專利名稱：重金屬整治系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生耐受包括汞、鉛、鋅和鎘的重金屬且能夠螯合和累積這些重金屬的基因修飾細(xì)菌以用于生物整治(bioremediation)受污染液體和固體的分子生物學(xué)領(lǐng)域。背景描述具有相對(duì)高的密度的金屬化學(xué)元素常常被稱為重金屬。重金屬甚至在低濃度下是有毒的。有毒的重金屬包括汞、鎘、鉛、鋅和銀。在重金屬當(dāng)中，汞、鉛和鎘被認(rèn)為是特別有毒的。汞已經(jīng)作為工業(yè)過程和天然過程的副產(chǎn)物被引入環(huán)境中且可以高的濃度累積在土壤和沉積物中。Patra,M.和 Sharma A. ,Bot. Rev. 66 =379-422(2000)。在美國(guó)，燃煤發(fā)電廠每年放出約48噸的汞，而在亞洲和非洲，燃煤發(fā)電廠每年釋放多于1500噸。2009年2月8日檢索的CleanAir Mercury Rule (清潔空氣萊規(guī)則).美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(“EPA”) 2009, www.epa. gov/air/mercuryrule/basic. htm。全世界每年來(lái)自所有源的萊排放估計(jì)在4800-8300噸。2009 年 2 月 8 日檢索的Mercury Human Exposure (萊人類暴露)，EPA 2008, www. usepa.gov/mercury/exposure, htm。汞化合物是神經(jīng)毒素和電子在細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)膹?qiáng)力阻斷劑。所有的汞形式是有毒的并對(duì)人類健康和對(duì)環(huán)境帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。開發(fā)成本有效的和高效的整治系統(tǒng)是極其重要的。當(dāng)前從環(huán)境清潔汞的整治策略包括沖洗、化學(xué)還原/氧化、挖掘、回收和廠外處置。這些方法是成本高的、環(huán)境破壞性的和無(wú)效的。Karenlampi, S.等人，Environ.Pollut. 1007 =225-231 (2000)。其他方法例如玻璃化和混凝土覆蓋使得該地方不能用且對(duì)于整治大面積是不切實(shí)際的。用當(dāng)前技術(shù)從環(huán)境整治一磅汞的成本是數(shù)千美元。Hussein，H.等人，Env. Sci. Technol. 41 :8439-8446(2007)。與汞一樣，其他重金屬例如鉛和鎘帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境威脅且必須被整治。鉛是可以累積在軟組織和骨中的強(qiáng)力的神經(jīng)毒素。因?yàn)槠涠拘?，鉛已經(jīng)被EPA和其他機(jī)構(gòu)禁止進(jìn)入消費(fèi)者產(chǎn)品中，包括油漆、汽油、水管、玩具以及其他的。EPA將飲用水中的鉛含量限制為小于0. 015ppm。鉛在2007綜合環(huán)境反應(yīng)、補(bǔ)償和責(zé)任法(Comprehensive EnvironmentalResponse Compensation, and Liability Act, CERCLA)危險(xiǎn)物質(zhì)的優(yōu)先級(jí)表中排在第二。當(dāng)前在多個(gè)消費(fèi)者應(yīng)用中，尤其在電池中廣泛使用鎘已經(jīng)增加了該重金屬的環(huán)境污染。鎘已經(jīng)被表明是高毒性的，造成嚴(yán)重的中毒、骨退化、細(xì)胞酶抑制和細(xì)胞膜破壞。如在汞的情況一樣，當(dāng)前的整治或捕獲鉛和鎘的方法依賴于使用物理化學(xué)方法，包括使用離子交換樹脂、沉淀和提取、埋藏、原地覆蓋和廠外處置。Kim，S.等人.J. Biosci. Bioeng. 99 109-114(2005)。這些方法是成本高的和/或?qū)φ恢鲝埍Ｗo(hù)的環(huán)境是破壞性的。需要新的技術(shù)來(lái)促進(jìn)被污染環(huán)境的整治。使用有機(jī)體來(lái)整治被污染環(huán)境的生物整治可以提供潛在低的成本和環(huán)境友好的方法。例如，細(xì)菌可以將某些有毒化合物分解為它們的無(wú)毒代謝物。然而，重金屬元素例如汞、鎘和鉛不能被解毒為無(wú)毒代謝物。通過揮發(fā)汞的汞生物整治方法依賴于mer操縱子的表達(dá)，mer操縱子管理Hg2+的運(yùn)輸和還原。mer操縱子基因之一，merA，編碼汞離子還原酶，該酶是催化Hg2+至Hg°的轉(zhuǎn)化的酶。Hgci是低揮發(fā)性的、低反應(yīng)性和低毒性形式的萊。Jackson, ff. J.和Summers, A. 0.,J. Bacteriol. 151 :962-970 (1982)。然而，在揮發(fā)過程中，元素汞釋放到環(huán)境中，在環(huán)境中它可以被轉(zhuǎn)化為毒性更大的形式。揮發(fā)方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是其不適合于水處理，因?yàn)榧?xì)菌將揮發(fā)的元素汞釋放到正被整治的相同的水中。細(xì)菌并不具有在允許汞在細(xì)胞內(nèi)部累積的同時(shí)提供對(duì)汞的高抗性的內(nèi)源性機(jī)制。 基因工程已經(jīng)用于將來(lái)自其他有機(jī)體的基因與增加汞抗性和累積的目標(biāo)結(jié)合。已知為螯合劑(chelator)或螯合劑(sequestration agent)的分子已經(jīng)被提出作為合適的重金屬清除劑，其可以在有機(jī)體內(nèi)被表達(dá)，目標(biāo)是從土壤或水回收重金屬。細(xì)菌系統(tǒng)中的金屬硫蛋白和多磷酸鹽(polyphosphate)已經(jīng)被包含在一些重金屬的解毒中。在大腸桿菌中被表達(dá)的這兩種物質(zhì)可以螯合汞、鎘和鉛，且因此保護(hù)細(xì)菌免于某些水平的這些重金屬元素。然而，至今結(jié)果是令人氣餒的。細(xì)菌不能夠有效地螯合這些元素且并不經(jīng)受得住高水平的這些重金屬。這些結(jié)果歸因于螯合劑蛋白劑的穩(wěn)定性的察覺到的缺乏，產(chǎn)生具有對(duì)重金屬弱的耐受性的細(xì)菌系統(tǒng)。金屬硫蛋白被哺乳動(dòng)物、植物和真菌中存在的mt基因編碼。Sousa，C.等人，J. Bacteriol. 180 :2280-2284(1998)。然而，已經(jīng)表明金屬硫蛋白(MT)當(dāng)在細(xì)菌中被表達(dá)時(shí)是不穩(wěn)定的。Berka，T.等人，J. Bacteriol. 170 :21_26 (1988)。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)MT蛋白當(dāng)在細(xì)菌中被表達(dá)時(shí)是不穩(wěn)定的，所以mt基因已經(jīng)與穩(wěn)定劑例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合，產(chǎn)生GST-MT 融合。Chen，S.和 Wilson D. B. ,Appl. Env. Microbiol. 63 :2442-2445 (1997)。各種GST-MT構(gòu)建體包括釀酒酵母(GST-YMT)、人類(GST-HMT)和豌豆(pea) (GST-PMT)。含有GST-HMT的細(xì)胞沒有被表明為產(chǎn)生可溶的MT蛋白，且該構(gòu)建體并不賦予對(duì)汞的任何抗性。表達(dá)YMT和PMT構(gòu)建體的細(xì)胞已經(jīng)被表明耐受具有至多5 u M汞的液體，至多5 u M汞是幾乎無(wú)毒的水平。更重要地，表達(dá)這兩個(gè)構(gòu)建體的細(xì)胞看來(lái)并不累積汞或保護(hù)細(xì)胞免于汞，除非細(xì)胞還工程化為表達(dá)mer操縱子的汞轉(zhuǎn)運(yùn)基因。也已經(jīng)進(jìn)行各種不成功的嘗試來(lái)工程化靶向細(xì)菌周質(zhì)的粗糙脈孢菌(N.crassa)的mt基因和其他人類mt基因的多個(gè)拷貝。然而，這些蛋白的不穩(wěn)定性和不溶性已經(jīng)不斷阻止它們用作有效的整治劑。Valls，M.和Lorenzo，V. , FEMS Micro. Reviews，26 :327-338(2002)。雖然這些融合蛋白賦予對(duì)于汞的某些有限的耐受性，但該效應(yīng)并不能明確地歸因于MT蛋白，因?yàn)檫€已知GST，即融合配偶體，結(jié)合重金屬例如萊。Chen, S.和 Wilson D. B. , Appl. Environ. Microbiol. 63 :2442-2445 (1997)；Deng, X.和 Wilson D.B., Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 :276-279 (2001) ；Custodio,
H.M.等人，Arch. Environ. Occup. Health 60:17-23(2005)。因此，已經(jīng)推斷出，用金屬硫蛋白基因修飾的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在細(xì)胞中沒有提供足夠的抗性。Beattie, J. H.等人，Toxicol. Lett. 157 :69-78(2005) ；Odawara, F.等人，J. Biochem. 118 :1131-1137(1995) ；Park, J. D.等人，Toxicology. 163 :93-100(2001)。對(duì)該失敗給出的解釋包括小的金屬硫蛋白肽被細(xì)胞蛋白酶快速降解、低的蛋白收率和可能的對(duì)細(xì)胞溶質(zhì)中的氧化還原路徑的干擾。Sousa，C.等人，J. Bacteriol. 180 :2280-2284(1998)；Yang, F.等人，Protein Expr. Purif. 53 :186-194 (2007)。并且，用金屬硫蛋白基因工程化細(xì)菌以增強(qiáng)對(duì)鋅的抗性的嘗試已經(jīng)證明是無(wú)效的。Odawara, F.等人，同上。在細(xì)菌中表達(dá)的金屬硫蛋白融合基因已經(jīng)顯示僅僅提供對(duì)鎘毒性的臨界耐受性，最多 50mg/ 升(約 150 u M)。Odawara, F.等人，同前；Keasling, J. D.，和 Hupf, G. A. AppliedEnv. Microbiol. 62 :743-746 (1996)。這些研究并不表明細(xì)菌可以在高的鎘濃度中生長(zhǎng)良好，這是因?yàn)樵?0mg/L的鎘之后，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與在沒有鎘的培養(yǎng)基(media)中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相比生長(zhǎng)顯著降低。其他人關(guān)注于工程化多磷酸鹽激酶(polyphosphate kinase,“ppk”)基因以在細(xì) 菌中表達(dá)。PPk酶負(fù)責(zé)已知吸收(螯合)汞的正磷酸鹽的長(zhǎng)線型聚合物的合成。與mt相似，僅ppk融合構(gòu)建體已被提出和利用。例如，產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)ppk基因已經(jīng)與假單胞菌衍生的merT和merP基因融合。merT和merP基因促進(jìn)萊的內(nèi)在化。融合意味著提高穩(wěn)定性，且選擇融合組分部分是由于相信汞內(nèi)在化將被限制，這還將限制表達(dá)PPk基因的細(xì)菌的生物整治效果。Pan-Hou, H.等人，Biol. Pharm. Bull. 24 1423-1426(2001) ；Pan-Hou, H.等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. 10325 :159-164 (2002)。表達(dá)這些構(gòu)建體的細(xì)菌能夠從溶液累積高達(dá)16 y M汞和24 ii M的有機(jī)汞化合物。在元素汞的存在下的細(xì)菌生長(zhǎng)在16 ii M汞時(shí)被完全破壞。當(dāng)將表達(dá)構(gòu)建體的工程化的細(xì)菌放在海藻酸鹽珠上時(shí)，已經(jīng)顯示出增加的對(duì)萊的抗性。然而，萊整治失效，且細(xì)菌在40-80 ii M萊的存在下喪失生活力。Kyono, M.等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 62 :274-278 (2003)。植物整治和真菌整治(非工程化的有機(jī)體)已經(jīng)成為試圖通過使鉛累積在根或葉中來(lái)生物整治鉛的方法。Huang, L. Z.等人，Biodegradation 20:651-660(2009) ；Vimala,R.和Das, N.，J. , Hazard. Mat. 168 :376-382(2009)?，F(xiàn)今沒有提出對(duì)于鉛的有效的細(xì)菌生物整治技術(shù)。由上述系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的工程化的細(xì)菌對(duì)重金屬的低的抗性水平排除了它們作為有效的生物整治系統(tǒng)的應(yīng)用。甚至在具有低的汞濃度的水中，這些系統(tǒng)將不是有效的，因?yàn)楣瘜⒁愿哂谟上到y(tǒng)耐受的濃度的濃度累積在細(xì)胞內(nèi)。發(fā)明概述在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于表達(dá)細(xì)菌中的重金屬螯合基因的載體，其包括以下功能連接的元件載體骨架，轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列,其源自質(zhì)體16S rrn基因，翻譯增強(qiáng)子元件序列，其源自噬菌體17基因10，螯合劑的編碼序列，其中載體是在細(xì)菌中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體還包括3’UTR不依賴P因子的翻譯終止子。優(yōu)選地，3’ UTR是質(zhì)體rpsl6轉(zhuǎn)錄終止子或大腸桿菌rrnB轉(zhuǎn)錄終止子。