DL2基因。B單元型在基因內(nèi)容上是更為可變的，不同的B單元型含有不同數(shù)量的刺激基因，一個或兩個2DL5基因，等等(Martin MP, et al. (2008) KIR haplotypes defined by segregation analysis in 59 Centre d' Etude Polymorphisme Humain(CEPH) families. Immunogenetics, Dec ；60 (12) :767—774.)。所有的KIR蛋白質(zhì)都錨定在細胞膜上，具有兩個或三個細胞外免疫球蛋白樣結構域和細胞質(zhì)的尾部。九種MR基因(IQR2DL和IQR3DL)編碼具有長的細胞質(zhì)尾部的蛋白質(zhì)，其含有基于酪氨酸的免疫抑制性基序(ITIM)。當細胞外結構域與它的配體接觸時，這些KIR蛋白質(zhì)可以向天然殺傷細胞發(fā)送抑制性信號。其余MR基因編碼具有短的細胞質(zhì)尾部的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)通過銜接分子樣DAP12發(fā)送激活信號。(Snyder MR et al.廣2004) Stimulatory killer Ig-Iike receptors modulate T cell activation through DAP12_dependent and DAP12_independent mechanisms. J Immunol. Sep 15 ； 173 (6) :3725-3731 ；和 Carr WH et aL (2007) Cutting Edge: KIR3DS1，a gene implicated in resistance to progression to AIDS, encodes a DAP12_associated receptor expressed on NK cells that triggers NK cell activation. J Immunol. Jan 15 ；178 (2) :647-651)o在附圖2中顯示了 IQR受體結構和每種IQR受體的I類HLA配體的同一性。 (改編自Parham P. et al. , Alloreactive killer cells hindrance and help for hematopoietic transplants. Nature Rev. Immunology. (2003) 3:108-122)。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)的命名描述了細胞外免疫球蛋白樣結構域的數(shù)量(2D或3D)以及細胞質(zhì)尾部的長度(L是長的，S是短的)。每種免疫球蛋白樣結構域用圓圈表示，細胞質(zhì)尾部中每個基于免疫受體酪氨酸的抑制性基序(ITIM)用長方形表示，并且跨膜區(qū)域中每個帶正電的殘基用菱形表示。刺激性MR用斜體表示(Parham P. et al. , Alloreactive killer cells hindrance and help for hematopoietic transplants. Nature Rev. Immunology. (2003) 3:108-122)。IQR和它們的I類HLA配體之間相互作用的強度可以取決于IQR序列和HLA序列兩者。雖然HLA區(qū)域已經(jīng)被研究了超過40年，KIR分子在1990年代中期才被首次描述(作為 NKB1) (Lanier et al. (1995) The NKBl and HP-3E4 NK cells receptors arestructurally distinct glycoproteins and independently recognize polymorphic HLA-B and HLA-C molecules. J Immunol. Apr 1 ；154(7):3320-3327 以及 Litwin V. et al. (1994) NKBl: a natural killer cell receptor involved in the recognition of polymorphic HLA-B molecules. J Exp Med. Aug 1 ;180(2):537_543)。發(fā)現(xiàn)的第一年主要致力于描述不同的MR基因，并且開發(fā)了一些方法來測定個體的IQR基因型。利用這些方法，已經(jīng)顯示了 MR基因與自身免疫性疾病和同種異體造血細胞移植之后接受者存活之間 Wffi^ft (Parham P. (2005)MHC class I molecules and KIRs in human history, health and survival. Nature reviews, Mar ；5 (3) : 201-214)。現(xiàn)在清楚的是，每種 KIR 基因具有超過一種序列；也就是說，由于單核苷酸多態(tài)性(SNP)、以及某些情況下編碼序列內(nèi)的插入或刪除，每種MR基因具有可變的序列。