專利名稱：用于乳狀液破碎和回收生物學(xué)成分的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于破碎分散在油相中的水性乳狀液微滴和分離其中含有的核酸產(chǎn)物的系統(tǒng)、方法、試劑和試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及從熱穩(wěn)定的乳狀液分離擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
用于在“油包水”乳狀液的微滴內(nèi)執(zhí)行生物學(xué)過(guò)程的方法和試劑盒的開(kāi)發(fā)，已經(jīng)為高處理量分析技術(shù)(特別是采用在乳狀液微滴內(nèi)擴(kuò)增的核酸物質(zhì)的高處理量核酸測(cè)序技術(shù))的開(kāi)發(fā)做出了巨大貢獻(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的乳狀液已經(jīng)成功地用于許多用途，包括體外轉(zhuǎn)錄/翻譯，這被稱作定向進(jìn)化和擴(kuò)增過(guò)程。例如，乳狀液的每個(gè)水性微滴是可以在其中單獨(dú)進(jìn)行目標(biāo)過(guò)程的微隔室或微反應(yīng)器，其中數(shù)千個(gè)微滴以整體平行的方式執(zhí)行該過(guò)程。在核酸擴(kuò)增的一個(gè)更具體的實(shí)例中，所述過(guò)程可以以非常高的效率進(jìn)行，且沒(méi)有鄰近微滴的污染。在 大多數(shù)應(yīng)用中，在水性乳狀液微滴中執(zhí)行的擴(kuò)增過(guò)程的類型是眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，所述方法受益于乳狀液的高效熱傳遞特征以及典型的油包水乳狀液的生物相容性。另外，許多用于產(chǎn)生可測(cè)序物質(zhì)(sequencable material)的乳狀液實(shí)施方案適合包含固相基質(zhì)諸如微球(即珠型基質(zhì))，在其上面可以固定化擴(kuò)增產(chǎn)物。這會(huì)有效地隔離擴(kuò)增產(chǎn)物，所以當(dāng)破碎乳狀液微滴來(lái)回收產(chǎn)物時(shí)，每種產(chǎn)物可以保持與其它產(chǎn)物分離，并隨后用作克隆群體。一般而言，破裂或“破碎”用于生物學(xué)背景中的油包水乳狀液，然后純化從微滴釋放出的生物物質(zhì)用于以后的應(yīng)用，優(yōu)選地不破壞或修改生物學(xué)完整性或組成。傳統(tǒng)上，已經(jīng)使用諸如異丙醇等溶劑來(lái)破碎油包水乳狀液，并通過(guò)離心方法來(lái)分離組分。在采用離心方法且擴(kuò)增的核酸群體與珠子隔離的實(shí)施方案中，優(yōu)選地重復(fù)離心過(guò)程數(shù)次，以去除油和表面活性劑，隨后用緩沖溶液沖洗，并進(jìn)一步離心以去除異丙醇。傳統(tǒng)的基于離心的方法是耗時(shí)的，且不適合轉(zhuǎn)換至可商業(yè)得到的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化平臺(tái)。因此，本發(fā)明的目的是，提供一種更有效的且可自動(dòng)化的方法，所述方法用于從乳狀液中提取生物學(xué)成分(biological elements),且不造成那些成分的破壞或特征改變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及核酸序列的測(cè)定。更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于校正在通過(guò)SBS測(cè)序核酸的過(guò)程中獲得的數(shù)據(jù)中的誤差的方法和系統(tǒng)。描述了從乳狀液提取生物物質(zhì)的方法的一個(gè)實(shí)施方案，其包括下述步驟a)使用溶劑破碎乳狀液，所述乳狀液包含多個(gè)在油連續(xù)相中的水性微滴，以生產(chǎn)混合的水-油混合物，其中所述溶劑會(huì)破裂水性微滴，所述水性微滴釋放出多個(gè)生物學(xué)成分到混合的水-油混合物中，所述生物學(xué)成分各自固定化在基質(zhì)上；b)將無(wú)機(jī)鹽導(dǎo)入混合的水-油混合物中，造成所述混合物相分離成第一相(其包含水性溶液和生物學(xué)成分)和第二相(其包含溶劑和油)；c)從第二相萃取第一相；和d)從第一相收集基質(zhì)固定化的生物學(xué)成分。上述實(shí)施方案和實(shí)現(xiàn)不一定彼此包括或排斥，可以以任意不沖突的和其它可行的方式相組合，無(wú)論它們是否與相同的或不同的實(shí)施方案或?qū)崿F(xiàn)相結(jié)合地呈現(xiàn)。一個(gè)實(shí)施方案或?qū)崿F(xiàn)的描述無(wú)意對(duì)其它實(shí)施方案和/或?qū)崿F(xiàn)進(jìn)行限制。而且，在本說(shuō)明書(shū)別處所述的任意一個(gè)或多個(gè)功能、步驟、操作或技術(shù)可以在替代實(shí)現(xiàn)中與在簡(jiǎn)述中描述的任意一個(gè)或多個(gè)功能、步驟、操作或技術(shù)相組合。因而，上述的實(shí)施方案和實(shí)現(xiàn)是例證性的，而不是限制性的。


結(jié)合附圖，從下述的詳細(xì)描述會(huì)更清楚地理解以上和其它特征。在附圖中，相同的參考數(shù)字代表相同的結(jié)構(gòu)、元件或方法步驟，并且參考數(shù)字的最左邊數(shù)字表示參考元件最早出現(xiàn)的附圖的編號(hào)(例如，元件160最早出現(xiàn)在圖I中)。然而，所有這些約定意圖是典型的或例證性的，而不是限制性的。圖I是在計(jì)算機(jī)控制和反應(yīng)基質(zhì)下的測(cè)序儀器的一個(gè)實(shí)施方案的原理框圖；且 圖2是使用鹽析方法從乳狀液中提取生物學(xué)成分的方法的一個(gè)實(shí)施方案的原理框圖。
具體實(shí)施例方式如下面將更詳細(xì)地描述的，本文所述的發(fā)明的實(shí)施方案包括用于破碎乳狀液和回收其中含有的生物學(xué)成分的系統(tǒng)、方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于擴(kuò)增核酸模板分子的油包水乳狀液和用于高處理量技術(shù)(諸如核酸測(cè)序)中的擴(kuò)增群體的回收。a. 一般解釋
術(shù)語(yǔ)“流程圖”通常表示，通過(guò)SBS方法、特別是基于焦磷酸鹽的測(cè)序方法(也稱作“焦磷酸測(cè)序”)產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)的圖示，且可以更具體地稱作“焦磷酸測(cè)序譜圖”。本文使用的術(shù)語(yǔ)“讀出”或“序列讀出”通常表示，從單個(gè)核酸模板分子或多個(gè)基本上相同的模板核酸分子拷貝群體得到的整個(gè)序列數(shù)據(jù)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“運(yùn)行”或“測(cè)序運(yùn)行”通常表示，在一個(gè)或多個(gè)模板核酸分子的測(cè)序操作中進(jìn)行的一系列測(cè)序反應(yīng)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“流”通常表示，向包含模板核酸分子的環(huán)境中加入溶液的系列循環(huán)或迭代循環(huán)，其中所述溶液可以包括用于添加到新生分子上的核苷酸物質(zhì)或其它試劑(諸如緩沖劑或酶)，所述試劑可以用于測(cè)序反應(yīng)中，或減少來(lái)自以前的核苷酸物質(zhì)流循環(huán)的遺留或噪聲效應(yīng)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“流循環(huán)”通常表示，連續(xù)的系列流，其中核苷酸物質(zhì)在該循環(huán)中流過(guò)一次(即流循環(huán)可以包括以T、A、C、G核苷酸物質(zhì)的次序連續(xù)加入，盡管其它序列組合也被視作該定義的一部分)。通常，流循環(huán)是重復(fù)的循環(huán)，其具有在循環(huán)之間相同的流次序。本文使用的術(shù)語(yǔ)“讀出長(zhǎng)度”通常表示，可以可靠地測(cè)序的模板分子的長(zhǎng)度的上限。許多因素促成系統(tǒng)和/或方法的讀出長(zhǎng)度，包括，但不限于模板核酸分子中的GC含量的程度。本文使用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)驗(yàn)片段”或“TF”通常表示，可以用于質(zhì)量控制、校正或其它相關(guān)用途的已知序列組成的核酸成分。本文使用的術(shù)語(yǔ)“引物”通常表示這樣的寡核苷酸其在一定條件下充當(dāng)DNA合成的起點(diǎn)，在所述條件下，在合適的溫度，在適當(dāng)?shù)木彌_液中，誘發(fā)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成。引物優(yōu)選地是單鏈寡脫氧核糖核苷酸。“新生分子”通常表示這樣的DNA鏈其通過(guò)摻入與模板分子中的對(duì)應(yīng)核苷酸物質(zhì)互補(bǔ)的核苷酸物質(zhì)而被模板-依賴性的DNA聚合酶延伸。