更優(yōu)選地，3’ UTR是質(zhì)體rpsl6轉(zhuǎn)錄終止子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，螯合劑由mt、ppk或半乳糖苷酶(IacZ)基因編碼,且基因在細(xì)菌中被表達(dá)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，螯合劑是由PPk合成的多磷酸鹽，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約100 PM汞、至少約IOOOii M鋅、至少約250 ii M鎘或至少約3，OOOii M鉛。在又一個(gè)實(shí)施方式中，mt基因是哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白。更優(yōu)選地，螯合劑由小鼠mtl基因序列編碼，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約160 ii M汞、至少250 ii M鎘、1,000 ii M鋅或3，OOOii M鉛。在還另一個(gè)實(shí)施方式中，螯合劑由￠-半乳糖苷酶(IacZ)基因序列編碼，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 u M汞和至少250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在還另外的另一個(gè)實(shí)施方式中，載體骨架是質(zhì)粒骨架。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包括轉(zhuǎn)基因螯合劑的細(xì)菌，其中細(xì)菌抵抗在至少約25 ii M和至少約IOOii M之間的Hg。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑基因從強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，并側(cè)翼為選定的5’UTR和任選的選定的3’UTR，例如至少在4，000和8，500拷貝之間的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA對(duì)應(yīng)于螯合劑基因，更優(yōu)選地在6，000和7，500拷貝之間的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA對(duì)應(yīng)于螯合劑基因。在還更優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑基因從源自質(zhì)體16S rrn基因的轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄，螯合劑基因側(cè)翼為源自噬菌體T7基因10的5’UTR翻譯增強(qiáng)子元件序列。仍還更優(yōu)選地，螯合劑基因從源自質(zhì)體16S rrn基因的轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄，且側(cè)翼為源自噬菌體17基因10的5’ UTR轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件序列和質(zhì)體rpsl6基因3’ UTR不依賴P因子的翻譯終止子序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于mtl基因，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約160 u M汞或抵抗至少約250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于P -gal ( ^ -半乳糖苷酶/IacZ)基因，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 U M汞或抵抗至少約250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在還另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于P-gal基因，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 ii M汞或抵抗至少約1，OOOii M鋅或3，000 y M鉛。在仍還另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于ppk基因，且其中細(xì)菌抵抗約250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在另外的實(shí)施方式中，細(xì)菌包括功能上連接于轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的mt、ppk或^ -gal基因序列，所述系統(tǒng)還包括轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子,其源自質(zhì)體16S rrn基因，翻譯增強(qiáng)子元件，其源自噬菌體17基因10，和不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子序列。在還另外的實(shí)施方式中，細(xì)菌當(dāng)在包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞、鋪、鋒或鉛且在萊的存在下在著色上變深。在還又一實(shí)施方式中，細(xì)菌當(dāng)在包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞、鎘、鋅或鉛，且細(xì)菌形成聚集體和沉淀物。在不同的還又一實(shí)施方式中，細(xì)菌當(dāng)在包含汞的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞，且細(xì)菌形成聚集體和沉淀物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，細(xì)菌是大腸桿菌、假單胞菌(Pseudomonas)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)或芽抱桿菌(Bacillus)。在不同的實(shí)施方式中，當(dāng)包括mt、ppk或P -gal基因序列的細(xì)菌在生物過濾器上生長(zhǎng)時(shí)，其可以從受污染液體除去重金屬。且其被便利地處理，例如從液體除去。在另一個(gè)不同的實(shí)施方式中，半乳糖苷酶裂解5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的能力由于重金屬的存在而與重金屬的濃度按比例地降低。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于從液體清除汞污染的方法，該方法包括將表達(dá)mt、ppk或P -半乳糖苷酶基因的細(xì)菌培養(yǎng)物加入所述液體中，其中所述細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)菌抵抗在約25 ii M Hg和至少約100 UM Hg之間的Hg，和在足以允許所述汞的螯合的一段時(shí)間之后從所述液體除去所述細(xì)菌。根據(jù)方法的一個(gè)實(shí)施方式，在所述細(xì)菌形成塊(clump)之后除去所述細(xì)菌。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，細(xì)菌通過篩分、抽吸或從過濾器除去細(xì)菌來(lái)除去。根據(jù)另一個(gè)方面，提供了一種監(jiān)測(cè)汞水平的方法，該方法包括將表達(dá)￠-半乳糖苷酶基因的細(xì)菌培養(yǎng)物加入液體中，其中細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)菌抵抗在約25 ii M Hg和至少約140 u M Hg之間的Hg，和·將X-gal加入樣品中和測(cè)試樣品以確定細(xì)菌代謝5_漠_4_氣_3_ [!引噪基-0-D-卩比喃半乳糖苷(X-gal)以產(chǎn)生藍(lán)色著色的能力以便確定萊在樣品中的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種從液體清除汞污染的方法，該方法包括將所述液體放在包括固體基質(zhì)的裝置中，其中所述基質(zhì)還包括￠-半乳糖苷酶，而沒有細(xì)胞載體；和當(dāng)所述液體被從所述固體基質(zhì)洗脫時(shí)，收集所述液體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)重金屬污染的試劑盒，該試劑盒包括流體容器，指示劑條上的表達(dá)￠-半乳糖苷酶(3-galactosidase)或￠-半乳糖苷酶(3-galactosidase enzyme)的細(xì)菌培養(yǎng)物，X-gal,和顯示著色的圖表，所述著色對(duì)應(yīng)于與指示劑條上的表達(dá)￠-半乳糖苷酶或￠-半乳糖苷酶的細(xì)菌培養(yǎng)物接觸的液體中的Hg的各種濃度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，試劑盒還包括比色增強(qiáng)劑(colorimetric enhancer)。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)重金屬污染的試劑盒，該試劑盒包括流體容器，表達(dá)P -半乳糖苷酶、ppk或mtl的細(xì)菌培養(yǎng)物,和顯示深的著色的指示劑條，所述深的著色對(duì)應(yīng)于表達(dá)￠-半乳糖苷酶、ppk或mtl的所述細(xì)菌培養(yǎng)物當(dāng)在液體中各種濃度的所述重金屬的存在下生長(zhǎng)時(shí)的著色。附圖簡(jiǎn)述圖I闡明細(xì)菌在所指示的濃度的汞的存在下生長(zhǎng)的能力。使培養(yǎng)物在汞中生長(zhǎng)16小時(shí)，之后它們的生長(zhǎng)作為培養(yǎng)物的光密度(0D_)的函數(shù)被測(cè)量。圖IA表示未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。圖IB表示工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物，包括表達(dá)P-gal蛋白的所指示的質(zhì)粒。圖IC表示工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物，包括表達(dá)mtl蛋白的所指示的質(zhì)粒。圖ID表示工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物，包括表達(dá)ppk酶的所指示的質(zhì)粒。圖2闡明細(xì)菌在所指示的濃度的汞的存在下生長(zhǎng)的能力。使培養(yǎng)物在汞中生長(zhǎng)120小時(shí)，且它們的生長(zhǎng)作為培養(yǎng)物的光密度(OD6J的函數(shù)被測(cè)量。圖2A表示未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。圖2B表示表達(dá)P-gal蛋白的工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物。圖2C表示表達(dá)mtl蛋白的工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物。圖2D表示表達(dá)ppk酶的工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物。圖3闡明根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄功效。從螯合劑的mRNA制備cDNA。mRNA拷貝數(shù)被計(jì)算并被歸一化為總的所提取的RNA。圖3A比較在未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(“wt”)中和在用P16s-gl0-mtl-3’ UTR遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中從mRNA轉(zhuǎn)錄物體外產(chǎn)生的cDNA。圖3B比較在wt細(xì)菌中和在用P16s-glO-ppk-3’UTR遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中從mRNA轉(zhuǎn)錄物體外產(chǎn)生的cDNA。圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的用于受污染液體的生物整治的設(shè)備的圖示。
圖5是細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)盒的示意圖。圖中涉及的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)僅表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。Prrn是指轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是質(zhì)體16S rrn啟動(dòng)子。5’UTR(非翻譯區(qū))表示翻譯增強(qiáng)子元件。優(yōu)選的5’UTR是來(lái)自噬菌體17的基因
