專利名稱：增加植物中多肽表達(dá)的翻譯增強(qiáng)子元件堆疊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及植物分子生物學(xué)，特別是增加植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組合物和方法。電子方式提交的序列表引用序列表正式文本通過EFS-Web電子方式提交，以ASCII格式序列表的文件名為“42473SEQ Listing_ST25. txt”，創(chuàng)建于2010年9月2日，文本大小17kb，并與說明書同時(shí) 提交。此ASCII格式的文件中所含的序列表是本說明書的一部分，它以其整體通過引用而構(gòu)成本文的一部分。
背景技術(shù)：
植物基因工程的進(jìn)展已經(jīng)能夠生產(chǎn)出具有農(nóng)藝學(xué)理想性狀的植物，而且還擁有了充當(dāng)有效的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的能力。這些進(jìn)展取決于編碼一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)多肽的重組多核苷酸構(gòu)建體在其所導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因植物中的正確表達(dá)。以前的工作提供了許多調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、內(nèi)含子和翻譯前導(dǎo)肽序列，它們益于影響這些重組多核苷酸構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。然而，許多原先確定的調(diào)控元件無法提供完全實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中選定基因?qū)氡磉_(dá)的預(yù)期效益所需的重組蛋白表達(dá)的水平。因此，仍然迫切需求的是，能夠擁有介導(dǎo)植物中所需多肽的高水平表達(dá)的新型調(diào)控元件和調(diào)控元件組合。小結(jié)本文提供了增加目標(biāo)多肽在植物及其植物部分中表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明的組合物是多核苷酸構(gòu)建體，其包括(a)至少一種源自病毒的翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種源自細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。本發(fā)明還提供了包含這些多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)盒、載體以及轉(zhuǎn)基因植物和植物部分。一種或多種翻譯增強(qiáng)子元件可以是與目標(biāo)多肽異源的。異源是指并非來自所表達(dá)目標(biāo)多肽的前導(dǎo)肽序列(5’UTR)的序列。本發(fā)明的方法包括將有效連接至在植物細(xì)胞中是功能性的啟動(dòng)子的本發(fā)明多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物或其植物部分的方法。在適于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)的培養(yǎng)條件下，串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件為所涉及的mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯提供了更高的效率。因此，本發(fā)明提供了目標(biāo)多肽在植物及其植物部分中表達(dá)的增加。本發(fā)明包括下列實(shí)施例。I. 一種多核苷酸構(gòu)建體，包括(a)至少一種源自病毒的翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種源自細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。2.實(shí)施例I的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒是植物病毒。3.實(shí)施例2的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒是RNA病毒。
4.實(shí)施例3的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為第IV組(+ ) ssRNA病毒的成員，并且其中源自所述病毒的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含所述病毒的前導(dǎo)肽序列(5’ UTR)。5.實(shí)施例4的多核苷酸構(gòu)建體,其中所述病毒為煙草花葉病毒(Tobamovirus)屬的成員，或選自馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)和蕃爺叢矮病毒科(Tombusviridae)的科的成員。6.實(shí)施例5的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒選自煙草花葉病毒(TMV)、煙草蝕紋病毒(TEV)、苜?；ㄈ~病毒(AMV)和玉米壞疽線條病毒(MNeSV)。7.實(shí)施例6的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為TMV，并且其中源自所述TMV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO: I中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO: I中所示的序列具有至少95%的序列同一性。8.實(shí)施例6的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為TEV，并且其中源自所述TEV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 18中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性·片段或變體，其中所述變體與SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 18中所示的序列具有至少95%的序列同一性。9.實(shí)施例6的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為AMV或麗eSV，并且其中源自所述AMV或所述麗eSV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19中所示的序列具有至少95%的序列同一性。10.任何實(shí)施例1-9的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞基因?yàn)閼?yīng)激反應(yīng)基因。11.實(shí)施例10的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因是選自醇脫氫酶基因和熱休克蛋白基因。12.實(shí)施例11的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述醇脫氫酶基因來自單子葉植物或雙子葉植物。13.實(shí)施例12的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述醇脫氫酶基因是來自煙草、水稻、擬南芥(Arabidopsis )、大豆或玉米。14.實(shí)施例13的多核苷酸構(gòu)建體，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID N0:4中所示的煙草醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少95%的序列同一性。15.實(shí)施例13的多核苷酸構(gòu)建體，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO:5中所示的水稻醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:5中所示的序列具有至少95%的序列同一性。16.實(shí)施例13的多核苷酸構(gòu)建體，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID N0:6中所示的擬南芥醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:6中所示的序列具有至少95%的序列同一性。17.實(shí)施例13的多核苷酸構(gòu)建體，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO:7中所示的玉米醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:7中所示的序列具有至少95%的序列同一性。18.實(shí)施例11的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述熱休克蛋白基因來自單子葉植物或雙子葉植物。
19.實(shí)施例18的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述熱休克蛋白基因來自玉米、大豆或矮牽牛。20.實(shí)施例19的多核苷酸構(gòu)建體，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO:5中所示的玉米熱休克蛋白101的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:5中所示的序列具有至少95%的序列同一性。21.實(shí)施例1-20中任一項(xiàng)的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述有效連接的多核苷酸編碼賦予表型的多肽，所述表型選自昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、非生物脅迫抗性、修飾的酶表達(dá)譜、改良的含油量及改良的營養(yǎng)含量。22.包含實(shí)施例1-21中任一項(xiàng)的多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)盒。23.實(shí)施例22的表達(dá)盒，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子，并且其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型啟動(dòng) 子。24.包含實(shí)施例I的多核苷酸構(gòu)建體或?qū)嵤├?2的表達(dá)盒的植物。25.實(shí)施例24的植物，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。26.實(shí)施例25的植物，其中所述植物選自水稻、大麥、馬鈴薯、甘薯、卡諾拉油菜、向日葵、黑麥、燕麥、小麥、玉米、大豆、甜菜、煙草、芒草、柳枝稷、紅花、樹、棉花、木薯、番爺、高粱、苜蓿和甘蔗。27.實(shí)施例24-26中任一項(xiàng)的植物，其中所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒被穩(wěn)定整合入植物基因組內(nèi)，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。28.實(shí)施例24-27中任一項(xiàng)的植物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括穩(wěn)定整合入其基因組內(nèi)的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。29.實(shí)施例24-28中任一項(xiàng)的植物種子，其中所述種子包括穩(wěn)定整合入其基因組內(nèi)的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。30. 一種增加目標(biāo)多肽在植物或其植物部分中表達(dá)的方法，所述方法包括將多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物或所述植物部分中，所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子，其中所述多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一種源自病毒的翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種源自細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼所述目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。31.實(shí)施例30的方法，其中所述病毒是植物病毒。32.實(shí)施例31的方法，其中所述病毒是RNA病毒。33.實(shí)施例32的方法，其中所述病毒為第IV組(+ ) ssRNA病毒的成員，并且其中源自所述病毒的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含所述病毒的前導(dǎo)肽序列(5’ UTR)。34.實(shí)施例33的方法,其中所述病毒為煙草花葉病毒(Tobamovirus)屬的成員，或者選自馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)和蕃爺叢矮病毒科(Tombusviridae)的科的成員。35.實(shí)施例34的方法，其中所述病毒選自煙草花葉病毒(TMV)、煙草蝕紋病毒(TEV)、苜蓿花葉病毒(AMV)和玉米壞疽線條病毒(MNeSV)。36.實(shí)施例35的方法，其中所述病毒為TMV，并且源自所述TMV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO: I中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體,其中所述變體與SEQID NO: I中所示的序列具有至少95%的序列同一性。37.實(shí)施例35的方法，其中所述病毒為TEV，并且源自所述TEV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 18中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 18中所示的序列具有至少95%的序列同一性。38.實(shí)施例35的方法，其中所述病毒為AMV或^eSV,并且源自所述AMV或所述MNeSV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID N0:3或SEQ ID NO: 19中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID N0:3或SEQ ID NO: 19中所示的序列具有至少95%的序列同一性。
39.任何實(shí)施例30-38的方法，其中所述細(xì)胞基因是應(yīng)激反應(yīng)基因。40.實(shí)施例39的方法，其中所述細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因選自醇脫氫酶基因和熱休克蛋白基因組合物。41.實(shí)施例40的方法，其中所述醇脫氫酶基因來自單子葉植物或雙子葉植物。42.實(shí)施例41的方法，其中所述醇脫氫酶基因來自煙草、水稻、擬南芥(Arabidopsis )、大豆或玉米。43.實(shí)施例42的方法，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ IDN0:4中所示的煙草醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQID NO:4中所示的序列具有至少95%的序列同一性。44.實(shí)施例42的方法，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ IDNO:5中所示的水稻醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQID NO:5中所示的序列具有至少95%的序列同一性。45.實(shí)施例42的方法，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ IDN0:6中所示的擬南芥(Arabidopsis)醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:6中所示的序列具有至少95%的序列同一性。46.實(shí)施例42的方法，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ IDNO:7中所示的玉米醇脫氫酶的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQID NO:7中所示的序列具有至少95%的序列同一性。47.實(shí)施例40的方法，其中所述熱休克蛋白基因來自玉米、大豆或矮牽牛。48.實(shí)施例47的方法，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ IDNO:5中所示的玉米熱休克蛋白101的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO:5中所不的序列具有至少95%的序列同一性。49.實(shí)施例30-48中任一項(xiàng)的方法，其中所述有效連接的多核苷酸編碼賦予表型的多肽，所述表型選自昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、非生物脅迫抗性、修飾的酶表達(dá)譜、改良的含油量及改良的營養(yǎng)含量。50.實(shí)施例30-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型啟動(dòng)子。51.實(shí)施例30-50中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
52.實(shí)施例51的方法，其中所述植物選自水稻、大麥、馬鈴薯、甘薯、卡諾拉油菜、向日葵、黑麥、燕麥、小麥、玉米、大豆、甜菜、煙草、芒草、柳枝稷、紅花、樹、棉花、木薯、番爺、高粱、苜蓿和甘蔗。
53.實(shí)施例30-52中任一項(xiàng)的方法，其中所述多核苷酸構(gòu)建體穩(wěn)定整合至植物或其植物部分的基因組內(nèi)。54.實(shí)施例30-53中任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽在所述植物或其植物部分中的表達(dá)，與所述目標(biāo)多肽在野生型植物或其植物部分中或者在對(duì)照植物或其植物部分中的表達(dá)相比較，增加到至少2倍。55.實(shí)施例54的方法，其中所述目標(biāo)多肽在所述植物或其植物部分中的表達(dá)，與所述目標(biāo)多肽在所述野生型植物或其植物部分中或者在所述對(duì)照植物或其植物部分中的表達(dá)相比較，增加到至少4倍。56. 一種多核苷酸構(gòu)建體,包括(a)源自SEQ ID NO: I中所不的煙草花葉病毒(TMV) 5’ UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ ID NO:4中所示的煙草醇脫氫酶5’ UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。57. 一種增加目標(biāo)多肽在植物或其植物部分中表達(dá)的方法，所述方法包括導(dǎo)入一種多核苷酸構(gòu)建體，其包括(a)源自SEQ ID NO: I中所示的煙草花葉病毒(TMV) 5’ UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ IDNO:4中所示的煙草醇脫氫酶5’UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。59. 一種多核苷酸構(gòu)建體，包括(a)源自SEQ ID NO:3中所述的苜蓿花葉病毒(AMV) 5’ UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ ID NO:4中所示的煙草醇脫氫酶5’ UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。60. 一種增加目標(biāo)多肽在植物或其植物部分中表達(dá)的方法，所述方法包括導(dǎo)入一種多核苷酸構(gòu)建體，其包括(a)源自SEQ ID NO: 3中所述的苜?；ㄈ~病毒(AMV) 5’ UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ ID N0:4中所示的煙草醇脫氫酶5’UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。61. 一種多核苷酸構(gòu)建體,包括(a)源自SEQ ID NO: I中所不的煙草花葉病毒(TMV)5’UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ ID NO: 7中所示的玉米須醇脫氫酶5’UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。62. 一種增加目標(biāo)多肽在植物或其植物部分中表達(dá)的方法，所述方法包括導(dǎo)入一種多核苷酸構(gòu)建體，其包括(a)源自SEQ ID NO: I中所示的煙草花葉病毒(TMV) 5’ UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ IDNO: 7中所示的玉米須醇脫氫酶5’UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。63. 一種多核苷酸構(gòu)建體，包括(a)源自SEQ ID NO: 18中所示的煙草蝕紋病毒(TEV) 5’ UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ ID N0:4中所示的煙草醇脫氫酶5’ UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。64. 一種增加目標(biāo)多肽在植物或其植物部分中表達(dá)的方法，所述方法包括導(dǎo)入一種多核苷酸構(gòu)建體，其包括(a)源自SEQ ID NO: 18中所示的煙草蝕紋病毒(TEV)5’UTR的翻譯增強(qiáng)子元件，與SEQ IDNO:4中所示的煙草醇脫氫酶5’UTR串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的啟動(dòng)子。附圖
簡(jiǎn)要說明圖I顯示了在表達(dá)盒內(nèi)單獨(dú)和串聯(lián)堆疊的煙草花葉病毒(TMV) Q 5’前導(dǎo)肽和煙草醇脫氫酶(ADH) 5’前導(dǎo)肽對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)表達(dá)的影響。當(dāng)將病毒5’前導(dǎo)肽(S卩Q) 置于細(xì)胞5’前導(dǎo)肽(即5’-ADH)上游時(shí)，可觀察到表達(dá)的增強(qiáng)。檢測(cè)了四種植物的各五種待測(cè)構(gòu)建體(不包括對(duì)照載體在內(nèi))，其中每個(gè)條形代表各植物的平均活性(X軸為EG活性(U mol/min/mg可溶性蛋白總量)；y軸為各植物)。圖2A-B也顯示了在表達(dá)盒內(nèi)單獨(dú)和串聯(lián)堆疊的煙草花葉病毒(TMV) Q 5’前導(dǎo)肽，也被稱為“Q”及煙草醇脫氫酶(ADH)5’前導(dǎo)肽對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)表達(dá)的影響。圖2A顯示了以葉鮮重計(jì)的內(nèi)切葡聚糖酶表達(dá)，而圖2B則顯示了以總可溶性蛋白計(jì)的內(nèi)切葡聚糖酶表達(dá)。當(dāng)將病毒5’前導(dǎo)肽序列(即Q )置于細(xì)胞5’前導(dǎo)肽序列(即5’ -ADH)的上游時(shí)，可觀察到表達(dá)的增強(qiáng)。檢測(cè)了三至四種植物的各五種受試構(gòu)建體(X軸為EG活性(y mol/min/g或mg) ;y軸為各構(gòu)建體)。序列表簡(jiǎn)要說明SEQ ID NO: I 為煙草花葉病毒(TMV) 5’ UTR。SEQ ID NO: 2 為煙草蝕紋病毒(TEV) 5’ UTR。SEQ ID NO: 3 為苜蓿花葉病毒(AMV) 5’UTR。SEQ ID NO:4 為煙草醇脫氫酶(ADH) 5’ UTR。SEQ ID NO:5 為水稻醇脫氫酶(ADH) 5’ UTR0SEQ ID NO:6 為擬南芥醇脫氫酶(ADH) 5’ UTR0SEQ ID NO:7 為玉米醇脫氫酶(ADH) 5’ UTR。SEQ ID N0:8 為玉米熱休克蛋白 101 (HSP101) 5’UTR。SEQ ID NO:9 為玉米熱休克蛋白 70 (HSP70) 5’ UTR0SEQ ID NO: 10 為矮牽牛熱休克蛋白 101 (HSP101) 5’UTR。SEQ ID NO: 11 為大豆熱休克蛋白 17. 9 (HSP17. 9) 5，UTR。SEQ ID NO: 12為洋丁香黃葉卷曲病毒啟動(dòng)子。SEQ ID NO: 13 為大豆 Kozak 序列。SEQ ID NO: 14為大豆球蛋白種子蛋白質(zhì)CDS。SEQ ID NO: 15為大豆優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶CDS。SEQ ID NO: 16為大豆優(yōu)化的ER滯留信號(hào)。SEQ ID NO: 17為花椰菜花葉病毒(CMV)終止子。SEQ ID NO: 18 為煙草蝕紋病毒(TEV) 5’ UTR。
