專(zhuān)利名稱(chēng)：可用于檢測(cè)braf突變的方法、引物、探針和試劑盒的制作方法
可用于檢測(cè)BRAF突變的方法、引物、探針和試劑盒相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求61/233，054 (2009年8月11日提交)；61/237，078 (2009年8月洸日提交)和61/301,790 (2010年2月5日提交)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)樣品中的突變體BRAF序列的存在，特別地用于檢測(cè)BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突變的存在的方法、引物和探針。
背景技術(shù)：
在正常細(xì)胞經(jīng)歷新生物轉(zhuǎn)化(neoplastic transformation)并變?yōu)閻盒约?xì)胞時(shí)出現(xiàn)癌癥。轉(zhuǎn)化的(惡性)細(xì)胞逃脫規(guī)定細(xì)胞表型并限制細(xì)胞增殖的正常生理控制。如此， 個(gè)體身體中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖，形成腫瘤。在發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)，臨床目標(biāo)是選擇性破壞惡性細(xì)胞， 同時(shí)減輕對(duì)經(jīng)歷治療的個(gè)體中的正常細(xì)胞引起的任何損害。B-raf (或BRAF)編碼一種屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶的蛋白質(zhì)。BRAF是 Ras/Raf/MEK/MAP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一部分，并且在調(diào)節(jié)MAPKinse/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。此基因的突變已經(jīng)與多種癌癥，諸如結(jié)腸直腸癌(CRC)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、惡性黑素瘤和腺癌聯(lián)系起來(lái)。已經(jīng)在結(jié)腸癌中報(bào)告了 BRAF的癌基因突變(幾乎均為V600E突變)(Davies H等Nature 2002 ；417 :949-54 ；Rajagopalan H等，Nature 2002 ；418 :934.)。 已經(jīng)在所有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性癌的超過(guò)一半中及在小得多的穩(wěn)定性結(jié)腸腫瘤亞類(lèi)中觀(guān)察到 V600E 突變(Wang L 等，Cancer Res 2003;63:5209-12)。V600E (先前為 V599E)突變位于 B-raf基因(登錄號(hào)ΝΜ_04333· 4)的外顯子15上于第1860位(編碼序列的第1799位)。 在編碼序列的第1799位，胸苷變?yōu)橄佘?，這導(dǎo)致從野生型/非突變體B-rag基因中的纈氨酸(V)變化為突變基因中的谷氨酰胺(E)。另外，也存在罕見(jiàn)的(< )V600K(1798-1799 GT > AA)突變。此外，V600D突變?cè)?. 6%的病例中存在，V600A突變?cè)谛∮诘牟±写嬖?，而V600M突變?cè)谛∮诘牟±写嬖?。另外，存在著V600R和K601E BRAF突變。V600E BRAF突變存在于許多組織/腫瘤類(lèi)型中，包括神經(jīng)系統(tǒng)、甲狀腺、皮膚、胃腸道、大腸、膽道、卵巢、眼、前列腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、小腸、乳房、胰、軟組織、上呼吸消化道、腎上腺、自主神經(jīng)節(jié)、造血和淋巴組織、肺、食管、腦垂體、和胃?？梢栽诒景l(fā)明的測(cè)定法中利用自這些組織類(lèi)型之任一的樣品提取的DNA或RNA。在穩(wěn)定性和不穩(wěn)定性癌癥兩者中，大于90%的具有BRAF突變的腫瘤具有廣泛的 CpG島甲基化或稱(chēng)為CpG島的甲基化物表型(CpG island methylator phenotype, CIMP)。 已經(jīng)報(bào)告了與散發(fā)性結(jié)腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)有關(guān)的存活改善(Samowitz WS等， Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001；10 :917-23 ；Hailing KC 等，J Natl Cancer Inst 1999 ;91 :1295-303),并且因?yàn)樯l(fā)性不穩(wěn)定性腫瘤通常顯示CMP(Toyota M等， Proc Natl Acad Sci U S A 1999 ；96 :8681-6 ；Toyota M 等，Proc Natl Acad Sci U S A 2000 ；97 710-5)和 BRAF 突變(Kambara T 等，Gut 2004 ；53 :1137-44 ；Nagasaka T 等，J Clin Oncol 2004 ;22 :4584-94)兩者，會(huì)預(yù)期這些特征也會(huì)顯示與不穩(wěn)定性腫瘤中的存活改善的關(guān)系。Samowitz已經(jīng)研究了微衛(wèi)星穩(wěn)定性腫瘤中的CIMP與存活間的關(guān)系，而且已經(jīng)評(píng)估了微衛(wèi)星穩(wěn)定性結(jié)腸癌中的BRAF突變與存活間的關(guān)系。參見(jiàn)Samowitz，Wade S.