10。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地編碼螯合劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑由lacZ、mtl或ppk基因編碼。3’UTR是指轉(zhuǎn)錄終止子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄終止子是質(zhì)體rpsl6終止子或大腸桿菌rrnB終止子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄終止子是rpsl6終止子。圖6是表示在120 ii M汞中生長(zhǎng)的表達(dá)IacZ和mtl基因的細(xì)菌的聚集的圖。圖6的圖是所觀察的聚集的Polaroid照片的示意圖。在工程化為表達(dá)IacZ基因(圖6A)和mtl基因(圖6B)的細(xì)菌的培養(yǎng)物中觀察到沉淀。圖7闡明工程化為表達(dá)螯合劑的細(xì)菌整治汞污染的培養(yǎng)基，即使培養(yǎng)基對(duì)不表達(dá)螯合劑的細(xì)菌(“wt”)無(wú)害的能力。圖7A示出wt細(xì)菌在沒有汞的培養(yǎng)基；包含120iiM汞的培養(yǎng)基；和經(jīng)處理的培養(yǎng)基中持續(xù)24小時(shí)的生長(zhǎng)。經(jīng)處理的培養(yǎng)基最初包含120 ii M汞并通過暴露于根據(jù)本發(fā)明工程化為表達(dá)IacZ基因的細(xì)菌120小時(shí)，隨后除去細(xì)菌細(xì)胞來(lái)處理。圖7B示出wt細(xì)菌在沒有汞的培養(yǎng)基；包含120 u M汞的培養(yǎng)基；和經(jīng)處理的培養(yǎng)基中持續(xù)24小時(shí)的生長(zhǎng)。經(jīng)處理的培養(yǎng)基最初包含120 PM汞并通過暴露于根據(jù)本發(fā)明工程化為表達(dá)mtl基因的細(xì)菌120小時(shí)，隨后除去細(xì)菌細(xì)胞來(lái)處理。圖8闡明根據(jù)本發(fā)明工程化為表達(dá)IacZ基因的細(xì)菌確定液體樣品的重金屬污染程度的用途。為了更易于目測(cè)，圖被選擇為呈現(xiàn)比色皿的Polaroid照片中捕獲的數(shù)據(jù)。(著色以其強(qiáng)度代表比色皿的Polaroid照片中觀察到的著色。)比色皿A在包含Oy M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；B在包含5 ii M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；C在包含IOii M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；且0在包含20 PM汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。板(panel) I示出在所指示的水平的汞的存在下生長(zhǎng)16小時(shí)之后的0D_測(cè)量結(jié)果。板II是板I中的測(cè)量結(jié)果的圖示。板III是如在板II的相應(yīng)的比色皿中的細(xì)菌，但比色皿中加入100 u g/ml 5-溴-4-氯-3-卩引哚基-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)底物每ml培養(yǎng)基。細(xì)菌與暴露于汞的水平成反比地喪失其裂解X-gal和產(chǎn)生典型藍(lán)色的能力。圖9證明了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)P-gal的細(xì)菌中半乳糖苷酶活性的減小。圖9A是在所指示的量的汞和IOOii g/ml X-gal的存在下生長(zhǎng)的細(xì)菌的照片。每一個(gè)培養(yǎng)物小瓶下面的有色棒接近小瓶中的內(nèi)容物的顏色并意圖用作與檢測(cè)試劑盒一起供應(yīng)的顏色代碼。圖9B描繪了用于容納/培養(yǎng)培養(yǎng)物的管，包括表達(dá)P -gal的細(xì)菌、X-gal和被污染流體。容器附有或伴有(attached thereto or comes accompanied by)指不細(xì)菌培養(yǎng)物在所指示的濃度的汞的存在下的預(yù)期的顏色強(qiáng)度的顏色圖表。圖9C是圖9B的示意圖。

圖10 示出表明包括 pBSK-P16S-glO-lacZ_3’ UTR( “l(fā)acZ”)、pBSK-P16S-glO-mtl-3’ UTR( “mtl”)和 pBSK-P16S-glO-ppk_3’ UTR( “ppk”)表達(dá)盒的細(xì)菌細(xì)胞系耐受包含所指示的濃度的鎘、鉛和鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力的細(xì)菌生物測(cè)定。未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109用作對(duì)照。在補(bǔ)充有鋅、鎘和鉛的LB營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h之后測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)物吸光度(0D 600nm)。圖IOA示出在1，000 y M的ZnCl2中生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞系。圖IOB示出在250 ii M CdCl2中生長(zhǎng)的細(xì)菌系。圖IOC示出在3，OOOii M的乙酸鉛Pb (C2H3O2)2 3H20中生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆。圖11示出通過表達(dá)轉(zhuǎn)基因的基因的細(xì)菌螯合汞。根據(jù)本發(fā)明的被IacZ構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在37°C在包含120 ii M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)120h。細(xì)菌通過離心、洗滌和再懸浮在 與初始培養(yǎng)物的體積相同的體積的培養(yǎng)基中來(lái)除去。處理再懸浮的細(xì)胞(“LacZ細(xì)菌”)以釋放任何汞并通過原子吸收光譜法來(lái)分析。經(jīng)處理的培養(yǎng)基的汞濃度和表達(dá)IacZ基因的細(xì)菌的汞濃度從光譜測(cè)定法結(jié)果來(lái)計(jì)算。在這些圖中所描繪的實(shí)驗(yàn)被執(zhí)行多次。在顯示棒偏差(bar deviation)的圖(圖
I、圖2、圖3、圖7、圖10和圖11)中所描繪的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)被執(zhí)行至少三份，且棒示出在結(jié)果內(nèi)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。除非另外指出，否則在這些圖中所描繪的其中細(xì)菌生長(zhǎng)被測(cè)量的實(shí)驗(yàn)中，每一種培養(yǎng)物的起始接種物(“種子”)是0. OlOD6tltl的起始培養(yǎng)物的相等大小的等分部分。在測(cè)試IacZ構(gòu)建體的有效性的某些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌培養(yǎng)物(未被轉(zhuǎn)化的和被轉(zhuǎn)化的)包含200mg/ml IPTG0然而，應(yīng)注意，在IacZ基因從組成型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)中，不需要由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。詳細(xì)描述本發(fā)明提供了安全的、高效的和成本有效的使用螯合劑(chelation agent)/螯合劑(sequestration agent)的重金屬整治方法。優(yōu)選的實(shí)施方式集中在表達(dá)螯合劑的細(xì)菌細(xì)胞的使用上。三種示例性螯合劑已經(jīng)在細(xì)菌中被表達(dá)，使得細(xì)菌抵抗高水平的重金屬且尤其是抵抗鉛、鎘、鋅和汞金屬硫蛋白(mt)、多磷酸鹽激酶(ppk)和￠-半乳糖苷酶蛋白。驚人地，現(xiàn)在已經(jīng)表明螯合劑基因可以產(chǎn)生高水平的表達(dá)和宿主細(xì)胞對(duì)重金屬的抗性的方式在細(xì)菌中被表達(dá)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，采用基于非細(xì)胞的螯合劑。在基于細(xì)菌細(xì)胞的系統(tǒng)中，螯合劑蛋白被表達(dá)，而不一定是融合蛋白的一部分。不需要mer基因的同時(shí)表達(dá)。對(duì)于表達(dá)這些基因的細(xì)菌，不需要海藻酸鹽或相似化合物的支撐床。工程化的細(xì)胞經(jīng)得起高水平的重金屬。這些驚人的觀察已經(jīng)允許開發(fā)細(xì)胞的和基于蛋白的生物整治的有效方法，如本申請(qǐng)中所描述的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供載體以在宿主細(xì)菌細(xì)胞中引入和表達(dá)基因。載體是能夠在宿主細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)。載體骨架可以包括轉(zhuǎn)化標(biāo)記物的基因，以指示載體對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化標(biāo)記物可以是用于從不含載體的正常細(xì)胞區(qū)分和選擇存在載體的細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物基因。這樣的標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常使用的選擇性標(biāo)記物包括賦予對(duì)特定的抗生素例如氨芐青霉素的抗性的基因。一些載體骨架還可以包括僅僅指示哪些細(xì)胞被載體轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物基因。轉(zhuǎn)化標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常使用的指示劑標(biāo)記物基因是編碼￠-半乳糖苷酶的IacZ基因的序列。其他通常使用的轉(zhuǎn)化標(biāo)記物包括各種螢光素酶基因和GFP。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌整治其在上面生長(zhǎng)的液體或固體表面?？蛇x擇地，固體表面通過暴露于液體而首先被浸泡/浙濾重金屬，且然后根據(jù)本發(fā)明工程化的有機(jī)體從液體除去重金屬。載體的一個(gè)組分是包括多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的克隆位點(diǎn)，其中這些標(biāo)記物以及另外的所需的核酸序列可以被引入載體中，且 通過轉(zhuǎn)化被引入細(xì)胞中。本發(fā)明的優(yōu)選的載體是質(zhì)粒。優(yōu)選的質(zhì)粒是工程化為允許表達(dá)轉(zhuǎn)基因的遺傳序列的質(zhì)粒。存在大量的已知的和被表征的載體。參見，例如Stanford數(shù)據(jù)庫(kù)http://genome-www. Stanford. edu/vectordb/vector_pages/plasmid_pages/Plasmid. html,上次訪問在2009年6月30日。允許相對(duì)容易地引入表達(dá)盒的質(zhì)粒的實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的和商業(yè)上可得到的。優(yōu)選的載體是pBlueScript 。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，提供了用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)螯合劑的質(zhì)粒。質(zhì)粒包括具有整合劑基因和允許質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)整合劑基因至聞水平的其他兀件的表達(dá)盒。其他元件(“基因表達(dá)元件”)包括啟動(dòng)子序列、翻譯增強(qiáng)子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列，全部以本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的方式在功能上連接。應(yīng)注意，盡管期望由于它們強(qiáng)烈增強(qiáng)表達(dá)的能力而選擇的全部三個(gè)表達(dá)元件的存在，但是螯合劑基因甚至在缺乏轉(zhuǎn)錄終止序列時(shí)被充分地表達(dá)至本文描述的水平。調(diào)整特征的任何有效的組合可能產(chǎn)生令人滿意地高的和穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選地用強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子來(lái)實(shí)施。預(yù)期質(zhì)粒可以包括不同類型的啟動(dòng)子，例如組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性的或組織特異性的啟動(dòng)子。同樣地，可能的是，以特定組合的其他有效的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和終止子可以產(chǎn)生令人滿意地高的和穩(wěn)定的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用源自質(zhì)體16S rrn基因序列的組成型啟動(dòng)子。Sriraman, P.等人，Plant Physiol. 117 1495-1499 (1998)和 Yukawa, M.等人，PlantMolecular Biology 23:359-365(2005)。16S rrn啟動(dòng)子序列被集成為盒的功能元件。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中提供的表達(dá)盒的另一個(gè)元件是翻譯增強(qiáng)子序列(“5’UTR”)。翻譯增強(qiáng)子序列增強(qiáng)質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)基因蛋白序列的翻譯。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的翻譯增強(qiáng)子是噬菌體17基因105’增強(qiáng)子元件。Olins,P. 0.和Rangwala，S. H.，J. Biol.Chem. 264 :16973-16976 (1989)。本發(fā)明中利用的增強(qiáng)子元件的序列被整合在表達(dá)盒的用于擴(kuò)增mtl、ppk和IacZ基因的合成的5’基因側(cè)翼PCR寡核苷酸(引物)內(nèi)。