SEQ ID NO: 19為玉米壞死線條病毒5’ UTR0SEQ ID NO: 20 為玉米 PEPC 啟動(dòng)子。SEQ ID N0:21為玉米Y -玉米醇溶蛋白信號(hào)序列。SEQ ID NO: 22 為玉米 Kozak 序列。SEQ ID N0:23為玉米優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶CDS。SEQ ID NO: 24為玉米優(yōu)化的ER滯留信號(hào)。SEQ ID NO: 25 為玉米 PEPC 終止子。發(fā)明詳細(xì)說明 本發(fā)明涉及增加目標(biāo)多肽在植物或其植物部分中表達(dá)的組合物和方法。組合物包括多核苷酸構(gòu)建體，其包含串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件所組合物的，這些翻譯增強(qiáng)子元件置于編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的上游(即5’端)且與之有效連接。與缺乏有效連接的、串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件的多核苷酸構(gòu)建體的多肽表達(dá)水平相比較，當(dāng)整合入具有目標(biāo)有效連接的啟動(dòng)子的表達(dá)盒時(shí)，串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件提供相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄體的翻譯功效的增加，從而增加目標(biāo)編碼多肽的表達(dá)。因此，本文介紹了制造和使用具有目標(biāo)多肽表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因植物的組合物和方法，其中轉(zhuǎn)基因植物包括包含多核苷酸構(gòu)建體的組合物的表達(dá)盒，所述多核苷酸構(gòu)建體具有至少兩種串聯(lián)堆疊的、與編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸有效連接的翻譯增強(qiáng)子元件，其中至少一種翻譯增強(qiáng)子元件是病毒來源的，而至少一種翻譯增強(qiáng)子元件為細(xì)胞來源的。本發(fā)明包括異源增強(qiáng)子的應(yīng)用。本文所述的組合物和方法可用于植物或其植物部分中增加蛋白產(chǎn)量方面有保證的應(yīng)用。這些應(yīng)用包括但不限于改善植物農(nóng)藝學(xué)性狀的代謝途徑基因操作，如增加的疾病抗性、除草劑抗性、營養(yǎng)利用和環(huán)境脅迫抗性；改變農(nóng)藝性狀的代謝途徑基因操作，如改變能夠提高動(dòng)物和人體營養(yǎng)的淀粉、油、脂肪酸或蛋白質(zhì)含量/組成的改良，提高消化率，和/或提高工藝品質(zhì)；改變發(fā)育的代謝途徑基因操作，如雄性不育癥，衰老等；以及引入藥物、工業(yè)酶等的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。多核苷酸構(gòu)建體本發(fā)明涉及提供增加的目標(biāo)多肽在植物或其植物部分中表達(dá)的多核苷酸構(gòu)建體。本文所用術(shù)語“多核苷酸構(gòu)建體”是指核苷酸的聚合物，如脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，或其修飾形式，或其以個(gè)別片段形式，或以較大構(gòu)建體的組分的形式，以單鏈或雙鏈形式。如適用根據(jù)本發(fā)明所實(shí)踐的方法目標(biāo)，則多核苷酸應(yīng)包括DNA或RNA的正義和反義多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是互補(bǔ)的DNA (cDNA)、基因組DNA、合成的DNA、或其雜交體，或RNA分子，如mRNA，其中包括非翻譯和翻譯區(qū)。本文所用術(shù)語“DNA構(gòu)建體”、“基因構(gòu)建體”、“多核苷酸”和“多核苷酸構(gòu)建體”指的是DNA和RNA分子。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。本文所用術(shù)語“有效連接的”，當(dāng)涉及與第二個(gè)核酸序列有效連接的第一個(gè)核酸序列時(shí)，是指第一個(gè)核酸序列被置于與第二個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中的情況。例如，如果啟動(dòng)子影響了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子與此編碼序列有效連接。同樣，如果信號(hào)肽影響了多肽的細(xì)胞外分泌，則該信號(hào)肽的編碼序列與此多肽的編碼序列有效連接。一般來說，有效連接的核酸序列是連續(xù)的，并在必要的情況下加入兩個(gè)蛋白編碼區(qū)，對(duì)開放閱讀框架進(jìn)行了序列比對(duì)。在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體背景下，串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件與編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸有效連接，因此功能上與其產(chǎn)生了相關(guān)性，其中串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件增加其相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯，從而提高了所編碼目標(biāo)多肽的表達(dá)。雖然并不想被任何特定的理論束縛，然而，翻譯的增加可以是由于串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件對(duì)mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的加工、mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率，或其任何組合的影響。本文所用術(shù)語“翻譯增強(qiáng)子元件”是指能夠增強(qiáng)(即增加)編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸翻譯且置于編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸上游(即相同核酸序列的5’方向)的多核苷酸。翻譯增強(qiáng)子元件被轉(zhuǎn)錄成RNA作為完全加工好的mRNA轉(zhuǎn)錄體的一部分，但它不被翻譯，并幫助(即促進(jìn))下游mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯，從而可增加所編碼的目標(biāo)多肽的表達(dá)。本發(fā)明的翻譯增強(qiáng)子元件可以包括異源序列。異源序列是指非來源于所表達(dá)目標(biāo)基因的前導(dǎo)肽序列的序列。
雖然不想要綁定到任何特定的理論，然而，據(jù)認(rèn)為，翻譯增強(qiáng)子元件能夠補(bǔ)充反式 作用因子，例如RNA結(jié)合蛋白(如熱休克蛋白)和其他諸如真核起始因子(eIF-1至4)在內(nèi)的翻譯起始因子、核糖體亞基，翻譯延伸因子(例如，真核延伸因子(eEF-1或eEF-2))等，這些反式作用因子最終能夠增強(qiáng)mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯。術(shù)語“翻譯增強(qiáng)子元件”明確排除了順式作用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)原件，如啟動(dòng)子、TATA盒、CAAT盒等。因此，在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)，串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件與本技術(shù)領(lǐng)域已知的串聯(lián)堆疊的順式作用轉(zhuǎn)錄元件相反，其中，后者能夠用于多核苷酸構(gòu)建體從而增加有效連接的、可轉(zhuǎn)錄目標(biāo)多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，例如，編碼多肽或抑制性RNA分子(例如，諸如發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNAi樣的干擾RNA)的多核苷酸。翻譯增強(qiáng)子元件包括但不限于翻譯前導(dǎo)肽序列(即5’UTR)，和其中定位的元件或結(jié)構(gòu)域，它們能夠通過增強(qiáng)產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯的能力而增加由有效連接的多核苷酸編碼的多肽的表達(dá)。本文所用術(shù)語“翻譯前導(dǎo)肽序列”、“5’UTR”、“前導(dǎo)肽序列”或“5’前導(dǎo)肽”是指來自或分離自基因組DNA (即基因)或mRNA上游調(diào)控區(qū)的多核苷酸，它開始于在編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并恰好在編碼序列的第一個(gè)翻譯起始密碼子(通常對(duì)于DNA序列為ATG，對(duì)于mRNA轉(zhuǎn)錄本則為AUG)之前終止。本領(lǐng)域技術(shù)人員也是指翻譯前導(dǎo)肽序列，如“5’未翻譯前導(dǎo)肽序列”或“5’非翻譯前導(dǎo)肽序列”。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“翻譯增強(qiáng)子元件”不應(yīng)解釋為僅指Kozak序列。本文所用術(shù)語“Kozak序列”、“Kozak共有序列”或“Kozak共有區(qū)”意指mRNA內(nèi)圍繞初始起始密碼子(AUG)的短共有序列。根據(jù)699種脊椎動(dòng)物的mRNA，Kozak建議在mRNA內(nèi)功能性AUG密碼子(加了下劃線的共有序列)的情況下，(GCC) GCC (A/G) CCAUGG為共有序列(例如，參見Kozak 等(1987)核酸研究.(Nucleic Acids Res. ) 15(20):8125_8148)。Kozak 序列可由核糖體識(shí)別為翻譯起始位點(diǎn)，從此位點(diǎn)蛋白質(zhì)由其mRNA分子所編碼，Kozak序列在翻譯過程開始期間發(fā)揮著重要的作用(例如，參見De Angioletti等(2004)，英國血液學(xué)雜志，(Br. J Haematol) 124(2) :224-231; Kozak (1984)，自然(Nature) 308:241-246; Kozak (1986)細(xì)胞(Cell) 44 (2) :283-292))。對(duì)于病毒 mRNA，圍繞著起始 AUG 的 Kozak 序列一般為 ACCAUGG,其中最一致的位置位于起始密碼子(AUG)之前的三個(gè)核苷酸，且?guī)缀蹩偸窃谙汆堰?A)核苷酸。高等植物的mRNA含有一段富含AC的共有序列，即CAA(A/C)A_GCG。在被子植物的兩個(gè)主要組之間，雙子葉植物mRNA的AUG密碼子上下游為AAA (A/C) AAUGGCU,這與高等植物的共有序列相似，而單子葉植物mRNA卻以C (A/C) (A/G) (A/C) CAUGGCG作為共有序列，這顯示了與Kozak提議的脊椎動(dòng)物共有序列在總體上的相似性(例如，參見Joshi等(1997)植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol)35:993-1001)o雖然核糖體需要Kozak序列(或該序列的變體)以起始翻譯，然而，Kozak序列有別于核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)(即信使RNA或內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的5’帽)。因此，其中5’UTR的一部分或片段充當(dāng)了本發(fā)明使用的翻譯增強(qiáng)子元件的作用，該部分可以包括一段適當(dāng)?shù)腒ozak序列，但不僅僅由Kozak序列組成。翻譯增強(qiáng)子元件可從基因的基因組拷貝中分離。因此，例如，翻譯前導(dǎo)肽序列，或其元件或結(jié)構(gòu)域，可以從非編碼的5’區(qū)(5’UTR)分離。備選地，翻譯增強(qiáng)子元件，如增強(qiáng)翻譯的翻譯前導(dǎo)肽序列及其功能性元件或結(jié)構(gòu)域，可以通過合成生產(chǎn)，或?yàn)椴倏v的非編碼DNA元件。有益于實(shí)施本發(fā)明的翻譯增強(qiáng)子元件是病毒或細(xì)胞來源的。任何給定的翻譯增強(qiáng)子元件的長(zhǎng)度會(huì)有所不同，但通常均低于約250個(gè)堿基對(duì)(bp)的長(zhǎng)度，低于約225bp的長(zhǎng)度，低于約200bp的長(zhǎng)度，低于約175bp的長(zhǎng)度，或低于約150bp，低于約125bp，低于約lOObp，低于約75bp,低于約50bp,或低于約25bp的長(zhǎng)度，以及通常至少為約IObp的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施例中，任何給定翻譯增強(qiáng)子元件的長(zhǎng)度為約IObp至約250bp，包括例如約10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90bp、95bp、lOObp、105bp、I10bp、I15bp、120bp、125bp、130bp、135bp、140bp、145bp、150bp、155bp、160bp、165bp、170bp、175bp、180bp、185bp、190bp、195bp、200bp、205bp、210bp、215bp、220bp、225bp、230bp、235bp、240bp、245bp、250bp，或任何如介于約 IObp 和約 250bp 之間的長(zhǎng)度。根據(jù)將被納入本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的天然翻譯增強(qiáng)子元件或其片段的長(zhǎng)度，與一個(gè)或多個(gè)其他翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊的每個(gè)翻譯增強(qiáng)子元件均應(yīng)有相同的長(zhǎng)度是不必要的，因?yàn)槎聦?shí)上通常這些翻譯增強(qiáng)子元件都具有不同的長(zhǎng)度。本文所用術(shù)語“串聯(lián)堆疊的”是指在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體中，至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件和至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件是順序或連續(xù)放置的(即按順序一前一后)。 這與多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)單獨(dú)放置的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件，或與多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)彼此相互隨機(jī)放置的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件(例如，隨機(jī)放置舉例來說，其中病毒翻譯增強(qiáng)子元件位于多肽編碼序列的上游，而細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件則位于編碼序列下游和/或編碼序列內(nèi))相反。此外，至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件置于至少一種細(xì)胞增強(qiáng)子元件的上游(即5’端)。雖然病毒和翻譯增強(qiáng)子元件優(yōu)選直接彼此緊密相鄰的(即無干擾性核苷酸位于病毒翻譯增強(qiáng)子元件的3’端和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件的5’端之間)，但是公認(rèn)的是，串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件可包括位于其各自多核苷酸構(gòu)建體的3’和5’端之間的接頭序列。當(dāng)含有接頭序列時(shí)，它可以高達(dá)多達(dá)30個(gè)核苷酸的單核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。因此，在一些實(shí)施中，串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件可包含I至約30個(gè)核苷酸、I至約25個(gè)核苷酸、I至約20個(gè)核苷酸、I至約15個(gè)核苷酸、I至約10個(gè)核苷酸，或I至約5個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的接頭序列。在其他實(shí)施例中，串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件可包含至少2個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸，至少5個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸，至少10個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸，至少15個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸，至少20個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸，至少25個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸，至少2個(gè)至高達(dá)約25個(gè)核苷酸，至少2個(gè)至高達(dá)約20個(gè)核苷酸，至少2個(gè)至高達(dá)約15個(gè)核苷酸，至少2個(gè)至高達(dá)約10個(gè)核苷酸，至少2個(gè)至高達(dá)約5個(gè)核苷酸，至少5個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸,至少5個(gè)至高達(dá)約25個(gè)核苷酸,至少5個(gè)至高達(dá)約20個(gè)核苷酸,至少5個(gè)至高達(dá)約15個(gè)核苷酸,至少5個(gè)至高達(dá)約10個(gè)核苷酸,至少10個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸,至少10個(gè)至高達(dá)約25個(gè)核苷酸，至少10個(gè)至高達(dá)約20個(gè)核苷酸，至少10個(gè)至高達(dá)約15個(gè)核苷酸，至少15個(gè)至高達(dá)約30個(gè)核苷酸,至少15個(gè)至高達(dá)約25個(gè)核苷酸,至少15個(gè)至高達(dá)約20個(gè)核苷酸，或至少20個(gè)至高達(dá)約25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的接頭序列。本發(fā)明特別關(guān)注的是病毒來源和細(xì)胞來源的翻譯增強(qiáng)子元件。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件是真核細(xì)胞來源的，包括例如動(dòng)物或植物細(xì)胞來源。因此，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體優(yōu)選地包括(a)至少一種源自病毒的翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種來源于細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。本文所用術(shù)語“源自”是指翻譯增強(qiáng)子序列是或者從天然產(chǎn)生的病毒或細(xì)胞基因的核酸序列獲得(如分離得到)，或者是從天然產(chǎn)生的病毒或細(xì)胞基因的核酸序列所設(shè)計(jì)(即“改造”)得到的。
任何已知病毒都可以作為在實(shí)施本發(fā)明的過程中所應(yīng)用的翻譯增強(qiáng)子元件來源而發(fā)揮作用。因此，例如，該病毒可以來自廣泛范圍的宿主，包括諸如細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物和昆蟲。病毒可以是DNA病毒或RNA病毒。術(shù)語“DNA病毒”是指以DNA作為其遺傳物質(zhì)而采用依賴DNA的DNA聚合酶進(jìn)行復(fù)制的病毒。DNA病毒的核酸可以是雙鏈DNA (dsDNA),也可以是單鏈DNA (ssDNA)0術(shù)語“RNA病毒”是指以RNA作為其遺傳物質(zhì)的病毒。RNA病毒的核酸可以是單鏈RNA (ssRNA)或雙鏈RNA (dsRNA)。RNA病毒可按照其RNA形成反義(negative-sense)(-)和正義(positive-sense) ( + )時(shí)的有義或極性，或雙義RNA病毒而進(jìn)一步分類。正義病毒RNA與病毒mRNA相同，因而可以由宿主細(xì)胞直接進(jìn)行翻譯。反義病毒RNA與mRNA互補(bǔ)，因而在翻譯前應(yīng)通過RNA聚合酶將其轉(zhuǎn)換成正義RNA。雙義(Ambisense)RNA病毒除了也翻譯正鏈基因外，均相似于反義RNA病毒。因此，病毒翻譯增強(qiáng)子元件可來源于任何病毒來源。在一些實(shí)施例中，病毒翻譯增強(qiáng)子元件是來源于植物病毒的，即病毒的宿主生物是植物。在一些這樣的實(shí)施例中，翻譯增強(qiáng)子元件是來源于RNA植物病毒的。任何RNA植物病毒均可作為病毒翻譯增強(qiáng)子元件的來源而發(fā)揮作用。目標(biāo)RNA植物病毒包括但不限于根據(jù)巴爾的摩病毒分類系統(tǒng)而定義的第IV組病毒的成員。巴爾的摩分類系統(tǒng)根據(jù)病毒的核酸(DNA或RNA)、鏈型(單鏈或雙鏈)、有義(即極性)以及復(fù)制方法而將病毒分為七個(gè)組。巴爾的摩第IV組病毒含有正義(+ )單鏈(ss)RNA基因組(簡(jiǎn)稱為第IV組( + )ssRNA病毒)。第IV組(+ ) ssRNA植物病毒的實(shí)例包括但不限于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)和蕃爺叢矮病毒科(Tombusviridae)的科的植物病毒，以及煙草花葉病毒(Tobamovirus)屬的植物病毒。雀麥花葉病毒科的示例性成員包括但不限于苜?；ㄈ~病毒(Alfamovirus)屬、禽腮腺炎病毒(Anulavrius)屬、等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒(Ilarvirus)屬、雀麥花葉病毒(Bromovirus)屬、黃瓜花葉病毒(Cucumovirus)屬和油橄欖潛隱病毒(Oleavirus)屬的病毒。馬鈴薯Y病毒科的示例性成員包括但不限于馬鈴薯Y病毒(Potyvirus)屬、黑麥草花葉病毒屬(Rymovirus)屬、大麥黃化花葉病毒(Bymovirus)屬、橙?；ㄈ~病毒(Macluravirus)屬、甘薯病毒(Ipomovirus)屬和小麥花葉病毒(Tritimovirus)屬的病毒。蕃爺叢矮病毒科的示例性成員包括但不限于蕃爺叢矮病毒(Tombusvirus)屬、磨香石竹斑駁病毒(Carmovirus)屬、壞死病毒(Necrovirus)屬、石竹病毒(Dianthovirus)屬、玉米裡綠斑駁病毒(Machlomovirus)屬、燕麥病毒(Avenavirus)屬和帕尼科病毒(Panicovirus)屬的病毒。然而,植物病毒分類正處于審查中，并且本病毒科和屬成員列表的目的不是限制本發(fā)明實(shí)施過程中所使用的病毒翻譯增強(qiáng)子元件 的植物病毒來源的范圍，因?yàn)槿魏芜m當(dāng)?shù)膩碜訰NA植物病毒的翻譯增強(qiáng)子元件均可采用本文所述的方式用于本發(fā)明的實(shí)施。在一些實(shí)施例中，病毒翻譯增強(qiáng)子元件來自第IV組(+ ) ssRNA病毒，所述病毒選自苜?；ㄈ~病毒(AMV ;雀麥花葉病毒科)、煙草線條病毒(TSV ;雀麥花葉病毒科)、雀麥花葉病毒(BMV ;雀麥花葉病毒科)、黃瓜花葉病毒(CMV ;雀麥花葉病毒科)、煙草蝕紋病毒(TEV ；馬鈴薯Y病毒科)、馬鈴薯Y病毒(PVY ;馬鈴薯Y病毒科)、黑麥草花葉病毒(馬鈴薯Y病毒科)、大麥黃花葉病毒(馬鈴薯Y病毒科)、橙?；ㄈ~病毒(馬鈴薯Y病毒科)、甘薯輕型斑駁病毒(SPMMV ;馬鈴薯Y病毒科)、小麥條紋花葉病毒(WSMV ;馬鈴薯Y病毒科)、玉米壞死線條病毒(MNeSV ;蕃爺叢矮病毒科)、番爺叢矮病毒(TBSV ;蕃爺叢矮病毒科)、香石竹環(huán)斑病毒(CRSV;蕃茄叢矮病毒科)、紅三葉草壞死花葉病毒(蕃茄叢矮病毒科)、甜三葉草壞死花葉病毒(蕃爺叢矮病毒科家庭)、煙草花葉病毒(TMV ;煙草花葉病毒屬)、U2-煙草花葉病毒(T2MV ;煙草花葉病毒屬)、番爺花葉病毒(ToMV ;煙草花葉病毒屬)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV ;煙草花葉病毒屬)、黃瓜病毒4 (CV4 ;煙草花葉病毒屬)、雞蛋花病毒(FV ;煙草花葉病毒屬)，蕃爺環(huán)斑病毒(0RSV ;煙草花葉病毒屬)、長(zhǎng)葉車前草花葉病毒(HRV ;煙草花葉病毒屬)、太陽麻花葉病毒(SHMV ;煙草花葉病毒屬)、甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV ;暫時(shí)指定為煙草花葉病毒屬)、絨毛煙草花葉病毒(NVMV;暫時(shí)指定為煙草花葉病毒屬)、花生叢簇病毒(PCV ;暫時(shí)指定為煙草花葉病毒屬)、馬鈴薯帚頂病毒(PMTV ;暫時(shí)指定為煙草花葉病毒屬)和土傳小麥花葉病毒(SBWMV ;暫時(shí)指定為煙草花葉病毒屬)在內(nèi)的組中篩選得到的。上述第IV組( + )ssRNA病毒的名單也僅僅是例證性地說明了本發(fā)明所采用的翻譯增強(qiáng)子元件的病毒來源，而不是旨在限制本發(fā)明的范圍。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，病毒來源的翻譯增強(qiáng)子元件是眾所周知的。