等， Cancer Research 65，6063-6069，2005 年 7 月 15 日。Samowitz 已經(jīng)評(píng)估了基于大群體的患有結(jié)腸癌的個(gè)體的樣品以測(cè)定其與存活和其它臨床病理學(xué)變量的關(guān)系。在5%的微衛(wèi)星穩(wěn)定性腫瘤和51. 8%的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腫瘤中看到V600E BRAF突變。在微衛(wèi)星穩(wěn)定性腫瘤中，此突變與結(jié)腸直腸癌的較差存活、CIMP較高的、晚期美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)階段、和家族史相關(guān)。在5年存活的單變量分析中 (16. 7%對(duì)60.0%)；在針對(duì)年齡、階段、和腫瘤部位調(diào)節(jié)的分析中；在對(duì)AJCC階段2至4的階段特異性、年齡經(jīng)調(diào)整的分析中(HRR分別為4. 88、3. 60、和2. 04)；及在對(duì)AJCC階段2至 4的Kaplan-Meier存活評(píng)估中觀(guān)察到較差的存活。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腫瘤與卓越的5年存活有關(guān)，無(wú)論V600E突變存在或缺乏(分別為76. 2%和75.0%)。Samowitz已經(jīng)推斷，微衛(wèi)星穩(wěn)定性結(jié)腸癌中的BRAF V600E突變與階段2至4結(jié)腸癌中顯著較差的存活有關(guān)，但是對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腫瘤的卓越預(yù)后沒(méi)有影響。此外，證明了來(lái)自具有MMR基因MLHl和MSH2中的種系突變的遺傳性非息肉病性結(jié)腸直腸癌綜合征(HNPCC)家族的腫瘤中缺乏BRAF突變。這些數(shù)據(jù)提示了 BRAF的癌基因激活僅牽涉散發(fā)性結(jié)腸直腸腫瘤發(fā)生。結(jié)腸直腸癌中的陽(yáng)性BRAF-V600E突變的檢出提示了疾病的散發(fā)性起源和MLH1、MSH2以及還有MSH6的種系改變的缺乏。這些發(fā)現(xiàn)在HNPCC診斷學(xué)的遺傳測(cè)試中具有潛在的影響，并且提示了 BRAF作為HNPCC的排除標(biāo)準(zhǔn) (exclusion criteria)或作為散發(fā)性癌癥的分子標(biāo)志物的潛在用途。參見(jiàn)Domingo等， Oncogene(2005)24，3995-3998。使用MEK的小分子抑制劑和整合的遺傳和藥理學(xué)分析，Solit的小組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了， BRAF的突變與在與“野生型”細(xì)胞或包含RAS突變的細(xì)胞相比時(shí)對(duì)MEK抑制的增強(qiáng)的且為選擇性的敏感性有關(guān)。不管組織譜系，在BRAF突變體細(xì)胞中觀(guān)察到此MEK依賴(lài)性，并且它與細(xì)胞周期蛋白Dl蛋白表達(dá)的下調(diào)和Gl阻滯的誘導(dǎo)兩者相關(guān)聯(lián)。藥理學(xué)MEK抑制完全消除BRAF突變體異種移植物中的腫瘤生長(zhǎng)，而RAS突變體腫瘤僅受到部分抑制。這些數(shù)據(jù)提示了對(duì)BRAF突變體腫瘤中的MEK活性的強(qiáng)烈依賴(lài)性，而且為此遺傳限定的腫瘤亞型提供了合理的治療策略。參見(jiàn) Solit，David B.等，Nature 439，358-362 (2006 年 1 月 19 日)。另外，基于遺傳研究的結(jié)果、細(xì)胞生物學(xué)、分子病理學(xué)和小鼠建模，已經(jīng)出現(xiàn)人黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)化的模型。研究已經(jīng)鑒定出黑素瘤組織中牽涉各種因素，包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子生成、ERK激活、和常見(jiàn)的BRAF突變。BRAF在RAS下游起作用，并且研究已經(jīng)表明了 RAS和BRAF中的同時(shí)突變?cè)诤谒亓鲋惺菢O端罕見(jiàn)的，提示了 BRAF突變替代突變體RAS的至少一些癌基因功能。對(duì)更好地滿(mǎn)足有風(fēng)險(xiǎn)形成轉(zhuǎn)移的患者的腫瘤標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)處于活躍的研究中。雖然基于結(jié)果的腫瘤標(biāo)志物評(píng)估和治療選擇作為結(jié)腸和乳腺癌管理中的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的一部分已有多年，但是對(duì)于黑素瘤不存在此類(lèi)標(biāo)志物。許多研究已經(jīng)顯示為有希望，但是均尚未通過(guò)開(kāi)發(fā)的初步階段成為臨床上有用的測(cè)定法。盡管在黑素瘤生物學(xué)研究中有最近的進(jìn)展，但是可用于診斷和/或監(jiān)測(cè)黑素瘤患者的分子工具的開(kāi)發(fā)仍是相對(duì)較新的。在為了對(duì)患者監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)，或選擇有形成轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)的患者而設(shè)計(jì)的方案中獲得的進(jìn)展很少。腫瘤階段(即來(lái)自黑素瘤的存活的最好預(yù)示)基于常規(guī)的臨床病理學(xué)變量，諸如原發(fā)性腫瘤的厚度和潰瘍及區(qū)域性淋巴結(jié)中或遠(yuǎn)端部位中轉(zhuǎn)移性疾病的存在。