可以用于適當(dāng)?shù)纳镎尾呗缘馁|(zhì)粒的另一個(gè)元件由編碼本身是螯合劑或能夠產(chǎn)生螯合分子的酶的蛋白的基因序列組成。螯合劑蛋白和能夠產(chǎn)生螯合分子的酶兩者/任一個(gè)在本文可互換地被稱為“螯合劑(chelator agent)”或“螯合劑(sequestrationagent)”。換句話說,直接地是螯合劑或產(chǎn)生螯合分子(chelating molecule)或螯合分子(sequestering molecule)的任何基因產(chǎn)物是根據(jù)本發(fā)明的螯合劑。一些螯合劑的實(shí)例包括ppk、mtl、植物螯合肽、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和merP。一種優(yōu)選的這樣的螯合劑是金屬硫蛋白(MT)蛋白。金屬硫蛋白(MT)是以生物學(xué)鈍化形式螯合金屬離子的富含半胱氨酸的低分子量金屬結(jié)合肽。Hamer, D. H. , Annu.Rev. Biochem. 55 :913-51 (1986)。一種特別優(yōu)選的mt基因源自小鼠(“mtl基因”)并編碼mtl蛋白。包含小鼠mtl cDNA的pCMV-SPORT 10載體獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)克隆 #MGC47147。還參見 Strausberg，R. L.等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:16899-16903(2002)。mtl基因通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從包含mtl基因的cDNA的質(zhì)粒pCMV-SPORT 10擴(kuò)增。mtl編碼序列的美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心序列，gi# :BC036990，用于設(shè)計(jì)和開發(fā)通過PCR分離mtl編碼序列用于隨后克隆的PCR擴(kuò)增引物。另一個(gè)優(yōu)選的螯合劑基因序列是編碼多磷酸鹽激酶的ppk序列，多磷酸鹽激酶負(fù)責(zé)強(qiáng)烈螯合的多磷酸鹽的合成。無(wú)機(jī)多磷酸鹽是通過高能磷酸酐鍵連接的正磷酸鹽的帶負(fù)電荷的長(zhǎng)線型聚合物鏈。Kornberg，A.，J. Bacteriol. 177 :491-496 (1995)。這些磷酸鹽聚合物可以在長(zhǎng)度上變化且對(duì)于所有活的有機(jī)體是普遍存在的。由PPk基因編碼的酶多磷酸鹽激酶承擔(dān)從ATP聚合Y磷酸鹽以形成長(zhǎng)的多磷酸鹽鏈。優(yōu)選的PPk基因源自細(xì)菌，尤其是源自大腸桿菌，且優(yōu)選的PPk螯合劑是從該基因表達(dá)的多磷酸鹽激酶和該多磷酸鹽激酶 的多磷酸鹽產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，PPk基因通過PCR使用從NCBI序列NC 000913設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物從大腸桿菌K12擴(kuò)增。(ppk基因是上述NCBI序列上的2. 07kb區(qū)，從堿基 2，621，066 至 2，623，132。) Akiyama, M.等人，J. Biol. Chem. 267 :22556-22561 (1992)和 Blattner, F. R.等人，Science. 277 :1453-1474(1997)。又一個(gè)優(yōu)選的螯合劑基因序列是源自大腸桿菌K12的P -半乳糖苷酶的IacZ基因序列。K12的3，072堿基對(duì)IacZ基因是大腸桿菌中的乳糖操縱子的一部分并表達(dá)酶￠-半乳糖苷酶，該酶催化二糖例如乳糖的水解。Kalnins，A.等人，EMBO 2 593-597 (1983)。大腸桿菌P -半乳糖苷酶是可由作為輔因子的鉀和鎂離子活化的464kDa四聚體蛋白。該酶由于其代謝X-Gal的能力而已被廣泛用于分子生物學(xué)和遺傳學(xué)，X-Gal是無(wú)色改性的半乳糖，其被代謝形成亮藍(lán)色的且可以作為指示劑或報(bào)告標(biāo)記物起作用的不溶性產(chǎn)物(5-溴-4-氯吲哚)。IacZ基因通過PCR使用從NCBI序列NC 000913設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物從大腸桿菌K12基因組DNA擴(kuò)增。(IacZ是3. 08kb區(qū)，從堿基362，455至365，529。)Blattner, F. R.等人，Science. 277 :1453-1474(1997)。應(yīng)注意，關(guān)于汞螯合，除非另外特別地論述，否則本發(fā)明本文通常是指并示例無(wú)機(jī)汞的螯合。然而，如果系統(tǒng)還包括功能性轉(zhuǎn)基因裂合酶，例如諸如merB基因，那么本發(fā)明還允許有機(jī)汞螯合。Ruiz, 0.等人，Plant Physiol. 132 :1344-1352 (2003) ；Bizily S. , ProcNatl Acad Sci USA 96:6808-6813(1999)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中呈現(xiàn)的表達(dá)盒的另一個(gè)任選的元件由轉(zhuǎn)錄終止序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄終止序列是3’UTR不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的3’ -UTR序列的實(shí)例包括細(xì)菌的和質(zhì)體衍生的rpsl6。對(duì)于細(xì)菌的rrnB終止子序列的描述由Abe，H.等人，Genes to Cells，4 :87-97 (1999)提供。特別優(yōu)選的終止子是由Hayes, M. L.等人，Nucleic Acids Res. 34 :3742-3754 (2006)描述的質(zhì)體衍生的 rpsl6 終止子(本文其他地方還稱為rpsT)，其中“T”代表“末端”。rpsl6基因轉(zhuǎn)錄終止子序列被整合為mtl、ppk和IacZ基因的合成的3’ PCR擴(kuò)增寡核苷酸(引物)的一部分。產(chǎn)生包括這些遺傳元件的盒的常規(guī)方法是產(chǎn)生為轉(zhuǎn)基因的PCR引物的合成的寡核苷酸，其中兩個(gè)PCR引物分別包括5’控制元件(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子)和3’ -UTR。雖然在上文我們描述了被采用來(lái)獲得和制備以將特定的遺傳元件轉(zhuǎn)移到表達(dá)盒中的特定的分子方法(PCR、合成的寡核苷酸等)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可選擇的引物、可選擇的設(shè)計(jì)和另外的方法學(xué)可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生表達(dá)盒和包括這些遺傳元件的轉(zhuǎn)移載體的相同的目標(biāo)。構(gòu)建表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括功能連接的用于表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和基因表達(dá)控制元件。上面列出的是優(yōu)選的元件源自質(zhì)體16S rrn基因的啟動(dòng)子；源自噬菌體T7基因10的5，UTR ;和rrnB序列或rpsl6轉(zhuǎn)錄終止子(3，-UTR),優(yōu)選地rpsl6。(注意,在本專利說明書中，rpsl6和rpsT是對(duì)于相同的3’ -UTR可互換使用的名稱。)該盒包括細(xì)菌中使用的調(diào)整元件的想不到的組合，如下面進(jìn)一步詳述的，該組合現(xiàn)在已經(jīng)被證明在細(xì)菌中提供強(qiáng)的表達(dá)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的載體中的表達(dá)控制序列包括強(qiáng)啟動(dòng)子和5’UTR,優(yōu)選地16S rrn啟動(dòng)子序列和噬菌體17基因105’UTR。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體還包括3’ UTR，優(yōu)選地rrnB或rpsl63’ UTR，還更優(yōu)選地rpsl63’ UTR。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，細(xì)菌工程化為高度表達(dá)這些螯合劑轉(zhuǎn)基因序列。所得到的細(xì)菌抵抗高水平的重金屬污染。作為推論，本文所描述的優(yōu)選的啟動(dòng)子5’ UTR和3’ UTR的組合包括用于高水平表達(dá)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物和翻譯產(chǎn)物的優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)，無(wú)論被表達(dá)的轉(zhuǎn)基因是螯合劑還是一些其·他基因產(chǎn)物。用于將載體引入各種細(xì)胞和有機(jī)體的轉(zhuǎn)化方法是熟知的。例如，可以經(jīng)由氯化鈣/熱激方法(化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞方法)、電穿孔、經(jīng)由質(zhì)粒接合、粒子轟擊等等引入載體構(gòu)建體。載體被轉(zhuǎn)化到有機(jī)體中以便表達(dá)螯合劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體被轉(zhuǎn)化到可以用于生物整治的有機(jī)體中，例如植物、真菌、藻類或細(xì)菌。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，有機(jī)體是細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌是環(huán)境上普遍存在的、非挑剔生長(zhǎng)的、在天然環(huán)境中易于供養(yǎng)(sustainable)的細(xì)菌。用本發(fā)明的編碼螯合劑的表達(dá)盒和/或轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的特別優(yōu)選的細(xì)菌是大腸桿菌、假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeuriginosa))、藍(lán)細(xì)菌(例如，共同念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc commune)或悅目顫藍(lán)細(xì)菌(Oscillatoria amoena))和芽孢桿菌(例如臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus))。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑基因序列是lacZ、mtl或ppk。表達(dá)P -半乳糖苷酶、金屬硫蛋白和多磷酸鹽激酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌被表明能夠從液體除去重金屬和汞。上文所描述的細(xì)菌構(gòu)建體已經(jīng)在汞抗性和累積方面顯著提高至先前所報(bào)告的至少8倍的水平。P -半乳糖苷酶(“ P -gal”)是細(xì)菌中乳糖代謝所需要的四肽酶。P -gal是熟知的，這是因?yàn)槠涞鞍仔蛄性?970年公諸于眾。不知P-gal蛋白螯合重金屬或汞。如下面的實(shí)施例中所描述的，^ -gal現(xiàn)在已經(jīng)被表明具有對(duì)汞的高親和力并在被過表達(dá)時(shí)有效結(jié)合萊。未知P-gal可以賦予暴露于高濃度的萊的細(xì)菌抗性。并且，P-gal防止高濃度的鎘、鋅和鉛的有害影響。當(dāng)￠-半乳糖苷酶表達(dá)盒(pBSK-P16S-glO-BY-rpst)被引入細(xì)菌中時(shí)，觀察到高水平的轉(zhuǎn)錄。此外，細(xì)菌變得抵抗高濃度的汞。未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在暴露于5 ii g/ml Hg時(shí)顯示顯著的生長(zhǎng)減弱且在較高的濃度下根本不生長(zhǎng)，但是被表達(dá)P-gal的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌抵抗0、5、10、20、40、80、100、120、140和160 y M汞的測(cè)試濃度中的每一個(gè)。圖I和圖2中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不僅經(jīng)受得住高達(dá)約140 u M的汞濃度，而且實(shí)際上在這些汞水平下繁殖。其他數(shù)據(jù)(圖I和2中未示出)顯示被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌還在160 u MHg下繁殖。包含質(zhì)粒的細(xì)菌容易耐受在受污染水和土壤中見到的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長(zhǎng)和復(fù)制。相似的實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)菌當(dāng)根據(jù)本發(fā)明被P-gal轉(zhuǎn)化時(shí)，可以抵抗包含高達(dá)至少約250 鎘(參見圖10)的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中復(fù)制。并且，根據(jù)本發(fā)明被P-gal轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠抵抗包含高達(dá)至少約1，000 PM鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中有效地復(fù)制。該相同的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌證明對(duì)高達(dá)至少約3，000 u M鉛的抗性。