例如，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以包括與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊的至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件，其中病毒翻譯增強(qiáng)子元件可以包括微小核糖核酸病毒翻譯前導(dǎo)肽序列，例如，腦心肌炎(EMCV) 5’前導(dǎo)肽(Elroy-Stein等(1989)美國科學(xué)院院刊(Proc. Natl.Acid. Sci. USA)86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒翻譯前導(dǎo)肽序列，如煙草蝕紋病毒(TEV)5’ 前導(dǎo)肽(Allison 等(1986)病毒學(xué)(Virology) 154:9-20 ；和 Gallie 等(1995)基因(Gene) 165:233-238);玉米矮花葉病毒(MDMV) 5’前導(dǎo)肽(Allison等(1986)病毒學(xué)(Virology) 154:9-20);馬鈴暮蝕刻病毒(PEV) 5’ 前導(dǎo)妝(Tomashevskaya 等(1993)遺傳病毒學(xué)雜志(J. Gen. Virol) 74:2717-2724);馬鈴薯S病毒基因組RNA的翻譯前導(dǎo)肽(Turner等(1999)病毒學(xué)文摘(Archives Virol) 144(7) : 1451-1461);苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白mRNA的翻譯前導(dǎo)肽序列(AMV RNA 45’ 前導(dǎo)肽)(Jobling 等(1987)自然(Nature) 325:622-625 ；美國專利號(hào)6，037，527);煙草花葉病毒(TMV) 5’前導(dǎo)肽(Gallie等(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 15:3257-3273 ;Gallie 等(1988)核酸研究(Nucleic AcidsRes.) 16:883-893 ;Gallie 等(1992)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 20:4631-4638 ;美國專利號(hào)5，489，527);玉米壞死線條病毒(MNeSv)5’前導(dǎo)肽(Louie等(2000)植物疾病(PlantDis. )84:1133-1139 ；SEQ ID NO: 19);和玉米褪綠斑駁病毒(MCMV) 5’ 前導(dǎo)肽(Lommel 等(1991)病毒(Virology)81:382-385)。人們認(rèn)識(shí)到，RNA病毒來源的翻譯增強(qiáng)子元件(例如，TMV 5’前導(dǎo)肽)可如這樣使用，通過采用如T4RNA連接酶，將其連接至與包含細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件及有效連接的編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的多核苷酸所互補(bǔ)的適當(dāng)mRNA轉(zhuǎn)錄本的上游而被用于制備本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體是專為在表達(dá)盒或表達(dá)載體中使用而設(shè)計(jì)的，在這種情況下，RNA病毒來源的翻譯增強(qiáng)子元件以互補(bǔ)DNA的形式應(yīng)用?？刹捎帽炯夹g(shù)領(lǐng)域內(nèi)那些已知的傳統(tǒng)方法獲得RNA病毒翻譯增強(qiáng)子元件的cDNA。在一些實(shí)施例中，RNA病毒翻譯增強(qiáng)子元件的cDNA經(jīng)化學(xué)合成而用于納入表達(dá)盒或表達(dá)載體內(nèi)。因此，就本發(fā)明的目的而言，包含病毒來源的翻譯增強(qiáng)子元件的多核苷酸構(gòu)建體包括RNA或翻譯增強(qiáng)子元件的cDNA序列的存在。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件也是眾所周知的，且可以從任何細(xì) 胞基因中獲得。本文尤其令人感興趣的是特定的宿主細(xì)胞內(nèi)是高表達(dá)的細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件。雖然不被任何理論或作用機(jī)制所束縛，來自高表達(dá)的基因的翻譯增強(qiáng)子元件可以在較高的水平發(fā)揮功能。高表達(dá)的基因可定義為那些表達(dá)時(shí)可至少代表細(xì)胞的10%mRNA的基因。備選地，高表達(dá)的基因可以編碼當(dāng)表達(dá)時(shí)代表特定細(xì)胞或組織類型的超過1%總可溶性蛋白的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，高表達(dá)的基因可以用于編碼當(dāng)表達(dá)時(shí)代表特定細(xì)胞或組織類型的超過1%總可溶性蛋白，但同時(shí)無法代表細(xì)胞的至少10%mRNA的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，翻譯增強(qiáng)子元件來源于細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的基因，例如，包括動(dòng)物或植物細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因。本文所用術(shù)語“應(yīng)激反應(yīng)基因”是指被對(duì)生物生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖產(chǎn)生不良影響的外部條件所上調(diào)的基因。這些應(yīng)激可以是生物的(由其他生物所實(shí)施的)或非生物的(因物理或化學(xué)環(huán)境過度或短缺而產(chǎn)生的，如過多或不足的太陽能、營養(yǎng)消耗、土壤含鹽量、高(熱和干旱)溫和低(冷和凍)溫、氧化應(yīng)激，或污染(如重金屬)。應(yīng)激反應(yīng)基因的實(shí)例包括但不限于醇脫氫酶基因、脫落酸(ABA)基因和熱休克蛋白基因(參見美國專利號(hào) 7，109，033 ；Seki 等(2001)植物細(xì)胞(Pant Cell) 13:61-72 ；Seki 等(2002)功能和整合基因組學(xué)(Funct. Integr. Genomic.) 2:282-291 ;及 Seki 等(2002)植物雜志(PlantJ.) 31:279-292，其中各實(shí)例均通過引用而成為本文中的部分。因此，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以包括與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊的至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件，其中細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件可以包括來自醇脫氫酶(ADH)基因的翻譯前導(dǎo)肽序列，例如，煙草ADH基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(NtADH 5’前導(dǎo)肽；Satoh 等(2004)生物科學(xué)和生物工程雜志(J. Bioscience Bioengineering) 98 (I) : 1-8),水稻ADH2基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(0sADH25’前導(dǎo)肽；Sugio等(2008)生物科學(xué)和生物工程雜志(J. Bioscience Bioengineering) 105 (3) :300-302),擬南芥 ADH 基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(AtADH5’前導(dǎo)肽；Sugio等(2008)生物科學(xué)和生物工程雜志(J. BioscienceBioengineering) 105 (3) :300_302)，和玉米ADHl基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(ADH15’前導(dǎo)肽)；和熱休克蛋白(HSP)基因的翻譯前導(dǎo)肽序列，例如玉米HSP101基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(HSP1015，前導(dǎo)肽；Nieto-Sotelo 等(1999)基因(Gene) 230:187-195)，以及矮牽牛HSP70、大豆HSP17. 9和玉米HSP70基因的翻譯前導(dǎo)肽序列，如美國專利號(hào)5，659，122和5，362，865所示，均以其整體通過引用而納入為本文的部分)。其他合適的細(xì)胞轉(zhuǎn)化增強(qiáng)子元件包括但不限于煙草光系統(tǒng)I基因PsaDb的翻譯前導(dǎo)肽序列(psaDb 5’前導(dǎo)肽列；Yamamoto 等(1995)生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 270 (21) : 12466-12470) ;Fed_15’ 前導(dǎo)肽(Dickey (1992)歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志(EMB0J.) 11:2311-2317);和核酮糖二磷酸輕化酶小亞基(RbcS) 5’前導(dǎo)肽(SiIverthorne等(1990)植物分子生物學(xué)雜志(J. Plant.Mol. Biol.) 15:49-58)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，翻譯增強(qiáng)子元件是翻譯前導(dǎo)肽序列，包括但不限于上述翻譯前導(dǎo)肽序列。雖然，在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體中使用的翻譯前導(dǎo)肽序列可以是全長(zhǎng)、天然的(即自然發(fā)生的)5’ UTR序列，但是，人們認(rèn)識(shí)到這些前導(dǎo)肽序列的功能片段和變體也可被用于實(shí)施所要求保護(hù)的本發(fā)明。因此，本文所述的天然翻譯前導(dǎo)肽序列可以是不同的(例如，通過置換、插入或缺失而得到)或平截的(可在5’端和/或3’端)，從而，只要不破壞其作為翻譯增強(qiáng)子的功能，則這種功能就可以受到調(diào)控(即增加或減少)，而其變體或平頭(截)序列在與至少一種其他翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)應(yīng)用時(shí)，則保留了提高目標(biāo)注多肽表達(dá)的能力。采用例如標(biāo)準(zhǔn)突變分析法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕松確定易于改變(即置換、插入、缺失或平截)的天然翻譯前導(dǎo)肽序列內(nèi)那些區(qū)域或天然翻譯前導(dǎo)肽那些代表功能片段的部分的識(shí)別。例如，參見Gallie等(1988),核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 16
(3):883-893。因此，雖然下列討論是指包括作為翻譯增強(qiáng)子元件的全長(zhǎng)、天然的翻譯前導(dǎo)肽序列的多核苷酸構(gòu)建體，但是所披露的各項(xiàng)實(shí)施例構(gòu)想了這些翻譯前導(dǎo)肽序列的功能性變體和片段的應(yīng)用，其中這些變體和片段與本文其他處所述的定義相同。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一個(gè)拷貝的煙草花葉病毒翻譯前導(dǎo)肽序列(TMV 5’前導(dǎo)肽)，與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。TMV 5’前導(dǎo)肽，也稱為Q，它是來自TMV基因組RNA的68個(gè)堿基對(duì)(bp)序列(例如，參見GalIie等(1987)核酸研究(NucIeic AcidsRes.) 15:8693-8711 ;Gallie 等(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 15:3257-3273)。Q的cDNA序列如SEQ ID NO: I中所不。該Q如導(dǎo)妝序列是聞度有序的8_喊基(5' -ACAAUUAC-3')同向重復(fù)的三個(gè)拷貝和27-堿基多聚(CAA)區(qū)(位于5’8-堿基同向重復(fù)和該重復(fù)序列的其他兩個(gè)拷貝之間)的一個(gè)拷貝，含有72%的前導(dǎo)肽(Gallie (1996)轉(zhuǎn)基因植物適用于工業(yè)和藥用蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)(Transgenic Plants: A Production Systemfor Industrial and Pharmaceutical Proteins),第 1-3 節(jié)轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄后控制”，Owen和Pen編輯(Wiley, Hoboken,新澤西州)。雖然四個(gè)不同的TMV株的5’未翻譯前導(dǎo)肽序列在長(zhǎng)度上有所不同，但是，它們均含有大約相當(dāng)?shù)闹貜?fù)和多聚(CAA)序列(Kukla等(1979)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur. J. Biochem) 98:61-66 ;和Goelet等(1982)美國科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 79:5818-5822)。正如本文其他處所述的，TMV 5’前導(dǎo)肽的功能性變體和片段可用于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體，且與至少一種細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊時(shí)，仍能夠目標(biāo)多肽的表達(dá)增加。Q的功能分析已確定了多聚(CAA)區(qū)為增強(qiáng)有效連接的體內(nèi)開放閱讀框架的體內(nèi)翻譯的主要元件(Gallie 和 Walbot( 1992)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 20:4631-4638 ；和 Gallie 等(1988)核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 16:883-893)。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，Q前導(dǎo)肽序列的功能性變體和片段是眾所周知的，且包括但不限于例如，缺失突變體QAl(缺乏SEQ ID NO: I的nt 2-9), Q A 2 (缺乏前8-堿基同向重復(fù)，對(duì)應(yīng)于SEQID NO: I的nt12-19)、Q A3 (缺乏 27-bp 多聚(CAA)區(qū)的 nt 1-23，對(duì)應(yīng)于 SEQ ID 顯1的扯 20-42)、Q A4 (缺乏第二個(gè)8-堿基同向重復(fù)，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: I的nt 47-54), Q A 5 (缺乏第三個(gè)8-堿基同向重復(fù)，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: I的nt 60-67)，而變異序列指定為QA、C —U (將多聚(CAA)區(qū)替換成多聚(U)和QA —C (5’8-堿基同向重復(fù)的AUU序列的單堿基置換，以CUU替換AUU)。雖然Q A 3缺失突變體和變體Q A、C — U序列是功能性的，優(yōu)選地，多聚(CAA)區(qū)保留在Q前導(dǎo)肽序列的片段或變體內(nèi)，以最大限度地提高翻譯增強(qiáng)子元件所提供的翻譯功效。例如，參見Gallie等(1988)，同上。在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一個(gè)拷貝的煙草蝕紋病毒翻譯前導(dǎo)肽序列(TEV 5’前導(dǎo)肽)，與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。煙草蝕紋病毒(TEV)是馬鈴薯Y病毒，它是感染植物的正鏈RNA病毒的小核糖核酸病毒超群的成員。TEV的基因組RNA是多聚腺苷酸mRNA,這種mRNA天然缺乏5’帽子結(jié)構(gòu)，但仍然有效翻譯。143個(gè)堿基對(duì)(bp)的TEV 5’前導(dǎo)肽(如SEQ ID NO: 2所示)足以賦予mRNA帽非依賴性的翻譯能力(Carrington和 Freed (1990)病毒學(xué)雜志(J. Virology)64:1590 - 1597 ；Gallie (2001)病毒學(xué)雜志 (J. Virology) 75:12141-12152)，并在功能上類似于“帽”，因?yàn)樗軌蚺c多聚(A)尾相互作用以促進(jìn)翻譯(Gallie等(1995)基因(Gene) 165:233-238)。兩個(gè)143bp TEV 5’前導(dǎo)肽內(nèi)的位于中心的帽獨(dú)立調(diào)控元件(CIRE)都必須介導(dǎo)帽獨(dú)立的翻譯，而且，當(dāng)用作單獨(dú)的翻譯前導(dǎo)肽時(shí)，兩者都需要與多聚(A)尾進(jìn)行功能上的相互作用以促進(jìn)最有效的翻譯(Ni印el和 Gallie (1999)病毒學(xué)雜志(J. Virology) 73:9080-9088)。這些 CIRE 置于 SEQ ID NO: 2的 nt 28-65 (CIRE-I)和 nt 66-118 (CRIE-2)內(nèi)。據(jù)報(bào)道，這種功能性的TEV 5’前導(dǎo)肽有144-bp長(zhǎng)(參見Carrington和Freed(1990)同上)，其中該序列與SEQ ID N0:2所示的序列是相同的，但包括在SEQ ID N0:2的位置I前插入的胸腺嘧啶(T)核苷酸(參見如SEQ ID NO: 18所示的144_bp序列)。因此，144-bp的TEV 5’前導(dǎo)肽在其5’端有如下五個(gè)(5)核苷酸5’-taaat-3’，與SEQ ID NO: 2中所示的143-bp TEV 5’前導(dǎo)肽的起始五個(gè)核苷酸(即5’-aaata-3’)相反。上述CIRE的定位以及下列關(guān)于TEV前導(dǎo)肽變體和片段的討論是關(guān)于如SEQ ID N0:2中所示的143-bp序列的。人們公認(rèn)的是，如上述CIRE及下列變體和片段所述的143-bp序列內(nèi)的核苷酸(nt)位置,可以在144-bp序列中鑒定，通過調(diào)整其位置以考慮在如SEQ ID NO:2中所示的143_bp序列的5’端進(jìn)行單獨(dú)的核苷酸插入。因此，例如，其中CIRE-I放置在SEQ ID NO:2的nt28-65之內(nèi)，144bp TEV 5’前導(dǎo)肽內(nèi)的相應(yīng)位置位于SEQ ID勵(lì)18的社29-66處。可以理解的是，144bp的TEV 5’前導(dǎo)肽也可以被用作本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)的病毒翻譯增強(qiáng)子元件的來源。因此，TEV前導(dǎo)肽的變體和片段可用于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體中，只要它們至少包含這些CIRE之一，優(yōu)選的是這些CIRE中的兩種。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，TEV前導(dǎo)肽的功能性片段是眾所周知的，且包括但不限于缺失突變體TEV28_143 (缺乏SEQ ID N0:2的nt1-27)、TEVh18 (缺乏 SEQ ID NO:2 的 ntll9_143)、TEV28_118 (缺乏 SEQ ID N0:2 的 nt 1-27和 119-143)、TEV1-J55 (缺乏 SEQ ID NO:2 的 nt66_143)、TEV66_143 (缺乏 SEQ ID N0:2 的 nt1-65)、TEV28_65 (缺乏 SEQ ID NO:2 的 nt 1-27 和 66-143)，以及 TEV66^118 (缺乏 SEQ ID NO:2的nt 1-65)。例如，參見Ni印el和Gallie (1999)，同上。
然而，在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一個(gè)拷貝的苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白(CP)mRNA翻譯前導(dǎo)肽序列(AMV RNA 45’前導(dǎo)肽)，與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。該36-堿基對(duì)的AMVRNA 45’前導(dǎo)肽如SEQ ID NO:3所示。至于其他翻譯增強(qiáng)子元件，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以包括AMV RNA 45’前導(dǎo)肽的功能性變體和片段，如其他處所定義的相同。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一個(gè)拷貝的玉米壞死線條病毒的翻譯前導(dǎo)肽序列(麗eSV 5’前導(dǎo)肽)，與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。該122-堿基對(duì)的麗eSV 5’前導(dǎo)肽如SEQ IDN0:19所示。至于其他翻譯增強(qiáng)子元件，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以包括MNeSV 5’前導(dǎo)肽的功能性變體和片段，如其他處所定義的相同。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種醇脫氫酶基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，醇脫氫酶基因的翻譯增強(qiáng)子元件是眾所周知的，包括但不限于煙草ADH基因的84-bp翻譯前導(dǎo)肽序列(NtADH 5’前導(dǎo)肽)，如SEQ ID N0:4所述；水稻ADH2基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(0sADH25’前導(dǎo)肽，如SEQ ID NO: 5所示；擬南芥ADH基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(AtADH 5’翻譯前導(dǎo)肽)，如SEQ ID N0:6所示；玉米醇脫氫酶基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(ADH 5’前導(dǎo)肽)JBSEQ ID NO: 7所述，或其功能性變體或片段。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括(a)至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種熱休克蛋白(HSP)基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，熱休克蛋白基因的翻譯增強(qiáng)子元件是眾所周知的，包括但不限于玉米HSPlOl基因的翻譯前導(dǎo)肽序列(HSP1015’前導(dǎo)肽)，如SEQ IDNO: 8所示；和玉米HSP70、矮牽牛HSP70和大豆HSP17. 9基因的翻譯前導(dǎo)肽序列，分別如SEQID N0:9、10和11所示(例如，參見美國專利號(hào)5，659，122和5，362，865，以其整體通過引用而成為本文的一部分)；或其功能性變體或片段。
因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的多核苷酸構(gòu)建體包括選自分別如SEQ IDNO :1、2 (或18),3和19所示的TMV、TEV, AMV RNA4和MNeSV 5’前導(dǎo)肽的至少一種翻譯增強(qiáng)子元件，與選自分別如SEQ ID NO :4、5、6和7所示的煙草、水稻、擬南芥和玉米ADH 5’前導(dǎo)肽的至少一種翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。在一些這樣的實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括如SEQ ID NO: I所示的TMVQ 5’前導(dǎo)肽(或其功能性片段或變體，如下所述)，與如SEQ ID N0:4所示的煙草ADH5’前導(dǎo)肽(或其功能性片段或變體，如下所述)串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供的多核苷酸構(gòu)建體包括選自分別如SEQ ID NO 1,2(或18)、3和19所示的TMV、TEV、AMV和^eSV 5’前導(dǎo)肽的至少一種翻譯增強(qiáng)子元件，與選自分別如SEQID NO :8、9、10和11所示的玉米HSPlOl基因、玉米HSP70基因、矮牽牛HSP70基因和大豆HSP17. 9基因的5’前導(dǎo)肽的至少一種翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。在一些這樣的實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包括如SEQ IDN0:1所示的TMV Q 5’前導(dǎo)肽(或其功能性片段或變體，如下所述)，與如SEQ IDN0:8所示的玉米HSP1015’前導(dǎo)肽(或其功能性片段或變體，如下所述)串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。