研究顯示，IQR3DL1多態(tài)性可能不僅影響KIR3DL1 在天然殺傷細胞上的表達水平，還影響MR3DL1與它的配體的結合親和性(Gardiner CM et al. (2001) Different NK cell surface phenotypes defined by the DX9 antibody are due to KIR3DL1 gene polymorphism. J Immunol. Mar 1 ；166(5):2992-3001 ；Pando MJ et al. (2003) The protein made from a common allele of KIR3DL1 (3DL1*004) is poorly expressed at cell surfaces due to substitution at positions 86 in Ig domain 0 and 182 in Ig domain 1. J Immunol. Dec 15 ； 171(12):6640-6649 ；0' Connor GM, et al.(2007)Functional polymorphism of the KIR3DL1/S1 receptor on human NK cells. J Immunol. Jan 1 ；178 (1): 235—241 ；以及 Thananchai H et al. (2007)Cutting Edge: Allele-specific and peptide-dependent interactions between KIR3DL1 and HLA-A and HLA-B. J Immunol Jan 1 ；178 (1) : 33-37)。
KIR與疾病的相關性
設計以研究KIR在人類疾病中的作用的研究顯示了各種IQR基因與病毒感染例如 CMV、HCV和HIV、自體免疫疾病、癌癥和先兆子癇的相關性(Parham P. (2005)MHC class I molecules and KIRs in human history, health and survival. Nature reviews, Mar ； 5 (3) :201-214)。在關于對炎癥性自體免疫性腸病克羅恩病的遺傳易感性的新近研究中發(fā)現(xiàn)，KIR2DL2與IQR2DL3雜合以及C2配體純合的患者對疾病敏感，而Cl配體是保護性的。(Hollenbach JA et al. (2009) Susceptibility to Crohn's Disease is mediated by KIR2DL2/KIR2DL3 heterozygosity and the HLAC ligand. Immunogenetics. Oct ；61 (10):663-71)。關于IQR和急性骨髓性白血病(AML)的非親緣造血細胞移植(HCT)的其他研究顯示了與A/A供體相比，B/x供體的顯著更高3年的總體存活率以及無復發(fā)風險存活方面 30%的) 體改善(Cooley S， et al. (2009)Donors with group B KIR haplotypes improve relapse-free survival after unrelated hematopoietic cell transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. Jan 15 ；113 (3) :726-732 ；禾口 Miller JSj et al. (2007) Missing KIR-Iigands is associated with less relapse and increased graft versus host diseaseCGVHD)following unrelated donor allogeneic HCT. Blood, 109 (11):5058-5061)。已經(jīng)根據(jù)對患者與對照的MR基因型的認識進行了這樣的研究，但是沒有對等位基因水平的MR進行該研究。已經(jīng)顯示了許多特定的HLA等位基因在人類疾病中是重要的(例如，HLA-DR3和HLA-DR4與I型糖尿病相關，HLA-DR8與青年類風濕性關節(jié)炎相關)，在等位基因水平上分型KIR的能力將細化將KIR與人類疾病相關的研究。
發(fā)明概述
本發(fā)明是并行測定關于一個或更多個個體的MR基因型的方法，所述方法包括對于每個個體，用正向引物和反向引物進行擴增反應，每種引物包含銜接子序列、個體識別序列以及KIR雜交序列，以擴增包含多態(tài)性位點的MR基因外顯子序列，來獲得KIR擴增子；合并(pooling)第一步驟中獲得的來自超過一個個體的MR擴增子；進行乳劑PCR;利用并行的焦磷酸測序測定關于每個個體的每個KIR擴增子的序列；以及通過將前述步驟中測定的 MR擴增子的序列與已知的IQR序列比較來確定哪種IQR等位基因存在于個體中，為每個個體指定KIR等位基因。在某些實施方式中，所述方法進一步包括測定每個個體中存在的KIR單元型。在某些實施方式中，所述方法的第一步驟進一步包括測定所述KIR擴增子的濃度。在某些實施方式中，至少一種引物具有選自表2的KIR結合區(qū)的序列。在某些實施方式中，至少一種引物具有選自表3的個體識別標簽。在其他實施方式中，所述方法進一步包括當在個體中發(fā)現(xiàn)某些KIR等位基因時確定個體傾向于先兆子癇或自身免疫性疾病、或者個體是適合的非親緣造血干細胞供體的步驟。在此，所述方法進一步包括當在指定步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因KIRDLl時確定個體傾向于先兆子癇的步驟。在其他實施方式中，所述方法進一步包括當在指定步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因 KIR2DS1時確定個體傾向于自身免疫性疾病的步驟。在又其他的實施方式中，所述方法進一步包括當在指定步驟中發(fā)現(xiàn)B組IQR等位基因時確定個體是適合的非親緣造血干細胞供體的步驟。