當(dāng)mtl表達(dá)盒(pBSK-P16S-glO-mtl_rpst)被引入細(xì)菌中時(shí),觀察到高水平的轉(zhuǎn)錄。參見圖3A。此外，細(xì)菌變得抵抗高濃度的汞。被表達(dá)mtl的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌抵抗20、40、60、80、100、120、140和160 y M汞的汞濃度。圖I和圖2中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不僅經(jīng)受得住高達(dá)至少約160 PM的汞濃度，而且實(shí)際上在這些汞水平下繁殖。應(yīng)注意，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率與汞水平成比例地稍微下降。盡管如此，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生長(zhǎng)的飽和水平。包含質(zhì)粒的細(xì)菌容易耐受在受污染水和土壤中見到的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長(zhǎng)和復(fù)制。 相似的實(shí)驗(yàn)證明了根據(jù)本發(fā)明表達(dá)mtl的細(xì)菌克隆可以抵抗包含高達(dá)至少約250 ii M鎘和高達(dá)至少IOOOii M鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中復(fù)制。表達(dá)mtl的細(xì)菌克隆還呈現(xiàn)對(duì)高達(dá)至少約3，000 u M鉛的抗性。參見圖10。同樣地，當(dāng)ppk表達(dá)盒被引入細(xì)菌中時(shí)，觀察到高水平的轉(zhuǎn)錄。參見圖3B。此外，細(xì)菌變得抵抗高濃度的汞。被表達(dá)mtl的上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌抵抗20、40、60、80和IOOyM汞。圖I和圖2中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不僅經(jīng)受得住高達(dá)約100 u M的汞濃度，而且實(shí)際上在這些汞水平下繁殖。包含質(zhì)粒的細(xì)菌容易耐受在受污染水和土壤中存在的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長(zhǎng)和復(fù)制。相似的實(shí)驗(yàn)證明了根據(jù)本發(fā)明表達(dá)ppk的細(xì)菌克隆可以抵抗包含高達(dá)約3，OOOii M鉛和1，OOOii M鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中復(fù)制。另外，轉(zhuǎn)基因細(xì)菌抵抗高達(dá)約250 ii M的鎘。參見圖10。清楚地，包括質(zhì)體16S rrn衍生的啟動(dòng)子、T7基因10衍生的5’ UTR和細(xì)菌衍生的rrnB或質(zhì)體衍生的rpsl63’ UTR的載體以高的拷貝數(shù)表達(dá)這些所闡明的螯合劑基因。作為推論，組合的這些表達(dá)控制序列可以用于以高的水平表達(dá)其他基因，具有如對(duì)于螯合劑基因看到的相似的拷貝數(shù)，或至少約4，000 ;4，500 ；5,000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ；7，500 ;8，000 ;8，500 全長(zhǎng)拷貝每 ng 總 mRNA。細(xì)菌中包括強(qiáng)啟動(dòng)子和/或適當(dāng)?shù)?’ UTR和3’ UTR以造成在細(xì)菌中生產(chǎn)至少約4，000 ;4，500 ;5，000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ;7，500 ;8，000 ;8，500 全長(zhǎng)拷貝每 ng 總
mRNA的螯合劑mRNA的任何遺傳構(gòu)建體，使得包括這樣的構(gòu)建體的細(xì)菌能夠通過螯合重金屬同時(shí)抵抗包括重金屬的環(huán)境并在該環(huán)境中繁殖而有效地整治包含重金屬的液體或固體。優(yōu)選地，細(xì)菌表達(dá)約6，000至7，500拷貝的螯合劑每ng總mRNA。具有包括￠-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌還可以有效地用作用于檢測(cè)汞與汞污染和溢出以及其他重金屬的生物傳感器。X-gal的裂解釋放5，5' -二溴_4，4' -二氯-靛，一種不溶性藍(lán)色化合物。在化合物X-Gal (和X-gal類似物)的存在下表達(dá)半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌產(chǎn)生容易地可區(qū)別的深藍(lán)色顏色反應(yīng)。然而，現(xiàn)在觀察到藍(lán)色顏色的強(qiáng)度與汞的濃度成比例下降。參見圖8和圖9。同樣地，其他重金屬例如鎘的存在可以具有破壞X-gal (和X-gal類似物)的裂解和藍(lán)色化合物的產(chǎn)生的相同效果。這些特征使得P-gal適合作為原位或體外生物傳感器。因此，￠-半乳糖苷酶在細(xì)菌中的表達(dá)保護(hù)細(xì)菌免于汞的有害影響，但也降低了酶代謝乳糖和乳糖類似物例如X-gal的能力。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)重金屬的試劑盒。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，試劑盒包括流體的測(cè)試小瓶或容器、測(cè)試條上的表達(dá)3 -半乳糖苷酶或3 -半乳糖苷酶的細(xì)菌培養(yǎng)物、5-溴-4-氯-3-卩引哚基-0-D-卩比喃半乳糖苷(X-gal)和指不劑條。指不劑條包含確定￠-半乳糖苷酶還原X-gal的程度的顏色標(biāo)記物。每一種標(biāo)記物可以具有不同色調(diào)的藍(lán)色，這樣的顏色色調(diào)通過暴露于不同濃度的重金屬例如汞來(lái)預(yù)先確定。試劑盒用來(lái)實(shí)施檢測(cè)汞或包括鎘、鉛和鋅的其他重金屬的方法。該方法包括將測(cè)試樣品放在流體容器中的步驟。任選地，在測(cè)試樣品是固體的情況下，加入液體以從固體釋放汞/重金屬。加入X-gal。將流體與細(xì)菌培養(yǎng)物或包括P-gal蛋白的測(cè)試條接觸預(yù)定的時(shí)間段。接著，將培養(yǎng)物的顏色與指示劑條上的標(biāo)記物進(jìn)行比較以確定汞是否存在流體中和在流體中的濃度。在高的重金屬或汞濃度的一些情況下，試劑盒可以僅提供陽(yáng)性/陰性 結(jié)果且并不指示全部濃度范圍。上述試劑盒的可選擇的實(shí)施方式還可以包括一組標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品可以包括各種具有在溶液中的各種濃度的Hg的標(biāo)準(zhǔn)容器。作為非限制性實(shí)例，容器可以具有以下Hg濃度A 0uM ；B 5uM ；C :10iiM ;和 D 20uMo試劑盒可以按以下方式利用。將指定體積的測(cè)試材料和液體(如果材料是固體)放在測(cè)試小瓶中，將一定體積的指示濃度的Hg標(biāo)準(zhǔn)品放在每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)小瓶中A :0 ii M ;B :5uM；C 10 u M5^PD 20 u M。將一定體積的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌放在測(cè)試小瓶和標(biāo)準(zhǔn)小瓶中的每一個(gè)中。將X-gal加入到每一個(gè)小瓶。允許培養(yǎng)物溫育指定的時(shí)間段。優(yōu)選地，溫育時(shí)間在約I分鐘和20分鐘之間，更優(yōu)選地在5和10分鐘之間。在溫育時(shí)間結(jié)束之后，將測(cè)試小瓶的著色與標(biāo)準(zhǔn)小瓶的著色進(jìn)行比較以便確定汞在樣品中的大致濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)充分理解，可選擇的實(shí)施方式圍繞汞和其他重金屬逐漸地降低^-gal的與重金屬的濃度相關(guān)聯(lián)的裂解X-gal的能力的概念而被容易地設(shè)計(jì)。作為實(shí)例，但不限于這些實(shí)例，細(xì)菌以非液體形式(例如，凍干的)被提供，包括P-gal的細(xì)菌是細(xì)菌的環(huán)境菌株，溫育在特定的溫度下例如在37°C或在室溫下進(jìn)行，采用純化的P -gal而不是培養(yǎng)物混合物中表達(dá)0 -gal基因的細(xì)菌或P -gal表達(dá)載體或P -gal酶增加著色測(cè)定可以與汞的濃度相關(guān)聯(lián)的范圍。測(cè)試樣品是固體或固體的液體洗滌物。同樣地，可選擇的顏色測(cè)定和/或用于精確地測(cè)量顏色變化的光學(xué)儀器(例如，分光光度計(jì)、比色計(jì))的使用是可能的。顏色效果增強(qiáng)技術(shù)的使用還是已知的和可能的。這些可選擇的設(shè)計(jì)和其他的是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，￠-半乳糖苷酶蛋白本身，即不存在細(xì)胞載體，可以用作重金屬或汞的螯合劑，用作原位和體外應(yīng)用的溢出清理系統(tǒng)的一部分。P-gal是商業(yè)上可得到的和可以通過熟知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)容易地從表達(dá)酶的有機(jī)體純化。大量酶的分離可以通過其過表達(dá)和針對(duì)酶的抗體的商業(yè)可用性來(lái)促進(jìn)。為了制造目的，P-gal在細(xì)胞中的表達(dá)可以通過加入IPTG來(lái)操縱/增加。P-gal蛋白的商業(yè)供應(yīng)商是已知的，例如Sigma-Aldrich0同樣地，金屬硫蛋白和多磷酸鹽激酶的多磷酸鹽產(chǎn)物可以獨(dú)立地，即不存在細(xì)胞載體下作為包括鋅、鎘、鉛或汞的重金屬的螯合劑用于整治努力。此外，在本發(fā)明中已經(jīng)表明，強(qiáng)啟動(dòng)子或特定的5’ UTR和3’ UTR或優(yōu)選地強(qiáng)的質(zhì)體啟動(dòng)子、噬菌體17增強(qiáng)子和有效的質(zhì)體衍生的轉(zhuǎn)錄終止子序列的特定組合允許金屬硫蛋白(mtl基因)、多磷酸鹽激酶(ppk基因)和￠-半乳糖苷酶(IacZ基因)在細(xì)菌中表達(dá)至允許它們作為汞和其他金屬的有效的生物整治系統(tǒng)的用途和商業(yè)化的水平。上述質(zhì)粒提供能夠產(chǎn)生這些和其他轉(zhuǎn)基因的高的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯的增強(qiáng)的基因表達(dá)構(gòu)建體。包括本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌獲得使得它們理想地適合于通過螯合的生物整治的性質(zhì)。舉例來(lái)說，它們抵抗高水平的汞，持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間段。參見圖I和圖2。它們不僅抵抗高水平的汞，而且它們?cè)谶@些水平下繁殖。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在5 ii M汞的存在下顯示減弱的生長(zhǎng)，且在10 y M汞下不生長(zhǎng)。相反，被表達(dá)pkk基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在包含10 PM汞的培養(yǎng)基中顯示很少或沒有生長(zhǎng)減弱且在高達(dá)約100 PM汞的濃度下生長(zhǎng)。重要地，細(xì)菌繁殖隨著時(shí)間繼續(xù)。當(dāng)在汞中生長(zhǎng)120h之后測(cè)試相同的構(gòu)建體時(shí)，IacZ構(gòu)建體在高達(dá)約140 M汞下顯示隨著時(shí)間的進(jìn)一步生長(zhǎng)，在總生長(zhǎng)水平上與在沒有汞下生長(zhǎng)的未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能區(qū)別。mtl構(gòu)建體在高達(dá)160 PM汞下顯示進(jìn)一步生長(zhǎng)(雖然 以稍微降低的生長(zhǎng)速率)，在總生長(zhǎng)水平上與在沒有汞下生長(zhǎng)的被轉(zhuǎn)化或未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能區(qū)別，且在包含高達(dá)160 u M汞的培養(yǎng)基中減弱但顯著生長(zhǎng)。ppk構(gòu)建體在高達(dá)80 ii M汞下顯示進(jìn)一步生長(zhǎng)，在總生長(zhǎng)水平上與在沒有汞下生長(zhǎng)的未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能區(qū)別。PPk構(gòu)建體在0-80 u M的任何汞濃度下顯示了小的生長(zhǎng)減弱。可能的是，磷酸鹽可用性對(duì)被ppk基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的生長(zhǎng)具有小的影響。在包含120 ii M汞的液體通過暴露于包括本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌來(lái)處理的實(shí)驗(yàn)中顯示了流體的成功的整治。參見圖7。在通過暴露于轉(zhuǎn)基因細(xì)菌處理包含汞的培養(yǎng)基120h之后，從培養(yǎng)基清除掉剩余的細(xì)菌(導(dǎo)致“經(jīng)處理的培養(yǎng)基”)。將未被轉(zhuǎn)化的(“wt”)細(xì)菌種子加入到經(jīng)處理的培養(yǎng)基、包括0 ii M汞的新鮮培養(yǎng)基和包括120 U M汞的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)菌在經(jīng)處理的培養(yǎng)基和沒有汞的新鮮培養(yǎng)基中同樣地生長(zhǎng)良好。這表明經(jīng)處理的培養(yǎng)基具有低于5 u M的汞濃度。轉(zhuǎn)基因細(xì)菌不僅在這些高水平的汞下生長(zhǎng)，而且螯合和除去重金屬。通過原子吸收光譜法分析產(chǎn)生的定量數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)菌的整治功效。參見圖