如上所述，病毒或細(xì)胞5’ UTR的功能性片段和變體可被用作本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)的翻譯增強(qiáng)子元件。本文所用術(shù)語“功能性”是指這樣的片段或變異的核酸序列，其在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)，當(dāng)與其他翻譯增強(qiáng)子元件(這也可以是全長(zhǎng)的5’UTR的片段或變體)串聯(lián)堆疊時(shí)，能夠提供目標(biāo)多肽的表達(dá)增加。本文所用術(shù)語“片段”是指所關(guān)注5’UTR的任何部分。5’UTR的片段可以介于至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸，至長(zhǎng)達(dá)全長(zhǎng)5’UTR所含有的核苷酸數(shù)之間。因此，在一些實(shí)施例中，5’^1 的片段是至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)，或介于約5個(gè)連續(xù)核苷酸至長(zhǎng)達(dá)僅比5’UTR全長(zhǎng)少一個(gè)核苷酸之間的任意值。因此，舉例來說，其中病毒翻譯增強(qiáng)子元件是TMV 5'UTR( Q ;參見SEQ ID N0:1)、TEV 5’UTR (SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 18)、AMV 5’UTR (SEQ ID NO: 3)或 MNeSV 5’UTR，此序列的片段可以串聯(lián)連接至任何細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件，只要它是功能性的，即在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)，當(dāng)與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊時(shí)，能夠提供目標(biāo)多肽 的表達(dá)增加。就Q而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65個(gè)或至多比全長(zhǎng)Q序列中含有的少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQID NO: I所述的68個(gè)核苷酸中的67個(gè)連續(xù)核苷酸)。就TEV 5’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140個(gè)或至多比全長(zhǎng)TEV5’UTR序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO:2所述的143個(gè)核苷酸中的142個(gè)連續(xù)核苷酸；或至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO: 18所示的144個(gè)核苷酸中的143個(gè)連續(xù)核苷酸)。就AMV 5’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30個(gè)或至多比全長(zhǎng)TEV 5’UTR序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID N0:3所示的36個(gè)核苷酸中的35個(gè)連續(xù)核苷酸)。就MNeSV 5’UTR 而言，這樣的片段可以包含至少約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120 個(gè)或至多比全長(zhǎng) MNeSV 5，UTR 序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO: 19所示的122個(gè)核苷酸中的121個(gè)連續(xù)核苷酸)。同樣，舉例來說，其中細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件是煙草ADH 5’UTR(參見SEQ ID N0:4)、水稻 ADH25’UTR(參見 SEQ ID NO: 5)、擬南芥 ADH 5’UTR(參見 SEQ ID NO: 6)、玉米 ADH5’UTR(參見SEQ ID N0:7)、玉米熱休克蛋白101 (HSPlOl) 5’UTR (參見SEQ ID N0:8)、玉米熱休克蛋白70 (HSP70) 5'UTR (參見SEQ IDN0:9)、矮牽牛熱休克蛋白70 (HSP70) 5'UTR (參見SEQ ID NO: 10)或大豆熱休克蛋白17.9 (HSP17. 9)5’UTR (參見SEQ ID NO: 11)，此序列的片段可以串聯(lián)連接至病毒翻譯增強(qiáng)子元件，只要它是功能性的，即在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)，當(dāng)與至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊時(shí)，能夠提供目標(biāo)多肽的表達(dá)增加。就煙草ADH 5’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80個(gè)或至多比全長(zhǎng)煙草ADH5’UTR序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID N0:4所示的84個(gè)核苷酸中的83個(gè)連續(xù)核苷酸)。就水稻ADH25’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95個(gè)或至多比全長(zhǎng)水稻ADH25’ UTR序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQIDN0:5所示的101個(gè)核苷酸中的100個(gè)連續(xù)核苷酸)。就擬南芥ADH 5’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55個(gè)或至多比全長(zhǎng)擬南芥ADH 5’UTR序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO:6所不的58個(gè)核苷酸中的57個(gè)連續(xù)核苷酸)。就玉米ADH 5’^1 而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105 個(gè)或至多比全長(zhǎng)玉米 ADH 5’UTR 序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO:7所示的107個(gè)核苷酸中的106個(gè)連續(xù)核苷酸)。就玉米HSP1015’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200 個(gè)或至多比全長(zhǎng)玉米 HSP1015’UTR 序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO:8所示的206個(gè)核苷酸中的205個(gè)連續(xù)核苷酸)。就玉米HSP705’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105 個(gè)或至多比全長(zhǎng)玉米 HSP705’UTR 序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO:9所示的107個(gè)核苷酸中的106 個(gè)連續(xù)核苷酸)。就矮牽牛HSP705’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 個(gè)或至多比全長(zhǎng)矮牽牛 HSP705’UTR 序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO: 10所示的96個(gè)核苷酸中的95個(gè)連續(xù)核苷酸)。就大豆HSP17. 95’UTR而言，這樣的片段可以包含至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70個(gè)或至多比全長(zhǎng)大豆HSP17. 95’UTR序列少一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸(即，至多長(zhǎng)達(dá)如SEQ ID NO: 11所示的72個(gè)核苷酸中的71個(gè)連續(xù)核苷酸)。本文所用，5’ UTR的“變體”是指擁有與所述5’ UTR核苷酸序列(如SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、18或19中所示的5’^10或其片段的基本上相似性的序列。就5’^'1 而言，諸如此類天然發(fā)生的變體可以采用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)而進(jìn)行鑒定，例如，采用PCR和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括應(yīng)用合成法得到的核苷酸序列，例如，通過采用定點(diǎn)誘變所生成的，其中的技術(shù)也是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。例如，參見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，Plainview,紐約 2001)和分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)方案(Current Protocols in MolecularBiology) (Ausubel等編著，格林出版社和Wiley-Interscience,紐約1995);上述以其整體通過引用而納入為本文的一部分。一般來說，包括SEQ ID NO: 1-11,18和19中任何的變體的特定5’ UTR的變體，通過如下所述的使用默認(rèn)參數(shù)的序列比對(duì)方案所確定的，與特定核苷酸序列應(yīng)有至少約40%、50%、60%、65%、70%，一般至少有約 75%、80%、85%，更優(yōu)選地至少有約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。所關(guān)注的5’ UTR的變體應(yīng)為功能性的，即在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)，當(dāng)與其他翻譯增強(qiáng)子元件(這也可以是全長(zhǎng)的5’ UTR的片段或變體)串聯(lián)堆疊時(shí)，能夠提供目標(biāo)多肽的表達(dá)增加的變體。生物活性的變體包括例如天然或天然生成的5’ UTR，其擁有一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失或插入。在本文中兩個(gè)核酸序列的上下文中所用的“序列同一性”或“同一性”是指當(dāng)比較特定比對(duì)窗的最佳對(duì)應(yīng)性時(shí)為相同的這兩個(gè)序列中的核苷酸。本文所用“比對(duì)窗”是指多核苷酸序列的連續(xù)、指定片段，其中對(duì)兩個(gè)序列的最佳比對(duì)而言，與參照序列(它不包括增加或缺失)相比較，在比對(duì)窗內(nèi)的多核苷酸序列可包括增加或缺失(即空位)。一般來說，比對(duì)窗至少有20個(gè)連續(xù)核苷酸的長(zhǎng)度，并人選地是30、40、50、100個(gè)還是更長(zhǎng)的核苷酸。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，用于比較的序列比對(duì)的方法是眾所周知的。因此，確定任何兩段序列之間的百分序列同一性可以通過采用數(shù)學(xué)算法來完成。這樣的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Myers和Miller的算法(1988) CABIOS 4:11-17 ；Smith等的局部對(duì)比算法(1981)高級(jí)應(yīng)用數(shù)學(xué)(Adv. Appl. Math. ) 2:482 ;Needleman和Wunsch的總體對(duì)比算法(1970)分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol. )48:443-453 ；Pearson和Lipman的局部對(duì)比搜索法(1988)美國科學(xué)院院刊(Poc. Natl. Acad. Sci) 85:2444-2448 ；Karlin 和 Altschul 算法(1990)美國科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 87:2264，由 Karlin 和 Altschul 修正(1993)美國科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90:5873-5877。這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)可以被用于對(duì)比序列，以確定序列同一性。這些實(shí)現(xiàn)包括但不限于PC/基因程序的CLUSTAL (Intelligenetics提供，Mountain View,加利福尼亞州)；ALIGN程序(第2. 0版)和第10版GCG威斯康星遺傳學(xué)軟件包的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA (Accelrys公司提供，圣地亞哥，加利福尼亞州)。采用這些程序的 比對(duì)都可以使用默認(rèn)參數(shù)。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的裝配及其在目標(biāo)表達(dá)盒內(nèi)的插入可以采用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的基因工程技術(shù)來完成。例如，參見Sambrook等(2001)同上；和Ausubel等，同上。此外，用于制備適合將多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物的重組載體的方法也是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。本文所用術(shù)語“載體”、“構(gòu)建體”、“載體構(gòu)建體”是指任何重組多核苷酸構(gòu)建體，它可以被用于植物轉(zhuǎn)化的目的，即向宿主植物細(xì)胞導(dǎo)入異源多核苷酸。例如，參見美國專利號(hào) 4，971，908、4，940,835,4, 769,061 和 4，757,011 所述的載體;Rodriguez，載體分子克隆載體及其應(yīng)用調(diào)查(Butterworths,波士頓1988) ;Glick等,植物分子生物學(xué)和生 物技術(shù)方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology) (CRC 出版社1993);和Ausubel等(1995)，同上；和Sambrook等(2001)，同上)。有益于向植物導(dǎo)入核酸的典型構(gòu)建體在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，它包括來自根癌土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)型質(zhì)粒的載體(Rogers 等(1987)酶學(xué)方法(Meth. Enzymol). 153:253-277)。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可被用于瞬時(shí)測(cè)定，以評(píng)估串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件對(duì)目標(biāo)多肽表達(dá)的影響。例如，可采用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)那些眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，構(gòu)建由有效連接至編碼目標(biāo)多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄本上的串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件的mRNA,例如，通過相應(yīng)cDNA的體外轉(zhuǎn)錄，而可將產(chǎn)生的mRNA導(dǎo)入目標(biāo)植物細(xì)胞，其中可對(duì)mRNA的翻譯進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如,參見Gallie等的瞬時(shí)分析(1987)核酸研究(Nucleic AcidsRes. ) 15:8693-8711，以及 Jobling 和 Gehrke (1987)自然(Nature) 325:622-625。在其他實(shí)施例中，可將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體納入表達(dá)盒內(nèi)，并導(dǎo)入目標(biāo)植物，用于瞬時(shí)或穩(wěn)定體內(nèi)轉(zhuǎn)錄及編碼的目標(biāo)多肽的翻譯。表達(dá)盒本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以有效連接至調(diào)控元件上，而該調(diào)控元件提供了編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸的表達(dá)。在這種方式下，本發(fā)明提供的表達(dá)盒和表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體，它包括(a)至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種源自細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。本文所用術(shù)語“表達(dá)盒”是指能夠介導(dǎo)目標(biāo)核苷酸序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的核酸分子，從而包括有效連接至目標(biāo)多核苷酸序列的5’和3’調(diào)控序列(即本發(fā)明的多核苷酸序列)。配置表達(dá)盒內(nèi)有效連接的元件，以便在它們之間能夠產(chǎn)生功能性連接，從而表達(dá)盒內(nèi)的各元件能夠完成其預(yù)期的功能。有效連接的元件可以是連續(xù)的，也可以是非連續(xù)的。本發(fā)明的表達(dá)盒包括本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體，因而是嵌合構(gòu)建體，即它們的至少一種組分的核酸序列相對(duì)于它們的至少一種其他組分的核酸序列是異源的(即外源或非同時(shí)天然發(fā)生的)。因此，例如，串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子是彼此異源的，因?yàn)樗鼈儊碜杂诓煌膩碓?即病毒對(duì)比細(xì)胞)。在類似方法下，調(diào)控區(qū)，例如啟動(dòng)子，可以對(duì)目標(biāo)多肽的編碼來說是異源的。人們同時(shí)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的表達(dá)盒內(nèi)，一個(gè)或多個(gè)個(gè)別組分對(duì)表達(dá)盒內(nèi)的另一個(gè)組分可以是天然的。例如，該啟動(dòng)子對(duì)所編碼的目標(biāo)多肽而言可以是天然生成的啟動(dòng)子，雖然這兩種組分均沒有出現(xiàn)在其天然配置中。本發(fā)明的表達(dá)盒是與所導(dǎo)入的植物細(xì)胞呈異源性的，即表達(dá)盒的具體DNA序列不在宿主植物細(xì)胞內(nèi)天然出現(xiàn)，而必須通過轉(zhuǎn)化事件而被導(dǎo)入宿主植物細(xì)胞或宿主植物細(xì)胞 前身內(nèi)。在任何情況下，表達(dá)盒內(nèi)的任何一個(gè)或多個(gè)個(gè)別組分可以對(duì)植物宿主是天然的(即組分自身的核苷酸序列能夠以植物宿主基因組內(nèi)天然發(fā)生的序列形式出現(xiàn))或可以對(duì)植物宿主是異源的(即組分自身的核苷酸序列對(duì)植物宿主是外源的，或者是以不同的生物體形式，或者是其原有形式的基因改造的形式，例如，通過核苷酸置換、插入、缺失和/或平截)。本發(fā)明的表達(dá)盒內(nèi)使用的示例性調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子序列、多聚腺苷酸信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控域、復(fù)制起始點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(“IRES”)、其他翻譯增強(qiáng)子(例如，3’UTRs)等，這些共同提供了有效連接的目標(biāo)多核苷酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，以及在目標(biāo)受體植物細(xì)胞內(nèi)其任何編碼序列的翻譯。只要目標(biāo)多核苷酸能夠被復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，并在受體植物細(xì)胞內(nèi)翻譯，則并非所有這些控制序列都需要始終存在。因此，調(diào)控序列可以是DNA的調(diào)控區(qū)，它通常包括能夠介導(dǎo)RNA聚合酶II的TATA盒，以在對(duì)于特定編碼序列的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起始RNA的合成。表達(dá)調(diào)控序列可以額外地包含一般放置在TATA盒上游或5’端的其他識(shí)別序列，它影響著(例如，增強(qiáng))轉(zhuǎn)錄起始速率。此外，表達(dá)調(diào)控序列可以額外包含一般放置在TATA盒下游或3’端的其他序列，它影響著轉(zhuǎn)錄起始速率。本發(fā)明的表達(dá)盒通常包括5’-3’方向的、在植物內(nèi)是功能性的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，本發(fā)明的有效連接的多核苷酸構(gòu)建體，以及有效連接的、在植物內(nèi)是功能性的翻譯終止區(qū)。在一些實(shí)施例中，表達(dá)盒包含用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子篩選的選擇性標(biāo)記基因。備選地，選擇性標(biāo)記可通過相同載體或不同載體上的額外表達(dá)盒而提供。只有當(dāng)宿主細(xì)胞暴露在某些特定的外部刺激下時(shí)，表達(dá)盒中多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)才可在起始轉(zhuǎn)錄的組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行。此外，啟動(dòng)子還可以對(duì)特定的組織或器官或者發(fā)育階段是特異性的。表達(dá)盒也可以包含至少一種額外目標(biāo)多核苷酸(如，另外的目標(biāo)多肽的編碼序列)，以將其共轉(zhuǎn)化入目標(biāo)植物體內(nèi)。備選地，額外目標(biāo)的多核苷酸可通過在相同載體或不同載體上的多重表達(dá)盒而提供。本發(fā)明的表達(dá)盒擁有多個(gè)用于插入處于調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的限制酶切位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)。在植物細(xì)胞內(nèi)是功能性的任何啟動(dòng)子(即能夠驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)有效連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸的表達(dá))可以有效連接至本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體。啟動(dòng)子可以是對(duì)于多核苷酸構(gòu)建體的編碼區(qū)是天然的(即天然發(fā)生的)啟動(dòng)子，或可以是對(duì)于多核苷酸構(gòu)建體的編碼區(qū)是異源的(即外源的或非天然發(fā)生的)啟動(dòng)子。凡啟動(dòng)子不是對(duì)于多核苷酸構(gòu)建體編碼區(qū)是天然產(chǎn)生的啟動(dòng)子，則可以會(huì)由于天然發(fā)生的啟動(dòng)子序列和/或天然發(fā)生的編碼序列的遺傳操作而成為異源的(例如，通過在天然發(fā)生的啟動(dòng)子和/或編碼序列內(nèi)核苷酸的置換、插入、缺失和/或平截)，或者也可以是由于其最初的遺傳來源而是異源的(例如，來自另一個(gè)基因和/或其他生物體的啟動(dòng)子)。在一些實(shí)施例中，啟動(dòng)子對(duì)于多核苷酸構(gòu)建體的編碼區(qū)是天然的啟動(dòng)子，而兩個(gè)序列對(duì)于導(dǎo)入表達(dá)盒的植物宿主而言均是天然的(即啟動(dòng)子和編碼序列都源自同一個(gè)基因，該基因在植物宿主內(nèi)是天然存在的)。備選地，啟動(dòng)子對(duì)于多核苷酸構(gòu)建體的編碼區(qū)是天然的啟動(dòng)子，但兩種序列對(duì)于導(dǎo)入表達(dá)盒的植物宿主是異源的(即外源的或非天然發(fā)生的)(即啟動(dòng)子和多核苷酸構(gòu)建體的編碼序列對(duì)于植物宿主均是外源的，例如是按照其原始序列的遺傳操作來說，或者按照來自另外的遺傳來源而言)。然而，在其他實(shí)施例中，啟動(dòng)子對(duì)于編碼序列是異源的，并且對(duì)于植物宿主是天然的(即，啟動(dòng)子源自于植物宿主的基因)，或者對(duì)于植物 宿主是外源的(即，其原始序列已被操作，或者來自另一個(gè)遺傳來源)。上述啟動(dòng)子、編碼序列和導(dǎo)入本發(fā)明的表達(dá)盒的植物宿主之間的關(guān)系(即異源的對(duì)比天然的)并非旨在限制，但在本質(zhì)上僅僅是示范的目的。