然而，兩名具有在顯微鏡下表現(xiàn)為相同的中間厚度的原發(fā)性腫瘤的患者可以具有明顯不同的存活。用于此類(lèi)評(píng)估的改善的預(yù)后手段的缺乏使主治醫(yī)生難以確定最好的治療策略。已經(jīng)在多至80%的黑素瘤組織(顯著高于此疾病中的任何其它分子改變的頻率) 中發(fā)現(xiàn)了 BRAF癌基因的突變。還已經(jīng)在來(lái)自其它類(lèi)型的癌癥的腫瘤組織中檢出BRAF突變。 實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明了，幾種BRAF突變，特別是T1799A(先前稱(chēng)作T1796A)熱點(diǎn)突變(其占黑素瘤中的BRAF突變的90%)可以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞。最近，顯示了阻斷黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中的突變體BRAF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞死亡，提示了 BRAF抑制劑可以顯著支持黑素瘤治療。發(fā)明概述本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)樣品中的BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突變的方法。本發(fā)明公開(kāi)了包含用于擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中存在的V600E，V600D、V600K、V600M、或V600A 突變體BRAF序列的引物和探針序列的組合物。在擴(kuò)增特定的BRAF突變中使用如本文中所公開(kāi)的特定的引物組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，也可以設(shè)計(jì)對(duì)1798-1799 GT > AA雙重突變特異性的引物。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了擴(kuò)增和檢測(cè)BRAF突變中所使用的引物和探針。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)BRAF突變的方法、引物、探針和試劑盒?？梢允褂帽景l(fā)明的方法、引物、探針和試劑盒來(lái)檢測(cè)許多不同細(xì)胞類(lèi)型中的BRAF V600E、V600D、V600K、 V600M、和V600A突變，并且如此可以用于診斷許多不同癌癥，諸如但不限于黑素瘤、直腸結(jié)腸癌、肺癌和甲狀腺癌。本發(fā)明的方法可以用作癌癥患者結(jié)果的預(yù)示。促成患有任何疾病且特別是癌癥(由于其進(jìn)行性和侵入性性質(zhì))的患者的結(jié)果改善的關(guān)鍵因素之一是早期且精確的診斷。本發(fā)明的方法解決對(duì)于用于檢測(cè)突變體BRAF序列(其存在是轉(zhuǎn)移性疾病的陽(yáng)性指示劑)的快速的、非侵入性的、且精確的篩選測(cè)定法的迫切需要。因此，它鑒定出那些需要用更具攻擊性的治療方案治療的患者。此外，因?yàn)榭梢詫?duì)DNA或RNA使用本發(fā)明，所以樣品制備是容易的，由此降低測(cè)定法變化性，其可以源自牽涉樣品制備的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的專(zhuān)門(mén)知識(shí)水平的差異。作為一個(gè)非限制性的例子，可以使用本發(fā)明的方法來(lái)監(jiān)測(cè)晚期轉(zhuǎn)移性黑素瘤 (III/IV期)患者。這些患者有最高的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，并且疾病活動(dòng)性升高的早期檢測(cè)會(huì)導(dǎo)致較早的治療和結(jié)果的改善。本發(fā)明的方法也可以針對(duì)測(cè)試較早階段疾病(I/II期)患者，這些患者有他們的疾病會(huì)轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。此外，用別的診斷測(cè)試和治療的早期干預(yù)會(huì)導(dǎo)致改善的患者存活。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中的BRAF突變的存在的方法，所述方法包括 (a)自所述樣品分離核酸，其中所述樣品包含核酸序列；(b)對(duì)所述樣品的所述核酸序列實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含能夠與BRAF突變體序列在BRAF序列中的第一位特異性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 或 SEQ ID N0:9，和能夠在BRAF序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中所述第二引物是SEQ ID N0:10，其中所述第一和第二引物與雙鏈BRAF序列的不同鏈退火，其中當(dāng)所述樣品的序列包含在所述 BRAF序列的所述第一位包含突變體序列的BRAF序列時(shí)，所述擴(kuò)增反應(yīng)能夠生成BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；并(c)顯現(xiàn)通過(guò)所述擴(kuò)增反應(yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出是所述樣品中的BRAF突變存在的陽(yáng)性指示劑。