11。原子吸收光譜法分析顯示在表達(dá)IacZ基因的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌細(xì)菌中非常高水平的汞累積。表達(dá)LacZ的大腸桿菌細(xì)胞在37°C在具有120 ii M Hg的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)120小時(shí)。制備用于光譜分析的細(xì)胞和培養(yǎng)基的方法基本上是根據(jù)環(huán)境保護(hù)局方法3010A。將細(xì)胞離心，在新鮮培養(yǎng)基中洗漆，再懸浮在小體積的培養(yǎng)基中，用70% (v/v)硝酸、30% (v/v)過氧化氫和濃HCl在95°C消化，達(dá)到等于它們生長(zhǎng)的初始體積的體積且然后通過原子吸收光譜法分析。在離心細(xì)菌細(xì)胞之后獲得的上清液培養(yǎng)基也在相似的處理之后被分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在從培養(yǎng)基除去汞和將高濃度的汞累積在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部上是非常有效的。如所觀察的，大部分有毒的汞見于轉(zhuǎn)基因細(xì)菌，而培養(yǎng)基中的汞被除去至低于5 u M的無(wú)毒濃度。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因的IacZ大腸桿菌具有通過螯合作用生物整治被汞高度污染的液體同時(shí)最佳地生長(zhǎng)的能力。在將被轉(zhuǎn)化細(xì)菌暴露于重金屬且尤其是汞之后，發(fā)現(xiàn)了關(guān)于這些細(xì)菌的另一個(gè)非常有用的性質(zhì)。細(xì)菌在充分累積包括汞的重金屬之后，變成較深的色調(diào)。此外，其傾向于緊密地聚集和固定。可以從容器挖出這樣的聚集的細(xì)菌，以例如吸移液體的方式抽吸，而不一定需要細(xì)菌可以在其上生長(zhǎng)的專用過濾器，或離心。聚集的細(xì)菌易于目測(cè)，因?yàn)槠鋵⒅優(yōu)樯畹纳{(diào)。參見圖6 ;圖8，板II ;和圖9，板A。聚集和深色調(diào)性質(zhì)可以單獨(dú)地或組合地良好地用在生物整治中。因此，本發(fā)明還提供用于從液體生物整治和吸收重金屬或汞的新穎的、簡(jiǎn)單的和低成本的機(jī)制。根據(jù)本發(fā)明使用的一個(gè)方法包括將受污染液體放在儲(chǔ)器中的第一步驟。在隨后的步驟中，將包括表達(dá)本發(fā)明的螯合劑(sequestration agent)/螯合劑(chelation agent)的質(zhì)粒的細(xì)菌加入到受污染液體中。允許細(xì)菌生長(zhǎng)并從液體除去重金屬。當(dāng)細(xì)菌除去汞且在細(xì)胞中達(dá)到高濃度的汞時(shí)，它們從溶液沉淀并形成緊密結(jié)合的聚集體。聚集體然后用篩裝置來(lái)回收。根據(jù)需要，加入另外的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌。
另外一個(gè)例子，深的著色可用于指示過程已經(jīng)發(fā)展到需要除去細(xì)菌的點(diǎn)，或作為工藝實(shí)際上在進(jìn)行中的質(zhì)量控制，且特定的色調(diào)水平可以通過將用于汞監(jiān)測(cè)的上述這些與IacZ系統(tǒng)并聯(lián)的方法用于指示或監(jiān)測(cè)受污染環(huán)境中存在的汞的水平。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌形成自持生物膜(self-sustained biofilm)以用作過濾系統(tǒng)的一部分以從液體和固體基質(zhì)除去重金屬或汞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，如圖4所描述的，提供了生物整治系統(tǒng)，其包括水儲(chǔ)器104 ；多孔固體基質(zhì)108 ;在水儲(chǔ)器和/或在多孔固體基質(zhì)中的細(xì)胞生物膜100，其中包括本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的抵抗Hg的細(xì)菌組成生物膜100 ;多孔過濾器112 ;和經(jīng)處理的水出口 116。遺傳工程化的細(xì)菌可以在多孔固體基質(zhì)108上生長(zhǎng)以形成生物膜100。因?yàn)榧?xì)菌高度抵抗汞和其他重金屬，所以其有效地從液體除去汞，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)部累積高濃度的汞。高的汞耐受性還允許細(xì)菌細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，這延長(zhǎng)了生物過濾器的使用壽命。細(xì)菌在過濾器上的著色可以指示它們的生物整治活性以及什么時(shí)候需要細(xì)菌替換。在根據(jù)本發(fā)明使用的一個(gè)方法中，將受污染水裝載到水儲(chǔ)器104。允許水穿過多孔固體基質(zhì)208并接觸細(xì)胞生物膜100。生物膜中的細(xì)胞螯合重金屬污染物，例如汞。干凈的水穿過多孔過濾器112，在多孔過濾器112中除去從生物膜100移去(dislodged)的任何細(xì)胞物質(zhì)以及其他雜質(zhì)。干凈的水然后通過經(jīng)處理水出口 116釋放。本申請(qǐng)中所描述的序列的組合可以用作各種體外系統(tǒng)、細(xì)胞系統(tǒng)和包括細(xì)菌、藻類、植物、動(dòng)物和真菌的有機(jī)體中新穎的生物整治系統(tǒng)。細(xì)胞或有機(jī)體可以被遺傳工程化為表達(dá)螯合劑，由此變得抵抗重金屬并通過螯合作用從培養(yǎng)基清除污染物。有機(jī)體可以被回收且重金屬或汞可以被回收和循環(huán)用于工業(yè)應(yīng)用。表達(dá)或包含被這些序列編碼的蛋白的體外系統(tǒng)、細(xì)胞或有機(jī)體還可以用作生物反應(yīng)器的一部分或用于土壤、水和沉積物的原位整治。在根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供包括上述重金屬或汞螯合系統(tǒng)和重金屬/汞運(yùn)輸機(jī)制的細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒還可以包括mer操縱子的merT和MerC基因的基因序列。質(zhì)粒然后可以被轉(zhuǎn)化到提供了將汞或其他重金屬運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)空間中和然后將汞螯合在細(xì)胞內(nèi)的能力兩者的細(xì)菌細(xì)胞中。預(yù)期mer操縱子的其他基因還可以被利用以便增強(qiáng)重金屬在細(xì)胞內(nèi)的螯合和提供對(duì)有機(jī)汞制劑例如甲基汞、二甲基汞和醋酸苯汞的抗性?？蛇x擇地，其他重金屬運(yùn)輸系統(tǒng)可以以如本發(fā)明中所描述的方式與本發(fā)明的螯合劑組合使用。設(shè)想可以產(chǎn)生包括編碼螯合劑的多于一個(gè)基因的細(xì)菌系統(tǒng)或其他有機(jī)體系統(tǒng)。這通過考慮到以下而更容易地制備螯合劑的細(xì)胞代謝效應(yīng)(不同于螯合)是不同的且它們作為螯合劑的活性也是不同的(例如，直接螯合或形成多磷酸鹽分子)。因此，多于一種類型的螯合劑的存在預(yù)期被宿主細(xì)胞/有機(jī)體相對(duì)充分地耐受。實(shí)施例I.本發(fā)明的螯合劑提供對(duì)高濃度的汞、鎘、鋅和鉛的耐受性并允許細(xì)菌在高濃度的汞、鎘、鋅和鉛的存在下生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將包括以商標(biāo)pBlueScript. (Stratagene)銷售的載體的質(zhì)粒構(gòu)建為以高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因。該載體中的表達(dá)盒包括質(zhì)體16S rrn基因啟動(dòng)子；5’ UTR翻譯增強(qiáng)子元件來(lái)自噬菌體17基因10 ;轉(zhuǎn)基因；和3’UTR不依賴P因子的終止子，如圖5所示的。在一個(gè)實(shí)施方式中，3’UTR是葉綠體rpsl6序列。來(lái)自基因10的5’UTR從合成的寡核苷酸產(chǎn)生。其他調(diào)節(jié)序列經(jīng)由聚 合酶鏈反應(yīng)來(lái)構(gòu)建。遺傳元件被產(chǎn)生為包括在每一個(gè)元件的末端附近的方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見,例如，Sambrook, J.和Rusell，D.，Molecular cloning A laboratory manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)) Cold Spring HarborLab press, Cold Spring Harbor,NY(2001)。產(chǎn)生多個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建體，其中轉(zhuǎn)基因編碼lacZ、mtl 或 ppk。包含這些構(gòu)建體的細(xì)菌克隆在包含不同濃度的HgCl2的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)16小時(shí)，如圖I所示的。在圖I中，圖IA表示未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109，圖IB表示包括PBSK-P16S-glO-lacZ-3’ UTR載體的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌，圖IC表示包括pBSK-P16S-glO-mtl-3’ UTR載體的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌，且圖ID表示攜帶pBSK-P16S-glO-ppk-3’UTR載體的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌克隆。將種子細(xì)菌接種物加入到細(xì)菌培養(yǎng)物燒瓶中，并將該燒瓶在37°C以用于培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)物的典型方式搖動(dòng)溫育。在16小時(shí)溫育時(shí)間結(jié)束時(shí)，在0D_nm測(cè)量培養(yǎng)基(culture media)的吸光度。幾乎相同的構(gòu)建體(但沒有P16S啟動(dòng)子元件)還被工程化和被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。在這些P16-構(gòu)建體(P16 minus construct)中，P16S啟動(dòng)子從載體中去除，IacZ啟動(dòng)子(the promoter was offthe vector, a IacZ promoter)。包括這些 P16S-構(gòu)建體的工程化的細(xì)菌也顯示出在高水平的汞下增加的抗性和生長(zhǎng)。例如，mtl基因構(gòu)建體經(jīng)受得住高達(dá)約20iiM Hg，且ppk構(gòu)建體經(jīng)受得住高達(dá)約40 ii M Hg。然而，清楚地，通過比較，包括P16S元件的構(gòu)建體能夠經(jīng)受得住顯著更高水平的汞。看來(lái)當(dāng)兩種蛋白被以較低水平表達(dá)時(shí)，例如在pBSK-glO-mtl-rpsT和pBSK-glO-ppk-rpsT載體的情況下，多磷酸鹽激酶比金屬硫蛋白提供了更好的對(duì)Hg的抗性。當(dāng)這些蛋白被過表達(dá)時(shí)，金屬硫蛋白比多磷酸鹽激酶提供更高的對(duì)抗Hg的有毒影響的保護(hù)。本發(fā)明不受具體的螯合劑的任何作用機(jī)理限制。盡管如此，以相對(duì)較低或較高水平表達(dá)PPk或mtl的細(xì)菌中的對(duì)汞的抗性的差異可以由兩種蛋白的作用機(jī)理來(lái)解釋。在金屬硫蛋白的情況下，因?yàn)槠渲苯域螲g，所以較高的表達(dá)水平等于較高的抗性水平。這不同于多磷酸鹽激酶，多磷酸鹽激酶可以甚至在較低的酶濃度下產(chǎn)生較高水平的多磷酸鹽，這是因?yàn)槠涫敲?。在較高的酶濃度下，Hg抗性的增量可能低于所預(yù)期的，這是因?yàn)槊傅孜镌诩?xì)胞中的可用性可能供應(yīng)不足，由此限制其活性。多磷酸鹽激酶承擔(dān)了從ATP聚合Y磷酸鹽以形成長(zhǎng)的多磷酸鹽鏈。