納入本發(fā)明的表達(dá)盒的啟動(dòng)子選擇取決于多種因素，包括但不限于功效、選擇性性、誘導(dǎo)性、目標(biāo)多肽的所需表達(dá)水平以及多肽的細(xì)胞或組織優(yōu)選表達(dá)。作為本技術(shù)領(lǐng)域一種常規(guī)的技能方式是通過適當(dāng)選擇和放置啟動(dòng)子和其他相對(duì)于其序列的調(diào)控區(qū)來調(diào)節(jié)有效連接的多核苷酸序列的表達(dá)。例如，鑒定和表征植物基因組DNA啟動(dòng)區(qū)的方法包括例如 Jordano 等(1989)植物細(xì)胞(Plant Cell) 1:855-866 ；Bustos 等(1989)植物細(xì)胞(Plant Cell) 1:839-854 ;Green 等(1988) EMBO 雜志(EMBO J), 7:4035-4044 ；Meier等(1991)植物細(xì)胞(Plant Cell) 3，309-316 ;以及 Zhang 等(1996)植物生理學(xué)(PlantPhysiology)110:1069-1079。用于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)的啟動(dòng)子可以是包含下述元件的強(qiáng)的植物啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子或嵌合啟動(dòng)子來自任何基因的TATA盒(或基于植物基因TATA盒的分析而合成的)，任選地融合至植物啟動(dòng)子TATA盒的5'區(qū)(其涉及組織和時(shí)空適當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá))，任選地融合至I個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子(如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S增強(qiáng)子、FMV增強(qiáng)子、CMP增強(qiáng)子、RUBISC0小亞基增強(qiáng)子、質(zhì)體藍(lán)素增強(qiáng)子(例如，參見Chua等(2003)植物細(xì)胞(Plant Cell) 15 (6) : 1468-1479)，以及來自根癌土壤桿菌章魚堿合酶基因的激活元件(參見美國專利號(hào)5，955，646)。備選地，弱的植物啟動(dòng)子可以用來改變目標(biāo)植物宿主細(xì)胞中的基因沉默的效應(yīng)。因此，例如，其中宿主植物細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)目標(biāo)多肽的表達(dá)受到了諸如反義或發(fā)夾RNA干擾的基因抑制技術(shù)的抑制，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體包含有效連接至目標(biāo)多肽編碼序列的串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件，它可以有效連接至弱啟動(dòng)子，并可通過任何本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的方法導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞內(nèi)，以提供目標(biāo)多肽的低水平表達(dá)。在本發(fā)明的這些實(shí)施例中，“弱啟動(dòng)子”是能夠提供目標(biāo)多肽的有效連接的編碼序列低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。然而，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，弱啟動(dòng)子可以是在植物宿主內(nèi)僅能夠在少數(shù)細(xì)胞內(nèi)提供有效連接的編碼序列表達(dá)，而在其他細(xì)胞內(nèi)僅能提供總體較低水平的目標(biāo)多肽表達(dá)的那些啟動(dòng)子。弱植物啟動(dòng)子可以是天然發(fā)生或可以代表了天然發(fā)生的啟動(dòng)子序列的變體，其經(jīng)過修飾能夠降低目標(biāo)多肽有效連接的編碼序列的表達(dá)水平，或天然發(fā)生啟動(dòng)子序列的平截版本，能夠提供降低表達(dá)的目標(biāo)多肽。弱啟動(dòng)子的例子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子(WO 99/43838和美國專利號(hào)6，072，050)、CaMV 35S核心啟動(dòng)子等。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的組成型表達(dá)是所希望的。組成型啟動(dòng)子提供有效連接的多核苷酸構(gòu)建體的了無調(diào)控的，從而連續(xù)的表達(dá)。示例性組成型啟動(dòng)子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子和WO 99/43838和美國專利號(hào)6，072, 050中披露的其他組成型啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子；CaMV 35S核心啟動(dòng)子(Odell等(1985)自然(Nature) 313:810-812)；水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等(1990)植物細(xì)胞(Plant Cell) 2:163-171);泛素啟動(dòng)子(Christensen 等(1989)植物分子生物學(xué)(Plant Mol. Biol. ) 12:619-632 ；以及Christensen 等(1992)植物分子生物學(xué)(Plant Mol. Biol. ) 18:675-689) ；pEMU (Last等(1991)理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor. Appl. Genet. ) 81:581-588) ；MAS (Velten 等(1984)EMBO雜志(EMBO J) 3:2723-2730) ；ALS啟動(dòng)子(美國專利號(hào)5，659，026)等。其他組成型啟動(dòng)子包括，例如，美國專利號(hào) 5，608，149 ；5, 608, 144 ;5，604，121 ;5，569，597 ;5，466，785 ；5，399，680 ;5，268，463 ;5，608，142，以及 6，177，611 ;7，256，276 ;7，550，578 所披露的啟動(dòng)子，其中披露內(nèi)容以其整體通過引用而成為本文的一部分。
適當(dāng)?shù)闹参锘蚯逗闲蛦?dòng)子有益于一些應(yīng)用，例如本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體在某些組織中的表達(dá)，同時(shí)使在其他組織(如種子或生殖組織)中的表達(dá)最小化。示例性的細(xì)胞類型或組織優(yōu)選的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)目標(biāo)組織中的優(yōu)先表達(dá)，但也導(dǎo)致其他細(xì)胞類型或組織中的一定表達(dá)。因此，可以選擇產(chǎn)生組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子(例如，根、葉和花的特異性啟動(dòng)子)。例如，參見下述啟動(dòng)子Yamamoto等(1997)植物雜志(Plant J. )12 (2):255-265 ；Kawamata 等(1997)植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol. ) 38 (7) :792-803 ;Hansen等(1997)分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)(Mol. Gen Genet. ) 254 (3) : 337-343 ;Russell 等(1997)轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Res. ) 6 (2) : 157-168 ；Rinehart 等(1996)植物生理學(xué)(Plant Physiol. ) 112(3) :1331-1341 ；Van Camp 等(1996)植物生理學(xué)(Plant Physiol.)112(2) :525-535 ； Canevascini 等(1996)植物生理學(xué)(Plant Physiol. ) 112(2) :513-524 ；Yamamoto 等(1994)植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol. ) 35(5) :773-778 ；Lam (1994)細(xì)胞分化的結(jié)果與問題(Results Probl. Cell Differ. ) 20:181-196 ；Orozco 等(1993)植物分子生物學(xué)(Plant Mol Biol. ) 23(6) :1129-1138 ;Matsuoka 等(1993)美國科學(xué)院院刊(Proc Natl. Acad. Sci. USA) 90 (20) :9586-9590 ;和 Guevara-Garcia 等(1993)植物雜志(Plant J. ) 4(3) :495-505。也參見下述披露的啟動(dòng)子美國專利號(hào)7，297，839和7，129，397，其提供了在質(zhì)粒中的優(yōu)先表達(dá)。為了驅(qū)動(dòng)在綠色組織如葉和根中的轉(zhuǎn)錄，本發(fā)明也包括在光合成組織中有效的啟動(dòng)子。最適合的是僅或主要在這些組織中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以賦予整個(gè)綠色組織內(nèi)組成性的表達(dá)，或相對(duì)于綠色組織的差異表達(dá)，或相對(duì)于發(fā)生表達(dá)的綠色組織的發(fā)育階段的差異表達(dá)，或響應(yīng)外部刺激的表達(dá)。這些啟動(dòng)子的實(shí)例包括核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶(RbcS)啟動(dòng)子,如來自東部落葉松(Larix Iaricina)的RbcS啟動(dòng)子，松樹cab6啟動(dòng)子(Yamamoto等(1994),植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol. ) 35:773-778)，來自小麥的Cab-1基因啟動(dòng)子(Fejes等(1990)，植物分子生物學(xué)(Plant Mol Biol. ) 15:921-932)，來自菠菜的CAB-1啟動(dòng)子(Lubberstedt 等(1994),植物生理學(xué)(Plant Physiol. )104:997-1006),來自水稻的 cab IR啟動(dòng)子(Luan等(1992)，植物細(xì)胞(Plant Cell) 4:971-981)，來自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)啟動(dòng)子(Matsuoka 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:9586-9590)，煙草Lhcbl*2 啟動(dòng)子(Cerdan 等(1997)，植物分子生物學(xué)(Plant Mol Biol. ) 33:245-255)，擬南芥SUC2蔗糖-H+共轉(zhuǎn)運(yùn)體啟動(dòng)子(Truernit等(1995)，植物196:564-570)和來自菠菜的類囊體膜蛋白啟動(dòng)子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR> atpC、atpD、cab、rbcS)。美國專利申請(qǐng)?zhí)?007/0006346中說明了驅(qū)動(dòng)莖、葉和綠色組織中轉(zhuǎn)錄的其他啟動(dòng)子，此處以其整體引用的方式構(gòu)成本文的部分。同樣，本領(lǐng)域已經(jīng)描述了已對(duì)編碼磷酸烯醇羧化酶的玉米基因(PEPC) (Hudspeth 和 Grula (1989)植物分子生物學(xué)(Plant Mol Biol. 12 :579_589)。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，該基因的啟動(dòng)子可以用于在植物中以綠色組織的特異方式驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是所希望的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子響應(yīng)諸如化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境刺激的外部刺激而驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。例如，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以賦予響應(yīng)環(huán)境刺激的轉(zhuǎn)錄(如熱休克基因啟動(dòng)子、干旱可誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子、病原可誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷可誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子以及光/暗可誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子)，或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(例如，來自被脫落酸、 生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子)。例如，參見美國專利號(hào)7，199，286和7，230，159。其他可以用來驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)的啟動(dòng)子包括但并不限于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、鴉片合成酶啟動(dòng)子(如，nos、mas、ocs等)、泛素啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、核酮糖二磷酸(RubP)羧化酶小亞基啟動(dòng)子、醇脫氫酶啟動(dòng)子、發(fā)育啟動(dòng)子(參見，例如，6，953，848和6，437，221)和如美國專利號(hào)6，987，179所述的嵌合啟動(dòng)子。本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，RubP羧化酶小亞基啟動(dòng)子是眾所周知的(Silverthorne等(1990)植物分子生物學(xué)(Plant Mol Biol. )15:49-58)。來自感染植物的病毒的其他適合啟動(dòng)子包括但不限于從芋花葉病毒、綠藻病毒(如小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子；Mitra和Higgins (1994)植物分子生物學(xué)(Plant Mol Biol. )26:85-93)、番茄斑萎病毒、煙草脆裂病毒、煙草壞死病毒、煙草環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒、黃瓜花葉病毒、花生殘端病毒、苜蓿花葉病毒、甘蔗桿狀DNA病毒等分離得到的啟動(dòng)子。許多轉(zhuǎn)錄終止子可用于包含本發(fā)明多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)盒。這些負(fù)責(zé)表達(dá)盒內(nèi)多核苷酸構(gòu)建體編碼區(qū)外的轉(zhuǎn)錄終止和校正mRNA聚腺苷化。終止區(qū)對(duì)于啟動(dòng)子可以是天然的(即天然發(fā)生的)，對(duì)于在多核酸構(gòu)建體內(nèi)有效連接的編碼序列可以是天然的，對(duì)于導(dǎo)入表達(dá)盒的植物可以是天然的，或可以來自另外的來源(即對(duì)啟動(dòng)子、編碼序列或植物是外源的或異源的)，或其任何組合。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子是那些植物中已知功能的終止子，包括例如CAMV 35S終止子、tml終止子、胭脂堿合成酶終止子和豌豆rbcs E9終止子。在一些實(shí)施例中，表達(dá)盒應(yīng)包括用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。在其他實(shí)施例中，選擇性標(biāo)記基因可在相同載體或不同載體上的另一個(gè)表達(dá)盒內(nèi)構(gòu)建，而本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體及選擇性標(biāo)記可轉(zhuǎn)化入目標(biāo)植物或植物部分內(nèi)。轉(zhuǎn)化過程中常規(guī)使用的選擇性標(biāo)記物包括npt 11基因，它賦予了對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素的抗性(Messing和Vierra(1982)基因(Gene)19 :259-268 ；Bevan 等(1983)自然(Nature)304:184_187);bar 基因，它賦予了對(duì)除草劑草丁膦的抗性(White等(1990)核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 18:1062 ；Spencer 等(1990)理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor. Appl. Genet. ) 79 :625-631) ；hph 基因，它賦予了對(duì)抗生素潮霉素的耐藥性(Blochinger和Diggelmann (1984)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell. Biol ).4 :2929-2931) ;dhfr 基因，它賦予了對(duì)甲氨蝶呤的抗性(Bourouis 等(1983)EMBO雜志(EMBO J. ). 2 :1099-1104) ;EPSPS基因，它賦予了對(duì)草甘膦的抗性(美國專利號(hào)4，940，935和5，188，642)，以及磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(PMI)，它提供了代謝甘露糖的能力(美國專利號(hào)5，767，378和5，994，629)。其他適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，而任何這樣的標(biāo)記均可以在本發(fā)明的實(shí)踐中運(yùn)用。此外，當(dāng)需要時(shí)，表達(dá)盒可設(shè)計(jì)為將所表達(dá)的目標(biāo)多肽靶向至在植物細(xì)胞的特定細(xì)胞器(例如，針對(duì)線粒體或質(zhì)粒，如葉綠體)，或?qū)⒍嚯陌邢蛴糜诩?xì)胞外分泌。已知植物中存在著各種祀向基因產(chǎn)物的機(jī)制，而控制這些機(jī)制發(fā)揮功能的序列已在一些細(xì)節(jié)方面進(jìn)行了表征。例如，將基因產(chǎn)物靶向葉綠體是由在各種蛋白質(zhì)氨基末端發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽所控制的，它會(huì)在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中經(jīng)過剪切，以產(chǎn)生成熟蛋白(Comai等(1988)生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. )263:15104-15109)。這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以融合至異源多肽產(chǎn)物以影響這些產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體內(nèi)(van den Broeck等(1985)自然(Nature) 313:358-363)。編碼適當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn) 肽的DNA可以分離自編碼RUBISC0蛋白、CAB蛋白、EPSP合成酶、GS2蛋白以及其他已知放置于葉綠體的蛋白質(zhì)的cDNA 5’末端。參見，美國專利號(hào)5，639，949的實(shí)施例37中，標(biāo)題為“葉綠體靶向表達(dá)”的章節(jié)，此處以其整體通過引用納入為本文的一部分。上述細(xì)胞靶向的機(jī)制不僅可以用來與其天然啟動(dòng)子相結(jié)合，也可用來與異源啟動(dòng)子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的特異性細(xì)胞靶向的目標(biāo)，該啟動(dòng)子的表達(dá)譜與來自靶向轉(zhuǎn)運(yùn)肽機(jī)構(gòu)的啟動(dòng)子的有所不同。因此，若本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體編碼靶向至葉綠體的多肽時(shí)，在構(gòu)建體內(nèi)的編碼序列可以是包含編碼適當(dāng)葉綠體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列的融合多核苷酸，該葉綠體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合入編碼目標(biāo)多肽的序列框架內(nèi)。為了確保質(zhì)粒內(nèi)的定位，例如，可以設(shè)想應(yīng)用質(zhì)體鐵氧還蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列菠菜的NADP+氧化還原酶(FNR),這是Jansen等(1988)當(dāng)代遺傳學(xué)(Current Genetics)13:517-522披露的。另一個(gè)例子是玉米糯蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，包括成熟糯蛋白的開始34個(gè)氨基酸殘基(Klosgen等(1989)分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)(Mol. Gen.Genet. )217:155-161)。應(yīng)用不含成熟蛋白開始34個(gè)氨基酸的該轉(zhuǎn)運(yùn)肽也是可以的。此外，也可以應(yīng)用核酮糖二磷酸羧化酶小亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(Wolter等(1988)美國科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 85:846-850 ；Nawrath 等(1994)美國科學(xué)院院刊(Proc. Natl.Acad. Sci. USA) 91:12760-12764)，NADP 蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(Galiardo 等(1995)植物(Planta) 197:324-332)，谷胱甘肽還原酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(Creissen等(1995)植物雜志(Plant J. ) 8:167-175),或Rl蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(Lorberth等(1998)自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)16:473-477)。當(dāng)需要目標(biāo)多肽分泌，例如進(jìn)入細(xì)胞壁或培養(yǎng)基內(nèi)，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體則可設(shè)計(jì)為使得構(gòu)建體內(nèi)的編碼序列是包含編碼融合在在編碼目標(biāo)多肽的框架內(nèi)的適當(dāng)信號(hào)肽的序列的融合多核苷酸。本文所用的“信號(hào)肽”或“信號(hào)序列”是指編碼與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上的受體蛋白相互作用的多肽的核酸序列，以轉(zhuǎn)運(yùn)生長(zhǎng)中的多肽鏈跨越膜而進(jìn)入ER用于從該細(xì)胞分泌。這種信號(hào)肽往往從前體多肽上切割下來，從而生成不含信號(hào)肽的“成熟”多肽。因此，表達(dá)盒內(nèi)的多核苷酸構(gòu)建體可以設(shè)計(jì)成所編碼的多肽能夠分泌到細(xì)胞壁內(nèi)或從該植物分泌出來，例如分泌至培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以使用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的任何適當(dāng)信號(hào)序列(包括細(xì)菌、酵母菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物和植物的信號(hào)序列)。例如，參見美國專利號(hào)6，020，169。信號(hào)肽可以對(duì)應(yīng)目標(biāo)多肽的信號(hào)肽。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽是眾所周知的。本文所述的表達(dá)盒可以包含其他已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控序列，以增強(qiáng)表達(dá)盒的基因表達(dá)，從而增加其中所包含的多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)。