術(shù)語(yǔ)“模板核酸”、“模板分子”、“靶核酸”或“靶分子”通常表示，作為測(cè)序反應(yīng)的主題的核酸分子，從所述測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)或信息。本文使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸物質(zhì)”通常表示，通常摻入新生核酸分子中的核酸單體的身份，包括嘌呤(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤)和嘧啶(胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“單體重復(fù)”或“同聚物”通常表示，包含相同核苷酸物質(zhì)(即重復(fù)的核苷酸物質(zhì))的2個(gè)或更多個(gè)序列位置。本文使用的術(shù)語(yǔ)“均勻延伸”通常表示延伸反應(yīng)的關(guān)系或階段，其中基本上相同的 模板分子群體中的每個(gè)成員均勻地執(zhí)行反應(yīng)中的相同延伸步驟。本文使用的術(shù)語(yǔ)“完成效率”通常表示，在給定的流期間適當(dāng)延伸的新生分子的百分比。本文使用的術(shù)語(yǔ)“不完全延伸率”通常表示，沒(méi)有適當(dāng)延伸的新生分子的數(shù)目與所有新生分子的數(shù)目之比。本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因組文庫(kù)”或“鳥(niǎo)槍法文庫(kù)”通常表示這樣的分子集合其源自和/或代表生物體或個(gè)體的整個(gè)基因組(即基因組的所有區(qū)域)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增子”通常表示選擇的擴(kuò)增產(chǎn)物，諸如從聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)生產(chǎn)的那些。本文使用的術(shù)語(yǔ)“變體”或“等位基因”通常表示許多物質(zhì)中的一種，所述物質(zhì)各自編碼類似的序列組成，但是彼此具有一定程度的區(qū)別。所述區(qū)別可以包括相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任意類型的遺傳變異，包括、但不限于多態(tài)性諸如單核苷酸多態(tài)性(SNP)、插入或缺失(插入/缺失事件的組合也稱作“indels”)、重復(fù)序列(也稱作串聯(lián)重復(fù))的數(shù)目的差異和結(jié)果變異。本文使用的術(shù)語(yǔ)“等位基因頻率”或“等位基因的頻率”通常表示，所有變體在由特定變體組成的群體中的比例。本文使用的術(shù)語(yǔ)“關(guān)鍵序列(key sequence) ”或“關(guān)鍵元件(key element)”通常表示，與在已知位置(即，通常包括在連接的銜接元件中)中的具有已知序列組成的模板核酸分子有關(guān)的核酸序列元件(通常在約4個(gè)序列位置，即，TGAC或核苷酸物質(zhì)的其它組合)，其被用作從模板分子產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制參照。如果序列數(shù)據(jù)包括與在正確位置的關(guān)鍵元件有關(guān)的已知序列組成，則它通過(guò)質(zhì)量控制。本文使用的術(shù)語(yǔ)“關(guān)鍵穿過(guò)(keypass)”或“關(guān)鍵穿過(guò)孔(keypass well)”通常表示，具有已知序列組成的全長(zhǎng)核酸實(shí)驗(yàn)序列(即，“實(shí)驗(yàn)片段”或上面提及的“TF”)在反應(yīng)孔中的測(cè)序，其中將源自TF序列的序列和/或與TF有關(guān)或在與靶核酸結(jié)合的接頭中的關(guān)鍵序列的準(zhǔn)確度與TF和/或關(guān)鍵(Key)的已知序列組成相對(duì)比，并用于測(cè)量測(cè)序準(zhǔn)確度和用于質(zhì)量控制。在典型的實(shí)施方案中，在測(cè)序運(yùn)行中的孔的總數(shù)的比例是關(guān)鍵穿過(guò)孔，在有些實(shí)施方案中，它們可以分布在局部。本文使用的術(shù)語(yǔ)“平端”與相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的理解一致地進(jìn)行解釋，通常表示具有用一對(duì)互補(bǔ)核苷酸堿基物質(zhì)結(jié)尾的末端的直鏈雙鏈核酸分子，其中一對(duì)平端通常適合與彼此的連接。本文使用的術(shù)語(yǔ)“粘性末端”或“突出端”與相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的理解一致地進(jìn)行解釋，通常表示在分子的一條鏈的末端處具有一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)的核苷酸物質(zhì)的直鏈雙鏈核酸分子，其中所述未配對(duì)的核苷酸物質(zhì)可以存在于任一條鏈上，且包括單個(gè)堿基位置或多個(gè)堿基位置(有時(shí)也稱作“粘端”)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“珠子”或“珠基質(zhì)”通常表示，從任意數(shù)目的已知物質(zhì)制成的任意方便大小的任意類型的珠子，所述物質(zhì)例如纖維素、纖維素衍生物、丙烯酸樹(shù)脂、玻璃、硅膠、聚苯乙烯、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、與二乙烯基苯等交聯(lián)的聚苯乙烯(描述在，例如，Merrifield、Biochemistry 3 (1964) 1385-1390)、聚丙烯酰胺、膠乳凝膠、聚苯乙烯、葡聚糖、橡膠、硅、塑料、硝酸纖維素、天然海綿、硅膠、控制孔玻璃、金屬、交聯(lián)的葡聚糖(例如，S印hadex )、瓊脂糖凝膠(瓊脂糖 )和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它固相珠子支持物。在下面一般地描述了與樣品制備和加工、序列數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和序列數(shù)據(jù)的分析有關(guān)的系統(tǒng)和方法的一些示例性的實(shí)施方案，其中的一些或全部適合與本文所述的發(fā)明的實(shí)施方案一起使用。具體地，描述了用于制備模板核酸分子、擴(kuò)增模板分子、產(chǎn)生靶物特異性的擴(kuò)增子和/或基因組文庫(kù)的系統(tǒng)和方法、測(cè)序方法和儀器以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的示例性的實(shí)施方案。在典型的實(shí)施方案中，源自實(shí)驗(yàn)樣品或診斷樣品的核酸分子必須從它的粗形式制備和加工成適合高處理量測(cè)序的模板分子。所述加工方法可以隨用途不同而異，產(chǎn)生包含不同特征的模板分子。例如，在高處理量測(cè)序的一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地制備這樣的模板分子其序列或讀出長(zhǎng)度至少是特定測(cè)序方法可以準(zhǔn)確地產(chǎn)生它的序列數(shù)據(jù)的長(zhǎng)度。在本實(shí)施例中，所述長(zhǎng)度可以包括約25-30堿基對(duì)、約50-100堿基對(duì)、約200-300堿基對(duì)、約350-500堿基對(duì)、大于500堿基對(duì)的范圍，或適合特定測(cè)序用途的其它長(zhǎng)度。在有些實(shí)施方案中，使用許多本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法，將來(lái)自樣品(諸如基因組樣品)的核酸片段化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法隨機(jī)地片段化(即不對(duì)特定序列或區(qū)域進(jìn)行選擇)核酸，且可以包括所謂的霧化或聲處理方法。但是，應(yīng)當(dāng)理解，其它片段化方法，諸如使用限制性內(nèi)切核酸酶消化，可以用于片段化目的。也在本實(shí)施例中，一些加工方法可以采用本領(lǐng)域已知的大小選擇方法，以選擇性地分離具有希望的長(zhǎng)度的核酸片段。另外，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地使額外的功能元件結(jié)合每種模板核酸分子。所述元件可以用于多種功能，包括，但不限于，用于擴(kuò)增和/或測(cè)序方法的引物序列、質(zhì)量控制元件(即諸如關(guān)鍵元件或其它類型的質(zhì)量控制元件)、編碼不同結(jié)合(諸如與來(lái)源或患者的樣品)的獨(dú)特標(biāo)識(shí)符(也稱作多路標(biāo)識(shí)符或“MID”)或其它功能元件。例如，所述發(fā)明的一些實(shí)施方案包括使具有已知的且可鑒別的序列組成的MID元件的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案與樣品結(jié)合，并使MID元件的實(shí)施方案與來(lái)自結(jié)合樣品的模板核酸分子相偶聯(lián)。