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)移性黑素瘤的存在的方法，所述方法包括(a)自所述樣品分離核酸，其中所述樣品包含核酸序列；(b)對(duì)所述樣品的所述核酸序列實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含能夠與BRAF突變體序列在BRAF序列中的第一位特異性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 或 SEQ ID N0:9，禾口能夠在BRAF序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中所述第二引物是SEQ ID NO=IO, 其中所述第一和第二引物與雙鏈BRAF序列的不同鏈退火，其中當(dāng)所述樣品的序列包含在所述BRAF序列的所述第一位包含突變體序列的BRAF序列時(shí)，所述擴(kuò)增反應(yīng)能夠生成BRAF 突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；并(c)顯現(xiàn)通過(guò)所述擴(kuò)增反應(yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出是所述樣品中的轉(zhuǎn)移性黑素瘤的陽(yáng)性指示劑。本發(fā)明的實(shí)施方案包含BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、和V600A突變體特異性引物。例示性的BRAF V600E突變體特異性引物對(duì)包括SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、或SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 100例示性BRAFV600D突變體特異性引物對(duì)包括SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、或 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :10。例示性 BRAF V600K 突變體特異性引物對(duì)包括 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、或 SEQ ID NO :6 禾口 SEQ ID NO: 10。例示性BRAF V600M突變體特異性引物對(duì)包括SEQ ID NO :6或SEQ ID NO 8禾P SEQ ID N0:10。例示性BRAF V600A特異性引物包括SEQ ID NO 3禾口 SEQ ID N0:10。這些引物設(shè)計(jì)為避免任何已知的BRAF多態(tài)性。如本文中所描述的，此類(lèi)寡核苷酸可以是可檢測(cè)地標(biāo)記的(detectably labeled)。BRAF V600突變體特異性引物(SEQ ID NO 1 ；SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10)或合適的BRAF突變體特異性引物對(duì)可以是包含生物學(xué)相容的鹽溶液和/或其它緩沖液或組分的組合物的組分。本發(fā)明的實(shí)施方案包括寡核苷酸探針序列SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12，其中使用寡核苷酸作為探針以供檢測(cè)BRAF突變體序列。此探針設(shè)計(jì)為避免任何已知的BRAF多態(tài)性。任選地，寡核苷酸是可檢測(cè)地標(biāo)記的。本發(fā)明還提供了包含SEQ ID NO :1_12中至少一項(xiàng)的試劑盒?？梢岳帽景l(fā)明的實(shí)施方案來(lái)檢測(cè)V600E、V600D、V600K、V600M、和V600A BRAF突變。腿所述方法包括自受試者(例如，哺乳動(dòng)物)獲得組織或體液樣品，其中所述樣品含有核酸?？梢允褂玫慕M織或體液的非限制性例子包括血液、血漿、淋巴、腫瘤活組織檢查、和身體組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織樣品包括經(jīng)石蠟包埋的組織樣本。在一些實(shí)施方案中， 所述核酸是脫氧核糖核酸(DNA)。在一些實(shí)施方案中，核酸是核糖核酸(RNA)?？梢詫⒈痉椒☉?yīng)用于來(lái)自患者的任何類(lèi)型的組織。此類(lèi)組織的來(lái)源包括但不限于
7神經(jīng)系統(tǒng)、甲狀腺、皮膚、胃腸道、大腸、膽道、卵巢、眼、前列腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、小腸、乳房、胰、軟組織、上呼吸消化道、腎上腺、自主神經(jīng)節(jié)、造血和淋巴組織、肺、食管、腦垂體、和胃。為了檢查腫瘤組織的抗性，優(yōu)選的是檢查腫瘤組織。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，也檢查來(lái)自自其獲得腫瘤的患者的正常組織的一部分?？梢栽谝淮笈[瘤類(lèi)型里應(yīng)用本發(fā)明的方法。這容許制備個(gè)體“腫瘤表達(dá)概況”， 由此在個(gè)體患者樣品中測(cè)定BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、或V600A突變體序列的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)對(duì)各種化療劑的響應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的方法應(yīng)用于結(jié)腸癌或黑素瘤腫瘤。分離核酸本發(fā)明的實(shí)施方案利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的DNA分離方法。一般地，目的是將細(xì)胞的細(xì)胞核中存在的DNA與其它細(xì)胞組分分開(kāi)。DNA的分離通常以裂解或分解組織或細(xì)胞開(kāi)始。