在其他實施方式中，所述方法進一步包括測定個體的HLA基因型的步驟。在又其他的實施方式中，在測定個體的HLA基因型的步驟之后，所述方法進一步包括當在個體中發(fā)現(xiàn)與某些HLA等位基因組合的某些KIR等位基因時確定個體傾向于清除HCV感染、減緩 HIV感染向AIDS或克羅恩病發(fā)展的步驟。在此，所述方法進一步包括當在指定步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因KIRDLl以及在HLA基因分型步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因HLA-Cl時確定個體傾向于清除 HCV感染的步驟。在其他實施方式中，所述方法進一步包括當在指定步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因 KIR3DS1以及在HLA基因分型步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因HLA_Bw4時確定個體傾向于減緩HIV感染向AIDS發(fā)展的步驟。在又其他的實施方式中，所述方法進一步包括當在指定步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因MR2DL2和IQR2DL3以及在HLA基因分型步驟中發(fā)現(xiàn)等位基因HLA-C2時確定個體傾向于克羅恩病的步驟。在其他實施方式中，本發(fā)明是用于獲得MR擴增子來并行測定一個或更多個個體中IQR基因型的試劑盒，包含包含銜接子區(qū)域、個體識別標簽和MR雜交區(qū)域的正向引物；包含銜接子區(qū)域、個體識別標簽和MR雜交區(qū)域的反向引物。在試劑盒的某些實施方式中，至少一種引物包含選自表2的IQR雜交序列。在試劑盒的某些實施方式中，至少一種引物包含選自表3的個體識別標簽。在某些實施方式中，所述試劑盒進一步包含具有附著的
引物的珠子的一種或更多種群體，所述引物能夠與所述正向和反向引物中的銜接子區(qū)域雜 、-父。在其他實施方式中，本發(fā)明是用于獲得MR擴增子來并行測定一個或更多個個體中MR基因型的反應混合物，包含一組引物，所述引物包括包含銜接子區(qū)域、個體識別標簽和IQR雜交區(qū)域的正向引物；以及包含銜接子區(qū)域、個體識別標簽和IQR雜交區(qū)域的反向引物。在反應混合物的某些實施方式中，至少一種引物包含選自表2的KIR雜交序列。在反應混合物的某些實施方式中，至少一種引物包含選自表3的個體識別標簽。在某些實施方式中，所述反應混合物進一步包含具有附著的引物的珠子的一種或更多種群體，所述引物能夠與所述正向和反向引物中的銜接子區(qū)域雜交。附圖簡述
圖1是KIR單元型的示意圖。圖2是KIR受體的結構以及它們的I類HLA配體的同一性的示意圖。圖3圖示了所有MR基因的外顯子5的前半序列的核苷酸比對。圖4圖示了所有IQR基因的外顯子5的后半序列的核苷酸比對。發(fā)明詳述 I.定義
術語“等位基因”是指基因的序列變體。至少一個遺傳學的差異可以構成等位基因。對于KIR基因，一般多個遺傳學差異構成等位基因。術語“擴增子”是指核酸分子，其含有目標核酸序列的全部或片段，并且其是作為任何適合的擴增方法的體外擴增的產(chǎn)物形成的。術語“多態(tài)性”是指一種情況，其中特定核苷酸序列、或編碼的氨基酸序列的兩種或更多種變體可以在群體中找到。多態(tài)性位置是指在核酸中發(fā)生區(qū)分變體的多態(tài)性核苷酸的位置?！皢魏塑账岫鄳B(tài)性”或SNP是指由單個核苷酸組成的多態(tài)性位點。術語“單元型”是指在個體中同一染色體上不同位置(座位或基因)處的等位基因的組合。對于特定的基因，術語“基因型”是指個體或樣品中含有的基因的等位基因的總和。術語“測定” MR基因的“基因型”是指測定受試者中存在的IQR基因的個體等位基因中存在的多態(tài)性。術語“目標區(qū)域”或“目標序列”是指樣品中要研究的多核苷酸序列。在本發(fā)明的上下文中，目標序列是來自個體的樣品中含有的MR基因序列。術語“寡核苷酸”是指短核酸，一般長度十個或更多個核苷酸。寡核苷酸通過本領域已知的任何適合的方法來制備，例如，在Narang et al. (1979)ifeiA Enzymo 1. 68:90-99 ;Brown et al. (1979)ifeiA Enzymol. 68:109-151 ;Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 ；Matteucci et al. (1981)/. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191中描述的直接化學合成；或本領域已知的任何其他方法。術語“引物”是指寡核苷酸，其能夠作為沿著模板核酸的互補鏈的核酸合成的起始點。與模板核酸的子序列至少部分互補的引物一般足以與模板核酸雜交和發(fā)生延伸。雖然任選地使用其他的引物長度，引物一般包含長度約6到約100個核苷酸范圍的雜交區(qū)域，最通常地長度在15到35個核苷酸之間。用于給定目標序列擴增的適合引物的設計是本領域公知的，并且在此處引用的文獻中描述。用于平行克隆擴增和測序的適合引物的設計在例如美國申請
發(fā)明者D.古德里奇, E.特拉赫特滕伯格, G.本特利, H.A.埃爾利希, M.拉德納 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司