將MID偶聯(lián)的、來(lái)自許多不同樣品的模板核酸分子合并成單個(gè)“多路化的”樣品或組合物，其然后可以有效地加工，以生成每個(gè)MID偶聯(lián)的模板核酸分子的序列數(shù)據(jù)。解卷積(de-convolute)每個(gè)模板核酸的序列數(shù)據(jù)，以鑒別偶聯(lián)的MID元件的序列組成 和與鑒別的起源的樣品的結(jié)合。在本實(shí)施例中，多路化的組合物可以包括來(lái)自約384個(gè)樣品、約96個(gè)樣品、約50個(gè)樣品、約20個(gè)樣品、約16個(gè)樣品、約10個(gè)樣品或其它數(shù)目的樣品的代表。在研究背景下，每個(gè)樣品可以與不同的實(shí)驗(yàn)條件、處理、物質(zhì)或個(gè)體相結(jié)合。類似地，在診斷背景下，每個(gè)樣品可以與不同的組織、細(xì)胞、個(gè)體、條件、藥物或其它處理相結(jié)合。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)明白，上面列出的樣品的數(shù)目是用于實(shí)例目的，因而不應(yīng)視作限制性的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)MID元件的序列組成是可容易地鑒別的，且不會(huì)導(dǎo)入來(lái)自測(cè)序過(guò)程的誤差。MID元件的一些實(shí)施方案包括核酸物質(zhì)的獨(dú)特序列組成，所述核酸物質(zhì)具有與天然存在的序列最小的序列相似性?；蛘撸琈ID元件的實(shí)施方案可以包括與天然存在的序列的一定程度的序列相似性。另外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，已知每個(gè)MID元件的位置與模板核酸分子和/或偶聯(lián)到模板分子上的銜接元件的某些特征有關(guān)。已知每個(gè)MID的位置，可用于發(fā)現(xiàn)序列數(shù)據(jù)中的MID元件和解釋可能出錯(cuò)的MID序列組成，并隨后與來(lái)源樣品相關(guān)聯(lián)。例如，可用作與MID元件的位置關(guān)系的錨的某些特征可以包括、但不限于模板分子的長(zhǎng)度(即已知MID元件具有的從5’或3’端的許多序列位置)、可識(shí)別的序列標(biāo)志物諸 如位于MID元件附近的關(guān)鍵元件和/或一種或多種引物元件。在本實(shí)施例中，所述關(guān)鍵元件和引物元件通常包括已知序列組成，所述序列組成通常不會(huì)隨多路組合物中的樣品不同而異，且可以用作檢索MID元件的位置參照。可以在計(jì)算機(jī)130上執(zhí)行由應(yīng)用程序135實(shí)現(xiàn)的分析算法，以分析產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)的每個(gè)MID偶聯(lián)的模板，從而鑒別更容易識(shí)別的關(guān)鍵元件和/或引物元件，并從那些位置推延，以鑒別據(jù)推測(cè)包括MID元件序列的序列區(qū)域。應(yīng)用程序135然后可以處理推測(cè)區(qū)域和在側(cè)接區(qū)中可能離開(kāi)一定距離的序列組成，以確定地鑒別出MID元件和它的序列組成。一些或所有所述的功能元件可以組合成銜接元件，所述銜接元件在某些加工步驟中偶聯(lián)至核苷酸序列上。例如，一些實(shí)施方案可以將包含互補(bǔ)序列組成的引發(fā)序列元件或區(qū)域結(jié)合到用于擴(kuò)增和/或測(cè)序的引物序列上。此外，相同的元件可以用于所謂的核酸分子的“鏈選擇”和核酸分子向固相基質(zhì)的固定化。在有些實(shí)施方案中，2組引發(fā)序列區(qū)域(此后稱作引發(fā)序列A和引發(fā)序列B)可以用于鏈選擇，其中僅具有引發(fā)序列A的一個(gè)拷貝和引發(fā)序列B的一個(gè)拷貝的單鏈被選擇，且被包括為制備的樣品。在替代實(shí)施方案中，銜接元件的設(shè)計(jì)特征消除了對(duì)鏈選擇的需求。相同的引發(fā)序列區(qū)域可以用于擴(kuò)增和固定化方法中，其中，例如，可以將引發(fā)序列B固定化在固體基質(zhì)上，并從其延伸擴(kuò)增的產(chǎn)物。為片段化、鏈選擇以及功能元件和接頭的添加而加工樣品的額外實(shí)例描述在公開(kāi)為US-2004-0185484-A1的美國(guó)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“Method forpreparing single-stranded DNA libraries”，提交日為 2004 年 I 月 28 日；公開(kāi)為US2009-0105959-A1 的美國(guó)專利申請(qǐng),標(biāo)題為“System and Method for Identification ofIndividual Samples from a Multiplex Mixture”,提交日為 2008 年 5 月 29 日；和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào) 12/380，139,標(biāo)題為 “System and Method for Improved Processing ofNucleic Acids for Production of Sequencable Libraries”，提交日為 2009 年 2 月 23日，它們各自為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文。描述了用于執(zhí)行模板核酸分子的擴(kuò)增以產(chǎn)生基本上相同的拷貝群體的系統(tǒng)和方法的不同實(shí)施例。普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，在SBS的一些實(shí)施方案中，希望產(chǎn)生每個(gè)核酸成分的多個(gè)拷貝，以在一種或多種核苷酸物質(zhì)摻入與模板分子的拷貝結(jié)合的每個(gè)新生分子中時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)。本領(lǐng)域已知許多用于產(chǎn)生核酸分子拷貝的技術(shù)，例如，使用所謂的細(xì)菌載體的擴(kuò)增、“滾環(huán)”擴(kuò)增(描述在美國(guó)專利號(hào)6，274，320和7，211，390中，通過(guò)上述引用并入)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，每種技術(shù)適合與本文所述的發(fā)明一起使用。特別適合高處理量用途的一種PCR技術(shù)包括所謂的乳狀液PCR方法(也稱作emPCR 方法)。乳狀液PCR方法的典型實(shí)施方案包括建立2種不混溶物質(zhì)的穩(wěn)定乳狀液，從而建立可以在其中發(fā)生反應(yīng)的水性微滴。具體地，適合用于PCR方法中的乳狀液的水性微滴可以包括第一流體諸如基于水的流體，其作為微滴(也稱作不連續(xù)相)懸浮或分散在另一種流體諸如疏水流體(也稱作連續(xù)相)內(nèi)，所述疏水流體通常包括某些類型的油。可以采用的油的實(shí)例包括、但不限于礦物油、基于有機(jī)硅的油或氟化的油。此外，有些乳狀液實(shí)施方案可以采用表面活性劑，所述表面 活性劑起穩(wěn)定乳狀液的作用，它們可能特別有助于特定加工方法諸如PCR。表面活性劑的一些實(shí)施方案可以包括有機(jī)硅或氟化的表面活性劑中的一種或多種。例如，可以采用一種或多種非離子型表面活性劑，包括、但不限于脫水山梨糖醇單油酸酯(也稱作Span 80)，聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(也稱作吐溫 80),或在有些優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用聚二甲基硅氧烷共聚醇(也稱作Abil EM90)、聚硅氧烷、聚烷基聚醚共聚物、聚甘油酯、泊洛沙姆和PVP/十六烷共聚物(也稱作Unimer U-151 )，或在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用在環(huán)戊硅氧烷中的高分子量有機(jī)硅聚醚(也稱作DC 5225C，可從Dow Corning得到)。乳狀液的微滴也可以稱作隔室、微膠囊、微反應(yīng)器、微環(huán)境或相關(guān)領(lǐng)域常用的其它名稱。水性微滴的大小可以隨乳狀液組分或組合物的組成、其中含有的內(nèi)容物和采用的形成技術(shù)而變化。所述的乳狀液會(huì)建立微環(huán)境，在所述微環(huán)境中可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，諸如PCR。例如，進(jìn)行希望的PCR反應(yīng)所需的模板核酸和所有試劑可以包囊在乳狀液的微滴中，并化學(xué)地分離。在一些實(shí)施方案中可以采用額外的表面活性劑或其它穩(wěn)定劑，以促進(jìn)如上所述的微滴的額外穩(wěn)定性。