此過(guò)程對(duì)于破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的，并且容許自細(xì)胞核釋放核酸。在鹽溶液中實(shí)施裂解，所述鹽溶液含有使蛋白質(zhì)變性的去污劑或蛋白酶(降解蛋白質(zhì)的酶)，諸如蛋白酶K，或在一些情況中含有這兩者。它導(dǎo)致細(xì)胞的分解，并溶解膜。DNA分離方法包括但不限于酚氯仿提取、高鹽沉淀、堿變性、離子交換柱層析、樹(shù)脂結(jié)合、和順磁性珠結(jié)合。本發(fā)明的實(shí)施方案利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的RNA分離方法?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法，包括但不限于Trizol 和硫氰酸胍-酚-氯仿提取來(lái)將RNA分離并準(zhǔn)備好以供雜交。 RNA分離的原理基于細(xì)胞/組織裂解，接著進(jìn)行提取、沉淀和清洗。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，RNA分離的選擇會(huì)取決于樣品類(lèi)型。通過(guò)提及而收錄US 12/144，388，其涉及一種自經(jīng)石蠟包埋的組織(一種用于癌基因標(biāo)志物測(cè)試的常見(jiàn)來(lái)源)分離RNA的方法。擴(kuò)增本發(fā)明的實(shí)施方案利用熱和等溫?cái)U(kuò)增方法，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、 逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、螺旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增(HDA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)及擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在 ARMS中使用所述引物和探針。腿本發(fā)明的實(shí)施方案利用檢測(cè)方法，包括但不限于標(biāo)記擴(kuò)增步驟期間使用的引物， 使得用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，并將擴(kuò)增產(chǎn)物與用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。可檢測(cè)標(biāo)志物包括但不限于化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽、熒光標(biāo)簽、和放射性標(biāo)簽。可以使用與依照本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)已知的方法使用的標(biāo)記物類(lèi)型對(duì)應(yīng)的方法來(lái)直接測(cè)量經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將經(jīng)標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，在患者腫瘤樣品中測(cè)定BRAF V600E突變體表達(dá)水平以預(yù)測(cè)治療方案的功效。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，在患者腫瘤樣品中測(cè)定BRAF V600E突變體表達(dá)水平以預(yù)測(cè)治療方案的功效。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，在患者腫瘤樣品中測(cè)定BRAF V600D突變體表達(dá)水平以預(yù)測(cè)治療方案的功效。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，在患者腫瘤樣品中測(cè)定BRAF V600K突變體表達(dá)水平以預(yù)測(cè)治療方案的功效。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，在患者腫瘤樣品中測(cè)定BRAF V600M突變體表達(dá)水平以預(yù)測(cè)治療方案的功效。在實(shí)施本發(fā)明的方法中，在患者腫瘤樣品中測(cè)定BRAF V600A突變體表達(dá)水平以預(yù)測(cè)治療方案的功效。
在實(shí)施本發(fā)明的此實(shí)施方案的方法中，優(yōu)選地，自患者分離腫瘤細(xì)胞。自患者手術(shù)切出或通過(guò)常規(guī)的活組織檢查獲得實(shí)體或淋巴腫瘤或其部分。通過(guò)本領(lǐng)域中典型的任何方法，例如 Sambrook, Fischer and Maniatis,Molecular Cloning, a laboratory manual (第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)從細(xì)胞提取自冷凍或新鮮的樣品分離的RNA。優(yōu)選地，注意避免提取過(guò)程期間的RNA降解。表 1