圖I中概括的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未被螯合劑轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(“wt”)可以在包含高達(dá)約5yM Hg的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，雖然生長(zhǎng)在暴露于5yM汞之后減弱。用指示的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌顯示當(dāng)以在20 ii M至高達(dá)約40 (pkk) ；80 ( ^ -gal) ;80 (mtl) y M萊范圍內(nèi)的萊濃度下生長(zhǎng)時(shí)在16小時(shí)時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)。在相似的實(shí)驗(yàn)中，如圖2所示的，轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌可以甚至在較高濃度的汞的存在下繼續(xù)生長(zhǎng)，且培養(yǎng)物在以下LB培養(yǎng)基中溫育120小時(shí)之后實(shí)現(xiàn)較高的密度包含各種指示的濃度的Hg，高達(dá)約以下的汞濃度對(duì)于ppk構(gòu)建體的100 ii M ;對(duì)于P -gal構(gòu)建體的140 u M ;和對(duì)于mtl構(gòu)建體的160 u M。因此，細(xì)菌抵抗這些高濃度的汞并在這些高濃度的汞下繼續(xù)生長(zhǎng)。 實(shí)施例2.本發(fā)明的構(gòu)建體(pBSK-P16S_glO-螯合劑_3’ UTR)將螯合劑元件轉(zhuǎn)錄至非常高的水平。mRNA從未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌和表達(dá)mtl和ppk的細(xì)菌克隆收集。總細(xì)胞RNA通過使用RNeasy微量試劑盒(RNeasy Mini Kit, Qiagen)和方案從在37°C在300rpm攪拌下在Luria Bertani (LB)肉湯中生長(zhǎng)16小時(shí)的Iml細(xì)菌克隆和未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109培養(yǎng)物分離。RNA樣品用100 u g/ml的濃度的DNA酶I處理。樣品通過隨機(jī)引物擴(kuò)增使用AccuScript cDNA試劑盒(Stratagene)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化和逆轉(zhuǎn)錄。cDNA通過定量實(shí)時(shí)PCR使用具有擴(kuò)增后融化曲線分析的兩步驟實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增程序來(lái)分析。從合成的寡核苷酸產(chǎn)生基因特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量。使用轉(zhuǎn)基因特異性引物的實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)生與mRNA模板成比例的量的cDNA。用作來(lái)自未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的模板mRNA的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示沒有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因特異性mRNA的拷貝數(shù)被計(jì)算和歸一化為存在的總mRNA。如圖3中可以見到的，克隆包含約7，000拷貝的每一種轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA。用包括B_gal元件的構(gòu)建體獲得了相似的數(shù)據(jù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這些數(shù)字表示轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)錄至非常高的水平。實(shí)施例3.包含本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌當(dāng)它們累積汞時(shí)形成聚集體。當(dāng)細(xì)菌在足夠高的濃度的汞中生長(zhǎng)或在較低濃度下生長(zhǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間時(shí)觀察到深的著色、聚集和沉淀。例如，如圖 6 所示的，pBSK-P16S-glO(5’ UTR)-mtl-3，UTR( “mtl”)和 pBSK_P16S-glO(5’UTR)-lacZ-3’UTR(“l(fā)acZ”)樣品在包含120 y M Hg的LB培養(yǎng)基中溫育之后形成在容器的底部累積的聚集體。用在80 ii M汞的存在下生長(zhǎng)的包括mtl或ppk基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌也觀察到相似的效應(yīng)。在約24小時(shí)之后觀察到變化且它們隨時(shí)間與累積成比例增加。三個(gè)細(xì)菌克隆全部在攪拌(以約280rpm)下在15ml錐形管中生長(zhǎng)。在攪拌期間出現(xiàn)聚集和沉淀，而不需要靜止溫育。所測(cè)試的三種螯合劑中的每一種都出現(xiàn)這些顏色變化和沉淀效應(yīng)。這提供細(xì)菌應(yīng)何時(shí)被除去和替換的目視指示劑。該效應(yīng)使得通過簡(jiǎn)單地從液體篩分細(xì)菌而容易除去已經(jīng)累積大量汞的細(xì)菌。已經(jīng)在細(xì)菌克隆pBSK-P16S-glO-mtl_rpsT 和 pBSK-P16S-glO-ppk_rpsT 中觀察到這些聚集和沉淀效應(yīng)。因此，看來(lái)不是基因型的直接功能，而是對(duì)汞的抗性和在細(xì)胞中累積汞的功能。僅在已經(jīng)在等于或高于80 ii M的汞濃度下生長(zhǎng)至少24小時(shí)的時(shí)間段的細(xì)菌中觀察到聚集和沉淀。在較低的汞濃度下，細(xì)胞將可能需要暴露于低濃度的汞較長(zhǎng)的時(shí)間段。盡管如此，在細(xì)菌已經(jīng)累積足夠的汞后，在較低濃度的汞下也出現(xiàn)顏色變化、聚集和沉淀。累積汞的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌獲得深的顏色，這用作細(xì)胞中高的汞濃度的指示。細(xì)胞的加深可以在40 ii M Hg或更高下察覺到。聚集、沉淀和著色效應(yīng)是在細(xì)菌細(xì)胞累積高的汞濃度之后識(shí)別和回收細(xì)菌細(xì)胞的非常有用的特征；它們可以是有用的標(biāo)記物以確定細(xì)胞何時(shí)即將從正被清潔的環(huán)境收獲，且還可以幫助降低將這些細(xì)菌系統(tǒng)應(yīng)用于汞生物整治的成本。這是由于累積高濃度的汞而在細(xì)菌細(xì)胞中觸發(fā)的形態(tài)學(xué)變化的第一報(bào)告。實(shí)施例4.在通過暴露于包括本發(fā)明的構(gòu)建體的細(xì)菌來(lái)處理培養(yǎng)基之后，經(jīng)處理的培養(yǎng)基基本上不含重金屬；萊被螯合。如圖7所不的,將未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109在沒有汞(0 u M)的LB培養(yǎng)基中、在經(jīng)處理的培養(yǎng)基中和在具有120 u M HgCl2濃度的LB培養(yǎng)
基中培養(yǎng)。經(jīng)處理的培養(yǎng)基是初始包含120 ii M HgCl2且細(xì)菌克隆pBSK-Prrn-5’UTR-lacZ-3’UTR 或 pBSK-Prrn-5’UTR-mtl-3’UTR 在其中生長(zhǎng) 120 小時(shí)的 LB培養(yǎng)基。通過以13，OOOrpm離心2分鐘從液體培養(yǎng)基除去細(xì)菌細(xì)胞，且通過使液體培養(yǎng)基穿過0. 22 y M過濾器以除去從離心過程留下的任何轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞而使液體培養(yǎng)基滅菌。經(jīng)處理的培養(yǎng)基用未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109再接種。在圖7A示出的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)處理的培養(yǎng)基是用包括pBSK-Prrn-5’UTR-lacZ-3’UTR(“l(fā)acZ”)構(gòu)建體的細(xì)菌處理的培養(yǎng)基。在圖7B示出的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)處理的培養(yǎng)基是用包括pBSK-Prrn-5 ’ UTR-mt 1_3 ’ UTR (“mt I ”) 構(gòu)建體的細(xì)菌處理的培養(yǎng)基。允許未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在相應(yīng)的經(jīng)處理的培養(yǎng)基中在37°C在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)16小時(shí)，且然后測(cè)量培養(yǎng)物的0D_吸光度。結(jié)果顯示未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在通過轉(zhuǎn)基因細(xì)菌處理的培養(yǎng)基中的正常生長(zhǎng)速率。作為對(duì)照，包含120iiM Hg的新鮮培養(yǎng)基也被過濾滅菌并加入大腸桿菌JM109細(xì)菌。未被轉(zhuǎn)化的JM109細(xì)菌不能夠在包含120iiM HgCl2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。參見圖7A和圖7B。這表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因克隆可以用于整治處理包含非常高濃度的汞的液體。該處理將Hg降低至無(wú)毒水平(小于約5 PM)并允許大腸桿菌JM109的正常生長(zhǎng)。實(shí)施例5.汞被螯合在細(xì)菌內(nèi)；轉(zhuǎn)基因細(xì)菌將汞降低至亞細(xì)菌抑制劑量。為了證實(shí)3 -半乳糖苷酶可以作為螯合劑，我們對(duì)從在具有120 ii M Hg的LB培養(yǎng)基中的5ml培養(yǎng)物在120小時(shí)之后獲得的pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT細(xì)菌小球(pellet)進(jìn)行冷蒸汽原子吸收光譜法(CVAAS)分析。將細(xì)胞通過離心從培養(yǎng)物除去，洗滌并再懸浮在Iml LB培養(yǎng)基中。遵循 EPA 方法 30IOA (EPA 方法 3010A. Methods for Chemical Analysis of Water andWastes (用于化學(xué)分析水和廢物的方法)；美國(guó)環(huán)境保護(hù)局-Washington, DC, 1992)將細(xì)胞和上清液?jiǎn)为?dú)地酸消化，使得達(dá)到5ml體積以維持初始的Hg比例，且然后通過CVAAS來(lái)分析。結(jié)果表明IacZ細(xì)菌克隆對(duì)于從培養(yǎng)基除去Hg是非常有效的，累積等于116 的濃度的Hg(圖11)。在120小時(shí)處理之后留在培養(yǎng)基中的濃度是2.7 ii M(圖11)。這些結(jié)果證實(shí)了顯示未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在用pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT細(xì)菌克隆事先處理的培養(yǎng)基中非常好地生長(zhǎng)的結(jié)果。從兩個(gè)研究明白的是，轉(zhuǎn)基因細(xì)菌能夠從液體培養(yǎng)物除去Hg至低于5 ii M的水平。實(shí)施例6. P -半乳糖苷酶生物測(cè)定 汞降低P -gal裂解X-gal的能力 如圖8所示的，包括pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsl6質(zhì)粒的細(xì)菌克隆在所指示的Hg+2濃度下生長(zhǎng)。板I示出在0至20iiM Hg+2范圍內(nèi)的Hg+2濃度下16小時(shí)之后的細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)量結(jié)果(0D_J。然后對(duì)在所指示的Hg濃度下生長(zhǎng)的每一種細(xì)菌制備雙份比色皿。參見板II和板III。將100 u g/ml X-gal加入到板III的比色皿。觀察到X-Gal至藍(lán)色顏色的轉(zhuǎn)化的降低與汞濃度的增加成比例，一直到20 ii M Hg+2。如板I和板II中觀察到的，轉(zhuǎn)基因克隆的細(xì)菌生長(zhǎng)不受在該濃度范圍內(nèi)的增加的汞濃度影響。這表明藍(lán)色顏色的降低是P-gal酶促活性的降低的因素而不是由于缺乏細(xì)菌生長(zhǎng)。