使用微滴可以執(zhí)行PCR方法的典型熱循環(huán)操作，以擴(kuò)增包囊的核酸模板，導(dǎo)致包含模板核酸的許多基本上相同的拷貝的群體的產(chǎn)生。在有些實(shí)施方案中，在微滴內(nèi)的群體可以稱作“克隆地分離的”、“隔室化的”、“隔離的”、“包囊的”或“局部化的”群體。也在本實(shí)施例中，一些或所有所述的微滴可以另外包囊固體基質(zhì)諸如珠子，所述珠子用于連接模板和擴(kuò)增的模板拷貝、擴(kuò)增的與模板互補(bǔ)的拷貝或它們的組合。此外，所述固體基質(zhì)可以能夠用于連接其它類型的核酸、試劑、標(biāo)記或其它目標(biāo)分子?？梢耘c本文所述的發(fā)明一起使用的乳狀液的實(shí)施方案可以包括非常高密度的微滴或微膠囊，它們使所述的化學(xué)反應(yīng)能夠以整體平行的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于擴(kuò)增的乳狀液的額外實(shí)施例和它們用于測(cè)序用途的應(yīng)用，描述在美國(guó)專利號(hào)7，638，276,7, 622，280和公開(kāi)為US-2005-0079510-A1的美國(guó)專利申請(qǐng)和公開(kāi)為US-2005-0227264-A1的美國(guó)專利申請(qǐng)中，它們各自為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文。有時(shí)稱作超深測(cè)序(Ultra-Deep Sequencing)的實(shí)施方案也會(huì)產(chǎn)生可以與本文所述的發(fā)明一起使用的用于測(cè)序的靶物特異性的擴(kuò)增子，其包括使用特異性的核酸引物集合來(lái)從包含靶核酸的樣品擴(kuò)增選擇的一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域。此外，所述樣品可以包括核酸分子群體，所述群體已知或疑似含有這樣的序列變體所述序列變體包含與研究或診斷用途有關(guān)的序列組成，其中可以采用引物來(lái)擴(kuò)增樣品中的序列變體并提供關(guān)于所述序列變體的分布的洞察。例如，可以執(zhí)行這樣的方法，所述方法通過(guò)核酸樣品中的多個(gè)等位基因的特異性擴(kuò)增和測(cè)序來(lái)鑒別序列變體。首先用一對(duì)PCR引物擴(kuò)增核酸，所述引物設(shè)計(jì)成擴(kuò)增在目標(biāo)區(qū)域周圍的區(qū)域或核酸群體共有的區(qū)段。隨后在單獨(dú)的反應(yīng)器(諸如上述的基于乳狀液的容器)中單個(gè)地進(jìn)一步擴(kuò)增PCR反應(yīng)的每種產(chǎn)物(第一擴(kuò)增子)。對(duì)得到的擴(kuò)增子(在本文中稱作第二擴(kuò)增子，各自源自第一擴(kuò)增子群體的一個(gè)成員)測(cè)序，并使用序列集合來(lái)測(cè)定存在的一個(gè)或多個(gè)變體的等位基因頻率。重要的是，所述方法不需要事先知道存在的變體，且通?？梢澡b別出以〈1%頻率存在于核酸分子群體中的變體。所述的靶物特異性的擴(kuò)增和測(cè)序方法的一些優(yōu)點(diǎn)包括比以前實(shí)現(xiàn)的更高水平的靈敏度。此外，采用高處理量測(cè)序工具的實(shí)施方案，諸如采用由454 Life SciencesCorporation提供的孔的所謂的PicoTiterPlate 陣列(有時(shí)也稱作PTP 平板或陣列)的實(shí)施方案，所述方法可以用于產(chǎn)生每次運(yùn)行或?qū)嶒?yàn)超過(guò)100，000、超過(guò)300，000、超過(guò)500，000或超過(guò)1，000, 000個(gè)核酸區(qū)域的序列組成，且可能至少部分地取決于用戶選擇，諸如通過(guò)使用襯墊實(shí)現(xiàn)的泳道構(gòu)型等。另外，所述方法會(huì)提供低豐度等位基因(其可能占等位基因變體的1%或更少)的檢測(cè)靈敏度。所述方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)包括產(chǎn)生包括分析的區(qū)域的序列的數(shù)據(jù)。重要的是，不需要具有待分析的基因座的序列的現(xiàn)有知識(shí)。 用于測(cè)序的靶物特異性的擴(kuò)增子的額外實(shí)例描述在美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)11/104，781,標(biāo)題為 “Methods for determining sequence variants using ultra-deepsequencing”，提交日為 2005 年 4 月 12 日；W0 2008/115427，標(biāo)題為 “System and Methodfor Detection of HIV Drug Resistant Variants，，,提交日為 2008 年 3 月 14 日；和公開(kāi)為US- 2010-0003687 的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)，標(biāo)題為“System and Method for Detectionof HIV Tropism Variants”，提交日為2009年6月17日，它們各自為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文。此外，測(cè)序的實(shí)施方案可以包括Sanger型技術(shù)、通常稱作雜交測(cè)序(SBH)、連接測(cè)序(SBL)或摻入測(cè)序(SBI)技術(shù)的技術(shù)。此外，所述測(cè)序技術(shù)可以包括所謂的polony測(cè)序技術(shù)；納米孔、波導(dǎo)和其它單分子檢測(cè)技術(shù)；或可逆的終止子技術(shù)。如上所述，一種優(yōu)選的技術(shù)可以包括合成測(cè)序方法。例如,有些SBS實(shí)施方案測(cè)序基本上相同的核酸模板拷貝的群體，且通常采用一種或多種寡核苷酸引物，所述引物被設(shè)計(jì)成與樣品模板分子的預(yù)定互補(bǔ)位置或與模板分子相連的一個(gè)或多個(gè)接頭對(duì)合。在有核酸聚合酶存在下，給引物/模板復(fù)合物提供核苷酸物質(zhì)。如果核苷酸物質(zhì)與核酸物質(zhì)(其與樣品模板分子上的直接鄰近寡核苷酸引物的3’末端的序列位置相對(duì)應(yīng))互補(bǔ)，則所述聚合酶會(huì)用核苷酸物質(zhì)延伸引物。或者，在一些實(shí)施方案中，給引物/模板復(fù)合物一次性提供許多目標(biāo)核苷酸物質(zhì)(通常A、G、C和T)，與在樣品模板分子上的直接鄰近寡核苷酸引物的3’末端的對(duì)應(yīng)序列位置處互補(bǔ)的核苷酸物質(zhì)被摻入。在所述實(shí)施方案中的任一個(gè)中，可以化學(xué)地阻斷核苷酸物質(zhì)(諸如在3’ -0位置)，以防止進(jìn)一步延伸，并需要在下一輪合成之前去阻斷。還應(yīng)當(dāng)理解，向新生分子的末端添加核苷酸物質(zhì)的過(guò)程，與上面關(guān)于向引物末端添加所述的過(guò)程基本上相同。如上所述，通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法，可以檢測(cè)核苷酸物質(zhì)的摻入，所述方法例如通過(guò)檢測(cè)焦磷酸鹽(PPi)的釋放，其中使用酶反應(yīng)方法來(lái)生成光，或通過(guò)檢測(cè)PH變化(在美國(guó)專利號(hào)6，210，891、6，258，568和6，828，100中所述的實(shí)施例，它們各自為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文)，或通過(guò)結(jié)合到核苷酸上的可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記的一些實(shí)例包括、但不限于質(zhì)量標(biāo)簽和熒光的或化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記。在典型的實(shí)施方案中，通過(guò)例如洗漆，去除未摻入的核苷酸。此外，在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)未摻入的核苷酸進(jìn)行酶降解，例如，使用腺苷三磷酸雙磷酸酶或焦磷酸酶的降解，這描述在公開(kāi)為 US 2009/0053724 的美國(guó)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為 “System and Method for AdaptiveReagent Control in Nucleic Acid Sequencing”,提交日為 2008 年 6 月 27 日；和公開(kāi)為US-2009-0203086-A1 的美國(guó)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“System and Method for Improved SignalDetection in Nucleic Acid Sequencing”,提交日為 2009 年 I 月 29 日，它們各自為了所有目的特此通過(guò)弓I用整體并入本文。