引物名稱(chēng)序列預(yù)測(cè)的突變檢測(cè)Braf 1799A IGT-FAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA600E、600D 和 600KBraf 1799A 2AT-FAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTGA600E 和600DBraf V600A 2AT-FAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTGC僅600ABraf V600D 2GA-FAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAAT600D 和 600K (弱的)Braf V600K 2AT-FAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTAA僅600KBraf V600M 2CG-FAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTAGAA600K 和600MBraf_V600D_2GC-F3AMTAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATAT僅 600DBraf_V600M_2GT-F2AMATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTAT僅 600MBraf—1799A—2GC-FAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACAGV600E常見(jiàn)的反向引物(與所有上述正向引物一起使用)
2Braf C600—R~ GATCCAGACAACTGTTCAMCTGA常見(jiàn)的探針(與所有引物組合一起使用)
Braf_C600-Mc26FAM-TCCATCGAGATTTCBraf_C600-Mc36FAM-ACCCACTCCATCGAGAX堿基=次要突變M堿基=感興趣的突變
實(shí)施例實(shí)施例1 測(cè)試本發(fā)明的引物制備合成的V600E構(gòu)建體以測(cè)試本發(fā)明的引物和探針特異性擴(kuò)增含有BRAF V600E突變的核酸的能力。使用針對(duì)BRAF V600E突變的兩組引物/探針來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。將V600E合成構(gòu)建體在gDNA(0.67ng/uL，5ng/PCR)的背景中連續(xù)稀釋(1 2) 17次。突變濃度范圍為IOfM至0. 15aM。對(duì)對(duì)照(外顯子13)和V600E突變一式二份測(cè)定每個(gè)稀釋樣品 6x(總共12次)。實(shí)施例2 :V600K BRAF突變的檢測(cè)可以利用為V600E突變?cè)O(shè)計(jì)的相同引物對(duì)來(lái)檢測(cè)罕見(jiàn)的V600K BRAF突變。V600K 突變是1798-1799 GT > AA雙重突變。SEQ ID NO :2構(gòu)成高度特異性引物，其僅會(huì)在存在單一 1799 T > A突變的情況中生成擴(kuò)增產(chǎn)物。如此，在實(shí)施利用引物對(duì)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 10的擴(kuò)增反應(yīng)和利用引物對(duì)SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :10對(duì)相同樣品的另一反應(yīng)時(shí)，第一反應(yīng)會(huì)提供擴(kuò)增產(chǎn)物(陽(yáng)性)，而第二反應(yīng)不會(huì)提供產(chǎn)物(陰性)。陽(yáng)性和陰性結(jié)果的此種組合指示V600K突變的存在。實(shí)施例3 =BRAF T1799A/GT1798-1799AA/TG1799-1800AT 突變排他性 (exclusivity)測(cè)試A)測(cè)試材料1.生成DNA合成片段，其含有BRAF V600D、E、和K突變a. BRAF V600D AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGATAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTb. BRAF V600Ec. BRAF V600K ACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTT2.針對(duì)BRAF突變V600D、E和K突變的序列特異性引物/探針(表1中所列的序列)a. 1799A_1GT (對(duì) 1799T 至 A 堿基對(duì)變化(V600E, V600D 和 V6OOK 特異性)b. V600D_2GA (對(duì) V600D 特異性)c. V600K_2AT (對(duì) V600K 特異性)B.規(guī)程1.將三種合成片段之每種在0.667ng/ul基因組DNA (Promega Corp.-人基因組 DNA, IOOug)中稀釋至200aM的濃度2.用所有三種引物組(對(duì)每種突變特異性)PCR擴(kuò)增每種突變的合成的特異性片段3.分析排他性C.對(duì)排他性的分析下列兩個(gè)引物/探針組已經(jīng)設(shè)計(jì)為擴(kuò)增特定的突變。用每種合成片段測(cè)試這些引物以測(cè)試排他性a. 1799A_1GT (擴(kuò)增V600E、V600D和V600K)。已經(jīng)在測(cè)定法開(kāi)發(fā)部分(7)中描述了此引物/探針組以擴(kuò)增堿基1799處的T至A變化。b. V600D_2GA (對(duì)V600D特異性)。已經(jīng)在測(cè)定法開(kāi)發(fā)部分(7)中描述了此引物/探針組以擴(kuò)增堿基1799-1800處的TG變化成AT。c. V600K_2AT (對(duì)V600K特異性)。已經(jīng)在測(cè)定法開(kāi)發(fā)部分(7)中描述了此引物/ 探針組以擴(kuò)增堿基1798-1799處的CT變化成AA。在排他性測(cè)試中使用所有引物和探針。結(jié)果下表描述了用特異性引物探針組成功擴(kuò)增的片段。加號(hào)(+)表示擴(kuò)增特異性片段。表2 限定每種突變體類(lèi)型的引物組合如下