例如，已表明多種內(nèi)含子序列能夠增強(qiáng)表達(dá)，特別是在單子葉植物細(xì)胞中的表達(dá)。據(jù)證實(shí)，內(nèi)含子I是特別有效的，并能夠增強(qiáng)具有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(dá)(Callis等(1987)遺傳與育種(GenesDevelop. )1:1183-1200)。參見例如，美國專利號(hào)6，342，660所述玉米醇脫氫酶內(nèi)含子的應(yīng)用。內(nèi)含子序列已常規(guī)地整合入植物轉(zhuǎn)化載體中，通常是在非翻譯的前導(dǎo)肽內(nèi)。因此，包含本發(fā)明多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)盒可以進(jìn)一步包括其中有效連接的內(nèi)含子序列。在一些實(shí)施例中，內(nèi)含子序列可插入一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件內(nèi)。人們認(rèn)識(shí)到，在不同生物體的翻譯起始密碼子的最佳翻譯起始上下游核苷酸序列之間，存在著已知的差異，而這些翻譯起始上下游核苷酸序列的組合可以影響翻譯起始的功效。例如，參見 Lukaszewicz 等(2000)植物科學(xué)(Plant Science) 154:89-98 ;和 Joshi 等(1997)植物分子生物學(xué)(Plant Mol. Biol.) 35:993-1001。本文所用的“翻譯起始密碼子”是指起始從目標(biāo)核酸分子轉(zhuǎn)錄的mRNA內(nèi)的編碼區(qū)翻譯的密碼子。該翻譯起始密碼子通常在DNA序列是ATG和在mRNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)是AUG。本文所用的“翻譯起始上下游核苷酸序列”是指翻譯起始密碼子5’端正好三個(gè)核苷酸的鑒定。因此，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)編碼序列的翻譯起始密碼子的翻譯起始上下游核苷酸序列可以通過選擇植物優(yōu)選的翻譯起始上下游核苷酸序列來修飾以增強(qiáng)植物中的表達(dá)。因此，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以采用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的任何適合的翻譯起始上下游核苷酸序列，特別是植物來源的。例如，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以進(jìn)行修飾，以便正好位于本發(fā)明多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)編碼序列的翻譯起始密碼子上游的三個(gè)核苷酸為“ACC”、“ACA”或“AAAAAA”。此外，任何在本文所述的表達(dá)盒內(nèi)含有的編碼序列均可就所要導(dǎo)入的植物內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。即，核苷酸序列可以采用用于改良表達(dá)的植物優(yōu)選密碼子進(jìn)行合成，或者也可以采用植物優(yōu)選密碼子使用頻率的密碼子進(jìn)行合成。一般來說，該基因的GC含量會(huì)有所提高。例如，參見 Campbell 和 Gowri (1990)植物生理學(xué)(Plant Physiol. )92:1-11 宿主優(yōu)選密碼子應(yīng)用的討論。在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，可提供用于合成植物優(yōu)選基因的方法。例如，參見美國專利號(hào) 5，380，831 和 5，436，391，以及 Murray 等(1989)核酸研究(Nucleic AcidsRes. ) 17:477-498，通過引用納入成為本文的一部分。顯示了基于GenBank 版本中列入序列的密碼子使用頻率的表格如日本千葉縣Kazusa DNA研究所的網(wǎng)站所示。此數(shù)據(jù)庫見Nakamura 等(2000)核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 28:292 所述。在構(gòu)建了本文所述的表達(dá)盒后，將其通過本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的任何適當(dāng)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入目標(biāo)植物內(nèi)，包括本文下述方法。目標(biāo)多肽在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)，串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件可以用于增強(qiáng)任何目標(biāo)多肽的表達(dá)。在這種方式下，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)的有效連接的編碼序列可編碼用于代謝途徑的基因操作的多肽，以改善植物農(nóng)藝學(xué)性狀如增加疾病抗性、除草劑抗性、營養(yǎng)利用以及環(huán)境脅迫抗性；以改變農(nóng)藝性狀，如淀粉、油、脂肪酸或蛋白質(zhì)含量/組成的改良以增強(qiáng)動(dòng)物和人體的營養(yǎng)，提高消化率，和/或提高工藝品質(zhì)；以及以發(fā)育改良，如雄性不育癥，衰老等；以及以導(dǎo)入藥物、工業(yè)酶等的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因此，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可包含能夠提供與植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長(zhǎng)和發(fā)育、產(chǎn)量、提高營養(yǎng)、疾病抗性昆蟲抗性害、或環(huán)境或化學(xué)耐受性相關(guān)的預(yù)期性狀的多肽編碼序列。這種多肽的表達(dá)是可取的，以賦予重要的農(nóng)藝學(xué)性狀。為作物植物提供有益的農(nóng)藝學(xué)性狀的多肽實(shí)例可以是，例如賦予如下的多肽，昆蟲控制(美國專利號(hào) 7，244，820 ;7，230，167 ;6，809，078 ;6，780，408 ;6，720，488 ;6，713，063 ;6，686，452 ；6，657，046 ;6，645，497 ;6，642，030 ;6，639，054 ;6，620，988 ;6，593，293 ;6，555，655 ；6，538，109 ;6，537，756 ;6，521，442 ;6，501，009 ;6，468，523 ;6，342，660 ;6，326，351 ；6，320，100 ;6，313，378 ;6，300，544 ;6，284，949 ;6，281，413 ;6，281，016 ;6，278，041 ；6，277，823 ;6，248，536 ;6，242，241 ;6，221，649 ;6，177，615 ;6，156，573 ;6，153，814 ；6，110，464 ;6，093，695 ;6，063，756 ;6，063，597 ;6，023，013 ;5，959，091 ;5，942，664 ；5，942，658，5，880，275 ;5，763，245 ;和 5，763，241);真菌疾病抗性(美國專利號(hào) 7，098，378 ；6，864，076 ;6，864，068 ;6，653，280 ;6，573，361 ;6，506，962 ;6，316，407 ;6，300，103 ； 6，215，048 ;5，516，671 ;5，773，696 ;6，121，436 ;6，316，407 ;和 6，291，647);病毒抗性(美國專利號(hào) 6，617，496 ;6，608，241 ;6，015，940 ;6，013，864 ;5，850，023 ；和 5，304，730);線蟲抗性(美國專利號(hào)6，784，337和6，228，992 );細(xì)菌疾病抗性(美國專利號(hào)7，098，378 ；6,956, 115 ;6，528，702 ;和 5，516，671);除草劑抗性(美國專利號(hào) 7，312，379 ;7，056，715 ；6，803，501 ;6，448，476 ;6，307，129 ;6，294，345 ;6，248，876 ;6，225，114 ;6，107，549 ；5，866，775 ;5，804，425 ;5，633，435 ;和 5，463，175 ;和美國專利申請(qǐng)公布號(hào) 2003/0135879和 2003/0115626);植物生長(zhǎng)和發(fā)育(美國專利號(hào) 6，723，897 ;6，603，064 ;和 6，518，488)；淀粉生成(美國專利號(hào) 6，538，181 ;6，538，179 ;6，538，178 ;5，750，876 ；和 6，476，295)；產(chǎn)率提高(美國專利 RE38, 446 ;美國專利號(hào) 6，716，474 ;6，663，906 ;6，476，295 ；6，441，277 ;6，423，828 ;6，399，330 ;6，372，211 ;6，235，971 ;6，222，098 ；和 5，716，837)；改良的油生產(chǎn)(美國專利號(hào)6，444，876 ;6，426，447 ；和6，380，462);高油產(chǎn)量(美國專利號(hào)6，495，739 ;5，608，149 ;6，483，008 ;和6，476，295);改良的脂肪酸含量(美國專利號(hào) 6，828，475 ;6，822，141 ;6，770，465 ;6，706，950 ;6，660，849 ;6，596，538 ;6，589，767 ；6,537, 750 ;6，489，461 ;和6,459,018);高蛋白產(chǎn)量(美國專利號(hào)6，380,466);果實(shí)成熟(美國專利號(hào)5，512，466);增強(qiáng)的動(dòng)物和人體營養(yǎng)(美國專利號(hào)6，723,837 ;6，653，530 ；6，5412，59 ;5，985，605 ;和6，171,640);生物聚合物(美國專利號(hào)RE37, 543 ;美國專利號(hào)6，228,623 ;5，958，745 ;和美國專利申請(qǐng)發(fā)布號(hào)2003/0028917);環(huán)境應(yīng)激抗性(美國專利號(hào)6,072, 103);藥用肽和可分泌肽(美國專利號(hào)6，812，379 ;6，774，283 ;和6，140,075 ；6，080，560);改進(jìn)的加工性狀(美國專利號(hào)6，476，295);改進(jìn)的消化率(美國專利號(hào)6，531,648);低棉子糖(美國專利號(hào)6，166，292);工業(yè)酶生成(美國專利號(hào)5，543，576)；改善的風(fēng)味(美國專利號(hào)6，011，199);固氮作用(美國專利號(hào)5，229，114);雜交種子生產(chǎn)(美國專利號(hào)5，689，041);纖維生產(chǎn)(美國專利號(hào)6，576,818 ;6，271,443 ;5，981，834 ;和5，869，720)；以及生物燃料生產(chǎn)(美國專利號(hào)5，998，700);這些專利和專利申請(qǐng)出版物的各項(xiàng)內(nèi)容均以其整體通過引用納入為本文的一部分。如上所述，且如適用，目標(biāo)多肽可作為融合多肽的一部分來表達(dá)。
因此，包含串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件的本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可以包含編碼任何目標(biāo)多肽的多核苷酸?？蓪⑦@些構(gòu)建體導(dǎo)入任何目標(biāo)植物，以改善農(nóng)藝學(xué)性狀、改變農(nóng)藝學(xué)特征，并提供藥物制劑、工業(yè)酶等的表達(dá)。目標(biāo)植物因此，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化(即轉(zhuǎn)基因)植物及其植物部分，其中的構(gòu)建體包括a)至少一種病毒翻譯增強(qiáng)子元件，與至少一種細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊；以及b)編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸。本文所用術(shù)語“植物部分”是指植物器官(如葉、莖、根等)、種子和植物細(xì)胞。植物部分還包括，但不限于植物或其后代產(chǎn)生的原生質(zhì)體、組織、根瘤、愈傷組織、可再生植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、胚胎和花、胚珠、花藥、花粉、莖、枝、果實(shí)、核、穗、穗軸、外果殼、柄、葉、分蘗、根、根尖等。植物細(xì)胞還包括但不限于種子細(xì)胞、胚胎、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子、花粉和小孢子。本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”是指已導(dǎo)入外源多核苷酸分子，如本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的植物或其植物部分。導(dǎo)入的多核苷酸分子可以整合入受體植物或植物部分的基因組DNA內(nèi)，以便導(dǎo)入的多核苷酸分子由隨后的后代遺傳?！稗D(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化的”植物或植物部分，例如，細(xì)胞或組織，也包括植物或植物部分的后代，和從采用類似轉(zhuǎn)基因植物或植物部分作為雜交親本并因含有外源多核苷酸分子，如本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體而顯示出改變的表型的育種程序而產(chǎn)生的后代。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體和在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的有效連接的啟動(dòng)子穩(wěn)定整合入植物或其植物部分的基因組內(nèi)，從而便于所需的由編碼多肽提供的特性或性狀可以由其后代遺傳，更特別的是，由多重連續(xù)世代的后代遺傳。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體能夠作為本發(fā)明的表達(dá)盒的一部分而穩(wěn)定整合入植物或其植物部分的基因組內(nèi)，從而植物或其植物部分可以通過將該表達(dá)盒導(dǎo)入一個(gè)或更多個(gè)植物細(xì)胞或其植物部分的方式而完成遺傳修飾。根據(jù)本發(fā)明，植物包括出于生產(chǎn)植物材料的目的而栽培的、之后由人類或由動(dòng)物用于口頭消費(fèi)或用于工業(yè)、醫(yī)藥或商業(yè)過程中利用的任何植物。本發(fā)明可應(yīng)用于多種植物中的任意一種，包括但不僅限于玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、高粱、一般豆類、卡諾拉油菜/蕓苔、紫花苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、小米、黑麥、甘蔗、甜菜、可可、茶、甘藍(lán)、棉花、煙草、咖啡、甘薯、亞麻、花生、三葉草；蔬菜類，如生菜、西紅柿、葫蘆、木薯、土豆、胡蘿卜、蘿
卜、豌豆、扁豆、甘藍(lán)、花椰菜、綠花椰菜、包子甘藍(lán)、辣椒和菠蘿；喬木水果，如柑橘、蘋果、梨、桃、杏、核桃、鱷梨、香蕉和椰子，以及鮮花，如蘭花、康乃馨、玫瑰等?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)施的其他植物包括多年生草類，如柳枝稷、草原草、印度草，大須芒草等。發(fā)明方法本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體可用于增加目標(biāo)多肽在植物及其植物部分中表達(dá)的方法。本發(fā)明的方法包括將有效連接至在植物中是功能性的啟動(dòng)子的本發(fā)明多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物或其植物部分中。在適于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)的培養(yǎng)條件下，串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件為所涉及的mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯提供了更高的功效。因此，本發(fā)明提供了目標(biāo)多肽在植物及其植物部分中的表達(dá)增加。本文所用術(shù)語“表達(dá)”是指合成所編碼的多肽，包括所編碼的多肽的轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配。多肽表達(dá)的增加是在任何兩種植物或植物部分之間的比較下進(jìn)行的，如已經(jīng)通過導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的方式進(jìn)行了遺傳修飾的、植物或植物部分內(nèi)的多肽表達(dá)，對(duì)比相應(yīng)野生型植物或野生型植物部分內(nèi)多肽的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)的增加是在植物或植物部分之間的比較下進(jìn)行的，其已經(jīng)通過導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的方式進(jìn)行了遺傳修飾，對(duì)比相應(yīng)對(duì)照植物或?qū)φ罩参锊糠謨?nèi)多肽的表達(dá)。本文所用術(shù)語“對(duì)照植物”或“對(duì)照植物部分”是指已經(jīng)進(jìn)行了遺傳修飾，從而表達(dá)來自多核苷酸構(gòu)建體的相同多肽的植物或植物部分，而該多核苷酸構(gòu)建體則僅在不含串聯(lián)堆疊的病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件方面才有別于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體。在這種方式下，對(duì)照植物或植物部分包括含有相同轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(即相同啟動(dòng)子)、多肽的相同編碼序列的多核苷酸構(gòu)建體，或者以下內(nèi)容沒有有效連接的翻譯增強(qiáng)子元件，或只有單獨(dú)的有效連接的翻譯增強(qiáng)子元件，該元件或者是本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體含有的同一個(gè)病毒翻譯增強(qiáng)子元件，或者是本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體所含有的同一個(gè)細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分中目標(biāo)多肽表達(dá)水平得到提高，與野生型植物或植物部分，或與對(duì)照植物或植物部分相比較，至少提高了約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、50%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、200%、225%、250%、275%、300%、350%、400%、450% 或者至少提高了500%。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分中目標(biāo)多肽表達(dá)水平得到提高，與野生型植物或植物部分，或與對(duì)照植物或植物部分相比較，至少是約I倍、I. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、4倍、4. 5倍或至少約5倍。目標(biāo)多肽表達(dá)水平可直接測(cè)量，例如，通過檢測(cè)植物或植物部分表達(dá)的多肽水平，例如，通過測(cè)量植物或植物部分的多肽活性。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體和表達(dá)盒可以采用任何本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入目標(biāo)植物或植物部分中，包括但不限于電穿孔(如美國專利號(hào)5，384，253所示)；微粒轟擊法(如美國專利號(hào) 6，403，865 ;5，015，580 ;5，550，318 ;5，538，880 ;6，160，208 ；6，399，861及6，403, 865所示)；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如美國專利號(hào)7，029, 908 ；5，824，877 ;5，591,616 ;5，981，840及6，384，301所示)和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(如美國專利號(hào)55，081，84所示)；所有這些都通過引用而納入為本文的一部分。這些構(gòu)建體和表達(dá)盒也可以采用育種計(jì)劃而導(dǎo)入目標(biāo)植物或植物部分。下述植物轉(zhuǎn)化技術(shù)僅為提供技術(shù)指導(dǎo)，不擬做任何限制。植物轉(zhuǎn)化和育種。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體和表達(dá)盒，單獨(dú)或與一種或多種額外的目標(biāo)核酸分子聯(lián)合，被轉(zhuǎn)化入所關(guān)注目標(biāo)植物的細(xì)胞內(nèi)?？梢酝ㄟ^許多本技術(shù)領(lǐng)域認(rèn)可的方式將這些構(gòu)建體和表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞中。在多核苷酸的情況下，本文所用術(shù)語“導(dǎo)入”是指以多核苷酸得以進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部這樣的方式將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體或表達(dá)盒呈遞至植物。凡導(dǎo)入一個(gè)以上核苷酸的情況下，這些多核苷酸可被裝配成單核苷酸構(gòu)建體的部分，或裝配成單獨(dú)的核苷酸構(gòu)建體，且可位于相同或不同的轉(zhuǎn)化載體上。相應(yīng)地，這些多核苷酸可在植物內(nèi)單一的轉(zhuǎn)化事件中，單獨(dú)的轉(zhuǎn)化事件中，或者作為育種方案的一部分而被導(dǎo)入目標(biāo)植物細(xì)胞。本發(fā)明的方法不依賴于將一個(gè)或多個(gè)多核苷酸導(dǎo)入植物的特定方法，而只取決于多核苷酸得以進(jìn)入至少一個(gè)植物細(xì)胞內(nèi)部。本技術(shù)領(lǐng)域中已知的將多核苷酸導(dǎo)入植物的方法，包括但不僅限于，瞬間轉(zhuǎn)化法、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法，以及病毒介導(dǎo)法。在多核苷酸的情況下，本文所用術(shù)語“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”或“瞬時(shí)表達(dá)”是指將多核苷酸導(dǎo)入植物，而并不會(huì)被整合入植物基因組中。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)表達(dá)可通過采用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)任何適當(dāng)?shù)囊阎椒▉韺?shí)現(xiàn)。例如，瞬時(shí)表達(dá)可以采用植物細(xì)胞培養(yǎng)或采用重組土壤桿菌菌株的浸潤(rùn)植株葉來實(shí)施。瞬時(shí)表達(dá)不會(huì)被任何植物后代所遺傳。在導(dǎo)入植物的多核苷酸情況下，本文所用術(shù)語“穩(wěn)定導(dǎo)入”或“穩(wěn)定導(dǎo)入(后)的”意指導(dǎo)入的多核苷酸是穩(wěn)定包含在植物基因組中的，因而該植物被此多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(后)的”是指表示被導(dǎo)入植物中的多核苷酸(如本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體或表達(dá)盒)可整合至植物基因組內(nèi)，并能夠由其后代遺傳，更具體地說，能夠由多個(gè)連續(xù)后代遺傳。在這些植物轉(zhuǎn)化的技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知許多可用于植物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體，并且本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體和表達(dá)盒可與任何此類載體一起使用。載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的目標(biāo)植物物種。對(duì)于某些目標(biāo)物種，優(yōu)選不同的抗生素或 除草劑選擇性標(biāo)記。轉(zhuǎn)化常規(guī)使用的選擇性標(biāo)記包括那些本文上述的選擇性標(biāo)記。在本技術(shù)領(lǐng)域中，用于轉(zhuǎn)化的方法和載體也是眾所周知的。例如，Ti質(zhì)粒載體已被用于遞送外源DNA，以及DNA直接攝取、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射以及基因槍微彈。