在使用可檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)施方案中，它們通常必須在下一個(gè)合成循環(huán)之前滅活(例如通過(guò)化學(xué)裂解或光漂白)。然后可以如上所述，用另一個(gè)核苷酸物質(zhì)或多個(gè)目標(biāo)核苷酸物質(zhì)查詢模板/聚合酶復(fù)合物中的下一個(gè)序列位置。核苷酸添加、延伸、信號(hào)獲取和洗滌的重復(fù)循環(huán)會(huì)導(dǎo)致模板鏈的核苷酸序列的測(cè)定。續(xù)接本實(shí)施例，通?？梢栽谌我粋€(gè)測(cè)序反應(yīng)中同時(shí)地分析大數(shù)目或大群體的基本上相同的模板分子(例如103、104、105、106或107分子)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于可靠檢測(cè)而言足夠強(qiáng)的信號(hào)。另外，在一些實(shí)施方案中，可能有利的是，通過(guò)采用所謂的“配對(duì)末端”測(cè)序策略， 提高測(cè)序過(guò)程的讀出長(zhǎng)度能力和性質(zhì)。例如，測(cè)序方法的一些實(shí)施方案對(duì)可以產(chǎn)生高質(zhì)量和可靠讀出的分子的總長(zhǎng)度具有限制。換而言之，可靠讀出長(zhǎng)度的序列位置的總數(shù)可以不超過(guò)25、50、100或500個(gè)堿基，這取決于采用的測(cè)序?qū)嵤┓桨?。配?duì)末端測(cè)序策略如下延長(zhǎng)可靠讀出長(zhǎng)度通過(guò)單獨(dú)地測(cè)序分子的每個(gè)末端(有時(shí)稱作“標(biāo)簽”末端)，所述分子包括在每個(gè)末端處的原始模板核酸分子的片段，所述片段通過(guò)接頭序列連接至中心。模板片段的原始位置關(guān)系是已知的，因而來(lái)自序列讀出的數(shù)據(jù)可以重組成具有更長(zhǎng)的高質(zhì)量讀出長(zhǎng)度的單個(gè)讀出。配對(duì)末端測(cè)序?qū)嵤┓桨傅钠渌鼘?shí)例描述在美國(guó)專利號(hào)7，601，499，標(biāo)題為“Paired end sequencing” ；和公開(kāi)為US-2009-0233291-A1的美國(guó)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“Paired end sequencing”,提交日為2009年I月28日，它們各自為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文。SBS裝置的一些實(shí)例可以實(shí)現(xiàn)上述的一些或所有方法，且可以包括一種或多種檢測(cè)裝置，例如電荷耦合裝置(即，CCD照相機(jī))或同焦型結(jié)構(gòu)、微流體室或流動(dòng)池、反應(yīng)基質(zhì)和/或泵和流量閥。作為基于焦磷酸鹽的測(cè)序的實(shí)例，裝置的實(shí)施方案可以采用化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)策略，該策略產(chǎn)生固有地低水平的背景噪音。在有些實(shí)施方案中，用于測(cè)序的反應(yīng)基質(zhì)可以包括平面基質(zhì)諸如載玻片型基質(zhì)、離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管(也稱作“ ISFET”)或波導(dǎo)型反應(yīng)基質(zhì)，在一些實(shí)施方案中，其可以包含孔型結(jié)構(gòu)。此外，反應(yīng)基質(zhì)可以包括所謂的PTP 陣列，該陣列可從454 Life SciencesCorporation得到，如上所述，其由纖維光學(xué)面板形成，所述面板被酸蝕刻，以產(chǎn)生數(shù)十萬(wàn)個(gè)或更多個(gè)非常小的孔，每個(gè)孔能夠容納基本上相同的模板分子群體(即，有些優(yōu)選的實(shí)施方案包含在70 X 75mm PTP 陣列上的約330萬(wàn)個(gè)孔，孔之間的間距為35 Um ) 在有些實(shí)施方案中，每個(gè)基本上相同的模板分子群體可以安置在固體基質(zhì)(諸如珠子)上，每個(gè)固體基質(zhì)可以安置在所述孔之一中。例如，裝置可以包括試劑遞送元件(用于為PTP平板底座提供流體試劑)，以及CCD型檢測(cè)裝置(其能夠收集從PTP平板上的每個(gè)孔發(fā)生出的光的光子)。包含用于提高信號(hào)識(shí)別的特征的反應(yīng)基質(zhì)的實(shí)例描述在美國(guó)專利號(hào) 7，682，816，標(biāo)題為 “THIN-FILM COATED MICROffELL ARRAYS AND METHODS OF MAKINGSAME”，提交日為2005年8月30日，其為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文。用于執(zhí)行SBS型測(cè)序和焦磷酸鹽測(cè)序的裝置和方法的其它實(shí)例描述在美國(guó)專利號(hào)7，323，305和美國(guó)專利號(hào)7，575，865，它們二者通過(guò)上述引用并入。另外，可以采用使一個(gè)或多個(gè)樣品制備過(guò)程(諸如上述的emPCR 過(guò)程)自動(dòng)化的系統(tǒng)和方法。例如，自動(dòng)化的系統(tǒng)可以用于提供有效的溶液，所述溶液用于產(chǎn)生乳狀液，所述乳狀液用于emPCR加工、執(zhí)行PCR熱循環(huán)操作和富集成功地制備的核酸分子群體進(jìn)行測(cè)序。自動(dòng)化的樣品制備系統(tǒng)的實(shí)例描述在公開(kāi)為US-2005-0227264-A1的美國(guó)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion”,提交日為 2005 年 I月28日，其為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文。另外，本文所述的本發(fā)明實(shí)施方案的系統(tǒng)和方法可以包括實(shí)現(xiàn)某些設(shè)計(jì)、分析或其它操作，所述操作使用為了執(zhí)行計(jì)算機(jī)系統(tǒng)而儲(chǔ)存的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。例如，下面詳細(xì)描述了幾個(gè)實(shí)施方案，它們用于加工檢測(cè)到的信號(hào)和/或分析使用SBS系統(tǒng)和方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，其中所述加工和分析實(shí)施方案可在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)。 用于與本文所述的發(fā)明一起使用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一個(gè)示例性實(shí)施方案可以包括任意類型的計(jì)算機(jī)平臺(tái)，諸如工作站、個(gè)人計(jì)算機(jī)、服務(wù)器或任意其它現(xiàn)有的或?qū)?lái)的計(jì)算機(jī)。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解，如本文所述的前述計(jì)算機(jī)平臺(tái)特別地構(gòu)造成執(zhí)行所述發(fā)明的專門化操作，且不視作一般目的計(jì)算機(jī)。計(jì)算機(jī)通常包括已知的部件如處理器、操作系統(tǒng)、系統(tǒng)內(nèi)存、存儲(chǔ)器存儲(chǔ)裝置、輸入輸出控制器、輸入輸出裝置、和顯示裝置。相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，計(jì)算機(jī)可能會(huì)有很多可能的配置和部件，并也可能包括高速緩沖存儲(chǔ)器、數(shù)據(jù)備份單元、和很多其它裝置。顯示裝置可以包括提供可視信息的顯示裝置，此信息通?？梢员贿壿嫷睾?或物理性地組織為像素陣列。也可以包括界面控制器，界面控制器可以包括任何類型的用于提供輸入輸出界面的已知或未來(lái)的軟件程序。例如，界面可以包括通常被定義為“圖形用戶界面”(通常稱作GUI)的界面，圖形用戶界面提供給用戶一個(gè)或多個(gè)圖形表示。界面通常能夠接受用戶使用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的選擇或輸入裝置進(jìn)行的輸入。在相同或可替換的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)上的應(yīng)用程序可以采用包括被稱為“命令行界面”(經(jīng)常稱為CLI)的界面。在應(yīng)用程序和用戶之間，CLI通常提供基于文本的交互。通常，命令行界面通過(guò)顯示裝置顯示輸出和接收輸入作為文本行。例如，一些實(shí)現(xiàn)方法可以包括所謂的“殼(shell) ”，如相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的Unix Shells，或Microsoft Windows PowershelI,其米用面向?qū)ο箢愋偷木幊腆w系結(jié)構(gòu)例如Microsoft.NET framework。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)明白，界面可以包括一個(gè)或多個(gè)GUI、CLI或它們的組