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)樣品中的BRAF突變的存在的方法，所述方法包括(a)自所述樣品分離核酸，其中所述樣品包含DNA序列；(b)對(duì)所述樣品的所述DNA序列實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含能夠與BRAF突變體序列在BRAF DNA序列中的第一位特異性退火的第一引物，其中所述第一引物是 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8 或 SEQ ID NO :9，和能夠在 BRAFDNA 序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物與雙鏈BRAF DNA序列的不同鏈退火，其中當(dāng)所述樣品的DNA序列包含在所述BRAF DNA序列的所述第一位包含突變體序列的BRAF DNA序列時(shí)，所述擴(kuò)增反應(yīng)能夠生成BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；并(c)顯現(xiàn)通過(guò)所述擴(kuò)增反應(yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出是所述樣品中的BRAF突變的陽(yáng)性指示劑。
2.一種用于檢測(cè)樣品中的BRAF突變的存在的方法，所述方法包括(a)自所述樣品分離核酸，其中所述樣品包含RNA序列；(b)對(duì)所述樣品的所述RNA序列實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含能夠與BRAF突變體序列在BRAF RNA序列中的第一位特異性退火的第一引物，其中所述第一引物是 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8 或 SEQ ID NO :9，和能夠在 BRAFRNA 序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物與雙鏈BRAF RNA序列的不同鏈退火，其中當(dāng)所述樣品的RNA序列包含在所述BRAF RNA序列的所述第一位包含突變體序列的BRAF RNA序列時(shí)，所述擴(kuò)增反應(yīng)能夠生成BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；并(c)顯現(xiàn)通過(guò)所述擴(kuò)增反應(yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出是所述樣品中的BRAF突變的陽(yáng)性指示劑。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述BRAF突變的存在是所述樣品中的轉(zhuǎn)移性黑素瘤的陽(yáng)性指示劑。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述BRAF突變的存在是所述樣品中的轉(zhuǎn)移性黑素瘤的陽(yáng)性指示劑。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述BRAF突變選自下組BRAFV600E、BRAF V600D、 BRAF V600K、BRAF V600M 和 BRAF V600A 突變。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述樣品選自下組血液、組織或細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述組織樣品是經(jīng)甲醛固定的經(jīng)石蠟包埋的組織。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中能夠在BRAF核酸序列中的第二位特異性退火的所述第二引物是 SEQ ID NO :10ο
9.一種確定用于治療患者中的腫瘤的化學(xué)治療方案的方法，包括(a)獲得所述腫瘤的組織樣品，并固定所述樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)自所述固定的腫瘤樣品分離 mRNA ； (c)使用能夠擴(kuò)增所述BRAF基因的區(qū)域的寡核苷酸引物對(duì)來(lái)將所述mRNA進(jìn)行擴(kuò)增， 以獲得BRAF擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定所述擴(kuò)增樣品中的BRAF mRNA量；(e)比較來(lái)自步驟(d) 的BRAF mRNA量與內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量；并(e)基于所述擴(kuò)增樣品中的BRAF mRNA量和 BRAF基因表達(dá)的閾值水平，確定化學(xué)治療方案。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述寡核苷酸引物由寡核苷酸引物對(duì)SEQID N0:1和SEQ ID NO: 10，或 SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :10，SEQ IDNO 7 和 SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 或與其至少80%相同的寡核苷酸引物對(duì)組成。
11.一種用于檢測(cè)BRAF基因表達(dá)的試劑盒，其包含寡核苷酸對(duì)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 10，或 SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :4 禾口 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :6 禾口 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO: 7 禾口 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 8 禾口 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO: 10 或與其至少80%相同的寡核苷酸引物對(duì)。