此外，土壤桿菌屬(Agrobacterium)細(xì)菌可被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。以下是雙子葉植物和單子葉植物轉(zhuǎn)化的代表性技術(shù)以及代表性的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)的說明。許多載體都可采用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這些典型載體通常至少攜帶一個(gè)T-DNA邊界序列，并包括諸如pBIN19這類的載體(Bevan(1984)核酸研究12:8711-8721)。對(duì)于土壤桿菌轉(zhuǎn)化有益的載體的構(gòu)建，例如，參見美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2006/0260011和美國專利號(hào)7，029，908，均通過引用而構(gòu)成本文的一部分。未使用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化規(guī)避了選定轉(zhuǎn)化載體中對(duì)T-DNA序列的要求，因此除了諸如上述包含T-DNA序列的載體以外，還可利用缺乏這些序列的載體。不依賴土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊、原生質(zhì)體攝取(如PEG和電穿孔)以及顯微注射而進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。載體選擇在很大程度上取決于需轉(zhuǎn)化的植物物種的優(yōu)先選擇。對(duì)于這類載體的構(gòu)建，例如，參見美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2006/0260011，均通過弓I用而構(gòu)成本文的一部分。凡希望向植物質(zhì)體導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體或表達(dá)盒的情況，均采用了質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPH143(W0 97/32011，參見例36)。從而，可將表達(dá)盒插入pPH143以取代PROTOX編碼序列。然后，將該載體用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化和就大觀霉素篩選抗性轉(zhuǎn)化子。備選地，將表達(dá)盒插入pPH143中，使其取代aadH基因。在這種情況下，就對(duì)PROTOX抑制劑的抗性篩選轉(zhuǎn)化子。參見，美國專利號(hào)7，235，711披露的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，以其整體通過引用構(gòu)成本文的一部分。在本技術(shù)中，雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)是眾所周知的，并且包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)涉及直接由原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。這可以通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、粒子轟擊介導(dǎo)的遞送，或顯微注射而實(shí)現(xiàn)。這些技術(shù)的實(shí)例如下所述Paszkowski 等(1984)EMB0雜志(EMBO J) 3:2717-2722 ；Potrykus等(1985)分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)Mol. Gen. Genet. 199:169-177，Reich等(1986)生物技術(shù)(Biotechnology) 4 :1001 - 1004 ;以及 Klein 等(1987)自然(Nature) 327:70-73。在每種情況下，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均采用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)再生成完整植物。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為雙子葉植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)，這是由于其高效率的轉(zhuǎn)化及在許多不同物種的廣泛應(yīng)用。土壤桿菌轉(zhuǎn)化通常涉及攜帶目標(biāo)外源DNA的二元載體(如PCIB200或pCIB2001)向適當(dāng)土壤桿菌菌株的轉(zhuǎn)移，這可以取決于宿主土壤桿菌菌株在共駐存的Ti質(zhì)?；蛉旧w上所攜帶的vir基因的補(bǔ)充(如pCIB200和pCIB2001的CIB542菌株(Uknes等(1993)植物細(xì)胞(Plant Cel) 15:159-169)。重組二元載體向土壤桿菌的轉(zhuǎn)移是采用攜帶著重組二元載體的大腸桿菌(一種攜帶著諸如PRK2013質(zhì)粒且能夠?qū)⒅亟M二元載體移動(dòng)至目標(biāo)土壤桿菌菌株的輔助大腸桿菌)通過三親株的交配程序而完成的。備選地，重組二元載體可通過DNA轉(zhuǎn)化而被轉(zhuǎn)移至土壤桿菌(Hofgen和Willmitzer (1988)核酸研究(NucI. Acids Res). 16:9877)。重組土壤桿菌介導(dǎo)的目標(biāo)植物物種的轉(zhuǎn)化通常涉及土壤桿菌與植物外植體的共培養(yǎng)，并遵循本技術(shù)中眾所周知的規(guī)程而進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的組織在攜帶著存在于二元質(zhì)粒T-DNA 邊界之間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的選擇性培養(yǎng)基上再生。用目標(biāo)多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一種方法涉及植物組織和細(xì)胞的推動(dòng)惰性或生物活性粒子。該技術(shù)披露于美國專利號(hào)4，945，050,5, 036，006和5，100，792，通過引用而構(gòu)成本文的一部分。一般來說，這種方法涉及在有效滲透至細(xì)胞外表面并提供了其內(nèi)部整合的條件下在細(xì)胞上推動(dòng)惰性或生物活性粒子。當(dāng)利用惰性粒子時(shí)，載體可以通過包被攜帶著含有所需基因載體的粒子的方式而被導(dǎo)入至植物細(xì)胞內(nèi)。備選地，目標(biāo)細(xì)胞可被載體包圍，以致于載體能夠通過粒子尾流而得以進(jìn)入細(xì)胞。生物活性粒子(例如，干的酵母細(xì)胞、干的細(xì)菌或噬菌體，每種均含有試圖導(dǎo)入的DNA )也可以被推入植物細(xì)胞組織中。大多數(shù)單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化目前也已成為常規(guī)程序。優(yōu)選的技術(shù)包括采用PEG或電穿孔技術(shù)將基因直接轉(zhuǎn)移入原生質(zhì)體以及粒子轟擊至愈傷組織內(nèi)。轉(zhuǎn)化可以采用單個(gè)DNA物種或多個(gè)DNA物種(即共轉(zhuǎn)化)進(jìn)行，且兩種技術(shù)均適合用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化可以具有避免完全型載體構(gòu)建及產(chǎn)生具有目標(biāo)基因的非伴性基因座和選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株，能夠在后代中去除選擇性標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)，這應(yīng)該被視為可取的。然而，共轉(zhuǎn)化應(yīng)用的缺點(diǎn)是單獨(dú)DNA物種被整合至基因組的頻率低于 100% (Schocher 等(1986)生物技術(shù)(Biotechnology) 4:1093-1096)。專利申請(qǐng)EP 0292435,EP 0392225和WO 93/07278描述了采用PEG或電穿孔法制備原種純系玉米的愈傷組織和原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，以及從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植株的技術(shù)。Gordon-Kamm 等(植物細(xì)胞(Plant Cell) 2:603-618( 1990))和 Fromm 等(生物技術(shù)(Biotechnology) 8:833-839 (1990))已發(fā)表了米用粒子轟擊法轉(zhuǎn)化A188衍生的玉米株的技術(shù)。此外，WO 93/07278 和 Koziel 等(生物技術(shù)(Biotechnology) 11:194-200(1993))描述了采用粒子轟擊法轉(zhuǎn)化原種純系玉米的技術(shù)。這種技術(shù)利用從玉米授粉后14-15天的玉米穗切斷的I. 5-2. 5mm長(zhǎng)的玉米幼胚和I3DS-IOOOHe的生物彈轟擊設(shè)備。參見，美國專利號(hào)6，403，865披露的生物彈道學(xué)轉(zhuǎn)化方法，以其整體通過引用構(gòu)成本文的一部分。水稻轉(zhuǎn)化也可以采用直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)利用原生質(zhì)體或粒子轟擊法進(jìn)行。已對(duì)粳型和秈型描述原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Zhang等(1988)植物細(xì)胞報(bào)告(Plant CellRep) 7:379-384 ;Shimamoto 等(1989)自然(Nature) 338:274-277 ;以及 Datta (1990)生物技術(shù)(Biotechnology)8:736-740)。這兩種類型也可采用粒子轟擊法(Christou等(1991)生物技術(shù)(Biotechnology)9 :957-962)進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化。此外，WO 93/21335描述了通過電穿孔而轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)。專利申請(qǐng)EP 0332581描述了早熟禾亞科原生質(zhì)體產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)。這些技術(shù)允許鴨茅和小麥的轉(zhuǎn)化。此外，Vasil等(生物技術(shù)(Biotechnology) 10:667-674(1992 已采用粒子轟擊進(jìn)入C型長(zhǎng)期再生愈傷組織的細(xì)胞描述了小麥轉(zhuǎn)化，而且Vasil等(生物技術(shù)(Biotechnology) 11:1553-1558 (1993))和 Weeks 等(植物生理學(xué)(PlantPhysiol. ) 102 :1077-1084 (1993))也已采用粒子轟擊幼胚和幼胚來源的愈傷組織而對(duì)此進(jìn)行了描述。然而，小麥轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)涉及通過粒子轟擊小麥幼胚而進(jìn)行的小麥轉(zhuǎn)化，也包括基因遞送之前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊之前，將任何數(shù)目的胚胎(0. 75-1毫米長(zhǎng))涂布至含3%鹿糖和3mg/L 2，4 - D的MS培養(yǎng)基上(Murashige和Skoog (1962)Physiologia Plantaruml5:473_497)以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚,這是允許在黑暗中進(jìn)行的。在選定的轟擊當(dāng)天，從誘導(dǎo)培養(yǎng)基取胚胎，并置于滲壓劑(即按照一般為15%的所需濃度添加的蔗糖或麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上。允許這些胚胎胞質(zhì)皺縮達(dá)2-3小時(shí)，然后對(duì)其進(jìn)行轟擊。雖然不是很關(guān)鍵，但每塊目標(biāo)平板的20個(gè)胚胎是典型的?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)方法將合適的攜帶基因的質(zhì)粒(PCIB3064或pS0G35)沉淀至微米大小的金顆粒上。每板胚胎均用 DuPont BIOUST丨設(shè)備以約IOOOpsi的爆破壓力采用標(biāo)準(zhǔn)80目屏進(jìn)行轟擊。轟擊后，這些胚胎被放置回黑暗處以恢復(fù)約24小時(shí)(仍置于滲壓劑上)。24小時(shí)后，從滲壓劑中取出這些胚胎，并放置回誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，再生前在該處維持大約I個(gè)月。約一個(gè)月后，攜帶發(fā)育中胚胎形成愈傷組織的胚胎外植體被轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上(MS+lmg/L的NAA，5mg/LGA),進(jìn)一步包含適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑(在pCIB3064的情況下10mg/L的basta,而在pS0G35的情況下2mg/L的甲氨蝶呤)。約一個(gè)月后，發(fā)育的芽被轉(zhuǎn)移至稱為“GA7s”的更大無菌容器中，其中含有半強(qiáng)度MS，2%蔗糖，以及相同濃度的選擇性試劑。采用土壤桿菌對(duì)單子葉植物的轉(zhuǎn)化也已經(jīng)被描述。參見W094/00977及美國專利號(hào)5，591，616，兩者均通過引用而構(gòu)成本文的一部分；參見Negrotto等(2000)植物細(xì)胞報(bào)告(Plant Cell Reports) 19:798-803,通過引用構(gòu)成本文的一部分。。例如,水稻(Oryza sativa)可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。也可使用多種水稻品種(Hiei等(1994)植物學(xué)報(bào)(Plant Journal) 6:271-282 ;Dong 等(1996)分子育種(MolecularBreeding) 2:267-276 ；Hiei 等(1997)植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology), 35 205-218)。此外，下文所述的各種培養(yǎng)基組分可以是有不同的數(shù)量差異或各種取代的。通過在MS-CM培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)鹽，4. 3g/升；B5維生素(200X)，5ml/L ;蔗糖，30g/L ;脯氨酸，500mg/L ;谷氨酰胺，500mg/L ;酪蛋白水解物，300mg/L ;2，4_D( lmg/mL)，2mL/L，用 IN KOH將pH值調(diào)整至5. 8 ;植物凝膠，3g/L)上的培養(yǎng)而起始胚胎發(fā)生反應(yīng)和/或從成熟胚建立培養(yǎng)物。無論是在培養(yǎng)物反應(yīng)初始階段的成熟胚還是已構(gòu)建的培養(yǎng)物品系均給予接種，并與包含所需載體構(gòu)建體的根癌土壤桿菌菌株LBA4404 (土壤桿菌)進(jìn)行共培養(yǎng)。將土壤桿菌從甘油儲(chǔ)備液到固體YPC培養(yǎng)基(100mg/L的壯觀霉素和任何其他適當(dāng)?shù)目股?上于28°C培養(yǎng)2天。將土壤桿菌在液肽MS-CM培養(yǎng)基中重懸。將此土壤桿菌培養(yǎng)物稀釋至在光密度(0D>600處為0. 2-0. 3的值，并且添加乙酰丁香酮至200 u M的終濃度。在將該溶液與水稻培養(yǎng)物混合之前，添加乙酰丁香酮以誘導(dǎo)土壤桿菌將DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。對(duì)接種而言，將植物培養(yǎng)物浸入菌懸液中。取液體菌懸液，將接種后的培養(yǎng)物置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，并于22°C孵育兩天。然后，將此培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有替卡西林(400mg/L)的MS-CM培養(yǎng)基上，以抑制土壤桿菌的生長(zhǎng)。對(duì)于利用PMI選擇性標(biāo)記基因的構(gòu)建體(Reed等(2001)體外細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)-植物(In Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant) 37:127-132)，7天后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有甘露糖作為碳水化合物來源的選擇性培養(yǎng)基中(含有2%甘露糖，300mg/L替卡西林的MS)，并在暗處培養(yǎng)3-4周。然后，將抗性菌落轉(zhuǎn)移至再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基(不含2，4-D，含0. 5mg/L IAA, lmg/L玉米素，200mg/L特美汀，2%甘露糖和3%山梨醇的MS)上，并于暗處生長(zhǎng)14天。然后，將增殖菌落轉(zhuǎn)移至新一輪的再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并移動(dòng)至光源生長(zhǎng)室內(nèi)。將再生的芽轉(zhuǎn)移至含有GA7-1培養(yǎng)基(不含激素和含2%山梨醇的MS)的GA7容器中達(dá)2周，然后當(dāng)它們足夠大且有足夠根時(shí)，將其移至溫室。將植物移植至溫室內(nèi)的土壤中(Ttl代)生長(zhǎng)成熟，然后收獲T1種子。 已采用本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可依據(jù)傳統(tǒng)方式培養(yǎng)成植物。例如，參見 McCormick 等(1986)植物細(xì)胞報(bào)告(Plant Cell Reports)5:81-84。然后，可以使這些植物生長(zhǎng)，并用相同的轉(zhuǎn)化株或者以不同的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行授粉，而由此產(chǎn)生的后代具有所需的表型鑒定特征的表達(dá)。可培養(yǎng)兩代或更多代，以確保所需表型特征的表達(dá)能夠維持穩(wěn)定，并可遺傳，然后采集種子，以確保所需表型特征的表達(dá)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。在這種方式下，本發(fā)明提供了含有穩(wěn)定導(dǎo)入其基因組內(nèi)的本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體或表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)。通過用本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化而獲得的植物可以是任何種類繁多的植物物種之一，其中包括單子葉植物和雙子葉植物中的物種；以及本文其他處所述的農(nóng)藝學(xué)重要目標(biāo)作物列表之一。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體和表達(dá)盒可與其他生產(chǎn)和質(zhì)量的重要特點(diǎn)相結(jié)合而得以通過育種被整合至植物株內(nèi)。育種方法和技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。例如,參見Welsh,植物遺傳學(xué)與育種原理(Fundamentals of Plant Geneticsand Breeding), John Wiley 和 Sons,NY( 1981);作物育種(Crop Breeding)(Wood編著，美國麥迪遜農(nóng)學(xué)院,威斯康星州(1983);Mayo,植物育種理論(The Theory of Plant Breeding)(第二版；Clarendon出版社，牛津城(1987)) ；Singh,疾病抗性蟲害育種(Breeding forResistance to Diseases and Insect Pests)(施普林格出版社,紐約州(1986) ;Wricke和 Weber,數(shù)量遺傳學(xué)與選擇性植物育種(Quantitative Genetics and Selection PlantBreeding), Walter de Gruyter 和 Co,柏林(1986)。以上所述改造入轉(zhuǎn)基因種子和植物的遺傳特性是通過有性繁殖或營養(yǎng)生長(zhǎng)來傳代的，因此可在后代植物中維持和傳播般情況下，維持很傳播利用了已知建立好的農(nóng)作方法，以適合特定用途，如耕作、播種或收割。目標(biāo)多肽的穩(wěn)定性整合和表達(dá)的檢測(cè)上述情況導(dǎo)致具有光合能力的綠色植株和植物的再生。如上所述，用于確定目標(biāo)核酸分子已穩(wěn)定整合入目標(biāo)植物、或其植物部分的基因組的測(cè)試，必須取決于賦予植物的特性。例如，當(dāng)特性是除草劑抗性，應(yīng)在對(duì)不經(jīng)歷轉(zhuǎn)化過程的對(duì)照植物致命的條件下，以除草劑噴灑或涂布葉片對(duì)生長(zhǎng)中的植物進(jìn)行處理，從而完成確定。在轉(zhuǎn)化植物或其植物部分中，目標(biāo)多肽的表達(dá)可以采用免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。免疫學(xué)方法包括但不限于采用基于免疫技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定系統(tǒng)，如Western印跡法、放射性免疫測(cè)定法、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、多重ELISA、“三明治”免疫測(cè)定法、免疫沉淀測(cè)定法、沉淀反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定法、凝集測(cè)定法、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定法、免疫放射測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法、蛋白A免疫測(cè)定法等。這些測(cè)定法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(參見，例如Ausubel等(1994)同上)。除了免疫測(cè)定法以外，可以通過評(píng)估編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸或報(bào)告基因或兩者的表達(dá)譜進(jìn)行表達(dá)測(cè)量。例如，可以采用Northern分析法、PCR、RT-PCR、Taq Man分析、核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定法、FRET檢測(cè)、單分子或多分子信標(biāo)監(jiān)測(cè)、寡核苷酸陣列雜交、cDNA陣列雜交、多核苷酸陣列雜交、液態(tài)微陣列雜交、微電子陣列雜交、基因測(cè)序、克隆雜交、cDNA片段指紋等來評(píng)估表達(dá)譜。應(yīng)根據(jù)諸如RNA恢復(fù)數(shù)、工作人員偏好、可用試劑和設(shè)備、檢測(cè)器等因素而選定特定方法。以下實(shí)施例是通過例證的方式，而不是通過限制的方式提供的。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例I :載體 構(gòu)建了 20個(gè)載體，以測(cè)試雙增強(qiáng)子的概念。針對(duì)煙草或小麥表達(dá)，產(chǎn)生了兩套每套9個(gè)載體。在小麥和煙草中均進(jìn)行了各增強(qiáng)子和增強(qiáng)子結(jié)合的測(cè)試。僅在煙草中進(jìn)行了兩個(gè)額外載體的測(cè)試。洋丁香啟動(dòng)子和35S終止子用于煙草表達(dá)，而PEPC啟動(dòng)子和PEPC終止子用于小麥表達(dá)。靶向ER的內(nèi)切葡聚糖酶用作報(bào)告基因。該內(nèi)切葡聚糖酶基因是針對(duì)表達(dá)宿主優(yōu)化過的密碼子針對(duì)玉米表達(dá)的玉米最優(yōu)化和針對(duì)煙草表達(dá)的大豆最優(yōu)化。注意保持啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間以及增強(qiáng)子與起始密碼子(Kozak)之間的上下游針對(duì)玉米或煙草的所有構(gòu)建體均是相同的。在采用了雙增強(qiáng)子的情況下，序列是連續(xù)的，增強(qiáng)子之間不含任何干擾序列。煙草啟動(dòng)子-TGCGGATCC -增強(qiáng)子插入_ AAAAAA -報(bào)告基因玉米啟動(dòng)子-GGATCC-增強(qiáng)子插入-TAAACC -報(bào)告基因。載體構(gòu)建更多詳情如下所述。實(shí)施例2 :串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件增強(qiáng)煙草瞬時(shí)系統(tǒng)中的表達(dá)在煙草瞬時(shí)系統(tǒng)中產(chǎn)生的結(jié)果表明與對(duì)照構(gòu)建體相比較，內(nèi)切葡聚糖酶(EG)的表達(dá)能夠在用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的煙草植物葉片中顯著增加，其中兩個(gè)翻譯增強(qiáng)子元件(病毒+細(xì)胞5’ UTRs)位于彼此相對(duì)串聯(lián)的位置。當(dāng)病毒翻譯增強(qiáng)子元件置于細(xì)胞增強(qiáng)子元件上游處(即5’端)時(shí)，可觀察到表達(dá)的增強(qiáng)。方法植物材料采用TEV-B煙草轉(zhuǎn)化子的瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定法用于監(jiān)測(cè)多個(gè)核苷酸構(gòu)建體所提供的EG表達(dá)水平。多核苷酸構(gòu)建體米用了 6種不同的多核苷酸構(gòu)建體。這些構(gòu)建體含有置于編碼EG序列上游的病毒和細(xì)胞5’ UTR的各種組合。這些構(gòu)建體用于煙草瞬時(shí)和穩(wěn)定系統(tǒng)。I.串聯(lián)構(gòu)建體Q -NtADH構(gòu)建體在這種構(gòu)建體中，煙草花葉病毒(TMV)的病毒翻譯增強(qiáng)子元件(5’UTR (5’前導(dǎo)肽)，也稱為“Q” (SEQ ID NO: I)與煙草醇脫氫酶(NtADH)基因的細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件5’UTR(SEQ ID N0:4)串聯(lián)堆疊。這種構(gòu)建體的元件以如下5’-3’順序放置