入
口 o處理器可以包括可商業(yè)得到的處理器，如Intel Corporation生產(chǎn)的Celeron 、Core 或Pentium 處理器，Sun Microsystems公司生產(chǎn)的SPARC 處理器，AMD公司生產(chǎn)的Athlon 、Sempron 、Phenom 或Opteron 處理器，或它可以是正在或?qū)⒁兂煽梢允褂玫钠渌幚砥髦?。處理器的一些?shí)施方案可以包括所謂的多核處理器，和/或能夠在單核或多核配置中釆用并行處理技術(shù)。例如，多核結(jié)構(gòu)通常包括兩個(gè)或更多個(gè)處理器“執(zhí)行核”。在本實(shí)施例中，每個(gè)執(zhí)行核可以以作為能夠并行執(zhí)行多個(gè)線程的獨(dú)立處理器執(zhí)行。另外，相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員會(huì)理解，處理器可以被設(shè)置成通常所謂的32位或64位結(jié)構(gòu)，或現(xiàn)在已知或?qū)?lái)可能開(kāi)發(fā)出的其它體系結(jié)構(gòu)。處理器通常運(yùn)行操作系統(tǒng)，所述操作系統(tǒng)可以是例如微軟公司的WINDOWS 型操作系統(tǒng)(諸如 Windows XP、Windows Vista 或 Windows _7);蘋果電腦公司的 Mac OS X 操作系統(tǒng)(諸如Mac OS X vlO. 6 “Snow Leopard”操作系統(tǒng))；可以從很多賣主或所謂的公開(kāi)渠道得到的Unix 或Linux-型操作系統(tǒng)；其它或未來(lái)的操作系統(tǒng)；或它們的一些組合。操作系統(tǒng)通過(guò)公知方式與固件和硬件接口，并且?guī)椭幚砥髡{(diào)整和執(zhí)行各種可以用多種編程語(yǔ)言書(shū)寫(xiě)的計(jì)算機(jī)程序的功能。操作系統(tǒng)通常與處理器協(xié)作地協(xié)調(diào)和執(zhí)行計(jì)算機(jī)的其它部件的功能。操作系統(tǒng)也會(huì)提供進(jìn)度表、輸入-輸出控制、文件和數(shù)據(jù)管理、存儲(chǔ)管理、以及通信控制及相關(guān)服務(wù)，所有的都依照已知的技術(shù)。系統(tǒng)存儲(chǔ)器可以包括任何類型的已知或未來(lái)的存儲(chǔ)器存儲(chǔ)設(shè)備。例子包括任何通?？梢垣@得的隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(RAM)，磁介質(zhì)例如駐存硬盤或磁帶，光學(xué)介質(zhì)例如讀和寫(xiě)光 盤，或其它存儲(chǔ)器存儲(chǔ)設(shè)備。存儲(chǔ)器存儲(chǔ)設(shè)備可以包括任何類型已知的或未來(lái)的設(shè)備，包括光盤驅(qū)動(dòng)、磁帶驅(qū)動(dòng)、可移動(dòng)硬盤驅(qū)動(dòng)、USB或閃存、或磁盤設(shè)備。這種類型的存儲(chǔ)器存儲(chǔ)設(shè)備通常讀自和/或?qū)懭氲匠绦虼鎯?chǔ)介質(zhì)中(未示出)例如，分別為光盤、磁帶、可移動(dòng)硬盤、USB或閃存或軟盤。這些程序存儲(chǔ)介質(zhì)中的任何一個(gè)或其它現(xiàn)在使用的或也許以后會(huì)開(kāi)發(fā)的可以視為計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。如所希望的，這些程序存儲(chǔ)介質(zhì)通常存儲(chǔ)計(jì)算機(jī)軟件程序和/或數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)軟件程序，同樣稱為計(jì)算機(jī)控制邏輯，通常被存儲(chǔ)在系統(tǒng)存儲(chǔ)器中和/或用于連接存儲(chǔ)器存儲(chǔ)設(shè)備的程序存儲(chǔ)設(shè)備中。在有些實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品被描述為包括計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)，該計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)具有存儲(chǔ)在其中的控制邏輯(計(jì)算機(jī)軟件程序，包括程序代碼)。當(dāng)由處理器執(zhí)行時(shí)，該控制邏輯使得處理器執(zhí)行這里所述的功能。在其它實(shí)施方案中，一些功能主要由使用例如硬件狀態(tài)機(jī)的硬件實(shí)行。執(zhí)行硬件狀態(tài)機(jī)以便執(zhí)行這里所述的功能對(duì)于本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。輸入-輸出控制器可以包括任何類型的已知的用于接收和處理來(lái)自用戶信息的設(shè)備，該用戶無(wú)論是人還是機(jī)器，無(wú)論是本地的還是遠(yuǎn)程的。這樣的設(shè)備包括，例如調(diào)制解調(diào)器卡、無(wú)線卡、網(wǎng)絡(luò)接口卡、聲卡、或用于任何類型已知輸入設(shè)備的其它類型的控制器。輸出控制器可以包括用于向用戶顯示信息的任何類型的已知顯示設(shè)備的控制器，該用戶無(wú)論是人還是機(jī)器，無(wú)論是本地還是遠(yuǎn)程。在當(dāng)前描述的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)的功能元件通過(guò)系統(tǒng)總線彼此相互通信。計(jì)算機(jī)的一些實(shí)施方案可以利用網(wǎng)絡(luò)或其它類型的遠(yuǎn)程通信與一些功能性的元件互相通信。正如相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然得知的，工具控制和/或數(shù)據(jù)處理應(yīng)用，如果用軟件執(zhí)行，則可以被載入并從系統(tǒng)內(nèi)存和/或存儲(chǔ)器存儲(chǔ)設(shè)備中執(zhí)行。所有或部分工具控制和/或數(shù)據(jù)處理應(yīng)用同樣可以駐留在只讀存儲(chǔ)器中或類似于存儲(chǔ)器存儲(chǔ)設(shè)備的設(shè)備中，這樣的設(shè)備不要求工具控制和/或數(shù)據(jù)處理應(yīng)用通過(guò)輸入-輸出控制器被首先加載。相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，工具控制和/或數(shù)據(jù)處理應(yīng)用或它們的一部分可以由處理器以公知的方式被載入到系統(tǒng)內(nèi)存中，或高速緩沖存儲(chǔ)器中，或二者中，作為執(zhí)行的優(yōu)勢(shì)。另外，計(jì)算機(jī)可以包括存儲(chǔ)在系統(tǒng)內(nèi)存中的一個(gè)或多個(gè)庫(kù)文件、試驗(yàn)數(shù)據(jù)文件、以及因特網(wǎng)客戶。例如，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以包括與一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)或分析相關(guān)的數(shù)據(jù)比如檢測(cè)信號(hào)值，或其它與一個(gè)或多個(gè)SBS試驗(yàn)或處理相關(guān)聯(lián)的值。此外，因特網(wǎng)客戶可以包括能利用網(wǎng)絡(luò)訪問(wèn)另一個(gè)計(jì)算機(jī)上的遠(yuǎn)程服務(wù)的應(yīng)用，例如可以包括通常所謂的“網(wǎng)絡(luò)瀏覽器”。在本實(shí)施例中，一些通常使用的網(wǎng)絡(luò)瀏覽器包括可從微軟公司得到的Microsoft InternetExplorer 8,可從Mozilla公司得到的Mozilla Firefox 3. 6,可從蘋果計(jì)算機(jī)公司得到的Safari 4,來(lái)自Google 公司的Google Chrome,或現(xiàn)在已知的或?qū)?lái)要開(kāi)發(fā)的其它類型的網(wǎng)絡(luò)瀏覽器。此外，在同一實(shí)施方案或其它實(shí)施方案中，因特網(wǎng)客戶可以包括專用軟件應(yīng)用程序(或可能成為它的一個(gè)元件)，該專用軟件應(yīng)用程序使得能經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)(例如用于生物學(xué)用途的數(shù)據(jù)處理應(yīng)用程序)來(lái)訪問(wèn)遠(yuǎn)程信息。網(wǎng)絡(luò)可以包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的許多不同類型網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)或多個(gè)。例如，網(wǎng)絡(luò)可以包括局域網(wǎng)或廣域網(wǎng)，其使用通常所謂的TCP/IP協(xié)議組進(jìn)行通信。網(wǎng)絡(luò)可以包括具有互連的計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)的全球系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)(其通常稱為因特網(wǎng))，或還可以包括各種內(nèi)聯(lián)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還會(huì)理解，一些用戶在網(wǎng)絡(luò)化的環(huán)境中可能偏好使用通常所說(shuō)的“防火墻”(有時(shí)候也稱為包過(guò)濾器或邊界保護(hù)設(shè)備)來(lái)控制去往和來(lái)自硬 件和/或軟件系統(tǒng)的信息交換。例如，防火墻可以包括硬件或軟件元件或它們的一些組合，并且通常設(shè)計(jì)成強(qiáng)化用戶設(shè)置的安全規(guī)則，例如用于即時(shí)的網(wǎng)絡(luò)管理等。b.本文所述的發(fā)明的實(shí)施方案