12.一種對(duì)BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突變特異性的核酸探針，其中所述探針包含SEQ ID NO =Il0
13.一種對(duì)BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突變特異性的核酸探針，其中所述探針包含SEQ ID NO :12ο
14.一種檢測(cè)突變體BRAF核酸序列的存在的方法，包括添加探針，其中所述探針包含寡核苷酸序歹Ij SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :12。
15.一種檢測(cè)樣品中的BRAF V600K突變的存在的方法，所述方法包括(a)自所述樣品分離核酸，其中所述樣品包含DNA序列；(b)對(duì)所述樣品的所述DNA序列實(shí)施第一擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含能夠與BRAF突變體序列在BRAF DNA序列中的第一位特異性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO :1，和能夠在BRAF DNA序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物與雙鏈BRAF DNA序列的不同鏈退火，其中當(dāng)所述樣品的DNA序列包含在所述BRAF DNA序列的所述第一位包含突變體序列的BRAF DNA序列時(shí)，所述擴(kuò)增反應(yīng)能夠生成BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)對(duì)所述樣品的所述 DNA序列實(shí)施第二擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO :2，和能夠在BRAF DNA序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中由于所述第一引物的簡(jiǎn)并性，所述擴(kuò)增反應(yīng)不能生成BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；并(d)顯現(xiàn)通過(guò)所述第一擴(kuò)增反應(yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中一個(gè)樣品中的BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出和來(lái)自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的缺乏是所述樣品中的BRAFV600K突變的陽(yáng)性指示劑。
16.一種檢測(cè)樣品中的BRAF V600K突變的存在的方法，所述方法包括(a)自所述樣品分離核酸，其中所述樣品包含RNA序列；(b)對(duì)所述樣品的所述RNA序列實(shí)施第一擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含能夠與BRAF突變體序列在BRAF RNA序列中的第一位特異性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO :1，和能夠在BRAF RNA序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物與雙鏈BRAF RNA序列的不同鏈退火，其中當(dāng)所述樣品的RNA序列包含在所述BRAF RNA序列的所述第一位包含突變體序列的BRAF RNA序列時(shí)，所述擴(kuò)增反應(yīng)能夠生成BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)對(duì)所述樣品的所述 RNA序列實(shí)施第二擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO :2，和能夠在BRAF RNA序列中的第二位特異性退火的第二引物，其中由于所述第一引物的簡(jiǎn)并性，所述擴(kuò)增反應(yīng)不能生成BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；并(d)顯現(xiàn)通過(guò)所述第一擴(kuò)增反應(yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中一個(gè)樣品中的BRAF突變體特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出和來(lái)自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的缺乏是所述樣品中的BRAF V600K突變的陽(yáng)性指示劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于檢測(cè)樣品中的突變體BRAF序列的存在，特別地用于檢測(cè)BRAF V600E、V600D、V600K、和V600M突變的存在的方法、引物和探針。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102575295SQ201080045765
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者C.斯蒂芬斯, K.達(dá)南伯格 申請(qǐng)人:應(yīng)答遺傳公司