(I)黃葉縮葉病毒的洋丁香啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 12); (2) Q增強(qiáng)子(SEQ ID NO: I)； (3)NtADH翻譯增強(qiáng)子元件(SEQ ID N0:4);(4)6bp的大豆Kozak序列(SEQ ID NO: 13)； (5)大豆種子大豆球蛋白的信號(hào)序列(SEQ ID NO: 14) ； (6)內(nèi)切葡聚糖酶編碼序列(SEQ ID NO: 15) ； (7)ER 滯留信號(hào)(SEQ ID NO:16);以及(8) t35s 轉(zhuǎn)錄終止子(SEQ ID NO: 17)。NtADH- Q構(gòu)建體在這種構(gòu)建體中，細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件(NtADH基因的5’UTR(SEQ ID N0:4)與病毒的譯增強(qiáng)子元件(TMV的5’UTR(SEQ ID N0:1))串聯(lián)堆疊。這種構(gòu)建體的元件以如下5’-3’順序放置(1)黃葉縮葉病毒的洋丁香啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 12) ； (2)NtADH 翻譯增強(qiáng)子元件(SEQ ID N0:4)；(3) Q 增強(qiáng)子(SEQ ID NO: I)； (4) 6bp 的大豆 Kozak序列(SEQ ID NO: 13)； (5)大豆種子大豆球蛋白的信號(hào)序列(SEQ ID NO: 14)； (6)內(nèi)切葡聚糖酶編碼序列(SEQ ID NO: 15); (7)ER滯留信號(hào)(SEQ ID NO: 16);以及(8)t35s轉(zhuǎn)錄終止子(SEQ ID NO:17)。2.單獨(dú)的構(gòu)建體
Q構(gòu)建體這種構(gòu)建體的元件以如下5’ -3’順序放置(I)黃葉縮葉病毒的洋丁香啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 12) ; (2) Q 增強(qiáng)子(SEQ ID NO: I) ; (3) 6bp 的大豆 Kozak 序列(SEQID NO: 13) ； (4)大豆種子大豆球蛋白的信號(hào)序列(SEQ ID NO: 14) ； (5)內(nèi)切葡聚糖酶編碼序列(SEQ ID NO: 15)； (6)ER 滯留信號(hào)(SEQ ID NO: 16);以及(7) t35s 轉(zhuǎn)錄終止子(SEQ IDNO:17)。NtADH構(gòu)建體這種構(gòu)建體的元件以如下5’ _3’順序放置(I)黃葉縮葉病毒的洋丁香啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 12) ; (2)NtADH翻譯增強(qiáng)子元件(SEQ ID NO:4) ; (3) 6bp的大豆Kozak序列(SEQ ID NO: 13) ； (4)大豆種子大豆球蛋白的信號(hào)序列(SEQ ID NO: 14) ； (5)內(nèi)切葡聚糖酶編碼序列(SEQ ID NO: 15); (6)ER滯留信號(hào)(SEQ ID NO: 16);以及(7)t35s轉(zhuǎn)錄終止子(SEQ ID NO: 17)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化規(guī)程(Transient Transformation Protocol):將表達(dá)盒克隆至二元載體內(nèi)。采用凍融法將二元載體轉(zhuǎn)移入根癌土壤菌株LBA4404內(nèi)(An等(1988) “二元載體”A31-19,植物分子生物學(xué)手冊(cè)(Plant Molecular Biology Manual ), Gelvin 和Schilproot 編著(Kluwar 科學(xué)出版社，Dordrecht)。TEV-B幼株的葉片(4周齡)被用于酶的瞬時(shí)表達(dá)。含有來自抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默的TEV的突變Pl/HC-Pro基因的的轉(zhuǎn)基因TEV-B煙草植物(在煙草栽培品種Xanthi中制備)用于煙草葉片中所選酶的瞬時(shí)表達(dá)(Mallory等(2002)自然-生物技術(shù)(Nat.Biotechnol) 20:622-625)。按照 Azhakanandam 等(2007)植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol. ) 63:393-404所述的方法進(jìn)行土壤桿菌培養(yǎng)物的制備和煙草的浸潤(rùn)。簡(jiǎn)單地說，將經(jīng)過遺傳修飾的土壤桿菌于含有100 U M乙酰丁香酮和10 ii M MES(pH 5. 6)的50ml LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過夜，隨后以4000X g離心10分鐘，使菌液沉淀。將該沉淀物于感染培養(yǎng)基內(nèi)重新懸浮(含維生素、2%蔗糖、500 ii M MESCpH 5. 6)、IOy M MgSO4和100 u M乙酰丁香酮的Murashige和Skoog鹽)至OD600=L 0，其后于28°C放置3小時(shí)。采用5ml注射器通過對(duì)著葉片背軸面按壓注射器頭(不帶針)而進(jìn)行大約4周齡的TEV-B煙草植株個(gè)別葉片的浸潤(rùn)。浸潤(rùn)植物均保持在22-25°C，其光照周期為16小時(shí)明和8小時(shí)暗。浸潤(rùn)后5天采集植物組織，用于后續(xù)分析?；钚詼y(cè)定該方法根據(jù)40°C、pH 4. 75的CM-纖維素上產(chǎn)生的自由葡萄糖，以nmol/min/mg蛋白質(zhì)的形式測(cè)量EG。葡萄糖氧化酶/過氧化物酶(G0P0D)化學(xué)被用于測(cè)量相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的葡萄糖?；谄咸烟堑臏y(cè)定法是比色法，其中G0P0D能夠與葡萄糖在40°C反應(yīng)生成淺至深粉紅色生色團(tuán)的光。該測(cè)定法包括4個(gè)基本步驟(I)研磨/磨轉(zhuǎn)基因組織；(2)稱出粗組織樣本；(3)在Na-醋酸緩沖液中提取酶；和(4)測(cè)定酶活性/蛋白定量。I.材料鈉-醋酸緩沖溶液每50ml緩沖液含IOOmM醋酸鈉(pH 4. 75),0. 02%NaN3、0. 02%吐溫和I片完整的蛋白酶抑制劑混合物片。制備該緩沖液，并將其儲(chǔ)存于4°C長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月；添加混合物片劑后，該緩沖液于4°C有I周的有效期。在約800ml的水中，將50ml醋酸鈉(lM)、50ml醋酸(1M)混合，pH值調(diào)整到4. 75，從而制備該溶液。然后，添加IOml疊氮鈉(2%)和IOml吐溫(2%)，并加水稀釋至1L。底物溶液稱取5g CMC-4M，置入IOOOml的干燥容量瓶中，制備0. 5%的羧甲基纖維素(CMC-4M ；Megazyme批號(hào)#81101 ；fficklow,愛爾蘭)溶液。將樣品用25ml 95%的乙醇徹底濕潤(rùn)，并一邊添加600ml的水一邊攪拌。將該溶液加熱至100°C，并攪拌10分鐘，以確保底物能夠溶解。然后，使該溶液冷卻至25°C，隨后添加50ml的醋酸鈉(lM)、50ml的醋酸(1M)，和IOml的疊氮鈉(2%)，并將其體積用水調(diào)節(jié)至1000ml。將該底物溶液儲(chǔ)存于4° C?！?葡萄糖苷酶溶液將每Iml底物與20iU的黑曲霉(Megazyme) P -葡萄糖苷酶混合，至終濃度為0. Sul/ml。該溶液應(yīng)每日新鮮制備。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液在無水葡萄糖(99. 5%純度)的醋酸鈉緩沖液中制備濃縮葡萄糖(IOOmM)0在醋酸鈉緩沖液中制備稀釋液，以產(chǎn)生0、1、2、3、4和5mM的葡萄糖。在GOPOD測(cè)定中，添加20 u I的各標(biāo)準(zhǔn)液，以生成0、1、20、40、60、80和IOOnmol的標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖試劑緩沖液(濃縮液IM正磷酸二氫鉀；200mM對(duì)羥基苯甲酸；和0. 4%的疊氮鈉。葡萄糖測(cè)定試劑(每小瓶)>12，000U葡萄糖氧化酶；>650U過氧化物酶；和
0.4mmol 4-氨基安替比林。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1. Omg/ml葡萄糖；和0. 2%w/v苯甲酸。顯色試劑(GOPOD):將50. Oml的葡萄糖試劑緩沖液用水稀釋至1L。將I小瓶葡萄糖測(cè)定試劑的內(nèi)容物溶解于葡萄糖試劑緩沖液中。若儲(chǔ)存在棕色試劑瓶中時(shí)，產(chǎn)生的GOPPOD試劑可在2-5°C穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，或若儲(chǔ)存在冷凍狀態(tài)中，則產(chǎn)生的GOPPOD試劑可穩(wěn)定>12個(gè)月。若這種試劑是新鮮制備的，則它可以是淺黃色或淺粉色的顏色。4°C儲(chǔ)存超過2-3個(gè)月后，它會(huì)形成很強(qiáng)的粉紅色。當(dāng)對(duì)蒸餾水讀數(shù)時(shí)，該溶液的吸光度應(yīng)小于0. 05。2.樣品制備和提取綠葉樣品/24孔板形式向保存在干冰上的24孔板的每孔內(nèi)添加4個(gè)滾珠軸承。對(duì)于每個(gè)樣品，將約0. 5g的綠葉轉(zhuǎn)移至板的每孔中，將板用橡膠塞密封，并放置在_80°C至少3小時(shí)。在測(cè)定當(dāng)天，將樣品采用K丨eeOR'滴定板/微管研磨機(jī)(Kleco ;Visalia,CA)研磨2分鐘，然后于3000rpm短暫離心30秒。從板上拿掉橡膠塞，并加入l_3ml的醋酸鈉。然后，用板封口機(jī)將24孔板密封兩次，每個(gè)方向一次，然后振蕩。然后，在室溫下采用臺(tái)式旋轉(zhuǎn)器提取樣品20分鐘。將24孔板于3000rpm離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至存檔板(即96孔平底計(jì)數(shù)板或96深孔板)，留下底部標(biāo)準(zhǔn)液空行。3.測(cè)定在干冰上以復(fù)制方式制備96孔PCR板。對(duì)于120時(shí)間點(diǎn)(T120)的板，向板的每孔中加入50 iil的0 -葡糖苷酶和底物混合液。然后，加入20 u I的樣品提取液。
將板密封、振蕩，并短暫離心(于3000rpm離心15秒)。接著，將板置于40°C的PCR儀內(nèi)達(dá)2小時(shí)。孵育2小時(shí)后，向96孔平底計(jì)數(shù)板的每孔中加入200 U I的G0P0D，并向其中加入20 ill的T120樣品或葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。將板密封、振蕩，并短暫離心(于3000rpm離心15秒)。接著，將該板置于40°C的熱板上達(dá)20分鐘，然后，計(jì)數(shù)510nm處的吸光度(Icm光徑)。對(duì)于0時(shí)間點(diǎn)(TO)的板，向板的每孔中加入50 ill的P -葡糖苷酶和底物混合液。然后，加入20 Ul的樣品提取液。將板密封、振蕩，并短暫離心。接著，將板置于90°C的PCR儀內(nèi)達(dá)10分鐘。孵育10分鐘后，向96孔平底計(jì)數(shù)板的每孔中加入200 U I的G0P0D，并向其中加入20 Ul的TO樣品或葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。將板密封、振蕩，并短暫離心。接著，將該板置于40°C達(dá)20分鐘，然后，計(jì)數(shù)5 IOnm處的吸光度(Icm光徑)?？偟鞍赘鶕?jù)生產(chǎn)商的指南，采用Thermo Scientific Pierce BCA蛋白檢測(cè)試劑 盒(賽默飛世爾科技公司；RoCkford，IL)測(cè)量總蛋白。計(jì)算公式酶活性mol/min/mg蛋白=(nmol葡萄糖T120樣品_ nmol葡萄糖TO 樣品)X (1/120 分鐘)X (1/0. 02ml 酶 rxn 加標(biāo))=(nmol/min/ml) / (mg/ml 總蛋白)=nmol/min/mg 蛋白。結(jié)果如圖I所示，目前不含翻譯增強(qiáng)子元件的構(gòu)建體在基線處已擁有內(nèi)切葡聚糖酶(EG)活性(8 ii mol/min/mg可溶性蛋白總量),而載體對(duì)照構(gòu)建體則低于基線。對(duì)于單獨(dú)的元件構(gòu)建體，NtADH翻譯增強(qiáng)子元件提高的活性是基線約I. 5倍。相比之下，Q翻譯增強(qiáng)子元件已對(duì)活性產(chǎn)生了負(fù)面影響。關(guān)于串聯(lián)堆疊的翻譯增強(qiáng)子元件構(gòu)建體，細(xì)胞和病毒翻譯增強(qiáng)子元件的放置順序顯著影響EG表達(dá)，并最終影響了 EG活性。也就是說，當(dāng)Q翻譯增強(qiáng)子元件被置于NtADH翻譯增強(qiáng)子元件上游時(shí)，增加的活性是基線的約2. 0倍。相反，當(dāng)NtADH翻譯增強(qiáng)子元件被置于Q翻譯增強(qiáng)子元件上游時(shí)，活性則低于基線以下。因此，內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)是受到翻譯增強(qiáng)子元件的串聯(lián)安排影響的。通過將病毒增強(qiáng)子元件置于細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件的上游，EG表達(dá)比使用單獨(dú)的細(xì)胞增強(qiáng)子元件觀察到的增加了額外的約25%。由于病毒翻譯增強(qiáng)子元件相對(duì)于細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件的順序似乎能夠影響表達(dá)，從而影響活性，因而采用上述5種構(gòu)建體(不含翻譯增強(qiáng)子元件的載體；Q構(gòu)建體；NtADH構(gòu)建體A-NtADH構(gòu)建體和NtADH-Q構(gòu)建體)完成了第二組實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，5種構(gòu)建體的表達(dá)以葉鮮重計(jì)進(jìn)行了比較(圖2A);在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，5種構(gòu)建體的表達(dá)以可溶性蛋白總量計(jì)進(jìn)行了比較(圖2B)。如上所述，病毒和細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件的順序顯著影響了EG活性。因此，EG活性增加超過了用NtADH翻譯增強(qiáng)子元件的基線，只有當(dāng)病毒翻譯增強(qiáng)子元件被置于細(xì)胞翻譯增強(qiáng)子元件上游時(shí)，才會(huì)進(jìn)一步增加。與目前不含增強(qiáng)子元件的載體構(gòu)建體相比較，Q -NtADH增強(qiáng)了 EG活性的程度如表I所示。表I : Q -NtADH構(gòu)建體的內(nèi)切葡聚糖酶活性增強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.多核苷酸構(gòu)建體，其包含(a)至少一種源自病毒的翻譯增強(qiáng)子元件，其與至少一種源自細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)有效連接的編碼目的多肽的多核苷酸。
2.權(quán)利要求I的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒是植物病毒。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒是RNA病毒。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為組IV(+) ssRNA病毒的成員，并且其中源自所述病毒的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含所述病毒的前導(dǎo)肽序列(5’ UTR)。
5.權(quán)利要求4的多核苷酸構(gòu)建體,其中所述病毒為煙草花葉病毒(Tobamovirus)屬的成員，或者選自馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)和蕃爺叢 矮病毒科(Tombusviridae)的科的成員。
6.權(quán)利要求5的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒選自煙草花葉病毒(TMV)、煙草蝕紋病毒(TEV)、苜?；ㄈ~病毒(AMV)和玉米壞死線條病毒(麗eSV)。
7.權(quán)利要求6的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為TMV，并且其中源自所述TMV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO: I中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO: I中所示的序列具有至少95%的序列同一性。
8.權(quán)利要求6的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為TEV，并且其中源自所述TEV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 18中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 18中所示的序列具有至少95%的序列同一,I"生。
9.權(quán)利要求6的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述病毒為AMV或麗eSV，并且其中源自所述AMV或所述麗eSV的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19中所示的前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19中所示的序列具有至少95%的序列同一性。
10.權(quán)利要求I的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述源自細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件為醇脫氫酶基因。
11.權(quán)利要求10的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述醇脫氫酶基因來自單子葉植物或雙子葉植物。
12.權(quán)利要求10的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述醇脫氫酶基因來自煙草、水稻、擬南芥、大豆或玉米。
13.權(quán)利要求10的多核苷酸構(gòu)建體，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID N0:4中所示的煙草醇脫氫酶前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID N0:4中所示的序列具有至少95%的序列同一性。
14.權(quán)利要求10的多核苷酸構(gòu)建體，其中源自所述細(xì)胞基因的所述翻譯增強(qiáng)子元件包含SEQ ID NO:7中所示的玉米醇脫氫酶前導(dǎo)肽序列或者其功能性片段或變體，其中所述變體與SEQ ID N0:7中所示的序列具有至少95%的序列同一性。
15.包含權(quán)利要求13的多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)盒。
16.包含權(quán)利要求14的多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)盒。
17.權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子，并且其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。
18.權(quán)利要求16的表達(dá)盒，其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子，并且其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。
19.包含權(quán)利要求I的多核苷酸構(gòu)建體的植物。
20.包含權(quán)利要求17的多核苷酸構(gòu)建體的植物。
21.包含權(quán)利要求18的多核苷酸構(gòu)建體的植物。
22.權(quán)利要求19的植物，其中所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒穩(wěn)定地整合到該植物的基因組中，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
23.權(quán)利要求20的植物，其中所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒穩(wěn)定地整合到該植物的基因組中，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
24.權(quán)利要求21的植物，其中所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒穩(wěn)定地整合到該植物 的基因組中，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
25.權(quán)利要求22的植物的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含穩(wěn)定地整合到其基因組中的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
26.權(quán)利要求23的植物的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含穩(wěn)定地整合到其基因組中的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
27.權(quán)利要求24的植物的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含穩(wěn)定地整合到其基因組中的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
28.權(quán)利要求22的植物的種子，其中所述種子包含穩(wěn)定地整合到其基因組中的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
29.權(quán)利要求23的植物的種子，其中所述種子包含穩(wěn)定地整合到其基因組中的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
30.權(quán)利要求24的植物的種子，其中所述種子包含穩(wěn)定地整合到其基因組中的所述多核苷酸構(gòu)建體或所述表達(dá)盒，并且其中所述多核苷酸構(gòu)建體有效連接至在植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。
全文摘要
本文提供了增加目標(biāo)多肽在植物及其植物部分中表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明的組合物是多核苷酸構(gòu)建體，其包括(a)至少一種源自病毒的翻譯增強(qiáng)子元件，其與至少一種源自細(xì)胞基因的翻譯增強(qiáng)子元件串聯(lián)堆疊，以及(b)一種編碼目標(biāo)多肽的有效連接的多核苷酸。本發(fā)明還提供了包含這些多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)盒、載體以及轉(zhuǎn)基因植物和植物部分。本文還提供了利用本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體和表達(dá)盒增加目標(biāo)多肽在植物及其植物部分中表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/64GK102753700SQ201080042872
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者A·德布里希特, K·阿扎卡南達(dá)姆 申請(qǐng)人:先正達(dá)參股股份有限公司