如上所述，所述發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于加工乳狀液以安全地且有效地提取其中含有的生物制品的改良的系統(tǒng)、方法和試劑盒。所述的實(shí)施方案可以用于從乳狀液系統(tǒng)回收水相(或非水相)，所述乳狀液系統(tǒng)使用異丙醇或其它有機(jī)溶劑通過(guò)所謂的“鹽析”效應(yīng)來(lái)破碎。應(yīng)當(dāng)理解，所述的實(shí)施方案會(huì)提供勝過(guò)傳統(tǒng)方法的實(shí)質(zhì)性加工改進(jìn)，因?yàn)樗鼈兪歉叨扔行У模瑫?huì)維持生物學(xué)完整性，且適合由自動(dòng)化的平臺(tái)/機(jī)器人型平臺(tái)來(lái)執(zhí)行。在一個(gè)典型的測(cè)序?qū)嵤┓桨钢校梢圆捎靡粋€(gè)或多個(gè)儀器元件來(lái)執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)過(guò)程步驟。例如，使用儀器來(lái)自動(dòng)化和實(shí)現(xiàn)一些或所有過(guò)程步驟，可以實(shí)現(xiàn)測(cè)序方法的實(shí)施方案。圖I提供了用于需要捕獲光信號(hào)的測(cè)序過(guò)程的測(cè)序儀器100的一個(gè)例證實(shí)施例，其通常包括光學(xué)子系統(tǒng)和流體子系統(tǒng)，它們用于執(zhí)行在反應(yīng)基質(zhì)105上發(fā)生的測(cè)序反應(yīng)和數(shù)據(jù)捕獲。但是，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于需要其它數(shù)據(jù)捕獲模式(即PH、溫度、電化學(xué)的等)的測(cè)序過(guò)程，可以采用數(shù)據(jù)捕獲模式的子系統(tǒng)，它們是相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。用于執(zhí)行測(cè)序過(guò)程的測(cè)序儀器100的實(shí)施方案可以另外包括在圖I中未圖解的不同額外組件，諸如用于一些功能的局部控制的微處理器和/或微控制器組件。在一些實(shí)施方案中，使用樣品制備儀器180，可以任選地以自動(dòng)化的或部分自動(dòng)化的方式制備用于測(cè)序的樣品，所述儀器構(gòu)造成使用儀器100來(lái)執(zhí)行測(cè)序必需的一些或所有制備。樣品制備儀器的實(shí)例可以包括機(jī)器人平臺(tái)，諸如可從Hamilton Robotics、BeckmanCoulter或Caliper Life Sciences得到的那些。此外,如圖I所示,測(cè)序儀器100可以可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)外部計(jì)算機(jī)組件諸如計(jì)算機(jī)130，后者可以例如執(zhí)行系統(tǒng)軟件或固件諸如應(yīng)用程序135，后者可以提供一個(gè)或多個(gè)儀器(諸如測(cè)序儀器100或樣品制備儀器180)的指令控制和/或數(shù)據(jù)分析功能。計(jì)算機(jī)130可以另外經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)150可操作地連接至其它計(jì)算機(jī)或服務(wù)器，所述網(wǎng)絡(luò)可以實(shí)現(xiàn)儀器系統(tǒng)的遠(yuǎn)程操作和大量數(shù)據(jù)向存儲(chǔ)和處理系統(tǒng)的輸出。在本實(shí)施例中，測(cè)序儀器100和/或計(jì)算機(jī)130可以包括上面一般地描述的實(shí)施方案的一些或所有組件和特征。用于破碎含有生物物質(zhì)的乳狀液的傳統(tǒng)方法通常已經(jīng)采用異丙醇或其它無(wú)毒溶劑的應(yīng)用，以破壞在生物相容的油中乳化的水性微滴的完整性，從而將每個(gè)微滴的內(nèi)容物釋放到溶液中，該過(guò)程通常稱作乳狀液“破碎”。應(yīng)當(dāng)理解，如果沒(méi)有以某種方式隔離所述生物物質(zhì)(即通過(guò)結(jié)合到基質(zhì)上或其它隔離方式)，結(jié)果是，所有生物物質(zhì)在整個(gè)體積中混合。因而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在釋放之前，將生物物質(zhì)隔離至微滴內(nèi)的基質(zhì)上，其中所述基質(zhì)(諸如珠子基質(zhì))然后可以與進(jìn)一步應(yīng)用不再需要或?qū)ζ溆泻Φ娜闋钜航M分(即油、表面活性劑等)分離。在所述的傳統(tǒng)實(shí)施方案中，高速離心已經(jīng)普遍地用于從乳狀液中提取出珠子。通常，該步驟需要重復(fù)數(shù)次，以分離油和表面活性劑物質(zhì)離開(kāi)珠子，隨后進(jìn)行緩沖液沖洗和其它離心步驟，以去除溶劑。因而，應(yīng)當(dāng)理解，傳統(tǒng)的方法是非常耗時(shí)的，對(duì)離心步驟的需要會(huì)限制采用低成本的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化平臺(tái)的能力。所述發(fā)明的實(shí)施方案提供了容易的、快速的、且節(jié)省成本的方法，其中在用異丙醇或同樣有效的溶劑破碎以后，從油相分離出水相，用于通過(guò)普通技術(shù)人員所說(shuō)的鹽析效應(yīng)，從水相萃取溶劑。結(jié)果是完全相分離，其能夠有效地分離核酸結(jié)合的基質(zhì)。例如，本發(fā)明的 一些實(shí)施方案采用親水珠子，所述珠子在相分離步驟以后優(yōu)先保留在水相中，可以用過(guò)濾管和真空泵裝置回收。在本實(shí)施例中，使用可商業(yè)得到的平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化變得可行。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)理解，從水性溶液中鹽析異丙醇的過(guò)程通常被接受為分離和濃縮異丙醇的方法。一個(gè)實(shí)例描述在Zhigang等人，J. Chemical Technology &Biotechnology 76 (2001) 757-763，其為了所有目的特此通過(guò)引用整體并入本文。但是，在所述發(fā)明中采用的鹽析過(guò)程不同于現(xiàn)有方法，因?yàn)樗糜趶乃鄰?qiáng)制分離溶劑、表面活性劑和油，目的是回收生物物質(zhì)。例如，一旦已經(jīng)在乳狀液中完成了生物加工步驟，加入異丙醇或其它相容的溶劑來(lái)破碎微滴和釋放生物物質(zhì)。在本實(shí)施例中，將無(wú)機(jī)鹽加入破碎的乳狀液混合物中，造成油相和水相的分離。在有些實(shí)施方案中，可以采用顆粒狀的無(wú)機(jī)鹽，但是，在替代實(shí)施方案中，可能優(yōu)選的是，將鹽加入溶液相中(即溶解在水中)，這會(huì)提高鹽在破碎的乳狀液混合物中的擴(kuò)散，并增加相分離的速率。通常還合乎需要的是，在鹽加入以后，通過(guò)諸如渦旋或搖動(dòng)，機(jī)械地混合溶液，以將鹽徹底地分布在溶液中。在所述的實(shí)施方案中，可以采用多種生物學(xué)上相容的溶劑，諸如異丙醇、乙醇等。此外，任意類型的無(wú)機(jī)鹽是有效的，這至少部分地取決于使用的溶劑的類型，所述無(wú)機(jī)鹽包括、但不限于NaCl、KCl、LiCl、Na2SO4、碳酸鉀、硫酸銨等。續(xù)接上面的實(shí)施例，當(dāng)將無(wú)機(jī)鹽加入破碎的乳狀液混合物中時(shí)，水分子被鹽離子吸引，因而更少地與溶劑相互作用，導(dǎo)致清楚地確定的溶劑和油/表面活性劑(即油相)從水性相/鹽(即水相)分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親水珠子停留在水相中，這是由于珠子的表面性質(zhì)。