為了更易于目測(cè)，圖8在板II和板III中呈現(xiàn)了包含樣品的實(shí)際比色皿的照片的圖。圖中的明暗是根據(jù)照片的明暗，并保存包含暴露于不同濃度的Hg的細(xì)菌的比色皿的相對(duì)暗度。板II是示出在0至20iiM Hg+2中16小時(shí)之后的細(xì)菌生長(zhǎng)的比色皿的照片的精確圖再現(xiàn)。板III是示出￠-半乳糖苷酶對(duì)Hg+2的增加的暴露和螯合作用降低了該酶將X-gal底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色顏色代謝物的能力的比色皿的照片的精確圖再現(xiàn)。A0uM；B5uM；C10uM；D 20 u M0板II和板III中的比色皿“D”的色調(diào)在視覺上是相同的。圖9板A示出相似實(shí)驗(yàn)的實(shí)際照片，其中表達(dá)P-gal的細(xì)菌克隆在37°C在100 u g/ml X-gal和所指示的濃度的汞的存在下生長(zhǎng)16小時(shí)。如可以見到的，在40 y M汞下生長(zhǎng)的培養(yǎng)物開始發(fā)展較深的顏色。該顏色變深是細(xì)胞中被螯合的汞累積的效應(yīng)。在每一個(gè)小瓶底部的有色棒是被開發(fā)為模擬/捕獲培養(yǎng)物當(dāng)暴露于所指示的濃度的汞時(shí)的色調(diào)的顏色編碼條。圖9板B示出用于檢測(cè)重金屬污染的原型試劑盒。提供容器，其中加入測(cè)試液體以及濃的X-gal和表達(dá)P-gal的構(gòu)建體或純化的P-gal。附接于培養(yǎng)管或在附近的是顏 色代碼圖，以允許目測(cè)比較測(cè)試結(jié)果與顏色圖。圖A是圖9B中的試劑盒的示意圖。在標(biāo)準(zhǔn)化條件下溫育一段時(shí)間之后，將培養(yǎng)物的顏色與顏色圖表進(jìn)行比較。實(shí)施例7.螯合劑提供對(duì)鋅、鎘和鉛的抗性。未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109( “wt”)和表達(dá)lacZ、mtl和ppk基因的細(xì)菌培養(yǎng)物中的每一種用0. OlOD600的細(xì)菌接種并在補(bǔ)充有1，OOOii M ZnCl2 (圖 10 板 A) ；250uM CdCl2 (板 B);和 3，000 y M Pb (C2H3) 2) 2 3H20 (板 C)的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h。如圖10中可以見到的，wt細(xì)菌顯示對(duì)這些毒素的某一水平的抗性。然而，轉(zhuǎn)基因細(xì)菌的抗性顯著更大。很可能，這些細(xì)菌克隆可以在還更高水平的鋅、鎘和鉛的存在下繼續(xù)生長(zhǎng)良好。包含PPk的克隆對(duì)鎘示出僅有限的抗性。克隆在鉛補(bǔ)充的培養(yǎng)基中顯示減弱的但顯著的生長(zhǎng)。所有三種被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在鋅中的生長(zhǎng)以及mt和P-gal克隆在鎘中的生長(zhǎng)基本上不受阻礙。作為對(duì)照，wt和所有三種被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株在沒有補(bǔ)充重金屬的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)同樣良好(數(shù)據(jù)未示出)。上述本發(fā)明應(yīng)結(jié)合所附的權(quán)利要求和附圖來(lái)閱讀。實(shí)施方式和實(shí)施例的描述使得人們能夠?qū)嵺`本發(fā)明的各種實(shí)現(xiàn)，且它們并不意圖將本發(fā)明限制于優(yōu)選的實(shí)施方式，而是作為本發(fā)明的特定的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，他們可以容易地將所公開的概念和具體的實(shí)施方式用作用于修改或設(shè)計(jì)用于進(jìn)行本發(fā)明的相同的目的的其他方法和系統(tǒng)的基礎(chǔ)。本文引用的包括出版物、專利申請(qǐng)、專利和網(wǎng)站內(nèi)容的所有參考文獻(xiàn)據(jù)此通過引用并入，達(dá)到如同每一個(gè)參考文獻(xiàn)單獨(dú)地和明確地被表明通過引用并入且在本文中以其整體提出的相同程度。在描述本發(fā)明的上下文中的術(shù)語(yǔ)“一 (a) ”和“一(an) ”以及“該(the) ”和相似的指示物的使用被解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者，除非本文另外表明或明顯地同上下文相矛盾。除非本文另外表明，本文的值的范圍的列舉僅意圖用作單獨(dú)地指代落入該范圍的每一個(gè)單獨(dú)的值的速記方法，且每一個(gè)單獨(dú)的值被并入說明書中，如同其單獨(dú)地在本文被列舉。詞語(yǔ)“約”當(dāng)伴隨數(shù)值時(shí)應(yīng)被解釋為表示達(dá)到所陳述的數(shù)值的10%且包括所陳述的數(shù)值的10%的偏差。除非另外要求，本文提供的任何和所有的實(shí)例或示例性的語(yǔ)言(“例如”或“諸如”)的使用，僅意圖更好地闡明本發(fā)明且并不造成對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。說 明書中的語(yǔ)言不應(yīng)被解釋為表示對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐必要的任何非要求保護(hù)的要素。
權(quán)利要求
1.一種用于在細(xì)菌中表達(dá)重金屬螯合基因的載體，所述載體包括以下功能連接的元件 載體骨架， 轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列，其源自質(zhì)體16S rrn基因， 翻譯增強(qiáng)子元件序列，其源自噬菌體17基因10， 螯合劑的編碼序列， 其中所述載體是在所述細(xì)菌中。
2.如權(quán)利要求I所述的載體，還包括3’UTR不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子序列。
3.如權(quán)利要求2所述的載體，其中所述3’UTR終止子是質(zhì)體rpsl6基因轉(zhuǎn)錄終止子或大腸桿菌rrnB基因轉(zhuǎn)錄終止子。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其中所述3’UTR轉(zhuǎn)錄終止子是質(zhì)體rpsl6基因轉(zhuǎn)錄終止子。
5.如權(quán)利要求I所述的載體，其中所述螯合劑由mt、ppk或P-半乳糖苷酶(IacZ)基因編碼。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其中所述螯合劑是由ppk合成的多磷酸鹽，且所述細(xì)菌抵抗高達(dá)約 100 ii M 萊、250 ii M 鎘、1000 u M 鋅或 3，000 u M 鉛。
7.如權(quán)利要求5所述的載體，其中所述mt是哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的載體，其中所述螯合劑由小鼠mtl基因序列編碼，且所述細(xì)菌抵抗高達(dá)約160 ii M汞、至少約250 ii M鎘、至少約1,000 PM鋅或至少約3，OOOii M鉛。
9.如權(quán)利要求5所述的載體，其中所述螯合劑由￠-半乳糖苷酶基因序列編碼，且所述細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 ii M汞、至少約250 ii M鎘、至少約1,000 PM鋅或至少約3，OOOii M鉛。
10.如權(quán)利要求I所述的載體，其中所述載體骨架是質(zhì)粒骨架。
11.一種細(xì)菌，該細(xì)菌包括轉(zhuǎn)基因螯合劑，其中所述細(xì)菌抵抗在至少約25iiM和約IOOii M之間的Hg。
12.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑基因從強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄并且側(cè)翼為選定的5’ UTR和任選的選定的3’ UTR，例如至少在4，000和8，500拷貝之間的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA對(duì)應(yīng)于所述螯合劑基因。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)菌，其中至少在6，000和7，500拷貝之間的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA對(duì)應(yīng)于所述螯合劑基因。
14.如權(quán)利要求12所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑基因從源自質(zhì)體16Srrn基因的轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄。
15.如權(quán)利要求12所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑基因側(cè)翼為源自噬菌體T7基因10的5’ UTR翻譯增強(qiáng)子元件序列和質(zhì)體rpsl6基因3’ UTR不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子序列。
16.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑基因從源自質(zhì)體16Srrn基因的轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄，并且側(cè)翼為源自噬菌體17基因10的5’ UTR轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件序列和質(zhì)體rpsl6基因3’ UTR不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子序列。
17.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于小鼠mtl基因，且其中所述細(xì)菌抵抗高達(dá)約160 ii M汞、至少約250 ii M鎘、至少約1,000 PM鋅或至少約3，000 y M鉛。
18.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于P-gal基因，且其中所述細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 u M汞、至少約250 u M鎘、至少約1，000 u M鋅或至少約3，000 u M鉛。
19.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于ppk基因，且其中所述細(xì)菌抵抗高達(dá)約100 U M汞、高達(dá)約250 u M鎘、至少約1，000 u M鋅或至少約3，000 u M鉛。
20.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，所述細(xì)菌當(dāng)處于包含汞的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞且在著色上變深。
21.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，所述細(xì)菌當(dāng)處于包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞、鎘、鋅或鉛且在著色上變深。
22.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，所述細(xì)菌選自大腸桿菌、假單胞菌、藍(lán)細(xì)菌和芽孢桿菌。
23.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，當(dāng)所述細(xì)菌處于包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環(huán)境中時(shí)，所述細(xì)菌累積汞、鎘、鋅或鉛，形成聚集體和沉淀物。
24.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，所述細(xì)菌在用于方便處理的生物過濾器中生長(zhǎng)以從污染液體除去重金屬。
25.如權(quán)利要求11所述的細(xì)菌，其中所述螯合劑轉(zhuǎn)基因是￠-半乳糖苷酶，且￠-半乳糖苷酶裂解5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的能力由于重金屬的存在而降低。
26.一種用于從液體清除汞污染的方法，所述方法包括 將表達(dá)mt、ppk或P -半乳糖苷酶基因的細(xì)菌培養(yǎng)物加入所述液體中，其中所述細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)菌抵抗在約25 ii M Hg和至少約100 UM Hg之間的Hg，和 在足以允許所述汞的螯合的一段時(shí)間之后從所述液體除去所述細(xì)菌。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中在所述細(xì)菌形成塊之后除去所述細(xì)菌。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中聚集體通過抽吸、篩分或過濾器去除而從經(jīng)歷清除污染的液體收集。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述細(xì)菌表達(dá)B-半乳糖苷酶，所述方法還包括將X-gal加入至少一個(gè)樣品中和測(cè)試所述樣品以確定所述細(xì)菌代謝5-溴-4-氯-3-吲哚基-0-D-卩比喃半乳糖苷(X-gal)以產(chǎn)生藍(lán)色著色的能力以便確定所述樣品中的萊濃度。
30.一種從液體清除汞污染的方法，所述方法包括 將所述液體放在包括固體基質(zhì)的裝置中，其中所述基質(zhì)還包括3 -半乳糖苷酶，而沒有細(xì)胞載體；和 當(dāng)所述液體被從所述固體基質(zhì)洗脫時(shí)，收集所述液體。
31.一種用于檢測(cè)重金屬污染的試劑盒，所述試劑盒包括 指示劑條上的表達(dá)3-半乳糖苷酶或3-半乳糖苷酶的細(xì)菌培養(yǎng)物， X-gal,和 顯示著色的圖表，所述著色對(duì)應(yīng)于與指示劑條上的表達(dá)3 -半乳糖苷酶或￠-半乳糖苷酶的細(xì)菌培養(yǎng)物接觸的液體中的Hg的各種濃度。
32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，所述試劑盒還包括比色增強(qiáng)劑。
33.一種用于檢測(cè)重金屬污染的試劑盒，所述試劑盒包括流體容器， 表達(dá)P -半乳糖苷酶、ppk或mtl的細(xì)菌培養(yǎng)物，和 顯示深的著色的指示劑條，所述深的著色對(duì)應(yīng)于表達(dá)P -半乳糖苷酶、PPk或mtl的所述細(xì)菌培養(yǎng)物當(dāng)在液體中各種濃度的所述重金屬的存在下生長(zhǎng)時(shí)的著色。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過細(xì)菌螯合重金屬的系統(tǒng)。該細(xì)菌表達(dá)ppk、mt和/或β-半乳糖苷酶(lacZ)基因且可以耐受至少25μM汞、1,000μM鋅、250μM鎘和3,000μMPb。該系統(tǒng)允許容易確定液體中重金屬污染物的存在和容易收集已經(jīng)螯合大量重金屬的細(xì)菌。還提供了一種在細(xì)菌中基因表達(dá)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括噬菌體和質(zhì)體基因表達(dá)元件并遞送特別高水平的蛋白表達(dá)和重金屬抗性。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102753691SQ201080045997
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者奧斯卡·魯伊斯 申請(qǐng)人:泛美波多黎各大學(xué)