重要地是，發(fā)現(xiàn)水相的密度低于油相的密度，因而導(dǎo)致水相成為上層，油相成為下層。此外，在許多實(shí)施方案中，珠子的密度通常高于水相并低于油相，因而在相分離以后，珠子通常位于上層和下層之間的相界面處或附近，其中相對(duì)容易地隨后回收珠子。在一些實(shí)施方案中，可以使用真空泵和過(guò)濾管來(lái)去除水相并捕集珠子到允許流體穿過(guò)的濾芯中，這可以在自動(dòng)化的處理平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)，所述平臺(tái)例如可商業(yè)得到的機(jī)器人平臺(tái)，包括可從Beckman Coulter, Inc.得到的Biomek FX實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化工作站、可從Caliper LifeSciences得到的Sciclone ALH 3000液體處理工作站或其它相容的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化平臺(tái)。另夕卜，因?yàn)榇嬖谒嗟耐耆厥眨樽雍陀袃r(jià)值的生物資源的損失機(jī)會(huì)較小。在一些實(shí)施方案中，可以添加提高水相的提取的額外步驟。例如，在水相和油相分離以后，可以在第一水相和第二油相之間導(dǎo)入第三相層，以產(chǎn)生額外的相“間隙”。重要的是，為了產(chǎn)生“間隙”相而導(dǎo)入的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)不會(huì)與水相或油相混合，以產(chǎn)生那些相之間的清楚地確定的分離。在本實(shí)施例中，在鹽析過(guò)程已經(jīng)分離水相和油相以后，可以使用本領(lǐng)域已知的方法(諸如吸液)，在水相和非水相之間緩慢地導(dǎo)入一定體積的高粘度硅油。這會(huì)使在水相中的珠子與油相進(jìn)一步分離，并提供珠子的更容易提取，其中有些間隙相可以與珠子一起可接受地回收，它們中的大部分可以容易地穿過(guò)濾芯。為了形成間隙相而導(dǎo)入的物質(zhì)的體積可以取決于希望的間隙相對(duì)于容器容積的大小或程度。在有些實(shí)施方案中，作為間隙相導(dǎo)入的油的組成可以與用于生產(chǎn)乳狀液的油(已知其是生物學(xué)上相容的，且通常適合與可得到的過(guò)濾裝置一起使用)相同，但是，由于乳狀液油相中的額外組分(即溶劑和表面活性劑)，在油相和間隙相之間仍然存在密度差，因而第三間隙和第二油相之間的混合受到抑制。類似地，由于密度差，第一水相和第三間隙相之間的混合受到抑制，且珠子基質(zhì)通常保留在水相中。在一些實(shí)施方案中，還可能合乎需要的是，額外地沖洗回收的核酸結(jié)合的基質(zhì)，以去除任何不希望的殘余組分。例如，如果使用間隙相，可能合乎需要的是，用緩沖溶液沖洗回收的基質(zhì)，以去除任何殘余的油。在一些實(shí)施方案中，還可能合乎需要的是，將緩沖劑與表面活性劑(諸如在乳狀液中使用的表面活性劑類型)相組合，以輔助去除殘余的油和/或其它殘余組分。例如，圖2提供了使用鹽析方法從乳狀液中提取核酸珠子的方法的一個(gè)例證實(shí)施例。如步驟210所示，以約1:1體積比，將PCR后的乳狀液(其具有含有親水珠子的單獨(dú)微滴，所述親水珠子具有固定化的從單個(gè)模板分子擴(kuò)增的核酸分子群體)與異丙醇徹底混合。在已經(jīng)破碎乳狀液的大部分水性微滴以后，加入一定體積的無(wú)機(jī)鹽溶液諸如5M NaCl，并如步驟230所示，混合整個(gè)體積，并靜置以發(fā)生相分離過(guò)程( 5 min)。必需的無(wú)機(jī)鹽溶液的濃度和/或體積可以隨破碎的乳狀液組分的體積而變化，其中組合的混合物中的無(wú)機(jī)鹽的終濃度是完全相分離(即水相不具有“乳狀”外觀)所指示的重要因素。步驟250解釋了下述任選的步驟將20 cst (cst或厘沲是運(yùn)動(dòng)粘度的量度)硅油緩慢地導(dǎo)入分離的水相和油相中，以建立在水相和油相之間希望的距離的間隙相。接著，如步驟270所示，萃取整個(gè)水相，且在有些情況下，萃取間隙相的一部分。然后可以如步驟290所述如下收集生物物質(zhì)通過(guò)加入去離子(也稱作DI)水來(lái)稀釋萃取的水溶液，并使用真空泵用5 Pm過(guò)濾器捕獲珠子基質(zhì)。實(shí)施例I:乳狀液破碎和通過(guò)鹽析效應(yīng)去除溶劑 富集(對(duì)照傳統(tǒng)的離心方法；新方法鹽析方法)
與用傳統(tǒng)方法回收的珠子相比，用鹽析方法回收的珠子同樣好地或更好地富集。
權(quán)利要求
1.一種用于從乳狀液中提取生物物質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟 a)使用溶劑破碎乳狀液，所述乳狀液包含多個(gè)在油連續(xù)相中的水性微滴，以生產(chǎn)混合的水-油混合物，其中所述溶劑破裂水性微滴，所述水性微滴釋放出多個(gè)生物學(xué)成分到混合的水-油混合物中，所述生物學(xué)成分各自固定化在基質(zhì)上； b)將無(wú)機(jī)鹽導(dǎo)入混合的水-油混合物中，造成所述混合物相分離成包含水性溶液和生物學(xué)成分的第一相與包含溶劑和油的第二相； c)從所述第二相萃取所述第一相；和 d)從所述第一相收集基質(zhì)固定化的生物學(xué)成分。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中； 所述溶劑選自異丙醇和乙醇。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中 所述生物學(xué)成分固定化在珠基質(zhì)上。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中 所述珠基質(zhì)是親水的。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中； 所述生物學(xué)成分包括核酸。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中 多個(gè)所述基質(zhì)各自包含從水性微滴之一內(nèi)的單個(gè)核酸擴(kuò)增的核酸群體。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，所述方法另外包括下述步驟 e)測(cè)序多個(gè)所述的核酸。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中 所述無(wú)機(jī)鹽選自NaCl、KCl、LiCl、Na2SO4、碳酸鉀和硫酸銨。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其中 所述無(wú)機(jī)鹽以顆粒形式導(dǎo)入。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其中 所述無(wú)機(jī)鹽以溶液形式導(dǎo)入。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其中 步驟b)另外包括混合無(wú)機(jī)鹽和混合的水-油混合物。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法另外包括 在所述第一相和所述第二相之間導(dǎo)入物質(zhì)，以產(chǎn)生間隙相。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中 所述物質(zhì)包括油。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中 所述油包括娃油。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其中 使用濾芯收集基質(zhì)固定化的生物學(xué)成分。
16.一種用于從乳狀液回收生物物質(zhì)的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 用于執(zhí)行如權(quán)利要求I所述的方法的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化平臺(tái)。
全文摘要
描述了用于從乳狀液中提取生物物質(zhì)的方法的實(shí)施方案，其包括下述步驟a)使用溶劑破碎乳狀液，所述乳狀液包含多個(gè)在油連續(xù)相中的水性微滴，以生產(chǎn)混合的水-油混合物，其中所述溶劑破裂水性微滴，所述水性微滴釋放出許多生物學(xué)成分到混合的水-油混合物中，所述生物學(xué)成分各自固定化在基質(zhì)上；b)將無(wú)機(jī)鹽導(dǎo)入混合的水-油混合物中，造成所述混合物相分離成包含水性溶液和生物學(xué)成分的第一相與包含溶劑和油的第二相；c)從所述第二相萃取所述第一相；和d)從所述第一相收集基質(zhì)固定化的生物學(xué)成分。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102712952SQ201080045259
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
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